SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS
ANGÉLICA CRISTINA ALTO DA SILVA VINICIUS RABELLO BELGA
Análise Retrospectiva das Micobactérias Não-tuberculosas (MNT) isoladas no Hospital das Clínicas da FMRP-USP de 2015 a 2016
RIBEIRÃO PRETO 2018
COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS
SILVA, ANGÉLICA CRISTINA ALTO DA BELGA, VINICIUS RABELLO
Análise Retrospectiva das Micobactérias Não-tuberculosas (MNT) isoladas no Hospital das Clínicas da FMRP-USP de 2015 a 2016
Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP/ Departamento DAM 3.2.2 – Laboratório de Microbiologia
Área: Microbiologia e Infecção Hospitalar Orientador: Prof.° Dr. Valdes R. Bollela Supervisora Titular: Renata Helena Candido Pocente
RIBEIRÃO PRETO 2018
Agradecemos em primeiro lugar a Deus que iluminou o nosso caminho durante toda a nossa jornada.
Ao nosso orientador Prof°. Dr. Valdes Roberto Bollela que sempre esteve presente e disposto a nos fazer dar o nosso melhor, como também todos os funcionários do Laboratório de Micobactérias, Renata Helena Candido Pocente, Sandra Mara Nunes Moroti e Lucas José Bazzo Menon que sempre nos auxiliaram durante toda a realização deste projeto.
Agradecemos também à nossa família pelo apoio e carinho, e também à nossa segunda família, nossos amigos, Aline Fifolato, Carolina Branquinho, Jacqueline Nikaido e Maria Paula Fiori, que ajudaram a deixar nossos dias mais alegres. Que as experiências compartilhadas no percurso até aqui sejam a alavanca para alcançarmos o caminho projetado e que vocês permaneçam sempre em nossas vidas.
Por fim, agradecemos a todos que direta ou indiretamente fizeram parte da nossa formação. O nosso muito obrigado!
Micobactérias atípicas ou micobactérias não-tuberculosas (MNT) pertencem ao gênero Mycobacterium, e podem ser classificadas de acordo com as características fenotípicas ou conforme a sua patogenicidade ao homem. As MNT potencialmente patogênicas podem causar diversas formas da doença, sendo os pulmões o principal órgão acometido, geralmente em paciente com doenças pulmonares pré-existentes ou também ocorre de forma disseminada em pacientes imunossuprimidos. O diagnóstico confirmatório da doença é bastante complexo e deve seguir uma série de critérios clínicos e microbiológicos e os esquemas de tratamento são bastante diversificados, pois a sensibilidade a fármacos difere entre espécies e cepas de uma mesma espécie. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi identificar as espécies de MNT isoladas e avaliar um novo teste molecular para esta finalidade em amostras clínicas de pacientes admitidos no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP - USP) nos anos de 2015 e 2016, através de um levantamento de dados da população do estudo, que tiveram pelo menos um isolado de MNT em espécimes respiratórios e no sangue, em seguida, foi realizada a identificação de espécies de MNT através de um teste molecular e a sua eficácia foi testada através da comparação de resultados provenientes do laboratório de referência. Essa pesquisa, dentro de um total de 4.213 amostras houve o crescimento de MNT em 331. Após a análise dos resultados, foi possível concluir que a espécie mais frequentemente isolada em amostras pulmonares foi M.
intracellulare ou M. chimaera, 27,3% e 44,8% em 2015 e 2016 respectivamente,
enquanto em amostras de sangue, em todas as amostras positivas para MNT foi isolado M. avium. Por fim, ao avaliar o teste Genotype Mycobacterium CM como uma nova técnica para identificação de espécies de MNT, nota-se que 53 (86,9%) de 61 amostras, houve a identificação até o nível de espécie, como também demonstra uma grande capacidade de identificação das espécies mais frequentemente isoladas na região.
Palavras chave: Micobactérias não-tuberculosas. Epidemiologia. Técnicas de
genus Mycobacterium and can be classified according to the phenotypic characteristics or according to their pathogenicity to humans. Potentially pathogenic NTM can cause various forms of the disease, usually in patients with pre-existing lung diseases or also occurs in disseminated form in immunosuppressed patients, since the lung is the main affected organ. The confirmatory diagnosis of the disease is quite complex and must follow a series of clinical and microbiological criteria and the options for treatment are quite diverse, since the sensitivity to drugs differs between species and strains of the same species. The aim of this study was to identify the isolated NTM species and to evaluate a new molecular test for this purpose in clinical samples of patients admitted to the Hospital das Clínicas of Ribeirão Preto (FMRP - USP) during 2015 and 2016, through a population data collection of the study who had at least one NTM isolate in respiratory samples and in the blood. The NTM species identification was performed through a molecular test and their efficacy was tested by comparing results from the reference laboratory. This study obtained 331 positive NMT samples from a total of 4213. After analyzing the results, it was concluded that the most frequently isolated species in respiratory samples was M. intracellulare or M. chimaera, 27.3% and 44.8% in 2015 and 2016, respectively, while in blood samples positive for NTM, M. avium was isolated. Finally, when evaluating the Genotype Mycobacterium CM test as a new technique for the identification of NTM species, 53 (86.9%) of 61 samples were identified to the species level, as well as a large identification of the most frequently isolated species in the region.
Keywords: Nontuberculous Mycobacteria. Epidemiology. Clinical Laboratory
1. INTRODUÇÃO ... 6 2. OBJETIVOS ... 10 2.1. Objetivo geral ... 10 2.2. Objetivos específicos ... 10 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 11 3.1. Tipo de estudo ... 11
3.2. Processamento das amostras ... 11
3.2.1. Baciloscopia direta ... 11
3.2.2. Cultura ... 13
3.3. Diferenciação entre M. tuberculosis e MNT ... 13
3.4. Identificação da espécie das MNT ... 15
4. RESULTADOS ... 19
5. DISCUSSÃO ... 26
6. CONCLUSÃO ... 28
1. INTRODUÇÃO
As bactérias do gênero Mycobacterium são caracterizadas como bacilos aeróbicos, imóveis, não esporulados e não encapsulados. Elas possuem elevado teor de lipídios em sua parede celular, chamados ácidos micólicos, que alteram a permeabilidade destes microrganismos a soluções corantes utilizadas em laboratório e a agentes desinfetantes. Este gênero é dividido entre o Mycobacterium leprae ou bacilo de Hansen, causador da hanseníase, o complexo Mycobacterium tuberculosis (CMtb) que inclui um grupo de bactérias patogênicas causadoras da tuberculose em humanos e em diversos outros animais e por último um grupo de bactérias que em sua maioria são saprófitas designados como micobactérias ambientais e, também conhecidas como micobactérias "atípicas" ou micobactérias não-tuberculosas (MNT) (FONTANA, 2008).
As MNT podem ser classificadas fenotipicamente em quatro grupos com base em duas características, produção de pigmentos carotenóides e tempo de crescimento em meio de cultura (SÃO PAULO, 2014).
Quadro 1 - Classificação das MNT de acordo com o tempo de crescimento e produção de pigmento
Grupos Pigmentação Tempo de crescimento
Grupo I Fotocromógenas Lento
Grupo II Escotocromógenas
Lento
Grupo III Acromógenas Lento
Grupo IV Produtoras ou não de pigmento
Rápido Fonte: adaptado de SÃO PAULO, 2014
As fotocromógenas são bactérias capazes de produzirem pigmento amarelo ou laranja em culturas expostas à luz, as escotocromógenas são semelhantes às anteriores, entretanto são capazes de produzir pigmentos carotenóides sejam na presença ou ausência de luz e as acromógenas são bactérias que não produzem pigmentos. Estes três primeiros grupos possuem crescimento lento, isto é, demoram mais de sete dias mais de sete dias, para que seja possível detectar o crescimento da micobactéria em meio de cultivo sólido, por
último há um grupo onde a produção de pigmento é facultativa, mas o que as diferencia do restante é o seu tempo de crescimento rápido, antes de sete dias (FONTANA, 2008).
As MNT são também classificadas conforme sua capacidade de causar doença no homem como potencialmente patogênicas e não patogênicas. Elas causam uma variedade de doenças em humanos e animais que diferem em importância de acordo com sua gravidade a virulência da MNT e, além da sua importância na saúde pública (SÃO PAULO, 2014).
Quadro 2 - Espécies de micobactérias não-tuberculosas classificadas conforme patogenicidade para seres humanos
POTENCIALMENTE PATOGÊNICAS
M . avium M . celatum M. intracellulare M. scrofulaceum
M. avium subsp
paratuberculosis M. chelonae M. kansasii M . simiae
M. abscessus M. fortuitum M . malmoense M. szulgai
M. asiaticum M . genavense M. marinum M. ulcerans
M . branderi M . haemophilum M. peregrinum M. xenopi
RARAMENTE PATOGÊNICA
M. agri M. diernhoferi M. komossense M. rhodesiae
M. aichiense M. duvalii M. lepraemurium M. senegalense
M. alvei M. fallax M. mucogenicum M. shimoidei
M. aurum M. farcinogenes M. nonchromogenicm M. smegmatis
M. brumae M. flavescens M. neoaurum M. sphagni
M. austroafricanum M. gadium M. obuense M. phlei
M. chitae M. gastri M. gordonae M. terrae
M. chubuense M. gilvum M. phlei M. thermoresistible
M. confluentis M. gordonae M. porcinum M. tokaiense
M. cooki M. hassiacum M. pulveris M. triviale
Fonte: adaptado de Brasil (2008)
A transmissão de micobactérias ocorre naturalmente em diversos reservatórios como água natural e de sistemas de abastecimento, solo, aerossóis e, após trauma. Atualmente existem relatos de contaminação de pacientes devido à limpeza e desinfecção inadequada de equipamentos médicos (PEDRO et al., 2008).
Inicialmente as micobactérias são fagocitadas pelos macrófagos que respondem através da produção de interleucina 12 (IL-12) que regula a produção de interferon gama (INF-γ), responsável pela ativação de neutrófilos e macrófagos para matar os patógenos intracelulares.
As MNT potencialmente patogênicas podem causar diversas formas de doença, sendo os pulmões o principal órgão acometido, geralmente em paciente com doenças pulmonares pré-existentes como doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), bronquiectasias, fibrose cística, pneumoconiose, tuberculose previamente tratada, proteinose alveolar pulmonar e doenças que afetam a motilidade esofágica (GRIFFITH et al., 2007). Já as micobacterioses extrapulmonares podem ocorrer na forma de adenopatias, nódulos, abscessos, ulcerações, bursites, lesões geniturinárias, meningite e também na forma disseminada (WILDNER et al., 2011).
A imunossupressão é um dos maiores fatores de risco para que as micobactérias se tornem patogênicas, portanto essa doença acomete com frequência pacientes portadores de HIV/AIDS, pois nestes pacientes estes organismos possuem um poder replicativo maior que no ambiente (SANTOS, 2008). O complexo Mycobacterium avium (MAC) é relatado como um dos principais patógenos, sendo a causa frequente de doenças disseminadas e morte (PEDRO et al., 2008).
Por serem presentes no meio ambiente e vivendo de forma saprófita no homem, o diagnóstico da doença causada pelas MNT é bastante complexo, principalmente na forma pulmonar devido aos sintomas semelhantes à tuberculose. Para um diagnóstico confirmatório é necessário que o paciente atenda a todos os critérios microbiológicos, sendo eles: (1) pelo menos duas culturas positivas de amostras diferentes de escarro, (2) uma cultura positiva no caso de lavado brônquico-alveolar ou (3) através de uma cultura positiva de biópsia de pulmão e/ou um exame anatomopatológico apresentando formação de granuloma inflamatório com ou sem a presença de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). O paciente também deve atender a critérios clínicos, isto é, em pacientes sintomáticos com resultados radiológicos compatíveis que também se adéqua aos critérios microbiológicos pode-se estabelecer um diagnóstico de doença pulmonar por MNT (SÃO PAULO, 2014).
Para o diagnóstico de doença disseminada é necessário apenas uma cultura positiva de sangue e/ou medula óssea,em pacientes imunocomprometidos que tenham estado avançado de imunossupressão, seja pela infecção por HIV, doenças hematológicas, transplante de órgãos e tratamento com corticóides. Deve ser investigada em pacientes com febre, perda de peso, anemia, diarréia e elevação de fosfatase alcalina. O diagnóstico pode ser auxiliado através da realização de exames complementares, como o anatomopatológico através de material oriundo de biópsias, que podem apresentar bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), com necrose aguda, crônica e granulomas. (SÃO PAULO, 2005).
O tratamento é bastante complexo, pois a sensibilidade a fármacos difere entre espécies e cepas de uma mesma espécie, por esta razão existem muitos esquemas de tratamento utilizados. As drogas disponíveis para o tratamento das MNT são: rifampicina, isoniazida, etambutol, macrolídeos (claritomicina e azitromicina), aminoglicosídeos (amicacina e estreptomicina), quinolonas (levofloxacina, moxifloxacina e ciprofloxacina), doxicilina, imepenem e cefoxetina (PUGA, 2016). Assim como na tuberculose devem ser combinados pelo menos dois fármacos e o tempo de tratamento não deve ser inferior a dezoito meses (WILDNER et al., 2011).
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi identificar as espécies de MNT isoladas e avaliar um novo teste molecular para esta finalidade em amostras clínicas de pacientes admitidos no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP – USP).
2.2. Objetivos específicos
Avaliar e caracterizar as espécies de MNT isoladas de pacientes atendidos pelo Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP – USP).
Correlacionar os resultados positivos de baciloscopias realizadas e a positividade da cultura para MNT.
Correlacionar a presença de MNT em amostras de sangue e infecção pelo HIV e a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.
Comparar um novo teste molecular para identificação de MNT com o método realizado no laboratório de referência Instituto Adolfo Lutz (IAL).
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Tipo de estudo
Este é um estudo em duas etapas, onde primeiramente foi realizado um levantamento de dados da população do estudo, compreendida por pacientes atendidos no Hospital das Clinica de Ribeirão Preto (FMRP - USP) que tiveram, pelo menos um isolado de MNT em espécimes respiratórios (escarro, escarro induzido e lavado bronco-alveolar (LBA)) e no sangue, em um período compreendido entre janeiro de 2015 a dezembro de 2016. Em seguida, foi realizada a identificação de espécies de MNT através de um teste molecular e a eficácia do teste foi testada através da comparação dos resultados provenientes do Instituto Adolfo Lutz. Alguns destes isolados foram também avaliados com um novo teste de identificação de espécies de MNT, que será descrito mais adiante.
3.2. Processamento das amostras
As amostras clínicas estudadas foram originadas da investigação médica de pacientes com provável doença pulmonar ou doença disseminada e que foram enviadas ao laboratório de micobactérias para pesquisa direta e cultivo de micobactérias. Todos os casos eram oriundos de pacientes atendidos nos ambulatórios e/ou enfermarias do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP – USP).
O material coletado seguiu o fluxo já estabelecido no hospital, conforme detalhado nas figuras 3 e 4.
3.2.1. Baciloscopia direta
Em amostras de escarro e escarro induzido, a baciloscopia é realizada em uma lâmina limpa, seca e sem gordura, onde com o auxílio de um palito de madeira se retira uma partícula mais purulenta de uma amostra e a deposita na lâmina, em seguida, a amostra é distendida até o extremo oposto da lâmina com movimentos de vai e vem em cima da amostra até obter um esfregaço homogêneo
que cubra a lâmina, sem deixar espaços vazios.
Em amostras de lavado gástrico e lavado bronco-alveolar, que tenham mais que 5 mL, a amostra é centrifugada por 15 minutos a 3000 RPM, após a centrifugação é desprezado o sobrenadante e ressuspendido o sedimento, então o sedimento é distendido em uma lâmina limpa, seca e sem gordura, e com o auxílio de um palito de madeira se realiza movimentos de vai e vem até obter um esfregaço homogêneo que cubra a lâmina, sem deixar espaços vazios.
Em amostras de sangue e medula óssea, a bacilos copia é realizada após a positividade da cultura, visando a confirmação de crescimento de micobactérias, neste caso, são retirados 4 mL da cultura líquida que será centrifugada por 30 minutos a 3000 RPM, em seguida é desprezado o sobrenadante e ressuspende-se o sedimento, com o auxílio de uma pipeta automática, se transfere de 100 a 200 µL para a uma lâmina limpa, seca e sem gordura e com uma segunda lâmina, corra um esfregaço e deixe secar.
Depois de completamente secas, fixar as lâminas, uma de cada vez, com o auxílio de uma pinça anatômica, com o esfregaço voltado para cima, passar rapidamente por três vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
Por fim, é feita a coloração pelo método de Ziehl Neelsen, no qual as lâminas são colocadas em um suporte, sem encostar uma nas outras e com o esfregaço voltado para cima, e em seguida são cobertas com fucsina fenicada a 0,3% (previamente filtrada para evitar os cristais formados devido ao repouso do corante), em seguida, na ponta de uma haste de metal com um chumaço de algodão embebido em álcool etílico, colocar fogo no algodão e passar a chama lentamente sobre as lâminas até que ocorra a emissão de vapores, a partir daí, contar 5 minutos e passar a chama pelas lâminas mais duas vezes durante esse tempo. Abrir devagar a torneira até obter um filete de água corrente para lavar as lâminas, deixar o filete de água cair em cima do número de cada lâmina, para que escorra suavemente sobre o esfregaço até eliminar todo o corante, em seguida, cobrir completamente cada lâmina com a solução descorante de álcool-ácido a 3%, e esperar 2 minutos, enxaguar em água corrente para eliminar o álcool-ácido, por fim, cobrir o esfregaço de cada uma das lâminas com o azul de metileno a 0,3% (previamente filtrado) e aguardar durante 3 minutos, enxaguar pela última vez o esfregaço até eliminar todo
o corante e colocar as lâminas para secar em pé sobre papel absorvente. 3.2.2. Cultura
Após a confecção da lâmina para a baciloscopia, as amostras são transferidas para um tubo de polietileno graduado e estéril e passam por um processo de descontaminação pelo método de Petroff, onde se usa uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 4% com indicador de vermelho de fenol, como agente de descontaminação e fluidificação, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, dobra-se o volume da amostra, em dobra-seguida, a amostra é vortexeada até formar uma mistura homogênea e incubada em estufa a 35ºC por 15 minutos, depois é centrifugada por mais 15 minutos a 3000 RPM. Após ser retirada da centrífuga, é desprezado o sobrenadante e ressuspendido o sedimento, então é gotejada uma solução de ácido clorídrico a 4% até que seja visível a viragem de cor de rosa para amarelo, por último é feita a neutralização com uma solução contendo um pequena concentração de NaOH, vermelho de fenol e sulfato de alumínio e potássio, até a viragem de cor de amarelo para rosa. Então, é transferido 500µL da amostra, já descontaminada, para o meio de cultura líquido Middlebrook 7H9, em que foi previamente adicionado o suplemento MGIT™ PANTA contendo nutrientes para auxiliar o crescimento e antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes, sendo este incubado no sistema BBL™ MGIT™960 (Mycobacteria Growth Indicator Tube, Becton & Dickinson®).
Em amostras de sangue e medula óssea, elas são semeadas no momento da coleta, onde é adicionado 5 mL da amostra em meio Myco/F Lytic®, que será posteriormente incubado no sistema BACTEC™ 9120 (Becton & Dickinson®). Já amostras de líquor, também são semeadas logo após a coleta, em meio Löwenstein Jensen, que é mantido em estufa a 35ºC, sendo inicialmente incubado em posição horizontal e com a tampa semi-aberta por 3 dias, depois, são transferidas para uma estante para aguardar o crescimento.
3.3. Diferenciação entre M. tuberculosis e MNT
A diferenciação do gênero Mycobacterium foi realizada através de um teste imunocromatográfico (ALERE® TB Ag MPT64), que se baseia na identificação
qualitativa do complexo M. tuberculosis através da detecção de anticorpos anti-MPT64, que é uma das proteínas mais presentes nestas micobactérias, e a presença ou não destes anticorpos é utilizada para diferenciação entre o complexo
M. tuberculosis e as MNT.
Figura 1 - Interpretação dos resultados fornecidos pelo teste imunocromatográfico ALERE® TB Ag MPT64
3.4. Identificação da espécie das MNT
Após a diferenciação, as amostras de MNT são resemeadas em meio de cultura Lowenstein Jensen e após o crescimento, pelo menos um isolado de cada paciente, foi enviado ao Instituto Adolfo Lutz para identificação da espécie através da análise fenotípica e de tipagem molecular.
Na fenotipagem, as cepas foram submetidas à triagem macroscópica (morfologia e pigmentação das colônias) e análise microscópica (morfologia do bacilo álcool-ácido resistente e pesquisa do fator corda) para identificação presuntiva. As cepas com colônias pigmentadas ou acromógenas lisas que não apresentaram formação de corda no exame microscópico tiveram classificação presuntiva de MNT e foram submetidas aos testes fenotípicos de análise do tempo e da temperatura de crescimento, testes enzimáticos e de inibição de crescimento em presença de drogas.
A identificação molecular das espécies foi realizada pelo método de amplificação pela PCR e análise de restrição de um fragmento de 441 pb do gene hsp65 (PRA-hsp65). O DNA extraído a partir da massa bacteriana foi amplificado e os fragmentos amplificados foram digeridos separadamente com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII e seus produtos separados por corrida eletroforética em gel de agarose a 3%. O padrão de restrição foi analisado para obtenção da espécie.
No laboratório de micobactérias do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP - USP), utilizando a cultura líquida também é realizado o Geno Type Mycobacterium CM (Hain Lifescience GmbH®), um teste in vitro qualitativo para a identificação do complexo M. tuberculosis, bem como 13 espécies diferentes de MNT. O procedimento é dividido em três etapas: (1) extração de DNA do material cultivado, no qual podem ser usadas micobactérias cultivadas em meios sólidos ou em meios líquidos, (2) uma amplificação multiplex e (3) uma hibridização reversa, onde os fragmentos amplificados se ligam a sondas específicas presentes em tiras de membrana, até que seja formado um corante que se torna visível nas tiras de membrana, para que seja possível a discriminação de forma confiável das diferentes espécies através de um padrão de bandas específicas para cada.
Figura 2 – Espécies identificadas pelo teste Geno Type Mycobacterium CM
Figura 3 – Fluxograma do funcionamento do laboratório de micobactérias a partir de uma amostra pulmonar
Figura 4 - Fluxograma do funcionamento do laboratório de micobactérias a partir de uma amostra de sangue ou medula óssea
4. RESULTADOS
Em 2015, foram recebidas um total de 2.101 amostras de origem pulmonar, deste total, 376 (17,90%) são culturas negativas, ou seja, ausência de crescimento após 42 dias enquanto 1.725 (85,10%) são culturas positivas. As culturas positivas foram divididas em três categorias, cultura positiva para
Mycobacterium tuberculosis, cultura positiva para micobactérias não-tuberculosas e
cultura positiva devido ao crescimento de contaminantes, seja bactérias ou fungos leveduriformes, sendo 376 (17,90%), 129 (34,31%) e 62 (16,49%) respectivamente (Tabela 1).
Tabela 1 – Relação de resultados de culturas positivas separados por categoria em amostras pulmonares em 2015
Resultado das culturas n %
Culturas positivas para Mycobacterium tuberculosis 376 17,90 Culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas 129 34,31 Culturas positivas para crescimento de contaminantes 62 16,49
Das culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas, 104 (80,62%) foram isoladas em amostras de escarro, 23 (17,83%) em escarro induzido e 2 (1,55%) em LBA (Tabela 5).
Das 270 amostras de sangue recebidas em 2015, 240 (88,89%) são negativas para crescimento após 42 dias de incubação, enquanto em 30 amostras (11,11%) houve crescimento, sendo 4 (13,33%) culturas positivas para
Mycobacterium tuberculosis, 9 (30%) culturas positivas para micobactérias
não-tuberculosas e 17 (56,67%) para o crescimento de contaminantes (Tabela 2).
Tabela 2 – Relação de resultados de culturas positivas separados por categorias em amostras de sangue em 2015
Resultados das culturas n %
Culturas positivas para Mycobacterium tuberculosis 4 13,33 Culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas 9 30 Culturas positivas para crescimento de contaminantes 17 56,67
Neste mesmo ano, 154 amostras positivas para a presença de MNT foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz (IAL) para identificação de espécie, sendo 119 provenientes de amostras pulmonares, destas amostras, 91 (76,47%) retornaram com a identificação de gênero e espécie, 10 (8,40%) voltaram apenas com as características fenotípicas da colônia (Tabela 3) e 17 amostras (14,28%) contaminaram e foram devolvidas para redescontaminação e em 1 amostra (0,84%) não houve o crescimento de BAAR no IAL. Já as 6 amostras de sangue enviadas, 5 (83,33%) retornaram com a identificação completa, sendo todas identificadas como
M. avium, e 1 amostra (16,66%) retornou devido a contaminação.
Tabela 3 – Resultado da identificação de espécies e/ou características fenotípicas em amostras pulmonares realizada pelo Instituto Adolfo Lutz em 2015
Identificação n
M.intracellulare ou M. chimaera 42
M. avium 29
M. abscessus 10
Micobactéria de crescimento lento acromógena 6
M. gordonae 5
M. kansasii 3
M. fortuitum 2
M. szulgai 1
Micobactéria de crescimento estocromógena 1 Micobactéria de crescimento lento 1 Micobactéria de crescimento rápido acromógena 1
Em 2016, foram recebidas 2.112 amostras de origem pulmonar, sendo 1.697 (80,35%) culturas negativas e 415 (19,65%) culturas positivas. Como no ano anterior, as culturas positivas foram divididas em três categorias, cultura positiva para Mycobacterium tuberculosis, cultura positiva para micobactérias não-tuberculosas e cultura positiva devido ao crescimento de contaminantes, sendo 210 (50,60%), 190 (45,78%) e 15 (3,61%) respectivamente (Tabela 4).
Tabela 4 - Relação de resultados de culturas positivas separados por categoria em amostras pulmonares em 2016
Resultados das culturas de amostras pulmonares n % Culturas positivas para Mycobacterium tuberculosis 210 50,60 Culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas 190 45,78 Culturas positivas para crescimento de contaminantes 15 3,61
Das culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas, 166 (87,37%) foram isoladas em amostras de escarro, 20 (10,53%) em escarro induzido e 4 (2,10%) em LBA (Tabela 5).
Tabela 5 – Resultado de culturas positivas para MNT separados por espécime clínico
Total de culturas positivas para MNT
2015 2016 129 190 n % n % Escarro 104 80,62 166 87,37 Escarro induzido 23 17,83 20 10,53 LBA 2 1,55 4 2,10
De um total de 214 amostras de sangue recebidas, 193 (90,18%) são negativas para crescimento, enquanto em 21 (9,81%) houve o crescimento. Sendo 4 (19,05%) culturas positivas para Mycobacterium tuberculosis, 3 (14,28%) para micobactérias não-tuberculosas e 14 (66,67%) para o crescimento de contaminantes (Tabela 6).
Tabela 6 - Relação de resultados de culturas positivas separados por categorias em amostras de sangue em 2016
Resultados de cultura em amostras de sangue n % Culturas positivas para Mycobacterium tuberculosis 4 19,05 Culturas positivas para micobactérias não-tuberculosas 3 14,28 Culturas positivas para crescimento de contaminantes 14 66,67
Das amostras positivas para a presença de MNT neste ano, 210 foram enviadas ao IAL para identificação de espécie, sendo 164 amostras de origem pulmonar, destas amostras, 142 (86,58%) retornaram com a identificação de gênero e espécie, 11 (6,71%) apenas com a identificação de gênero, 3 (1,83%) voltaram com as características fenotípicas da colônia (Tabela 7), 1 (0,61%) não foi possível realizar a identificação por se tratar de uma colônia mista, 2 amostras (1,22%) contaminaram e foram devolvidas para redescontaminação e em 5 amostras (3,05%) não houve o crescimento de BAAR no IAL. Já as 2 amostras de sangue enviadas, ambas retornaram com a identificação da espécie M. avium.
Tabela 7 - Resultado da identificação de espécies e/ou características fenotípicas em amostras pulmonares realizada pelo Instituto Adolfo Lutz em 2016
Identificação n M. intracellulare ou M. chimaera 94 M. abscessus 20 Mycobacterium sp 11 M. fortuitum 8 M. gordonae 8 M. avium 6
Micobactéria de crescimento lento escotocromógena 3
M. mucogenicum 1 M. peregrinum 1 M. scrofulaceum 1 M. szulgai 1 M. xenopi 1 M.nebraskense 1
Ao compararmos a relação de pacientes com cultura positiva para a presença de MNT, podemos observar que de um total de 129 culturas positivas em 2015, apenas 13 (10,08%) possuem baciloscopia positiva, independente da quantidade de cruzes, 84 (65,12%) são baciloscopias negativas e 32 (24,81%) não possuem resultado no LIS. Já em 2016, de 190 culturas, a baciloscopia é positiva em apenas 11 (5,79%) amostras, 142 (74,74%) são negativas e os 37 (19,47%) restantes não possuem resultados no LIS (Tabela 8).
Tabela 2 – Relação entre culturas positivas para MNT e o resultado da baciloscopia
2015 2016
Total de culturas positivas para MNT 129 190
n % n %
Baciloscopia positiva 13 10,08 11 5,79
Baciloscopia negativa 84 65,12 142 74,74
Sem resultado 32 24,81 37 19,47
Ao relacionarmos os pacientes com cultura positiva para MNT em amostras de sangue e o teste sorológico ELISA anti-HIV, realizado pelo laboratório de sorologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP - USP), observa-se, de um total de 9 e 3 pacientes em 2015 e 2016 respectivamente, todos apresentam resultado reagente para o teste sorológico.
Das amostras positivas para a presença de MNT nos anos de 2016 e 2017, 61 foram enviadas ao IAL para identificação de espécie, sendo 60 amostras de origem pulmonar e 1 amostra de abscesso de mama, destas, 47 retornaram com a identificação completa de gênero e espécie, 7 com apenas a identificação de gênero e outras 7 não houve resultado.
Destas mesmas amostras enviadas ao IAL, foi realizado o teste GenoType Mycobacterium CM, onde o CM identificou 53 amostras (86,9%), enquanto 5 amostras (8,2%) levaram a um resultado inconclusivo e em 3 amostras (4,9%) não houve amplificação.
Ao compararmos os resultados gerados pelo CM aos fornecidos pelo IAL, verificou-se que em 37 amostras (60,7%) o IAL e o CM concordam, em 7 amostras (11,5%) discordam, enquanto outras 17 amostras (27,8%) não houve resultado, seja pelo IAL ou pelo CM. A relação completa das espécies identificadas está detalhado no quadro 3, enquanto o desempenho entre os dois testes está detalhado no quadro 4.
Quadro 3 – Relação das concordâncias e discordâncias entre os resultados obtidos pelo teste Genotype Mycobacterium CM e os resultados enviados pelo laboratório de referência (IAL)
N ID Bandas Identificação pelo CM Identificação IAL Situação
1 1 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 2 2 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 3 3 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 4 4 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 5 5 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 6 6 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 7 7 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 8 8 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 9 9 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 10 11 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 11 13 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 12 14 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 13 15 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 14 16 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 15 17 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 16 18 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 17 19 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 18 20 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 19 21 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 20 23 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 21 24 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 22 25 9 M. intracellulare M. intracellulare ou M. chimaera concorda 23 26 9 M. intracellulare M. intracellulare concorda 24 27 5,6,10 M. abscessus M. abscessus subsp abscessus concorda 25 28 5,6,10 M. abscessus M. abscessus subsp abscessus concorda 26 29 5,6,10 M. abscessus M. abscessus concorda 27 30 5,6,10 M. abscessus M. abscessus concorda 28 32 5,6,10 M. abscessus M. abscessus concorda
29 33 4 M. avium M.avium concorda
30 34 7,14 M. fortuitum M. fortuitum concorda
31 35 14 M. fortuitum M. fortuitum concorda
32 36 7,14 M. fortuitum M. fortuitum concorda
33 37 7,14 M. fortuitum M. fortuitum concorda
34 38 7,14 M. fortuitum M. fortuitum concorda
35 43 8,1 M. gordonae M.gordonae concorda
36 44 9,10,11 M. interjectum M. gordonae, M. heidelbergense, M. interjectum concorda
37 46 9,1 M. scrofulaceum M. scrofulaceum concorda
38 10 9 M. intracellulare M. avium discorda
39 12 9 M. intracellulare Mycobacterium sp ignorada
40 22 9 M. intracellulare M. avium discorda
41 31 5,6,10 M. abscessus M.intracellulare discorda 42 39 7,14 M. fortuitum Mycobacterium sp ignorada
43 40 8,10 M. gordonae M. xenopi discorda
44 41 8,10 M. gordonae Mycobacterium sp ignorada 45 42 10,11 M. gordonae M. szulgai discorda 46 45 9,1 M. scrofulaceum M. fortuitum discorda 47 47 9,10 M. scrofulaceum M. lentiflavum discorda 48 48 10 Inconclusivo Mycobacterium sp ignorada 49 49 10 Inconclusivo Mycobacterium sp ignorada 50 50 10 Inconclusivo Mycobacterium sp ignorada 51 51 1,2,3 Inconclusivo M. lentiflavum, M. florentinum, M. simiae ignorada 52 52 10 Inconclusivo Mycobacterium sp ignorada 53 53 Não amplificou M.gordonae ignorada 54 54 Não amplificou M. abscessus ignorada 55 55 Não amplificou Sem resultado ignorada 56 56 5,6,10 M. abscessus Sem resultado ignorada 57 57 9 M. intracellulare Sem resultado ignorada
58 58 7,14 M. fortuitum Sem resultado ignorada
59 59 8,9,10 M. gordonae e M. intracellulare Sem resultado ignorada 60 60 10,12 M. kansasii Sem resultado ignorada 61 61 9 M. intracellulare Sem resultado ignorada
Quadro 4 – Relação do desempenho entre o teste Genotype Mycobacterium CM e o teste realizado pelo laboratório de referência (IAL)
IDENTIFICAÇÃO PELO IAL
SIM NÃO IDENTIFICAÇÃO PELO CM SIM 44 9 53 NÃO 3 5 8 47 14 61
5. DISCUSSÃO
O número de espécies pertencentes ao gênero Mycobacterium aumentou nos últimos anos, inclusive de novas espécies clinicamente significantes. O aumento no isolamento de MNT pode ser explicado pela implantação do método automatizado com cultura líquida, método mais sensível que a cultura tradicional realizada em meio sólido. Muitos trabalhos sugerem que a incidência de micobacterioses tem aumentado nas últimas décadas, entretanto por não ser uma doença de notificação compulsória no Brasil, o número real de pacientes acometidos pode ser ainda maior (PEDRO et al., 2008).
De acordo com o nosso estudo, os agentes mais prevalentes em 2015, foram M. intracellulare ou M. chimaera (46%) e M. avium (31%) e em 2016, M.
intracellulare ou M. chimaera (65%) e M. abscessus (14%). Já o trabalho de PUGA
(2016), que compreende os anos de 2011 a 2014, os resultados são semelhantes, sendo as espécies mais prevalentes M. intracellulare ou M. chimaera (62%) e M.
avium (10%), enquanto houve uma menor quantidade de isolados de M. abscessus
(4%). Já o trabalho de PEDRO et al. (2008), que compreende os anos de 1996 a 2005, o M. avium foi o mais frequente com 57%, seguido pelo M. gordonae (10,4%). Sendo que todos foram realizados no estado de São Paulo, pode-se afirmar que mesmo com o passar dos anos, as espécies mais frequentemente isoladas pertencem ao complexo Mycobacterium avium (MAC).
A baciloscopia é uma metodologia de execução rápida, fácil e de baixo custo, porém possui sensibilidade limitada comparada a cultura, além de ser incapaz de diferenciar a morfologia de diferentes espécies de MNT, podendo levar a um diagnóstico equivocado de tuberculose (LIMA, 2014). Em nosso estudo, observa-se
que a relação entre baciloscopia positiva e a positividade da cultura para MNT é baixa, 10,1% e 5,8% em 2015 e 2016 respectivamente. Portanto, é essencial que para um diagnóstico definitivo, seja feita a cultura em parceria com a baciloscopia, para que também seja possível a diferenciação entre colonização e infecção.
Em relação as hemoculturas positivas para MNT, a literatura afirma que a doença disseminada, seja por M. tuberculosis ou por MNT é uma consequência de uma severa imunossupressão, sendo mais comum em pacientes HIV positivos que possuem níveis de linfócitos T CD4 inferiores a 50 células/mL. M. avium foi a
espécie isolada em todos os casos de hemoculturas positivas para MNT durante os dois anos estudados e todos os pacientes apresentavam sorologia positiva para HIV. Entretanto pode-se observar que o número de hemoculturas positivas para o crescimento de contaminantes, sejam bactérias ou fungos, sobressai o total de hemoculturas positivas, seja para M. tuberculosis ou para MNT, portanto a cultura automatizada de sangue não é a melhor metodologia para o diagnóstico de micobacterioses, pois a doença apresenta um foco primário, geralmente pulmonar, que pode ser diagnosticado previamente a doença disseminada.
Ao avaliar o Genotype Mycobacterium CM como uma nova técnica para identificação de espécies de MNT, nota-se que 53 (86,9%) de 61 amostras, houve a identificação até o nível de espécie e comparando com a técnica realizada pelo IAL (PRA-hsp65), houve uma concordância de 60,7%. Outros estudos comparativos entre técnicas demonstram que uma alta taxa de concordância, como nos trabalhos de Lee et al. (2009) que comparam a cromatografia líquida e o CM, houve uma concordância de 90,8%, e entre MALDI-TOF e o CM, 96,9% no estudo de Mediavilla-gradolph et al. (2015). Não há estudos comparativos similares ao nosso, entretanto o CM demonstra uma grande capacidade de identificação das espécies mais frequentemente isoladas na região (M. intracellulare, M. abscessus e M.
avium).
Os resultados demonstram que o GenoType Mycobacterium CM é um teste confiável, de fácil execução e capaz de agilizar a identificação das espécies de micobactérias, fornecendo resultados em cerca de 3 dias. Apesar de identificar somente o complexo a que pertencem algumas espécies, a identificação obtida com no teste do CM já é suficiente para a adoção do tratamento adequado (WILDNER, 2012).
6. CONCLUSÃO
No presente trabalho foi verificada a caracterização das espécies de MNT isoladas em amostras clínicas de pacientes admitidos no Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto (FMRP - USP) nos anos de 2015 e 2016, como também avaliar um novo teste molecular para esta finalidade. Dentro de um total de 4.213 amostras houve o crescimento de MNT em 331, provenientes de amostras pulmonares e sangue.
A partir dos resultados obtidos, observa-se que a espécie mais isolada em amostras pulmonares foi M. intracellulare ou M. chimaera, enquanto em amostras de sangue foi o M. avium. Entretanto com apenas os dados fornecidos pelo LIS, não são suficientes para que seja realizado o diagnóstico de micobacteriose preconizado pela American Thoracic Society (ATS) e pela Infectious Disease Society Of America (IDSA).
Ao relacionar a baciloscopia positiva e a cultura positiva para presença de MNT, nota-se que mesmo que o resultado da baciloscopia seja mais rápido, é menos sensível levando a uma baixa quantidade de resultados positivos para MNT, portanto a melhor metodologia é a semeadura do espécime clínico para obter o crescimento e a posterior identificação de espécie.
O teste Genotype Mycobacterium CM permite uma detecção rápida e específica das espécies mais frequentemente isoladas e também as mais relevantes de interesse clínico, com o benefício de um resultado mais rápido comparado ao tempo levado para a identificação pelo laboratório de referência.
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