PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
PATOLOGIA COMPARADA DE INFECÇÃO NASAL
CAUSADA POR Conidiobolus lamprauges E Pythium
insidiosum EM OVINOS
Daniel Guimarães Ubiali
Cuiabá - MT 2012
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
PATOLOGIA COMPARADA DE INFECÇÃO NASAL
CAUSADA POR Conidiobolus lamprauges E Pythium
insidiosum EM OVINOS
Autor: Daniel Guimarães Ubiali Orientadora: Profª. Dr ª. Caroline Argenta Pescador Co-Orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade de animais domésticos e silvestres, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso para obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Cuiabá - MT 2012
U15p Ubiali, Daniel Guimarães.
Patologia comparada de infecção nasal causada por Conidiobolus lamprauges e Pythium insidiosum em ovinos. / Daniel Guimarães Ubiali -- 2012.
57 f. ; 30 cm : color. (incluem figuras e tabelas)
Orientadora: Profª. Drª. Caroline Argenta Pescador Co-orientador: Profº. Drº. Edson Moleta Colodel.
Dissertação (mestrado) -- Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia, Medicina veterinária e Zootecnia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Cuiabá, 2012.
À Lis, que me ensina sobre a simplicidade da vida
À professora Caroline Argenta Pescador pela dedicação diária e assídua com os trabalhos da pós-graduação, do LPV e pela atenção com seus orientandos (as). Ao professor Edson Moleta Colodel pelas orientações e informações. Aos professores Franklin Riet-Correa, Luciano Nakazato e Valéria Dutra pela colaboração.
Aos ovinocultores que contaram com a equipe do LPV diante de doença ou morte de seus animais e subsidiaram este trabalho. Aos animais que doaram suas vidas.
À Daphine De Paula, Raquel Cruz e Marcus Amorim que respectivamente participaram das atividades de biologia molecular, patologia e apoio técnico com as imagens. À Bianca Weiss pelo companheirismo.
Ainda aos amigos que são irmãos, à minha família, aos amigos do Rancho Flehmen, aos companheiros de laboratório. Aos professores, funcionários e estagiários do Hospital Veterinário da UFMT. Àqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente à força divina.
1 INTRODUÇÃO ... 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 14 2.1 Conidiobolomicose ... 14 2.1.1 DEFINIÇÃO ... 14 2.1.2 ETIOLOGIA ... 14 2.1.3 EPIDEMIOLOGIA ... 15 2.1.4 CONIDIOBOLOMICOSE EM OVINOS ... 15
2.1.5 INFECÇÕES EM OUTRAS ESPÉCIES ... 17
2.1.6 INFECÇÃO EM HUMANOS ... 17 2.2 Pitiose... 18 2.2.1 DEFINIÇÃO ... 18 2.2.2 ETIOLOGIA ... 18 2.2.3 EPIDEMIOLOGIA ... 18 2.2.4. PITIOSE EM OVINOS ... 19
2.2.5INFECÇÕES EM OUTRAS ESPÉCIES ... 20
2.2.6 INFECÇÃOEM HUMANOS ... 21
2.3 Diagnóstico de Infecções fúngicas ... 21
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 24
3.1 Obtenção das amostras ... 24
3.2 Procedimentos de necropsia e histopatologia ... 24
3.3 Análise micológica ... 24
3.4 Imuno-histoquímica ... 25
3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) ... 26
4 RESULTADOS ... 26
4.4 PCR ... 35
5 DISCUSSÃO ... 40
6 CONCLUSÕES ... 43
REFERÊNCIAS ... 44
Rinite em ovinos (n=30) causada por C. lamprauges (n=15) ou P. insidiosum (n=15) foimorfologicamente investigadaatravés de avaliação macroscópica e histológica. O diagnóstico foi baseado na avaliação histopatológica e confirmado através da técnica de imuno-histoquímica. A Infecção por Conidiobolus lamprauges (n=15) foi caracterizada por rinite granulomatosa com grande quantidade de células gigantes, macrófagos e poucos eosinófilos e neutrófilos circundados por material Splendore-Hoeppli e imagens negativas de hifas. A infecção por P. insidiosum (n=15) caracterizava-se por necrose severa e difusa com grande quantidade de eosinófilos epresença de imagens de hifas circundadas por material eosinofílico e granular representando material Splendore-Hoeppli. A maioria das diferenças morfológicas entre infecção por C. lamprauges e P. insidiosum é associada com o padrão macroscópico das lesões, padrão celular inflamatório, morfologia e localização de hifas no exame de imuno-histoquímica. Ambos agentes foram fortemente impregnados pela prata (GMS) apresentando resultado negativo na coloração de PAS. Este trabalho tem por objetivo estabelecer a diferença dos padrões morfológicos da rinite causada por C. lamprauges e P. insidiosum.
Palavras chave: Rinite granulomatosa, Doenças de ovinos, Imuno-histoquímica, Patologia veterinária.
Thirty cases of fungal or fungal-like rhinitis in sheep caused by Conidiobolus lamprauges (n=15) or Pythium insidiosum (n=15) were morphologically investigated. The diagnoses were based on the histopathological lesions but were confirmed by immunohistochemical identification of the aetiological agent. Lesions from cases of conidiobolomycosis were characterised by granulomatous rhinitis with numerous multinucleated giant cells, macrophages and a limited number of eosinophils and neutrophils that were surrounded by amorphous Splendore-Hoeppli reactions and hyphae. Conversely, pythiosis histological lesions consisted of severely necrotising eosinophilic rhinitis with negatively stained structures representing fungal hyphae that were surrounded by granular and eosinophilic Splendore-Hoeppli material. Both ethiologic agents were positive in GMS and negative in PAS stain. The majority of these differences between the types of fungal or fungal-like infection were associated with the macroscopic aspects of the lesion, the inflammatory cell population, the fungal morphology and the localisation of hyphae by immunohistochemistry.
Key words: Granulomatous rhinitis, Sheep disease, Immunohistochemistry, Veterinary pathology.
FIGURA 1: A. Ovino com conidiobolomicose rinofaríngea. B. Secção médio-sagital de cabeça de ovino com conidiobolomicose rinofaríngea. C. Ovino com conidiobolomicose rinofacial. D. Secção médio-sagital de cabeça de ovino com conidiobolomicose rinofacial...29 FIGURA 2: Histopatologia de tecido nasal de ovino com conidiobolomicose...32 FIGURA 3: A. Ovino com pitiose rinofacial. B. Secção médio-sagital de cabeça de ovino com pitiose rinofacial. C. Ovino com pitiose rinofacial com quadro clínico avançado. D. Secção médio-sagital de cabeça de ovino com pitiose rinofacial...33 FIGURA 4: Histopatologia de tecido nasal de ovino com pitiose...37 FIGURA 5: Exames etiológicos utilizados para diagnóstico de conidiobolomicose. A. Colônia em Ágar Dextrose Sabouraud. B. Aspecto microscópico de C. lamprauges. C. Hifas fortemente impregnadas pela prata. GMS, Obj 40x. D. Imuno-histoquímica evidenciando hifas de C. lamprauges. Obj 40x...38 FIGURA 6: Exames etiológicos utilizados para diagnóstico de pitiose. A. Colônia em Ágar Dextrose Sabouraud. B. Aspecto microscópico de P. lamprauges. C. Hifas fortemente impregnadas pela prata. GMS, Obj 40x. D. Imuno-histoquímica evidenciando hifas de P. insidiosum. Obj 40x...39
TABELA 1: Resumo dos dados de diagnóstico de ovinos com rinite causada por Conidiobolus lamprauges ou Pythium insidiosum...28 TABELA 2: Resultados de Isolamento do agente, imuno-histoquímica e PCR obtidos de ovinos com rinite micótica...28 TABELA 3: Alterações macroscópicas em casos de rinite por Conidiobolus lamprauges e Pythium insidiosum. ...34 TABELA 4: Histopatologia comparada de infecção por Conidiobolus lamprauges e Pythium insidiosum em ovinos...36
% por cento ° C grau Celsius
ABD Ágar Batata Dextrose ASD Ágar Saboraud Dextrose AT Azul de Toluidina
DNA Ácido Desoxirribonucléico GMS Grocott Metenamine Silver HE Hematoxilina e Eosina IHQ Imuno-histoquímica PAS Ácido Periódico de Schiff pb pares de bases
PCR Reação em Cadeia pela Polimerase rDNA DNA ribossômico
SAEG Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas TCA Solução de Ácido Tricloroacético
1 INTRODUÇÃO
A ovinocultura é uma atividade emergente na região Centro-Oeste do Brasil, correspondendo a 7% do rebanho brasileiro com aproximadamente 1.086.238 cabeças (IBGE 2010) de ovinos.
Embora o controle sanitário e dados relacionados às patologias que acometem esses animais nessa região ainda sejam escassos, o diagnóstico das doenças em animais de produção, nos últimos anos, têm sido mais tecnificado fazendo com que veterinários de campo busquem gradativamente informações claras e concisas sobre o diagnóstico presuntivo ou definitivo das enfermidades presentes no rebanho ovino do Estado.
Dentre as enfermidades que acometem ovinos, as doenças respiratórias, entéricas e neurológicas são as mais comumente relatadas, causando prejuízos na cadeia produtiva. Entretanto, existem infecções nos ovinos que cursam com manifestações clínicas semelhantes, como por exemplo, as rinites micóticas, sendo os agentes etiológicos mais comumente relatados o Conidiobolus sp., Criptococcus sp., Aspergillus sp. e o oomiceto Pythium insidiosum (PORTELA et al., 2010).
Relatos de rinite micótica em ovinos têm sido freqüente no Brasil, principalmente nas regiões Nordeste e Centro Oeste e causam sérios prejuízos econômicos em decorrência da morte dos animais (SILVA et al., 2007a;BOABAID et al. 2008; RIET-CORREA et al., 2008; PORTELA et al., 2010;CÂMARA et al., 2011).
Na prática clínica nota-se grande dificuldade em lidar com o diagnóstico etiológico da rinite granulomatosa em ovinos (RIET-CORREA et al., 2008; SANTURIO et al., 2008; PORTELA et al., 2010; VILELA et al., 2010). O objetivo deste trabalho foi caracterizar o aspecto macroscópico e histopatológico de 30 casos de rinite em ovinos causada por Conidobolus lamprauges ou Pythium insidiosum.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Conidiobolomicose
2.1.1 DEFINIÇÃO
Doença granulomatosa geralmente fatal descrita em regiões tropicais causada por fungos do gênero Conidiobolus, acomete animais domésticos, silvestres e o homem (ELGART, 1996).
2.1.2 ETIOLOGIA
Fungos do gênero Conidiobolus são considerados patógenos oportunistas, pertencentes à classe dos Zigomicetos, ordem Entomophthorales. As principais espécies de interesse em medicina veterinária são: C. coronatus, C. incongruus e C. lamprauges, causando tanto infecções localizadas como disseminadas (CARRIGAN et al., 1992; SHARMA et al., 2003;VILELA et al., 2010), sendo também responsáveispor infecções invasivas em humanos (WALSH et al., 1994; STEPHENS & GIBSON, 1997; SHARMA et al., 2003; TADANO et al., 2005; MADSON et al., 2009; KIMURA et al. 2011).
Esses fungos são saprofíticos, comumente encontrados no solo, em folhas secas e insetos em regiões de clima tropical e subtropical, possuem elevado grau de adaptabilidade expresso por suas características patológicas, biológicas e ecológicas (JAFFEY et al., 1990; MORRIS et al., 2001; SILVA et al., 2007a; SILVA et al., 2007b;BOABAID et al., 2008; VILELA et al., 2010).
Conidiobolus spp. são também termofílicos, crescem em Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) e Ágar Batata Dextrose (ABD) à temperatura de 22 a 37°C. No ASD as colônias apresentam-se esbranquiçadas ou pigmentadas com aspecto enrugado e formação de colônias satélites. Seu crescimento é rápido a 37°C, principalmente em amostras clínicas, quando comparadas com outras obtidas de fontes ambientais sugerem que este pode ser um fator de virulência deste organismo. Microscopicamente as hifas fúngicas possuem poucos septos, ramificações
irregulares econídios arredondados com diâmetro de 14-22 µm, paredes finas e papilas proeminentes (MORRIS et al., 2001; VILELA et al., 2010).
2.1.3 EPIDEMIOLOGIA
Apenas hipóteses foram levantadas com relação ao modo de transmissão do Conidiobolus, sendo a mais aceita, a inalação de esporos presentes no ambiente e fixação na mucosa nasal. Outras formas de transmissão incluem a implantação traumática dos esporos por picadas de insetos e/ou a inoculação dos esporos por plantas forrageiras pontiagudas que entram em contato com a cavidade nasal. (CARRIGAN et al.,1992; KETTERER et al., 1992).Devido ao fato da germinação do fungo ocorrer em níveis de umidade acima de 95%, a presença do fungo no ambiente está intensamente relacionada com o aumento do índice pluviométrico verificado principalmente nos períodos chuvosos( SILVA et al., 2007b).
Em humanos a zigomicose causada por fungos dos gêneros Basidiobolus e Conidiobolus são registradas em várias regiões geográficas tropicais. No Brasil há relatos na região Nordeste (COSTA et al., 1991), no Estado de Mato Grosso (TADANO et al., 2005) e no Pará (MORAES et al., 1994).Em ovinos, a enfermidade também têm ocorrido em rebanhos da região Nordeste e Centro-Oeste (SILVA et al., 2007a; SILVA et al., 2007b; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; Câmara et al., 2011), e esporadicamente em rebanhos do Rio Grande do Sul (PEDROSO et al., 2009b) e Santa Catarina (FURLAN et al., 2010).
No Piauí, SILVA et al., (2007b) demonstraram incidência anual média da doença de 2,8% e uma taxa de letalidade de 100% em ovinos naturalmente infectados. Na Austrália a conidiobolomicose ovina apresenta um índice de morbidade de 0,01 a 1% e atinge animais de todas as idades (CARRIGAN et al., 1992; KETTERER et al., 1992; MORRIS et al., 2001).
2.1.4 CONIDIOBOLOMICOSE EM OVINOS
Em ovinos a conidiobolomicose pode ocorrer na região rinofacial ou rinofaríngea, a localização da lesão estáinteiramente associada à apresentação dos sinais clínicos. O quadro de dispnéia e estertores é comum às duas formas clínicas (RIET-CORREA et al., 2008). Na forma rinofaríngea, os sinais clínicos caracterizaram-se principalmente por assimetria crânio-facial, exoftalmia unilateral devido à presença de uma massa ocupando a região da órbita e a perda da visão pode ou não ocorrer em consequência de ceratite e conjuntivite. Há secreção nasal que varia de serosa a mucosa e/ou hemorrágica. Sinais clínicos inespecíficos também ocorrem, assim como anorexia, febre, apatia, depressão e inapetência. Adicionalmente podem ocorrer sinais neurológicos, incluindo depressão, cabeça baixa, pressão da cabeça contra objetos e incoordenação motora (CARRIGAN et al., 1992; KETTERER et al., 1992; MORRIS et al., 2001; SILVA et al., 2007a; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; PEDROSO et al., 2009b).
Esta é uma doença geralmente fatal, atingindo animais de todas as idades (CARRIGAN et al., 1992; KETTERER et al., 1992; MORRIS et al., 2001; CÂMARA et al., 2011). O curso clínico da doença éde uma a cinco semanas.No entanto, as lesões sugerem que os sinais clínicos aparecem algum tempo após o início da infecção, sendoassociados, principalmente, com alterações obstrutivas nas vias nasais superiores (RIET-CORREA et al., 2008; BOABAID et al., 2008).O curso clínico e a morte do animal estão relacionados com os fatores de virulência do agente, susceptibilidade do hospedeiroe ausência de tratamento (SILVA et al., 2007b).
2.1.4.2 Macroscopia e histopatologia
Na forma rinofacial da doença, há uma massa granulomatosa localizada no vestíbulo nasal, regiãomuco-cutânea do plano naso-labial, pele do focinho, região proximal da face e palato duro (SILVA et al., 2007a; RIET-CORREA et al., 2008).Na forma rinofaríngea, há uma massa com aspecto semelhante, afetando a região etmoidal, conchas nasais, seios paranasais, palato mole e duro, órbita, faringe, músculos e linfonodos regionais. Nesta última, a extensão da lesão para a órbita causa exoftalmia e lesões oculares, que geralmente são unilaterais. Lesões rinocerebrais podem ocorrer devido à infiltração inflamatória a partir da lâmina
cribriforme nos ossos da caixa craniana e sistema nervoso central (SILVA et al., 2007b; BOABAID et al., 2008). É comum os animais apresentarem nódulos granulomatosos nos pulmões e linfonodos; mais raramente nos rins, fígado e vesícula biliar (CARRIGAN et al., 1992; SILVA et al., 2007b).
Histologicamente as lesões são caracterizadas por granulomas multifocais com áreas de necrose, infiltração por macrófagos, células gigantes, linfócitos, plasmócitos e neutrófilos. Frequentemente nota-se presença de hifas com dilatações balonosas, que são facilmente observadas em coloração com prata e metanamina (CARRIGAN et al., 1992; SILVA et al., 2007a; RIET-CORREA et al., 2008; BOABAID et al., 2008; PEDROSO et al., 2009b; FURLAN et al., 2010).
2.1.5 INFECÇÕES EM OUTRAS ESPÉCIES
Conidiobolomicose foi primeiramente descrita causando lesão granulomatosa nasal em um equino nos EUA (EMMONS & BRIDGES, 1961).A doença também foi descrita em cães (BAUER et al., 1997; GROOTERS, 2003), muares (JOHNSTON et al., 1967), golfinhos (MEDWAY, 1980), primatas (MIGAKI,et al., 1982), cervos (STEPHENS e GIBSON, 1997; MADSON et al., 2009) e lhamas (MOLL et al., 1992; FRENCH & ASHWORTH, 1994).
2.1.6 INFECÇÃO EM HUMANOS
O primeiro caso descrito foi na Jamaica (BRAS et al.,1963). A maioria dos indivíduos afetados são agricultores residentes em regiões tropicais e subtropicais, como a África (KHALIL et al., 1999), Índia (SHARMA et al., 2003), América do Sul (PÉREZ et al., 2004; BITTENCOURT et al., 2006),Turquiae China (YANG et al., 2010).
No Brasil Tadano et al., (2005) relataram um caso humano de zigomicose rinofacial causada por C. coronatus, no Estado do Mato Grosso. Adicionalmente, Moraes et al., (1994) relataram zigomicose em uma paciente no Estado do Pará.
Geralmente indivíduos imunossuprimidos são os mais susceptíveis (JAFFEY et al., 1990; WALSH et al., 1994), sendo a doença caracterizada por uma tumefação na mucosa das conchas nasais, seios paranasais e tecido subcutâneo do nariz,
atingindo os lábios. A lesão causa deformidade facial acentuada, principalmente nos casos mais crônicos (SHARMA et al., 2003; KIMURA et al., 2011).
2.2 Pitiose
2.2.1 DEFINIÇÃO
A pitiose é uma oomicose grave, cosmopolita, que ocorre em regiões de climas tropical, subtropical e temperado descrita em animais domésticos, silvestres e humanos (SANTURIO et al., 2006a).
2.2.2 ETIOLOGIA
P. insidiosum (DE COCK et al., 1987) pertence ao Reino Stramenopila, Filo Oomycota, Classe Oomycetes, Ordem Peronosporales e Família Pythiaceae. Seu ambiente natural é aquático com substrato orgânico e temperatura entre 30ºC e 40ºC (MENDOZA et al.,1996).
O gênero Pythium possui mais de 120 espécies, sendo a maioria habitante do solo e patógenos de plantas, enquanto apenas P. insidiosum é conhecido por causar doenças tanto em animais e no homem (DAVIS et al., 2006). A infecção por P. insidiosum é associada ao contato dos animais com água contaminada por zoósporos biflagelados, móveis e livres, que são atraídos por pêlos ou pele danificada. Uma vez fixados na ferida, se encistam e produzem o tubo germinativo que inicia a lesão (MENDOZA et al., 1993).
2.2.3 EPIDEMIOLOGIA
Embora a pitiose tenha sido reconhecida como cosmopolita, considera-se que o Pantanal brasileiro seja o local com a maior ocorrênciada doença (MENDOZA et al., 1996; SANTURIO et al., 1998; TABOSA et al., 2004; MONTEIRO LEAL et al., 2001; Martins et al., 2012).
A reprodução de P. insidiosum está relacionada com a produção de zoósporos, em ambiente aquático. Uma vez que os hospedeiros entram em contato
com água contendo zoósporos, estes realizam quimiotaxia a pêlos ou pele/mucosa justificando a localização anatômica das lesões em eqüinos, por exemplo, que é freqüentemente localizada nos membros e na porção ventral do abdomem (DE COCK et al., 1987, MENDOZA et al., 1993).
Estudos filogenéticos demonstraram que P. insidiosum se divide em três grupos divididos em regiões geográficas distintas do globo, e são chamadas de clusters: são conhecidos os clusters I, II e III. O Cluster I foi demonstrado em isolados das Américas (Costa Rica, Brazil, Haiti, EUA). O Cluster II consistiu em isolados da Asia (Índia, Thailandia, Japão e Papua Nova Guiné) e o Cluster III foi encontrado em amostras da Tailândia e EUA (SCHURKO et al., 2003; SUPABANDHU et al., 2007).
2.2.4. PITIOSE EM OVINOS
2.2.4.1 Sinais clínicos
Em ovinos há somente três relatos da doença, ambos no Brasil. O primeiro relato descrito por Tabosa et al., (2004) consistiu em dois surtos de doença cutânea em ovinos com acesso a água de açude no Estado da Paraíba. Esses animais apresentavam nódulos cutâneos ulcerados únicos ou múltiplos, na região dos membros, abdômen e/ou escápula. O outro caso semelhante foi relatado posteriormente por Silva et al., (2011) na mesma região.
No estado de Mato Grosso houve relato de ovinos com rinite granulomatosa rinofacial e úlcera de palato duro com fístulas oro-nasais (SANTURIO et al., 2008).
2.2.4.2 Macroscopia e histopatologia
Os ovinos com pitiose rinofacial apresentam aumento de volume na região nasal (SANTURIO et al., 2008) ou nódulos cutâneos (TABOSA et al., 2004). Histologicamente, as lesões são caracterizadas por áreas de necrose caseosa dfusa, multifocal ou coalescente, contendo grande quantidade de hifas intralesionais, infiltrado inflamatório com grande quantidade de eosinófilos, neutrófilos, e ocasionais
macrófagos, linfócitos e plasmócitos e raras células gigantes (TABOSA et al., 2004; SANTURIO et al., 2008).
2.2.5INFECÇÕES EM OUTRAS ESPÉCIES
A pitiose é mundialmente conhecida como doença em eqüinos e se manifesta de forma clássica como doença cutânea/subcutânea. A lesão é comumente descrita como feridas únicas e focalmente extensas constituídas por tecido fibroso abundante circundando massas amarelas, compactas e firmes (kunkers). Histologicamente, as lesões são caracterizadas por tecido conjuntivo fibroso, com múltiplas áreas com tecido de granulação jovem, circundando coleções de eosinófilos densas e grosseiramente circulares (correspondentes aos kunkers) (BROWN & ROBERTS, 1988; SALLIS et al.,2003;Martins et al., 2012).
Em cães a pitiose apresenta trêsformas distintas; a gastrointestinal (PEREIRA et al., 2010; RECH et al., 2004), cutânea (TROST et al., 2009) ou disseminada(RIVIERRE et al., 2005). Na forma gastrointestinal o achado macroscópico mais frequente é o espessamento do intestino delgado, com ou sem estenose (BENTINCK-SMITH et al., 1989; MENDOZA & NEWTON 2005), envolvendo outros órgãos do sistema digestivo (MENDOZA et al., 2003). O achado histológico principal é a inflamação multifocal piogranulomatosa/granulomatosa com fibrose acentuada, que acomete a lâmina própria, submucosa e muscular comprometendo a arquitetura do órgão (RECH et al., 2004).
Em bovinos a pitiose ocorre na forma cutânea (SANTURIO et al., 1998; GABRIEL et al., 2008; GRECCO et al., 2009; 1998; SILVA et al., 2011). Macroscopicamente observam-se espessamentos dérmicos ulcerados, multifocais, de tamanhos variados, localizados principalmente nos membros. As lesões cutâneas podem ou não estar ulceradas e podem apresentar secreção serossanguinolenta ou purulenta. Microscopicamente as lesões podem ser compostas por granulomas, piogranulomas ou como áreas amplas de necrose com inflamação mista (SANTURIO et al., 1998; SILVA et al., 2011). A cura espontânea é um achado clínico comumem bovinos com pitiose, fato que foi atribuído em parte à resposta imune/inflamatória diferente da observada em eqüinos, devido à maior quantidade
de macrófagos, menor quantidade de eosinófilos e ausência de kunkers (GABRIEL et al., 2008; GRECCO et al., 2009).
Em caprinos a pitiose foi descrita recentemente na forma cutânea, envolvendo os membros anteriores, sendo macroscópicamente caractrizada por aumento de volume,áreas de ulceração com presença de material amarelado de aspecto granular (SILVA et al., 2011).
P. insidiosum foi também associado a doenças em animais silvestres, como onça-pintada (Panthera onça), tigre-de-bengala (Panthera tigris tigris) (BUERGELT et al., 2006), caraúna-de-cara-branca (Plegadis chihi) (PESAVENTO et al., 2008),e dromedários (Camelus dromedarius) (CAMUS et al., 2004; VIDELA et al., 2012).
2.2.6 INFECÇÃOEM HUMANOS
A pitiose humana tem quatro formas clínicas descritas, sendo elas, vascular, ocular, cutânea/subcutânea e disseminada, em ordem decrescente de ocorrência (KAJAEJUN et al., 2006).
A maioria dos casos de pitiose humana foi observada na Tailândia, e esporadicamente, em outros países (MENDOZA et al., 1996; KRAJAEJUN et al., 2006; PUPAIBOOL et al., 2006). No Brasil há somente um relato em humano, diagnosticado no Estado de São Paulo. A posterior investigação permitiu isolamento de microorganismo compatível com P. insidiosum que foi confirmado por PCR e seqüenciamento compatível com cluster I (BOSCO et al., 2005).
2.3 Diagnóstico de Infecções fúngicas
O diagnóstico de infecções fúngicas é tradicionalmente confirmado através doisolamento dos agentesutilizando-se técnicas micológicas clássicas (CHANDLER et al., 1980; SCHWARZ, 1982). Dados epidemiológicos, clínicos e patológicos são importantes indicadores para auxílio diagnóstico (GROOTERS, 2003; SHARON, 2007). Dificuldades em diagnósticar infecções fúngicas possibilitam o rápido curso da doença e contribuem para o aumento da mortalidade (SILVA et al., 2007b).
O isolamento de agentes fúngicosrequertempo e às vezes apresenta uma baixa sensibilidade e/ou especificidade. Agentes contaminantes secundários
dificultam a realização e interpretação dessa técnica, ocasionando frequentemente um resultadofalso negativo (GOTTFREDSSON et al., 1998; RIBES et al., 2000; GROOTERS et al., 2002).
O diagnóstico de pitiose pode ser complementado pela técnica de zoosporogênese in vitro (PEREIRA et al., 2008). Adicionalmente, o exame direto com esfregaços diretamente de lesões pode ser realizado utilizando-se solução deHidróxido de Potássio (KOH) 10% ou azul de algodão. O resultado positivo consiste em detectar imagens de hifas esparsamente septadas com freqüentes ramificações e ângulos retos, compatíveis com P. insidiosum (GAASTRA et al., 2010).
O exame histopatológico através da coloração de hematoxilina e eosina representa um método auxiliar no diagnóstico de pitiose uma vez que possui características morfológicas distintas. Técnicas especiais como impregnação pela prata, utilizadas de forma freqüente pelos laboratórios de patologia possibilitam a visualização das hifas no interior das lesões (GROOTERS, 2003).
O método imuno-histoquímico auxilia e suporta um diagnóstico rápidoe eficaz, sendo relatado pela primeira vez em casos de pitiose por Brown et al., (1988) e posteriormente utilizada por vários autorespara o diagnóstico em outras espécies de animais (REIS JR. et. al., 2002; TROST et al., 2009; GABRIEL et al., 2008). A possibilidade de utilização de tecidos fixados em formol e embebidos em parafina tornou-se uma vantagem desta técnica, uma vez que permite estudos epidemiológicos em arquivos de laboratório de diagnóstico (PEDROSO et al., 2009a).
Adicionalmente, esforços têm sido realizados na produção de um anti-C. lamprauges policlonal em coelho por equipes de pesquisadores da Universidade Federal de Mato Grosso, que obtiveram sucesso e descreveram o método pela primeira vez (UBIALI et al., 2011).
Outros exames laboratoriais como hemograma, proteinograma, parâmetros bioquímicos e enzimáticos revelaram alterações características em ovinos comconidiobolomicose (BATISTA et al., 2009).
Recentemente o desenvolvimento de testes moleculares rápidos e sensíveis comoa Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) tem sido empregada como teste diagnóstico para a detecção do DNA de fungos das mais variadas espécies, a partir
da amplificação de regiões altamente conservadas e específicas de fungos como a região 18S rRNA (RIBES et al., 2000; DE PAULA et al., 2010). A PCR de sequências que codificam o gene 18S rDNA são utilizadas na diferenciação de infecções causadas por outros fungos patogênicos. Vilela et al., (2010) descreveram a taxonomia e a filogenia dos isolados de C. lamprauges de ovinos com a forma rinofaringea da doença.
Dentre as vantagens da PCR, ressalta-se sua maior sensibilidade quando comparada ao cultivo micológico. Diversos laboratórios têm utilizado a PCR em rotinas de diagnóstico. Entretanto, devido ao alto grau de contaminação bacteriana em tecidos como pele e órgãos do sistema alimentar (tecidos comumente infectados por P. insidiosum), sugere-se cautela na interpretação das amplificações quando utilizada como única forma de diagnóstico (GROOTERS & GEE, 2002; REIS et al., 2003; VANITTANAKOM et al., 2004; BOSCO et al.,2008).
Os exames sorológicos disponíveis capazes de detectar anticorpos anti-Conidiobolus, são de simples execução, e possibilitam a detecção de infecções precoces ou ainda subclínicas (MENDONZA e ALFARO, 1985; KAUFMAN et al., 1990; RIBES et al., 2000). Kaufman et al., (1990) descreveram o teste de imunodifusão para o soro-diagnóstico das zigomicoses causadas por Basidiobolus ranarum e C. coronatus em humanos e animais. Para detecção de anticorpos anti-P. insidiosum pode-serealizar imunodifusão. (MENDOZA et al., 1986, PRACHARTAM et al., 1991), Ensaio Imuno Enzimático (ELISA) (SANTURIO et al., 2006b) ou Western blot (GAASTRA et al., 2010).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção das amostras
Durante o período Janeiro de 2006 a Agosto de 2011 foi realizado exame clínico e patológico em 30 ovinos com doença nasal crônica. Os animais tiveram origem em nove propriedades nos municípios de Alto Paraguai, Barão de Melgaço, Nobres, Poconé, Santo Antônio do Leverger e Sinop no Estado de Mato Grosso, Brasil.
3.2 Procedimentos de necropsia e histopatologia
A necropsia foi realizada em ovinos que morreram em decorrência dos sinais clínicos ou em animais que foram submetidos à eutanásia in extremis. Durante a necropsia a cabeça foi seccionada médio-sagitalmente e as alterações macroscópicas foram classificadas em: 1) lesões rinofaríngeas, evolvendo a região etmoidal, conchas nasais, seios paranasais, palato duro e mole; ou 2) lesões rinofaciais, envolvendo a região rostral da cavidade nasal, conchas nasais, junção mucocutânea, lábio superior e pele da face (RIET-CORREA et al., 2008).
Fragmentos da lesão nasal e amostras de linfonodos submandibulares, retrofaríngeos e mediastínico, encéfalo, coração, pulmões, fígado, rins, baço, pré-estômagos, abomaso, intestinos, bexiga, parótida, músculo masseter, língua, traquéia e esôfagoforam acondicionadas em formalina 10%, processados em gradientes de álcool e xilol, embebidos em parafina e corados pela hematoxilina-eosina (HE). Secções foram selecionadas para impregnação pela prata (GMS), ácido-periódico de Schiff (PAS) e azul de toluidina (AT) (PROPHET et al., 1992). Adicionalmente, morfometria das imagens das hifas foram avaliadas segundo Miller & Campbell (1984) sendo os valores de diâmetro submetidos à análise de variância e teste de médias utilizando o software SAEG2007.
Fragmentos da região nasal (n=27) foramsubmetidos ao isolamento. Osfragmentos foram coletados lavados em solução salina estéril acrescida de antibiótico (ampicilina 50mg/L), macerados e semeados em placas de petri e tubos contendo Agar Sabouraud Dextrose 2% (ASD - glicose 20 g; peptona 10 g; ágar 18 g; água destilada qsp 1000 ml; pH 5,0), ASD acrescido de cloranfenicol (0,05g/L) e incubadas a 30°C e 37°C por até 7 dias.
A caracterização morfológica foi realizada através do exame direto em lâminas pela coloração com Azul de Algodão (Grooters et al., 2002; Vilela et al., 2010).
3.4 Imuno-histoquímica
Para detecção de P. insidiosum utilizou-se anticorpo primário policlonal (anti-P. insidiosum) produzido no Laboratório de Pesquisas Micológicas da Universidade Federal de Santa Maria. A produção de anti-P. insidiosum foi obtida pela inoculação subcutânea de zoósporos de P. insidiosum em coelhos. Após 45 dias da inoculação foi realizada a coleta de sangue dos animais e obtenção do soro (PEREIRA et al., 2007). A quantificação de anti-P. insidiosum no soro foi determinada utilizando-se o teste de ELISA (SANTURIO et al., 2006b).
Para detecção de C. lamprauges padronizou-se a técnica de imuno-histoquímica. Utilizou-se anticorpo primário policlonal (anti-C. lamprauges) produzido em coelho no Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso. O antígeno foi preparado a partir de cultura pura de C. lamprauges, previamente submetido à técnica de PCR segundo De Paula et al., (2010). Amostras desta cultura foram acondicionadas em caldo ASD, incubadas por 30 dias a 25°C com agitação constante. Após, a colônia foi inativada com (solução de ácido tricloroacético) TCA sendo posteriormente filtrada. Doses semanais de exoantígeno acrescido de adjuvante de Freund foram aplicadas por via subcutânea. Após a sétima inoculação realizou-se a coleta de sangue e a obtenção do soro (YANGCO et al., 1986). A presença de anti-C. lamprauges no soro dos coelhos foi testada pela técnica de imunodifusão (KAUFMAN et al., 1990).
Para detecção de P. insidiosum e C. lamprauges utilizou-se o método biotina-streptavidina conjugada com fosfatase alcalina. A recuperação antigênica
empregada foi tampão citrato e calor durante três minutos e Proteinase K durante 7 minutos. O anti-C. lamprauges foi diluído em uma concentração de 1:3000, e incubado em estufa a 37°C durante três horas. O anti-P. insidiosum foi diluído em concentração de 1:1000. O cromógeno utilizado foi permanente vermelho (Dako) e contra corado com Hematoxilina de Mayer (PEDROSO et al., 2009a; UBIALI et al., 2011).
3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Para a extração de DNA dos isolados e tecidos frescos, o material foi macerado em nitrogênio líquido (DOYLE & DOYLE, 1987). As amostras fixadas em formol e embebidas em parafina foram inicialmente lavadas com xilol seguido de extração pelo método fenol-clorofórmio (SAMBROOK & RUSSEL,2001).
Na PCR foram utilizados os pares de oligonucleotídeos que codificam sequência ITS1 do gene ribossomal de P. insidiosum (GROOTERS & GEE, 2002) e oligonucleotídeos que codificam a sequência parcial do gene 18S rRNA de C. lamprauges (DE PAULA et al., 2010), que amplificam 120 pb e 540 pb respectivamente.
Os produtos de amplificação foram analisados em eletroforese em gel agarose 1,5% à 100 V por cm. Como marcador de massa molecular utilizou-se o padrão 100 pb DNA Ladder (Fermentas).
4 RESULTADOS
Todos ovinos deste estudo (n=30) apresentaram rinite sugestiva de infecção fúngica. A idade dos animais variou entre seis mesese cinco anos (média 2,75 ± 3,18), dos quais 25 eram da raça Santa Inês.Dos 30 ovinos com rinite micótica 50% (15/30) foram infectados por C. lampraugese 50% (15/30) foram infectados por P. insidiosum.Os dados epidemiológicos e o diagnóstico estão resumidos na Tabela 1.
Das 27 amostras encaminhadas para o isolamento, 8 (29,6%) foram positivas para C. lamprauges e 4 (14,8%) foram positivas para P. insidiosum. As colônias foram morfologicamente compatíveis com as descrições relatadas por outros autores
(GROOTERS et al., 2002; VILELA et al., 2010). Os dados de isolamento e resutados da IHQ e PCR estão dispostos na Tabela 2.
4.1 Conidiobolomicose
Das 15 lesões examinadas macroscopicamente, 86.7% (13/15) foram classificadas como rinofaríngea. Clinicamente, os animais apresentavam exoftalmia, ceratite e ulceração corneal unilateral associada com assimetria crânio-facial (Figura 1A) e secreção nasal serossanguinolenta ou mucossanguinolenta. Frequentemente as lesões invadiam a região etmoidal, conchas nasais e lâmina cribriforme e era caracterizada por uma massa amarelo-esbranquiçada com superfície irregular e lisa, consistência firme com dimensões médias de 5 a 13 cm crânio-caudalmente e 3-8 cm dorso ventralmente (Figura 1B).
Em 23% (3/13) dos ovinos, houve envolvimento da lâmina cribriforme e a lesão invadiu o bulbo olfatório no telecéfalo frontal, apresentando sinais clínicos de depressão severa. Em 46,1% (6/13) dos ovinos havia lesão pulmonar, sendo caracterizada por nódulos amarelo-esbranquiçados multifocais com consistência firme e medindo 0,5-2 cm de diâmetro. Em 23% (3/13) dos ovinos os linfonodos regionaisestavam aumentados em volume, com consistência firme e superfície de corte úmida. Adicionalmente, lesões similares foram localizadas no fígado e abomaso em 15,3% e 7,7%, respecivamente.
Dois ovinos 13,3% (2/15) infectados por C. lamprauges tiveram a forma rinofacial da doença, caracterizada por aumento de volume crânio rostral unilateral com acometimento da narina, lábio superior e pele da face (Figura 1C). Havia também úlceras extensas (5cm de diâmetro) no palato duro, extendendo-se desde o pulvino dental até os primeiros premolares. A área ulcerada apresentou superfície lisa e coloração rósea.
A secção médio-sagital da cabeça revelou uma massa esbranquiçada, lisa, firme e brilhante (semelhante à massa encontrada na região rinofaríngea dos outros 13 ovinos) causando estenose das narinas com envolvimento das conchas nasais, extendendo-se desde a junção mucocutânea até o interior da cavidade nasal (Figura 1D). Havia nódulos pulmonares semelhantes aos observados nos casos rinofaríngeos. Os demais órgãos não apresentaram alterações macroscópicas.
2 8 T a b e la 1 .D a d o s e p id e m io ló g ic o s e d ia g n o s ti c o d e o v in o s c o m r in it e c a u s a d a p o r C o n id io b o lu s l a m p ra u g e s o u P y th iu m i n s id io s u m . E ti o lo g ia R a ç a S e x o Id a d e ( a n o s ) M u n ic íp io S a n ta In ê s B e rg a m a s c ia S R D F M 0 -1 1 2 3 4 5 A lt o P a ra g u a i B a rã o d e M e lg a ç o N o b re s P o c o n é S in o p S t. A n t. L e v e rg e r P . in s id io s u m 1 1 3 1 1 1 4 1 4 2 3 5 0 8 5 0 2 0 0 C . la m p ra u g e s 1 4 0 1 1 5 0 1 2 3 4 3 2 2 0 6 3 1 3 T o ta l S t. A n t. L e v e rg e r = S a n to A n tô n io d o L e v e rg e r T a b e la 2 . R e s u lt a d o s d e I s o la m e n to d o a g e n te , im u n o -h is to q u ím ic a e P C R o b ti d o s d e o v in o s c o m r in it e m ic ó ti c a . E ti o lo g ia T o ta l Is o la m e n to IH Q P C R C . la m p ra u g e s P . in s id io s u m C . la m p ra u g e s P . in s id io s u m C . la m p ra u g e s P . in s id io s u m C . la m p ra u g e s 1 5 8 0 1 5 0 1 2 0 P . in s id io s u m 1 5 0 4 0 1 4 7 1 1
FIGURA 1:Ovino. Conidiobolomicose rinofaríngea. A. Exoftalmia unilateral direita acentuada, ceratite e úlcera de córnea. B. Secção médio-sagital evidencia uma massa irregular, de coloração amarelo-esbranquiçada, firme e com superfície lisa e brilhante na região caudal da cavidade nasal, se extendendo na faringe, palato mole, lâmina cribriforme, conchas nasais até a porção média da cavidade nasal. C. Ovino. Conidiobolomicose rinofacial. Aumento de volume da narina esquerda, lábio superior e pele da face. D. Secção médio-sagital dacabeça evidencia uma massa esbranquiçada, firme, irregular e proliferativa se extendendo da porção média da cavidade nasal, até a região subcutânea rostral. Observa-se também extensa área de ulceração na região do palato duro.
Histologicamente, as lesões foram caracterizadas como rinite granulomatosa com proliferação de fibroblastos, grande quantidade de células gigantes (Figura 2 A,B), proliferação endotelial vascular, infiltrado inflamatório predominantemente composto por células mononucleares incluindo principalmente macrófagos, linfócitos, plasmócitos (Figura 2 C,D). Áreas multifocais de necrose com material eosinofílico amorfo correspondendo ao fenômeno Splendore-Hoeppli com ampla variação de intensidade foram vistas circundando estruturas compatíveis com hifas não coradas pelo HE (Figura 2
E,F). O coágulo eosinofílico correspondente aomaterial Splendore-Hoeppli frequentemente estava circundado por inúmeras células gigantes multinucleadas, moderada quantidade de neutrófilos e poucos eosinófilos. Adicionalmente foram visto pequenos trombos, hiperemia e fibrose extensa.
Através da coloração GMS as hifas foram vistas predominantemente no interior da reação de Splendore-Hoeppli1 e em moderada quantidade no interior de células gigantes multinucleadas. As hifas apresentaram-se esparsamente septadas, com paredes não-paralelas, com pouca ramificação lateral e largura variando entre 5,5 a 11,4µm com dilatações balonosas (21,3-37,1µm de diâmetro). Ambas as colorações, PAS e TB foram negativas em todos os casos.
4.2 Pitiose
Macroscopicamente 93.3% (14/15) dos ovinos apresentaram a forma rinofacial da doença (Figura 3 A,C). Em 42.8% (6/14) dos ovinos, os principais sinais clínicos foram caracterizados por deformidade facial devido ao aumento de volume naso-rostral. Em 21.4% (3/14) dos ovinos observou-se dificuldade respiratória severa caracterizada por dispneia, com estertores e momentos de apneia. Mais frequentemente, notou-se depressão e anorexia moderada.
A secção médio-sagital da cabeça desses 14 ovinos revelou uma massa marrom-avermelhada, friável e de odor fétido correspondente à rinite necrosante que extendia-se desde a região mucocutânea até 12 cm para o interior da cavidade nasal (Figura 3 B,D) causando obstrução parcial. Em 35,7% (5/14) dos ovinos com pitiose rinofacial foram observados úlcera de palato duro, variando de 1-5 cm em diâmetro, com fístula oro-nasal contendo tecido necrótico e conteúdo alimentar. Adiconalmente perda de tecido ósseo do palato com substituição por uma massa necrótica foi observada, sendo que em um caso havia também comprometimento nos ossos maxilar e nasal.
1
Splendore-Hoeppli é um fenômeno morfológico presente em processos inflamatórios, caracterizado por um coágulo eosinofílico frequentemente encontrado circundando determinados agentes infecciosos sendo facilmente visualizadas em secções coradas por HE.
Ocasionalmente, notou-se presença de múltiplas estruturas firmes, irregulares, amareladas e cilíndricas semelhantes à kunkers com 1-5 mm de diâmetro, que permitiram ser facilmente removíveis do tecido de origem. Lesões também foram observadas nos linfonodos submandibulares e na glândula parótida em 40% (6/15) e 20% (3/15) dos ovinos, respectivamente. Ambos apresentaram macroscopicamente necrose caseosa central observada através da superfície de corte. Em 6,6% (1/15) dos ovinos o pulmão apresentava nódulos firmes variando em tamanho entre 1-4 cm de diâmetro.
Somente 6,6% (1/15) dos ovinos apresentaram a forma rinofaríngea da doença caracterizada por uma massa ulcerada de coloração marrom-avermelhada que se extendia desde a região etmoidal até a borda ventral da lâmina cribriforme. Os demais órgãos não apresentaram alterações histológicas significativas. As principais alterações macroscópicas estão listadas na Tabela 3.
FIGURA 3:Ovinos.Pitiose rinofacial. A. Nota-se aumento de volume naso rostral bilateral, moderado. B. Secção médio-sagital da cabeça evidenciando extensa área necrótica extendendo-se da concha nasal ventral à pele da face, evidenciando massa marrom e friável C. Quadro avançado de deformidade crânio-facial com acometimento da pele da face. D. Secção médio-sagital da cabeça demonstrando acometimento das conchas nasais, pele da face, ossos do palato, maxilar e nasal.
FIGURA 2: Tecido nasal de ovino com conidiobolomicose. A.Proliferação de tecido conjuntivo fibroso difusa moderada e infiltrado inflamatório mononuclear com inúmeras células gigantes multinucleadas. HE, obj 10x. B. Imagens de hifas sendo fagocitadas por células gigantes multinucleadas circundadas por proliferação de tecido conjuntivo fibroso. HE, obj 40x. C e D. Inúmeras células gigantes multinucleadas ao redor de infiltrado de linfócitos. Nota-se no interior das células gigantes imagens negativas de hifas fúngicas (setas). HE, obj 40x.E. Inúmeras hifas (setas) com paredes não coradas ficaram evidenciadas em meio a coágulo amorfo de material Splendore-Hoeppli circundado por células gigantes multinucleadas e infiltrado inflamatório mononuclear. HE, obj 40x. F. Nesta secção observa-se dilatação balonosa de hifas fúngicas (setas) e material Splendore-Hoeppli (cabeças de setas) eosinofílico multifocal. HE, obj 40x.
Tabela 3. Alterações macroscópicas em casos de rinite por Conidiobolus lamprauges e Pythium insidiosum.
Achado macroscópico C. lamprauges P. insidiosum
Localização da massa na cabeça
Rinofacial + +++ Rinofaríngea +++ + Aspecto da massa Necrótica e friável 0 +++ Consistência firme +++ 0 Aumento de linfonodos
Consistência firme na superfície de corte ++ 0
Consistência macia/ necrose na superfície de corte 0 ++
Úlcera de palato duro + +++
Osteólise de osso do palate duro/maxilar 0 ++
Envolvimento da lâmina cribriforme/córtex frontal ++ 0
Envolvimento da parótida 0 +
Pulmão: nódulos amarelo-esbranquiçados ++ +
Úlcera de abomaso + 0
Fígado: nódulos amarelados + 0
0 = ausente; + = leve; ++ = moderado; +++ = acentuado.
Histologicamente, rinite por P. insidiosum (n=15) foi caracterizada por necrose caseosa acentuada e difusa, algumas vezes multifocal ou coalescente, com estruturas representando hifas, não coradas pelo HE, e circundadas por coágulo eosinofílico e granular correspondente com o fenômeno Splendore-Hoeppli localizado no interior da área de necrose (Figura 4 B,C,D). Ocasionalmente notou-se presença de kunkers em secções histológicas (Figura 4 A). Circundando a área de necrose havia intensa infiltração de eosinófilos e ocasionais linfócitos e plasmócitos (Figura 4 E). Em secções observadas em maior aumento (objetiva 100x), notou-se que o material Splendore-Hoeppli era composto por grânulos eosinofílicos circundando as imagens compatíveis com hifas, com inúmeros eosinófilos degranulados (Figura 4 F). Proliferação de tecido fibroso foi observada circundando as áreas de necrose com agregados de macrófagos e raras células gigantes multinucleadas. Infiltração moderada de neutrófilos foi notada circundando a área de necrose e ocasionalmente notou-se presença de trombos. Frequentemente o epitélio nasal estava ulcerado e a superfície estava coberta por fibrina e colônias bacterianas. O tecido ósseo revelou área extensa de necrose peritrabecular e reabsorssão osteoclástica. Os linfonodos e a glândula
parótida apresentaram infiltrado inflamatório misto, necrose caseosa com imagens de hifas.
Na coloração GMS do tecido nasal havia grande quantidade de hifas com parede espessa, esparsamente septadas, 3,9-5,15µm de largura, com ramificação lateral e paredes quase paralelas frequentemente encontradas no interior da reação Splendore-hoeppli ou no interior de células musculares esqueléticas necróticas.
As colorações de PAS e AT foram negativas em todas as amostras testadas. Na tabela 4 estão resumidos os achados histológicos das infecções por C. lamprauges e P. insidiosum.
4.3 Imuno-histoquímica
Todos os casos (n=15) de rinite por C. lamprauges apresentaram marcação positiva na imuno-histoquímica. As hifas foram visualizadas principalmente no interior de células gigantes (Figura 5 D), ou em meio do material Splendore-Hoeppli.
Das 15 amostras testadas para P. insidiosum pela imuno-histoquímica, 14 (93,3%) foram positivas sendo a maracação localizada principalmente em áreas de necrose (Figura 6 D) ou em meio ao material Splendore-Hoeppli. Em ambas reações a coloração de fundo (background) foi mínima.
4.4 PCR
Das 15 amostras testadas, 12 (80%) apresentaram amplificação de um fragmento de 540 pb, compatível com C. lamprauges (DE PAULA et al., 2010).E para pythium insidiosum, das 15 amostras testadas, 11 (73,3%), resultaram em amplificação de um fragmento de 120 pb compatível com o produto esperado (GROOTERS & GEE, 2002).
Tabela 4. Histopatologia comparada de infecção por Conidiobolus lamprauges e Pythium insidiosum em ovinos.
Achodo histológico Conidiobolomicose Pitiose Necrose
Distribuição Multifocal Difusa
Intensidade ++ +++
Hifas
Largura 5.5-11.4 µm 3.9-5.1µm
(média) 8.3µm 4.4 µm
Grau de septação Esparso Esparso
Espessura da parede Fina Espessa
Grau de paralelismo de parede Não-paralelas Quase paralelas Diâmetro da dilatação bulbosa 21.3-37.1µm
0 (média) 32,6 µm Splendore Hoeppli (SH) ++ ++ Zona Peri-SH Polimorfonucleares 0 +++ Mononucleares ++ 0 Tecido conjuntivo Macrófagos +++ ++ Macrófagos epitelióides +++ ++ Células gigantes +++ + Linfócitos +++ + Plasmócitos +++ + Neutrófiloss + +++ Eosinófilos + +++ Mastócitos 0 + Edema + ++ Fibrose +++ ++ Fibrina 0 ++ Proliferação vascular +++ ++ Hemorragia ++ ++ Hiperemia ++ +++ Trombos + ++ Ulcerações + +++
Necrose de fibras musculares 0 +++
Metaplasia do epitélio respiratório ++ +
Osteólise 0 ++
Bactéria 0 ++
FIGURA 4: Tecido nasal de ovino com pitiose. A. Kunker representado por uma área focal e necrose circundada por infiltrado inflamatório polimorfonuclear e tecido fibroso na periferia. HE, Obj. 10x. B. Músculo esquelético. Necrose de miofibras com presença de infiltrado inflamatório polimorfonuclear. HE, Obj 20x. C. Área de necrose com imagens tubuliformes não coradas circundadas por material Splendore-Hoeppli granular e infiltrado inflamatório polimorfunclear com predomínio de eosinófilos. HE, Obj 40x. D. Músculo esquelético. Necrose de miofibras contendo imagens tubuliformes negativas em seu interior (setas) circundado por infiltrado inflamatório misto. HE, Obj 40x E. Eosinófilos degranulados e necróticos entremeados ao material Splendore-Hoeppli. HE, Obj 40x E. Evidencia-se o aspecto granular do material Splendore-Hoeppli (seta) em meio a infiltrado de eosinófilos e fragmentos de hifas não coradas. HE, Obj 100x.
FIGURA 4: A. Colônia de C. lamprauges cultivada em ágar Sabouraud Dextrose à 37°C isolada de ovino com conidiobolomicose apresentando coloração creme e superfície rugosa. B.Hifas com paredes finas, não paralelas, dilatação balonosa com papilas arredondadas. Azul de algodão, obj 40x. C.Tecido nasal.A impregnação pela prata evidenciou hifas com paredes finas, não paralelas, esparsamente septadas com dilatações balonosas terminais. GMS, 40x. D.Tecido nasal. Hifas de C. lamprauges fortementes marcadas no interior de células gigantes multinucleadas. Nota-se em algumas hifas a dilatação balonosa característica. IHQ (método estreptavidina-biotina fosfatase-alcalina), Obj 40x.
FIGURA 6: A. Colônia de P. insidiosum cultivada em ágar Sabouraud Dextrose à 37°C isolada de ovino com pitiose. Apresenta coloração creme, aspectoliso e fortemente aderida ao ágar. B. Crescimento micelial do oomiceto isolado revelando hifas com paredes quase paralelas semelhante à micélio fúngico. C. Tecido nasal. Hifas fortemente marcadas com paredes espessas, quase paralelas espalhadas na lesão nasal. GMS, 40x. D. Tecido nasal. Hifas de P. insidiosum fortementes marcadas evidenciando-as em meio à tecido necrótico. IHQ (método estreptavidina-biotina fosfatase-alcalina), Obj 40x.
5 DISCUSSÃO
A dificuldade de distinguir infecções causadas por zigomicetos das causadas pelo oomiceto P. insidiosum é largamente discutida (GROOTERS, 2003; MILLER & CAMPBELL 1984; VANITTANAKOM et al.,2004; MENDOZA & NEWTON 2005; SHARON, 2007; BOSCO et al., 2008) em parte, por ambos agentes habitarem em ambientes úmidos e quentes e por apresentarem sinais clínicos semelhantes(BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA ET AL., 2008; SANTURIO et al., 2008; PORTELA et al., 2010; VILELA et al., 2010).
Casos de infecção por C. lamprauges como causa de riniteem ovinos sãofrequentemente diagnosticadosem diferentes estados brasileiros,observando-se uma maior freqüência nas regiões Nordeste e Centro-Oeste(SILVA et al., 2007a; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; SANTURIO et al., 2008; PEDROSO et al., 2009b; PORTELA et al., 2010; CÂMARA et al., 2011; DE PAULA et al., 2010; FURLAN et al., 2010).
Rinite causada por C. lamprauges na maioria das vezes envolve a região etmoidal e estruturas adjacentes,geralmente apresentandomassas irregulares, firmes, as vezes brilhantes, de coloração branco-amarelada que proliferam no interior do epitélio nasal.Em contraste, a rinite causada por P. insidiosum freqüentemente afeta o tecido subcutâneo, vestíbulo nasal e palato duro, sendo tipicamente caracterizado pela presença de tecido friável, necrótico e acastanhado. Embora, ambos agentes etiológicos possam também produzir danos teciduais, em ambas as regiões, rinofacial e rinofaríngea, observamos no presente estudo que a localização eo tipo de lesão pode contribuir com o diagnóstico diferencial.
Aspectos morfológicossignificativos de ambas as doenças foram identificados no presente trabalho. As lesões de pitiose em ovinos foram semelhantes aos descritos na literatura. No entanto, um dos aspectos mais importantes observados, foi o padrão acentuado de necrose caseosacontendo no hifasintralesionais epresença de grande quantidade de eosinófilos em torno da região de Splendore-Hoeppli (TABOSA et al., 2004; SANTURIO et al., 2008). Embora o papel dos eosinófilos na resposta imune da pitiose em ovinos ainda não esteja elucidada, uma variedade de funções como fagocitose,
redução da resposta anafilática, dano direto ao agente (Munitz & Levi-Schaffer, 2004) e formação de necrose (Martins et al., 2012) têm sido apontados.
Por outro lado, os casos de infecção por C. lamprauges apresentaram um padrão granulomatoso multifocal, sendo as células gigantes multinucleadas e macrófagos o principal componentecelular, presentetipicamenteem infecções por fungos da ordem Entomophthorales,sugerindo que (CARRIGAN et al., 1992; SILVA et al., 2007a; FURLAN et al., 2010; CÂMARA et al., 2011) ambas doenças apresentam padrões morfologicamente distintos.
Na infecção por C. lamprauges, moderado comprometimento vascular foi visualizadona maioria das lesõesnasais, indicando a propagação hematógena do agente para outros órgãos, como observado no pulmão (53,3%) sendo similar aos verificados por outros autores (RIET-CORREA et al. 2008; PEDROSO et al., 2009b; FURLAN et al., 2010; CÂMARA et al., 2011). Adicionalmente, sinais clínicos caracterizados por dificuldade respiratória foram observados na maioria dos animais, levantando a hipótese que o desprendimento de fragmentos dalesão na região nasal pudesse deslocar para os pulmões, resultando em uma resposta inflamatória nas vias aéreas (SILVA et al., 2007b).
Outra alteração microscópica significativa foi relacionada à morfologia e tamanho das hifas fúngicas. As hifas deP. Insidiosum apresentaram paredes quase paralelas, variando de 3,9-5,1 µm de diâmetro. Em contraste, as hifas de C. lamprauges possuiam as paredes irregulares,apresentando 5,5-11,4 µm de diâmetro, com dilatação balonosa característica dos fungos da Ordem Entomophtorales. Embora ambas os tipos de hifas pudessem ser visualizadas na coloração de HE e serem também fortemente marcadas na impregnação pela prata (GMS), as hifas de P. Insidiosum não foram observadas na coloração de PAS.A técnica do PAS, amplamente utilizada na identificação de fungos, geralmente não cora as hifas de P. insidiosum (GROOTERS, 2003) e essa falha na coloração provavelmente ocorre porque, diferentemente dos fungos, a parede celular dos oomicetos não contém quitina (HENDRIX, 1964), substância que é demonstrada pela técnica do PAS (Martins et al., 2012).
Em nosso estudo, a coloração AT também foi negativa nas lesões causadas por ambos agentes, contrastanto com os resultados previamente descritos em equinos com pitiose (Martins et al., 2012).
O diagnóstico de infecções fúngicasé realizado através dos sinais clínicos, achados macroscópicos e histopatológicos e confirmados com base na cultura dos organismos, imuno-histoquímica e PCR (CHANDLER et al., 1980; GROOTERS, 2003; SHARON, 2007; BOABAID et al., 2008; RIET-CORREA et al., 2008; DE PAULA et al., 2010; VILELA et al., 2010; Martins et al., 2012). No presente estudo, a utilização da imuno-histoquímica permitiu diferenciar infecção entre C. lamprauges e P. insidiosum nas amostras analisadas, sendo considerada uma ferramenta importante no estabelecimento do diagnóstico. Uma das vantagens do processo de IHQ é a sua capacidade de fornecer um diagnóstico rápido e preciso, em comparação com oscultivos micológicos, que normalmente leva tempo e requer a experiência de um micologista. Adicionalmente, os dois anticorpos utilizados não demostraram reação cruzada, justificada em parte, pela distância taxonômica entre os organismos e suas diferentes composições da parede celular (HENDRIX, 1964; DIETRICH, 1973; SHIPTON et al., 1982; BOSCO et al., 2008; DE PAULA et al., 2010; VILELA et al., 2010;). Para recuperação antigênica, o uso de uma enzima proteolítica (proteinase K) e tampão citrato e calor através do microondas foram empregados em nosso protocolo de IHQ. Embora os mecanismos responsáveis pelas propriedades proteolíticas de enzimasnão estejamtotalmente compreendidas, a adição de proteinase K no procedimento aumentou a especificidade da reação (JACKSON & DAVID, 2007).
A PCR é frequentemente utilizada como ferramenta confiável e alternativa de diagnóstico. No presente estudo, a sensibilidade da PCR foi menor que a da imuno-histoquímica, sugerindo que a parafina ea duração da fixação em formalina podem afetar o processo (CHUNG et al., 2008).
Em resumo, as alterações morfológicas em ovinos com rinite por C. lamprauges e P. Insidiosum apresentam características macroscópicas e histológicas distintas. Os laboratórios de diagnóstico devem estar atentos para estes achados morfológicos, contribuindo para um diagnóstico histopatológico mais preciso, uma vez que nem sempre é possivel a realização de exames confirmatórios.
6 CONCLUSÕES
1- Ambas as doenças apresentam características morfológicas distintas, possibilitando um diagnóstico histopatológico com boa acurácia.
2- Diferença macroscópica marcante foi notada com relação ao aspecto e localização das lesões. A infecção por C. lamprauges está associada com lesões rinofaríngeas e P. insidiosum com lesões rinofaciais.
3- O exame de imuno-histoquímica utilizando anticorpo primário policlonal (anti-C. lamprauges) produzido em coelhos a partir de exoantígenos de fungos desta espécie pode ser utilizado para comprovação do diagnóstico.
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