Beatriz de Andrade Ripper

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS

MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA

Beatriz de Andrade Ripper

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EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS

MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA

Beatriz de Andrade Ripper

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos (PPGCAL) do Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira

Rio de Janeiro Agosto de 2015

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Ripper, Beatriz de Andrade

Efeito da torrefação sobre a composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a atividade antioxidante da bebida / Beatriz de Andrade Ripper – Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Química, 2015.

xviii, 88f.: il. ; 31 cm.

Orientador: Daniel Perrone Moreira

Dissertação (mestrado) – UFRJ, Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, 2015.

Referências bibliográficas: f. 85 – 94

1. Café. 2.Composição química e processamento. 3. Compostos Bioativos do café. 4. Melanoidinas. 5. Atividade Antioxidante. I. Moreira, Daniel Perrone. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos. II. Efeito da torrefação sobre a composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a atividade antioxidante da bebida.

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EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS

MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA

Beatriz de Andrade Ripper

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DOS ALIMENTOS DO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS.

Examinada por:

____________________________________________ Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira, DSc Instituto de Química Universidade Federal do Rio de Janeiro

____________________________________________ Profa. Dra. Mariana Costa Monteiro, DSc Instituto de Nutrição Josué de Castro Universidade Federal do Rio de Janeiro

____________________________________________ Profa. Dra. Tatiana El-Bacha Porto, DSc Instituto de Nutrição Josué de Castro Universidade Federal do Rio de Janeiro

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AGRADECIMENTOS

Antes de tudo, gostaria de agradecer aos meus pais, tão amados, que sempre estiveram ao meu lado. Eles nunca mediram esforços para investir em mim. À minha mãe, Ana Claudia, que por ser professora de português, me ensinou a ler e a escrever. Sempre foi minha amiga, irmã, conselheira e parceira. Ela me chama de corajosa, mas eu gostaria de ter metade da sua coragem. Não me imagino sem os seus conselhos que sempre mantiveram os meus pés no chão. Ao meu pai, João Guilherme, que me ensinou a ter foco, disciplina, perseverança e a nunca desistir dos meus sonhos. Ele sempre foi um grande exemplo de profissional para mim. Cresci ouvindo ele dizer: “nós somos do tamanho dos nossos sonhos”. Isso significa muito na minha vida.

Ao meu irmão do meio, João Paulo, que sempre foi meu ombro amigo em todos os momentos. Meu parceiro de comida japonesa e Outback, muito obrigada por todo seu carinho. Ao meu irmão mais novo, Kauã, que nasceu me fazendo chorar de tanta emoção. Um pestinha que não me deixava estudar e que rabiscou todos os meus artigos científicos. Eu não imaginava aos 23 anos ganhar um “irmão-filho” e ter que enfrentar o desafio de ser o exemplo de irmã mais velha. Obrigada por todas as fofuras e alegrias que você trouxe para a minha vida. Tudo ficou bem mais colorido com a sua chegada.

À minha tia, Maria Sylvia, que nunca mediu esforços para me ajudar. Sempre viveu os meus sonhos, angústias e alegrias comigo. Sei que posso contar com você em todos os meus momentos. Muito obrigada por toda diferença na minha vida. Meu amor por você é eterno. Sem você eu não teria chegado até aqui!

À minha avó, Norma, minha “segunda-mãe”. Sempre cuidou muito bem de mim e me protegeu. Ela tem remédio para tudo, seja para uma dor de cabeça ou dor na alma. Ela triplica as minhas alegrias como ninguém. Sem ela nada teria sentido. Nem as dores e nem as alegrias. Nem as conquistas e nem os desafios. É um grande prazer tê-la na minha vida. Obrigada por tudo.

Ao meu avô, Paulo, que por ser Químico sempre me incentivou a seguir na área. “Você será a primeira mestre da família”, ele sempre me dizia. Sei que posso contar com você a qualquer hora. Nunca vou me esquecer das suas cervejinhas, queijinhos, suquinhos detox, caronas e ajudas com o meu carro. Você é o melhor avô do mundo.

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À minha avó, Maria Lúcia, que não está mais nesse mundo, mas sempre esteve viva dentro de mim. Eu sempre rezo para ela e sei que me ajuda de alguma forma. É dela que tiro forças para lutar e perseverar naquilo que eu quero. Eu sei que ela está sempre ao meu lado, pois a nossa ligação sempre foi muito forte. Aonde quer que você esteja, muito obrigada por tudo vó.

Ao meu padrasto muito amado, Cristiano, que desde o início me adotou como filha. Obrigada por sempre me ouvir, me aconselhar e me socorrer quando preciso. Meu carinho por você é imenso.

À toda minha família, que sempre apostaram em mim e comemoraram cada conquista. Sempre foram a minha base, força e motivo de alegria. Sem vocês nada disso teria sentido.

Ao meu orientador, Daniel Perrone que não me conhecia direito e me aceitou de braços abertos como sua aluna de iniciação científica e, posteriormente, de mestrado. Me sugeriu um projeto de tamanha responsabilidade. Então me vi de frente a um grande desafio, que superei graças à sua ajuda. Sempre muito atencioso e dedicado, nunca mediu esforços para me ajudar. É um orientador que qualquer um gostaria de ter. Vai para a bancada te ensinar e passa horas corrigindo cada ponto final do seu artigo. Muito mais que um orientador, sempre tive você como um amigo. Sempre me escutou e apoiou as minhas decisões. Muito compreensível comigo, sempre me colocou para cima. Aprendi muito com você, tanto profissionalmente quanto pessoalmente. Muito obrigada por tudo! Sem você eu jamais teria conseguido.

Ao professor Carlos Kaiser, pela sua grande colaboração com o meu trabalho. Você me ajudou muito com a técnica de RMN. Me ensinou tanto a teoria quanto a prática. Obrigada por todas aquelelas horas que você passou me explicando como manipular o equipamento. Foi uma metodologia nova para mim e que graças à sua ajuda eu consegui aplicá-la no meu estudo. Muito obrigada também pelas excelentes aulas que assisti durante a sua disciplina. Aprendi muito com elas.

À professora Sabrina Ferreira, que graças à sua disciplina eu consegui me aprofundar mais nas técnicas de massas, IV, UV e principalmente em RMN que é o foco do meu estudo.

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À professora Luciana Cardoso, sempre muito prestativa comigo durante o TCC e que me encaminhou para o mestrado. Ao professor Anderson Teodoro que me despertou a paixão pela química dos alimentos durante as suas excelentes aulas de bromatologia na graduação.

Aos professores Alexandre, Nathalia, Juliana e Vanessa e aos alunos do LBNA, principalmente, Genilton, Kim, Luiza, Daniela, Thaísa, Nívea, Ellen, Emília e André, muito obrigada pela amizade e parceria durante todos esses anos.

Às minhas grandes amigas, especiamente Gabrielle, Priscilla, Isabela, Paula, Bruna e Mabel que têm o poder de tornar a minha vida mais leve, com mais risadas e menos problemas. Amo muito vocês.

Ao meu namorado Yuri, que sempre me apoiou em tudo, principalmente para que eu seguisse a vida acadêmica. Você é muito importante para mim! Obrigada por existir.

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RESUMO

EFEITO DA TORREFAÇÃO SOBRE A COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS

MELANOIDINAS DO CAFÉ POR CLAE-DAD-EM E RMN E SUA RELAÇÃO COM A ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA BEBIDA

Beatriz de Andrade Ripper Orientador: Daniel Perrone

O café é uma das bebidas mais populares no mundo. As melanoidinas do café são os compostos responsáveis pela cor e por parte do aroma característicos do produto. Além disso, são compostos nitrogenados e de alto peso molecular formados durante Reação de Maillard. O objetivo do presente estudo foi foi investigar o efeito da torrefação sobre a composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a atividade antioxidante da bebida. As bebidas de café apresentaram 19,5 mg/mL de sólidos solúveis, onde 32,2% correspondiam às melanoidinas. Todas as amostras apresentaram maiores teores de FPME (fração de peso molecular elevado) em relação à FPMI (fração de peso molecular intermediário). As amostras de café arábica apresentaram, em média, 67,5% de FPME e 32,5% de FPMI, enquanto a amostra de café conillon apresentou 80% de FPME e 20% de FPMI. Observou-se, em média, um decréscimo de 31,5 a 13,7 mmols Fe2+/100g e de 47,3 a 17,6 µmols Trolox/L para a atividade antioxidante bebidas de café arábica, pelos ensaios de FRAP e TEAC, respectivamente. Para a amostra de café conillon observou-se um decréscimo de 46,6 a 14,6 mmols Fe2+/100g e de 47,6 a 12,5 µmols Trolox/L, respectivamente. As FPME e FPMI apresentaram variações da AA (atividade antioxidante) ao decorrer da torrefação, atingindo a 332,5 mmols Fe2+/100g e 211,6 µmols Trolox/L para FPMI e 183,8 mmols Fe2+/100g e 211,4 µmols Trolox/L para FPME. Em todas as amostras, os teores de compostos fenólicos ligados covalentemente às melanoidinas foi maior do que aqueles ligados ionicamente. O ácido caféico foi o composto fenólico incorporado mais abundante, em média 69% do teor total, seguido pelo ácido ferúlico (22%) e ácido p-cumárico (9%). Em geral, os teores relativos de ácido caféico incorporado às melanoidinas diminuíram entre 28% e 98% ao longo do processo de torra, enquanto que os teores relativos dos ácido ferúlico e p-cumárico aumentaram. Observou-se correlação entre os teores de compostos fenólicos ligados covalentemente e a atividade antioxidante medida por FRAP (r > 0,80, p < 0,001, n=19) e TEAC (r > 0,88, p < 0,001, n=19). Esses resultados demonstram que a atividade antioxidante de melanoidinas deve-se aos compostos fenólicos incorporados em sua estrutura. Nos espectros de RMN de 1H foram observados dois grupos de dubletos com uma constante de acoplamento elevada (J=16,4 Hz) em 6,5 e 7,7 ppm. Esses grupos de sinais correspondem aos prótons olefínicos em configuração trans da porção cinâmica dos ácidos clorogênicos. No entando, a região espectral entre 5,0 ppm e 7,9 ppm mudou dramaticamente durante o processo de torra. As FPME de torras escuras e muito escuras apresentaram sinais fracos correspondentes ao anomérico, olefínicos e prótons aromáticos. Observou-se correlação intensa entre a área dos sinais relativos aos ácidos clorogênicos no espectro de RMN de 1H e o teor de compostos fenólicos incorporados às melanoidinas (r > 0,87, p < 0,0001, n = 19).

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ABSTRACT

THE EFFECT OF ROASTING ON THE CHEMICAL COMPOSITION OF COFFEE MELANOIDINS BY CLAE-DAD-MS AND NMR AND THEIR RELATIONSHIP WITH

THE BREW’S ANTIOXIDANT ACTIVITY Beatriz de Andrade Ripper

Advisor: Daniel Perrone

Coffee is one of the most popular beverage in the world. Coffee melanoidins are compounds responsible for the color and characteristic of the aroma of the product. Moreover, they are nitrogenous compounds and high molecular weight formed during the Maillard reaction. The aim of this study was to investigate the effect of roasting on the chemical composition of coffee melanoidins by clae-dad-ms and nmr and their relationship with the brew’s antioxidant activity. The coffee beverages showed 19.5 mg/mL of soluble solids, which corresponded to 32.2% of melanoidins. All samples showed higher HMWF (high molecular weigh fraction) levels in relation to IMWF (intermediate molecular weigh fraction). Arabica coffee samples showed 67.5% and 32.5% of HMWF and IMWF while Conillon coffee sample showed 80% of HMWF and 20% of IMWF. There was, on average, a decrease from 31.5 to 13.7 mmol Fe 2+/ 100g and from 47.3 to 17.6 μmols Trolox /L for Arabica coffee beverage antioxidant activity by the FRAP and TEAC assays, respectively. For Conillon coffee there was a decrease from 46.6 to 14.6 mmol Fe2+/ 100g and from 47.6 to 12.5 μmols Trolox/L, respectively. The HMWF and IMWF presented variations of AA (antioxidant activity) during the roasting, reaching 332.5 mmol Fe2+/100g and 211.6 μmols Trolox / L for IMWF and 183.8 mmol Fe 2+/ 100g and 211.4 μmols Trolox /L for HMWF . In all samples, the levels of phenolic compounds covalently linked to melanoidins was higher than those connected ionically. The caffeic acid was the most abundant phenolic compound incorporated, on average, 69% of the total content, followed by ferulic acid (22%) and p-coumaric acid (9%). In general, the relative levels of caffeic acid incorporated into melanoidins decreased from 28% to 98% during the roasting process, while the relative contents of ferulic acid and p-coumaric increased. A positive correlation was observed between the content of phenolics covalently linked and antioxidant activity measured by FRAP (r> 0.80, p <0.001, n = 19) and TEAC (r> 0.88, p <0.001, n = 19 ). These results demonstrate that the antioxidant activity of melanoidins is due phenolic acids incorporated into the structure. In the 1H NMR spectra were observed two groups of doublets with a high coupling constant (J = 16.4 Hz) at 6.5 and 7.7 ppm. These signal groups correspond to olefinic protons in trans configuration of chlorogenic acids. However, the spectral region between 5.0 ppm and 7.9 ppm changed dramatically during the roasting process. The HMWF dark and very dark roasts showed weak signals corresponding to the anomeric, olefin and aromatic protons. There was strong correlation between the area of the signals relating to chlorogenic acids in the 1H NMR spectrum and the content of phenolic compounds incorporated into the melanoidins (r> 0.87, p <0.0001, n = 19).

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LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1. A lenda de Kaldi, descrita no século III, d. C………..18

Figura 2. A chegada das mudas de café no Brasil, em 1727………19

Figura 3. Implantação da ferrovia em Ribeirão Preto, SP………...20

Figura 4. Queima de um cafezal em 1929 por ordem do governo de Getúlio Vargas…….21

Figura 5. Ilustração da árvore do café………..22

Figura 6. Grãos verdes de café arábica (lado esquerdo) e de conillon (lado direito)…...23

Figura 7. Fluxograma simplificado das etapas de processamento do café………..26

Figura 8. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados……….28

Figura 9. Mecanismo de formação das lactonas……….29

Capítulo 2

Figura 2. Average relative content (%) of covalently and ionically bound phenolic acids in the HMWF and IMWF of 10% coffee brews………..48

Figura 3. Total contents (mmol/100 g) of phenolic compounds covalently and ionically linked to coffee brew melanoidins (sum of all phenolic compounds contents). Covalently bound contents were calculated from the alkaline hydrolysis procedure and subtracting the residual and ionically bound phenolic compounds. Ionically bound contents were calculated after such high ionic strength treatment and subtracting the residual phenolic compounds………....49

Figura 4. Total contents (mmol/100 g) of phenolic compounds covalently linked to coffee brew melanoidins (sum of HMWF and IMWF contents). Covalently bound contents were calculated from the alkaline hydrolysis procedure and subtracting the residual and ionically bound phenolic compounds……….50

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Figura 5. Relative contents of covalently bound CA, FA, and CoA in HMWF of Arabica 1, Arabica 2, and Conillon samples……….51 Figura 6. Relative contents of covalently bound CA, FA, and CoA in IMWF of Arabica 1, Arabica 2, and Conillon samples……….52 Figura 7. Typical 1H NMR spectrum of HMWF melanoidins (Arabica 1 green coffee)..56 Figura 8. Typical 1H NMR spectrum of IMWF melanoidins (Conillon green coffee)…57 Figura 9. 13C NMR spectrum of HMWF (dark roast of Arabica 1)………58 Figura 10. 1H–13C HSQC spectrum of HMWF (dark roast of Arabica 1)……….59 Figura 11. 1H spectra of HMWF melanoidins of Arabica 1 coffee brews of increasing roasting degrees………..61

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LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1. Composição química do café verde em g/100g em base seca………..24 Tabela 2. Características agronômicas das plantas de café arábica e café robusta……24 Tabela 3. Composição química do café torrado em g/100g em base seca………..27

Capítulo 2

Tabela 1. Weigh loss (%), color, soluble solids (mg/mL) and relative contents (mg/mL) of IMWF and HMWF of coffee samples………44 Tabela 2. Chlorogenic acids (CGA) and lactones (CGL) contents (mg/L) in coffee brews. Tabela 3. AA of whole and clarified coffee brews measured by FRAP (mmols Fe2+/L) and TEAC (mmols Trolox/L) assays………...46 Tabela 4. AA of IMWF and HMWF of coffee brews measured by FRAP (mmols Fe2+/100g) and TEAC (mmols Trolox/100g) assays………54

Capítulo 3

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

%PM Perda de massa percentual AA Atividade Antioxidante

ABIC Associação Brasileira da Indústria de Café

ABTS 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt CGA Ácido clorogênico

CGL 1,5-γ-lactonas dos ácidos clorogênicos CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-DAD-EM Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada à Espectrometria de Massas com Arranjo de diodos

p-CoA Ácido p-cumárico

CQA Ácido cafeoilquínico

CQL Lactona do ácido cafeoilquínico CV Coeficiente de Variação

diCQA Ácido dicafeoilquínico

diCQL Lactona dos ácido dicafeoilquínico diFQA Ácido diferuloilquínico

di-p-CoQA Ácido di-p-cumaroilquínico DP Desvio-padrão

FA Ácido ferúlico

FQA Ácido feruloilquínico

FQL Lactona dos ácido feruloilquínico FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power HSQC Heteronuclear single-quantum correlation ND Não detectado

QA Ácido quínico

RMN Espectroscopia de ressonância magnética TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity TPTZ 2,4,6-tripyridyl-S-triazine

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SUMÁRIO

Capítulo 1……….17

1. O café no Brasil e no mundo……….18

2. Café verde: a planta, composição química geral e o processamento………....21

3. Compostos bioativos do café……….28

3.1 Ácidos clorogênicos e lactonas………..…………..28

3.2 Melanoidinas………...30

3.3 Utilização de técnicas de RMN para análises em alimentos………...33

Objetivo geral……….…..35

Capítulo 2……….37

1. Introduction………39

2. Materials and Methods……….40

2.1. Coffee Samples………40

2.2. Coffee Brew Preparation………41

2.3. Extraction and quantification of free chlorogenic acids and lactones………41

2.4. Isolation of coffee melanoidins………41

2.5. Antioxidant activity……….42

2.6. Determination of unbound, ionically bound, and covalently bound phenolic compounds in HMWF and IMWF……….43

2.7. Spectroscopic characterization of melanoidins by NMR………43

3. Results and Discussion………43

3.1. Roasted coffee samples classification………46

3.2. Chemical characterization of coffee brews………53

3.3. Phenolic characterization of HMWF and IMWF………46

3.4. Antioxidant activity of coffee brews, clarified coffee brews, and HMWF and IMWF melanoidins………53

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Capítulo 3………..

3.3 Extração e quantificação de CGA e CGL livres………...66

3.4 Isolamento das melanoidinas do café………...67

3.5 Atividade antioxidante (AA)………68

3.6 Determinação dos compostos fenólicos residuais, ligados ionicamente e covalentemente às melanoidinas do café………..69

3.7 Caracterização espectroscópica das melanoidinas do café por RMN……..70

4. Conclusão……….…71

Referências……….72

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Capítulo 1

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1. O café no Brasil e no mundo

O café teve origem na Etiópia, no século IX, prevaleceu no Egito e na Europa e depois difundiu-se para o mundo (Wikipedia, 2015). Algumas lendas relatam a sua origem. A mais popular é sobre o pastor de cabras Kaldi, que viveu na Absínia, hoje Etiópia, há cerca de mil anos. Kaldi observou que suas cabras demonstravam uma maior vitalidade após mastigarem as frutas amarelo-avermelhadas dos arbustos que lá cresciam. Observando tal comportamento, um monge apanhou um pouco das frutas e levou consigo. No monastério ele provou os frutos na forma de infusão e percebeu que a bebida o ajudava a ser manter alerta em suas orações noturnas. Como resultado, a bebida se difundiu rapidamente para outros monastérios aumentando a sua demanda (Wikipedia, 2015). Outra lenda é aquela das tribos africanas, que preparavam os grãos de café em forma de pasta e a utilizavam para alimentar os animais e dar maior vitalidade aos guerreiros (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015; ICO, 2015).

Figura 1. A lenda de Kaldi, descrita no século III, d. C.

O cultivo do café foi introduzido na Arábia por prisioneiros de guerra. O Iêmen foi um centro de cultivo importante, de onde se propagou pelo resto do mundo árabe. O conhecimento dos efeitos da bebida disseminou-se pelo oriente no século XVI, sendo torrado pela primeira vez na Pérsia. O café gerou conflitos entre os árabes, que consideravam suas propriedades contrárias às leis do profeta Maomé. No entanto, a resistência ao seu consumo não durou muito tempo. Médicos muçulmanos aderiram à bebida para favorecer a digestão e afastar o sono (Wikipedia, 2015; ICO, 2015).

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Em 1615, os europeus começaram a provar o café na forma de infusão. No século XVII, os holandeses cultivaram suas primeiras mudas no jardim botânico de Amsterdã, o que tornou a bebida de café parte dos hábitos dos europeus. Além disso, os europeus utilizavam o cafeeiro como planta decorativa. Os holandeses ampliaram o cultivo para Sumatra e os franceses começaram o cultivo nas ilhas de Sandwich e Bourbon. O crescente mercado consumidor europeu de café difundiu o plantio no Suriname, São Domingo, Cuba, Porto Rico, Guianas e no Brasil. Com isso, o café adiquiriu um grande valor comercial e o Haiti se tornou o maior exportador mundial do produto (ABIC, 2015).

Em 1727, o café chegou em Belém do Pará (Figura 2). As mudas foram trazidas da Guiana Francesa pelo sargento Francisco de Mello Palheta. Devido às condições climáticas favoráveis, o cultivo do café difundiu-se rapidamente pelo Brasil com a produção voltada para o mercado interno. Os estados do Maranhão, Bahia, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Minas Gerais iniciaram seus plantios. Em pouco tempo, o café passou a ser de suma importância para a economia brasileira (Wikipedia, 2015; ICO, 2015).

Figura 2. A chegada das mudas de café no Brasil, em 1727.

No final do século XVIII, ocorreu a guerra de independência do Haiti contra a França. Com isso, a exportação de café daquele país declinou e o Brasil aumentou significativamente a sua produção, exportando o produto com maior regularidade. Os embarques foram realizados pela primeira vez em 1779, com a insignificante quantia de 79 arrobas. Somente em 1806, as exportações atingiram um volume mais significativo, de 80 mil arrobas (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015; ICO, 2015) .

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No Rio de Janeiro, as matas da Floresta da Tijuca tornaram-se grandes cafezais. O plantio estendeu-se para Angra dos Reis, Parati, São Paulo e Minas Gerais. Neste contexto, as fazendas de café contaram com a mão-de-obra europeia de imigrantes italianos, portugueses, espanhóis, alemães, suíços e eslavos. Em pouco tempo, o vale do rio Paraíba tornou-se a maior região produtora de café no Brasil. Com isso, ocorreu um grande crescimento econômico da região e um sistema complexo de estradas férreas foi estabelecido. Entretanto, a grande erosão do solo fizeram com que as terras para plantio se esgotassem rapidamente. Sendo assim, a cultura cafeeira migrou para o oeste da província de São Paulo, centralizando-se em Campinas e estendendo-se até Ribeirão Preto (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015).

Campinas passou a ser então o grande pólo produtor do país. Na região, os cafezais sofriam menos com esgotamento dos solos pela superfície plana da região. Foi implantada uma grande rede de estradas rodoviárias e ferroviárias na região (Figura 3). Com este novo pólo produtor, o café mudou seu centro de escoamento: toda a produção do oeste paulista era enviada para São Paulo e exportada no porto de Santos. Em 1920, a valorização do café tornou-se crescente, o que elevou os preços e aumentou a concorrência entre o Brasil e outros países (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015).

Figura 3. Implantação da ferrovia em Ribeirão Preto, SP, em 1883.

Com a crise de 1929, Getúlio Vargas ordenou que todos os estoques fossem queimados e os preços reduzissem, tornando o café acessível à qualquer cidadão (Figura 4). Foram queimadas 72 milhões de sacas. A partir de 1944, a oferta de café passou a ser

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regulada por convênios entre países produtores. Em 18 de julho de 1975, ocorreu uma geada em São Paulo dizimando todos os cafezais (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015).

Figura 4. Queima de um cafezal em 1929 por ordem do governo de Getúlio Vargas.

Neste contexto, o maior pólo produtor de café foi transferido para Minas Gerais, com produção de 26,6 milhões de sacas, o que corresponde a mais de 50% da produção nacional do produto e 17% da produção mundial. Na segunda metade do século XX, o café perdeu importância na economia brasileira, dando lugar ao setor industrial. Entretanto, o Brasil permanece como maior produtor mundial de café até os dias de hoje (Wikipedia, 2015; ABIC, 2015).

2. Café verde: a planta, composição química geral e o processamento

O café pertence à família Rubiaceae. O seu gênero correspondente é o Coffea. As duas espécies mais importantes esconomicamente são arabica e canephora. C.

arabica ocupa 74% da produção de café do Brasil, enquanto que C. canephora 26%. Duas

outras espécies que são cultivadas em uma escala muito menor são Coffea liberica e Coffea

dewevrei (ICO, 2015).

A planta do café (Figura 5) é uma pequena árvore de até 5 m de altura e 7 cm de diâmetro. O tronco é cinza claro e fino. O arbusto apresenta folhas opostas e elípticas. Suas flores são brancas, pequenas, perfumadas e produzidas quando a planta tem entre três a quatro anos. Os frutos ovais apresentam até 18 mm de comprimento e de 10 a 15 mm de diâmetro. Além disso, são verdes e quando maduros, se tornam vermelho-brilhantes

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(“cereja”) ou amarelos, dependendo da variedade. Cada fruto apresenta duas sementes. Os grãos de café são as sementes, que apresentam de 8 a 12 mm de comprimento e são arrendondadas. Cada grão é coberto por uma fina película. Em torno desta, uma película amarela (“pergaminho”) é encontrada. Todo conteúdo do fruto está contido em uma polpa mucilaginosa, que forma a “carne” do fruto (John et al., 2015; Perrone, 2008).

Figura 5. Ilustração da árvore do café. Silva, 2012.

A espécie C. arabica (Figura 6) foi primeiramente descrita por Linnaeus em 1753. As variedades mais conhecidas são “Typica” e “Bourbon”, mas também existem outras, tais como Caturra, Mundo Novo, Tico, San Ramon e Blue Mountain. O café arábica é cultivado na América Latina, África Oriental e Central, Índia e na Indonésia. A espécie C. canephora (Figura 6), também chamado de “Robusta” é uma variedade de grande dimensão desta espécie. O café Robusta é cultivado na África Central, na Ásia Ocidental e no Brasil, sendo a variedade Conillon a mais plantada no nosso país (ICO, 2015).

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Figura 6. Grãos verdes de café arábica (lado esquerdo) e de conillon (lado direito).

Neste contexto, existem diferenças importantes entre ambas as espécies. O café robusta desenvolve-se em altitudes mais baixas, é mais resistente às variações climáticas, é mais resistente a doenças e demanda um maior conteúdo orgânico do que o café arábica. O grão arábica é esverdeado e oval, ao contrário do grão robusta, que é redondo e amarronzado. Além disso, as espécies descritas diferem-se em relação à composição química (Tabela 1).

O teor de cafeína e carboidratos, por exemplo, está presente em maior quantidade no café Conillon (Perrone, 2008). O mesmo perfil é observado para os ácidos clorogênicos, que contribuem para o amargor da bebida de café (Clarke, 2003b).

Por outro lado, a trigonelina está presente em maiores quantidades no café Arábica. Este apresenta aproximadamente 60% mais lipídios que o café Conillon. Os teores de cinzas, proteínas e aminoácidos livres são semelhantes para ambas as espécies (Clarke, 2003b).

Durante o cultivo, as condições climáticas devem ser favoráveis (Tabela 2) para promover uma boa floração e o desenvolvimento dos frutos.

O planta do café Arábica atinge 2,5 a 4,5 metros de altura, crescem a uma temperatura entre 19 °e 22ºC e em altitudes de 600 a 2200 metros. A planta de café Conillon é ligeiramente mais alta (4,5 a 6,5 metros), requer temperaturas mais quentes (22° a 26ºC) para o seu desenvolvimento e crescem em altitudes mais baixas (800 metros) quando comparadas ao arbusto de café Arábica. Grãos de café Arábica são ligeiramente ovalados e menores quando comparados aos grãos de café Conillon, que apresentam forma mais redonda e são maiores. Por fim, o café Arábica apresenta o dobro do número de cromossomos do que café Conillon (Silva, 2012).

Tabela 1. Composição química típica do café verde em g/100g em base seca. Adaptado de Clarke, 2003b e Perrone, 2008.

24 Cafeína 1,2 2,2 Trigonelina 1,0 0,7 Cinzas 4,2 4,4 Ácidos Clorogênico total 6,5 10,0 Alpifáticos 1,0 1,0 Quínico 0,4 0,4 Carboidratos Sacarose 0,8 Redutores 0,1 Polissacarídeos 44,0 4,0 0,4 48,0 3,0 2,0 11,0 0,8 10,0 Lignina 3,0 Pectinas 2,0 Proteínas 11,0 Aminoácidos livres 0,5 Lipídeos 16,0

Tabela 2. Características agronômicas das plantas de café arábica e café robusta. Adaptado de Silva, 2012.

Parâmetros Café Arábica Café Robusta Cromossomos Tamanho do arbusto (m) Folhas Flores Formato da semente Tamanho da semente (mm) Maturação (meses) Clima ideal Altitude (m) 44 22 2,5-4,5 4,5-6,5

Pequenas e ovais Grandes e mais claras Pequenas Grandes Ovalada Arredondada 5-13 4-8 7-9 9-11 Temperado (19-22ºC) Equatorial (22-26ºC) 600-2200 0-800

O processamento do café (Figura 7) se inicia na colheita, que ocorre de sete a oito meses após floração. Ao final desse período, espera-se que 90% dos frutos estejam maduros e com teor de água entre 45 e 65%. Este processo é conduzido de forma manual ou mecanizada. Os frutos colhidos passam por lavadores, onde são removidas as impurezas e são separados entre frutos maduros e secos (ABIC, 2015; Silva, 2012).

A etapa seguinte é a secagem. Esta pode ocorrer por via úmida ou seca. O primeiro processo requer a secagem dos grãos de café inteiros ao sol até que a umidade atinja menos

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de 13%. Já o segundo processamento requer a secagem dos grãos descascados. O descascamento ocorre por descascadores mecânicos, nos quais o epicarpo (casca) e o mesocarpo (polpa) do fruto são removidos. O café descascado é então degomado, por meio da fermentação ou de forma mecânica (ABIC, 2015; Silva, 2012). O primeiro processo pode ocorrer por agentes biológicos naturalmente presentes, cepas de microrganismos selecionados ou enzimas industriais que degradam a mucilagem. Dependendo do método empregado, este processo pode durar de 7 a 20 horas. Na degomagem mecânica é empregado o equipamento denominado desmucilador (ABIC, 2015; Silva, 2012).

A secagem de café pela via seca ocorre em duas etapas. Na primeira, o café é seco em terreiros, estufas ou secadores de leito fixo e a sua umidade original de 45 a 65% é reduzida para 30%. A segunda etapa ocorre em secadores de fluxos cruzados, concorrentes, contracorrentes e mistos, nos quais a umidade do é reduzida para aproximadamente 12% (ABIC, 2015; Silva, 2012).

Depois de seco, o produto é armazendado. A armazenagem do café ocorre em silos ou tulhas, por no mínimo 10 dias. Durante este período é importante que a umidade relativa no ar no espaço intergranular esteja próxima de 60%, para inviabilizar a infestação de fungos e o reumedecimento do produto. Após este período, o café é beneficiado. O objetivo deste processo é remover o pergaminho do café descascado para ser obtido o grão de café verde. Em seguida, os grãos são limpos e classificados pelo seu tamanho. Durante a limpeza, materiais extrínsecos (gravetos, torrões, pedras e metais) e grãos defeituosos são retirados. A classificação ocorre de acordo com a cor e a densidade do grão. A armazenagem do café beneficiado ocorre a granel ou em sacarias. Nessa fase, são formados lotes de produtos homogêneos e que atendem os padrões de peneira e qualidade da bebida, de modo a atender as demandas de exportação e das indústrias (ABIC, 2015; Silva, 2012).

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Colheita

Preparo

Secagem

Armazenagem

Beneficiamento

Armazenagem do café beneficiado

Torrefação e moagem

Mercado interno

Exportação

Figura 7. Fluxograma simplificado das etapas de processamento do café. Adaptado de Silva, 2012.

A torrefação é um processo dependente do tempo e da temperatuta. Neste, modificações químicas e físicas ocorrem no interior dos grãos, assim como o processo de pirólise e a perda de massa (Bonnländer et al., 2005; Vitorino et al., 2001). Na indústria, este processo ocorre através de torradores com troca de calor por condução e por convecção. No primeiro caso, a troca de calor ocorre por meio da superfície metálica aquecida de uma cuba esférica, cônica ou cilíndrica. No segundo caso, uma mistura de gases aquecidos a 450 ºC é utilizada. No terceiro caso, os grãos de café são resfriados (Silva, 2012).

O processo de torrefação pode ser dividido em três estágios; secagem, torrefação e resfriamento. No primeiro, ocorre a liberação de água e compostos voláteis dos grãos e a coloração do grão muda de verde para amarelo. No segundo, ocorrem reações químicas

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exotérmicas de pirólise com liberação de gás carbônico, a cor dos grãos varia de marrom claro a escuro devido à caramelização dos açúcares e à Reação de Maillard. No terceiro, ocorre a condensação de substâncias aromáticas no interior dos grãos de café (Bekedam et

al., 2008).

Durante a torrefação, compostos fenólicos sofrem elevada degradação (Tabela 3), dando origem a pigmentos e compostos voláteis responsáveis pelo aroma do produto torrado (Perrone et al., 2008). Entretanto, os teores de lipídeos, polissacarídeos, proteínas e de cafeína permanecem relativamente inalterados. Além disso, são formadas as melanoidinas, um grupo de compostos nitrogenados responsáveis por aproximadamente 25% do peso seco do café torrado (Clarke, 2003a).

Tabela 3. Composição química do café torrado em g/100g em base seca. Adaptado de Clarke, 2003a e Perrone, 2008.

Compostos Café Arábica Café Robusta Cafeína 1,3 2,4 Trigonelina 1,0 0,7 Cinzas 4,5 4,7 Ácidos Clorogênico total 2,5 3,8 Alpifáticos 1,6 1,6 Quínico 0,8 1,0 Carboidratos Sacarose 0,0 Redutores 0,3 Polissacarídeos 33,0 0,0 0,3 37,0 3,0 2,0 7,5 0,0 11,0 25,0 Lignina 3,0 Pectinas 2,0 Proteínas 7,5 Aminoácidos livres 0,0 Lipídeos 17,0 Melanoidinas e outros 25,5 produtos da caramelização

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3. Compostos bioativos do café 3.1 Ácidos clorogênicos e lactonas

Os ácidos clorogênicos (CGA) (Figura 8) são os compostos fenólicos majoritários no café. São ésteres formados entre o ácido quínico (QA) com uma a quatro moléculas de derivados de ácidos trans-cinâmicos, principalmente os ácidos caféico (CA), ferúlico (FA) e p-coumárico (p-CoA). Os ésteres podem ser formados na posição 1, 3, 4 ou 5 do QA. Dessa forma, podem ser fornados os ácidos cafeoilquínicos (CQA), dicafeoilquínicos (diCQA), feruloilquínicos (FQA) e p-coumaroilquínicos (p-CoQA), com pelo menos três isômeros de posição em cada classe, e os ácidos cafeoilferuloilquínicos (CFQA), com pelo menos seis isômeros de posição (Perrone, 2008; Farah et al., 2006; Trugo e Marae, 1984).

Figura 8. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados. Farah & Donangelo, 2006.

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No grão verde, os teores de CGA variam de 7 a 10% em C. canephora e de 5 a 7,5% em C. arabica (Clifford, 1999; Clifford, 2000). Os CGA são precursores na formação de lignina e protegem a planta contra microrganismos agressores. O 5-CQA é o mais prevalente dentre os CGA, representando até 62% do total (Bekedam et al., 2008). Seguido deste, os outros oito isômeros mais prevalentes são, em geral: 4-CQA, 3-CQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, 3,4-diCQA, 5-FQA, 4-FQA e 3-FQA. Os isômeros 3-CQA e 4-CQA representam até 10% do teor total de CGA, e as classes diCQA e FQA representam de 15 a 20% e de 5 a 13% respectivamente (Perrone, 2008; Farah et al., 2006; Trugo e Macrae, 1984). A relação CQA/diCQA aumenta de acordo com a maturação do fruto, devido à hidrólise dos diCQAs em mono-ésteres (Montavon et al., 2003).

Durante a torrefação os CGA são convertidos em lactonas (CGL) através da perda de uma molécula de água do ácido quínico e formação da ligação éster intramolecular (Figura 9) (Moreira et al., 2012; Perrone, 2008). Além disso, estudos mostram que ocorre a condensação desses compostos a produtos de grande complexidade estrutural e de alto peso molecular, denominados melanoidinas (Moreira et al., 2012; Nunes e Coimbra, 2010; Bekedam et al.,2008). Os teores de CGA nas bebidas de café dependem do blend de espécies/cultivares usado, do grau de torrefação, da granulometria do café e do modo de preparo da bebida (Clifford, 2000). O modo de preparo doméstico por percolação extrai de 80 a 100% dos CGA e CGL presentes nos grãos torrados (Farah et al., 2006).

Figura 9. Mecanismo de formação das lactonas. Farah et al., 2006.

Estudos a partir de sistemas-modelo mostram que durante a torrefação ocorre a descarboxilação do 5-CQA gerando uma gama de fenóis simples. Com isso, compostos amargos presentes na bebida de café parecem ser gerados pela oligomerização de um único fenol (4-vinilcatecol) a partir de porções de ácido caféico liberados mediante torrefação (Moreira et al., 2012). Além disso, esses compostos participam da formação de pigmentos, aroma e sabor do café torrado (Perrone, 2008; Farah et al., 2006).

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Muitas propriedades farmacológicas do café têm sido atribuídas à esses compostos em estudos in vitro, com modelos animais e seres humanos. A maior parte está associada à sua atividade antioxidante, visto que esses compostos são capazes de quelar metais de transição e de sequestrar radicais livres, interrompendo reações em cadeia entre eles. A prevenção da oxidação de lipoproteínas e do DNA é um exemplo de atividade antioxidante destes compostos (Laranjinha et al., 1994).

Além disso, o consumo moderado do café tem sido atribuído ao menor risco relativo de hipertensão, doenças coronarianas, diabetes tipo II, mal de Alzheimer, câncer de cólon, cirrose hepática, câncer de fígado, alcoolismo, depressão e suicídios (Perrone, 2008; Moreira et al., 2005; Pereira et al., 2003; Trute et al., 1997; Basnet et al., 1996). As CGL também têm sido estudadas, devido ao seu potencial efeito hipoglicemiante e sobre a função cerebral, como por exemplo, a sua atuação sobre os receptores de adenosina (Farah

et al., 2006).

3.2 Melanoidinas

As melanoidinas são um conjunto de moléculas com peso molecular intermediário a elevado, nitrogenadas e de coloração marrom (Coelho et al., 2014; Moreira et al., 2012; Forgliano et al., 2011;; Perrone, 2008; Bekedam et al., 2008; Gniechwitz et al., 2008). Estes compostos são responsáveis pela cor e por parte do aroma característicos de café, pão, malte e carne. Dentre esses alimentos, o café é considerado a maior fonte de melanoidinas na dieta humana (Moreira et al., 2012). Estudos com sistemas-modelo mostram que esses compostos são parcialmente hidrofóbicos (Gniechwitz et al., 2008), aniônicos (Nunes e Coimbra, 2010) e apresentam propriedades redutoras (Homma et al., 1997).

As melanoidinas são formadas durante a Reação de Maillard através de diversos mecanismos, tais como ciclização, isomerização e condensação de compostos de baixo peso molecular (Bekedam et al., 2008). Sendo assim, a formação das melanoidinas ocorre durante a torrefação do café e sua composição química varia de acordo com os teores dos compostos presentes no grão verde: sacarose (após a inversão), polissacarídeos (galactomananas e arabinogalactomananas), aminoácidos, proteínas (da parede celular e de estoque) e CGA (Nunes and Coimbra, 2007). Sua estrutura quimica é relativamente

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desconhecida, devido à complexidade de produtos gerados durante a Reação de Maillard (Bekedam et al., 2008).

Existem três principais hipóteses sobre formação das melanoidinas. Heyns (1970) e Tressl (1998) sugerem que as melanoidinas são polímeros formados por unidades de furanos e/ou pirróis ligados por reações de policondensação durante os estágios avançados da Reação de Maillard. Hofmann (1998) detectou substâncias coloridas de baixo peso molecular capazes de realizarem ligações cruzadas com proteínas através de grupos ε-amino da lisina ou arginina, produzindo compostos marrons e de alto peso molecular. Kato e Tsuchida (1981), e mais recentemente, Cammerer et al. (1995) sugeriram que o esqueleto das melanoidina é formado por produtos de degradação de açúcares, formados nas fases iniciais da Reação de Maillard, polimerizados através de condensações do tipo aldol, e, possivelmente, ligados a compostos com o grupamento amino.

Apesar das propostas apresentadas fornecerem informações importantes sobre a formação das melanoidinas, as estruturas sugeridas são baseadas principalmente em estudos com sistemas-modelo. Em alimentos, a composição química das melanoidinas é provavelmente muito mais complexa, devido à presença de muitos outros compostos. Sendo assim, é provável que todas as estruturas propostas possam ser encontradas para as melanoidinas do café (Bekedam et al., 2008).

O teor de melanoidinas em café pode ser determinado por subtração aos teores de carboidrato, proteína e cafeína. Outra forma de mensuração desses compostos ocorre pela sua absorbância em 405 nm, um comprimento de onda em que a intensidade da coloração marrom é medida (Bekedam et al., 2008). Atualmente, técnicas analíticas mais sofisticadas têm sido empregadas para o isolamento e quantificação das melanoidinas do café (Nunes e Coimbra, 2010). A fração de peso molecular elevado (FPME) da bebida de café tem sido isolada por diálise, utilizando membranas com corte de peso molecular de 2 kDa (Gniechwitz et al., 2008) e de 12 a 14 kDa (Nunes and Coimbra, 2008); por diafiltração com membranas de 3 kDa (Bekedam et al., 2008; Bekedam et al., 2006; Bekedam et al., 2007); e ultrafiltração com membranas de 100, 50, 10, e 3 kDa (Gniechwitz et al., 2008; Delgado-Andrade, 2005; Marco et al., 2011). A grande diversidade de técnicas utilizadas com membranas de diferentes pontos de corte sugere que os autores ainda não chegaram a um consenso sobre o peso molecular mínimo das melanoidinas (Moreira et al., 2012). Com

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isso, a grande limitação dos estudos com melanoidinas é a grande diversidade de métodos analíticos para o seu isolamento o que sugere a obtenção de frações muito heterogêneas entre eles (Nunes e Coimbra, 2010).

O processo de incorporação de compostos fenólicos às melanoidinas do café tem sido assunto de debate na comunidade científica, uma vez que o destino dos CGA degradados durante a torrefação nunca foi completamente compreendido. A incorporação do 5-CQA, CA, FA e QA foi observada nas FPME e nas frações de peso molecular intermediário (FPMI). Além disso, estudos mostram a presença da ligação éster destes compostos às melanoidinas, após o tratamento das frações com a solução alcalina. Estas ligações covalentes detectadas mostram que a fusão alcalina é o melhor método de obtenção de compostos fenólicos ligados covalentemente às melanoidinas (Bekedam et al., 2008; Nunes and Coimbra, 2007).

De acordo com Perrone (2012), os CGA são incorporados às melanoidinas e degradados continuamente, com maior taxa de degradação do que incorporação. Além disso, este estudo mostra que a incoporação ocorre em sua maior parte de forma covalente, através da ligação do grupamento hidroxila do CA com uma cadeia lateral de polissacarídeo ou com um grupamento amino de aminoácido. Em contraste, Coelho (2014) observou maiores teores de CGA ligados ionicamente do que covalentemente em melanoidinas isoladas por ultrafiltração.

De acordo com Nunes e Coimbra (2010), a interação entre os grupamentos hidroxilas dos CGA e o grupamento amino dos peptídeos ocorrerá preferencialmente de forma iônica. A ocorrência da ligação iônica foi observada em melanoidinas isoladas por ultrafiltração (Delgado e Morales, 2005). Entretanto, a liberação de compostos ligados covalentemente às melanoidinas foi observada após o tratamento alcalino da FPME (Bekedam et al., 2008). Baixos teores de CA (0,5% a 0,9%) e FA (0,1%) foram encontrados, em contraste com os teores de QA (1,7% a 3,7%). Isto sugere que maiores teores de QA são esterficados às melanoidinas (Nunes e Coimbra, 2010).

Rufian-Henares (2007) e Vignoli (2013) sugeriram que a atividade antioxidante (AA) da FPME ocorre devido aos CGA ligados ionicamente e covalentemente às melanoidinas. O mecanismo pelo qual as melanoidinas exercem AA ainda não se encontra muito claro na literatura. Entretanto, sabe-se que este potecial é baseado na sua capacidade

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de quelar metais e de se ligar aos radicais livres (Delgado-Andrade, 2005). De acordo com Richelle (2001), a AA das melanoidinas reduz ao decorrer da torrefação e a atividade máxima ocorre em torras médias. Os diferentes tipos de ensaios para a verificação da AA das frações e a grande variabilidade da sua composição química contribuem para a obtenção de resultados muitas vezes discrepantes.

A relevância fisiológica das melanoidinas do café permanece desconhecida. Entretanto, Coelho (2014) relatou que formas condensadas de compostos fenólicos presentes nas melanoidinas associados aos polissacarídeos não digeríveis podem atuar como “esponjas”, ligando-se à radicais livres no trato gastrointestinal. Ullman et al. (2011) demonstraram que as FPMEs isoladas por ultrafiltração apresentam atividade antioxidante, o que sugere uma possível proteção contra radicais livres no cólon que poderiam estar associados ao desenvolvimento de câncer de cólon. De acordo com Ushida (2013), as melanoidinas apresentam a habilidade de inibir a lipoperoxidação, protegendo assim o organismo humano contra a aterosclerose e outras doenças ligadas ao estresse oxidativo.

4. Utilização de técnicas de RMN para análises em alimentos

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica não destrutiva e amplamente utilizada para a elucidação estrutural de moléculas orgânicas. Durante a análise, a substância é colocada sob influência de um campo magnético, o que acarreta no desdobramento dos níveis de energia de spin nuclear e na inversão do momento magnético. O pulso de radiofrequência excita o sistema, que retorna ao seu estado de equilíbrio através da relaxação. A relaxação de uma molécula está diretamente ligada a sua dinâmica e flexibilidade (Novoa-carballal et al., 2011).

Neste contexto, os núcleos a serem estudados devem conter um número de massa ímpar, número atômico ímpar ou ambos. Consequentemente, eles possuirão um momento magnético. Neste contexto, núcleos como 1H, 13C, 15N, 19F e 31P podem ser estudados. (Pavia et al., 2010). A técnica de RMN possui algumas vantagens, como elevada reprodutibilidade e simplicidade analítica de preparação de amostras, detecção de uma grande variedade de compostos e elaboração de experimentos bidimensionais (2D). A sua

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desvantagem está na baixa sensibilidade quando comparada as demais técnicas (Tyagi et

al., 2010).

O do RMN (1D), como RMN de 1H e RMN de 13C são amplamente difundidos. No entanto, o RMN (2D) têm sido tão utilizado quanto o RMN (1D) (Kaiser, 2010; Reynolds e Enríquez, 2002). A importância dos espectros 2D está no mapeamento das interações intramoleculares e intermoleculares. As interações mais observadas são: homonucleares (por exemplo, 1H-1H) e heteronucleares (por exemplo,1H-13C). O HSQC (Heteronuclear

single-quantum correlation), por exemplo, é uma correlação heteronuclear, mostrando

núcleos de 1H e 13C diretamente conectados (Claridge, 2009).

A aplicação do RMN (1D) para a análise de alimentos tem sido cada vez maior. Wei

et al. (2012) utilizaram RMN de 1H em grãos de café arábica para investigar a variação da

concentração relativa de CGA, sacarose, ácidos alifáticos, hidroximetilfurfural, polissacarídeos, trigonelina e ácido nicotínico em torras claras, médias e escuras. Bosco (1999) analisou o café expresso por RMN de 1H e obeservou o comportamento da cafeina, QA e trigonelina durante o processo de torrefação.

No caso das melanoidinas do café, não é possível detectar compostos individuais por RMN (1D), sendo necessário fazer uso dos experimentos bidimensionais (RMN-2D) (Forseth e Schroeder, 2011). No estudo de Gniechwitz et al. (2008), por exemplo, foi utilizada RMN (2D) para obeservar a incorporação de compostos fenólicos às melanoidinas do café. Entretanto, poucos são os estudos que tentam elucidar a estrutura química destas moléculas. A extrema complexidade e diversidade de estruturas, além da grande dificuldade de isolamento das melanoidinas torna este assunto de grande interesse no meio científco (Wei et al., 2010).

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O objetivo geral do presente trabalho foi investigar o efeito da torrefação sobre a composição química das melanoidinas do café por CLAE-DAD-EM e RMN e sua relação com a atividade antioxidante da bebida.

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Capítulo 2

Chemical and spectroscopic caracterization of

coffee melanoidins and their relationship with the

antioxidant activity

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1. Introduction

Melanoidins are the final brown products of the Maillard Reaction. They are high-molecular weight nitrogenous compounds responsible for the color and aroma characteristics of coffee, bread, malt, and meat, among other thermally processed foods. Among these types of foods, coffee is regarded as the largest source of melanoidins in human diet (Coelho et al., 2014; Moreira et al., 2012; Coimbra et al., 2010).

Melanoidins correspond to approximately 25% of roasted coffee weight (Hernández Perez et al., 2012; Perrone et al., 2009). During the coffee roasting process, they can be formed from sucrose, arabinogalactans, galactomannans, amino acids, proteins, and chlorogenic acids (CGA). All the forementioned compounds can increase the complexity and heterogenicity of this family of molecules. (Coelho et al., 2014; Vignoli et al., 2014; Moreira et al., 2012; Wang et al., 2011; Gniechwitz et al., 2008).

All such compounds may exert biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, antihypertensive, and antiglycative (Moreira et al., 2012). Despite the intense decrease in the CGA content in coffee brews during roasting, some studies show that these compounds are partially incorporated into melanoidins during this process, justifying their potential bioactivity (Coelho et al., 2014; Vignoli et al., 2014; Wang et al., 2011; Bekedam et al., 2008; Borelli et al., 2002).

Different methods have been employed for the isolation of coffee melanoidins. The high molecular weight fraction (HMWF) has been isolated by dialysis using membranes with molecular weight cut-off (MWCOs) of 2 kDa and 12-14 kDa, by diafiltration using hollow fiber with MWCO of 3 kDa. Through ultrafiltration, the HMWF has been isolated using membranes with MWCOs of 100, 50, 10 and 3 kDa (Coimbra, et al., 2010; Gniechwitz et al., 2008). The diversity of separation techniques with different MWCOs proves that researchers have not reached a consensus regarding the minimum molecular weight for melanoidins (Moreira et al., 2012).

All these factors contribute to keeping the chemical structure of coffee melanoidins still unknown. Their structural elucidation is extremely complex, the diversity of their structures is large, and the isolation of melanoidins fraction is a very laborious process and subject to changes. Nevertheless, the characterization of the chemical structure of

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melanoidins remains a topic of great academic interest. The analytical complexity of melanoidins structure challenges any investigation using conventional analytical approaches, such as CLAE-DAD. In this context, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has been featuring promissing results in the food science field, due to the possibility of analyzing a variety of compounds simultaneously, and to the amount of structural information that can result from it. Moreover, NMR analysis has other advantages over chromatographic techniques, such as short-time procedures, easy sample preparation, and non-destructive technique (Wei et al., 2010). On the other hand, HPLC technique is more sensitive than NMR. HPLC doesn’t require high pressures, the system is compact and it’s easier to calculate the concentration of each compound.

The aim of the present study was to investigate the effect of roasting on the chemical structure of coffee melanoidins by both HPLC-DAD and NMR spectroscopy, and to investigate its relationship with the antioxidant activity of these macromolecules.

2. Materials and Methods

2.1. Coffee Samples

Two samples of good quality green Coffea arabica (named Arabica 1 and 2) were obtained from producers in Guaxupé, Minas Gerais, Brazil. A good quality sample of green

Coffea canephora cv. Conillon was obtained from Cocam Company, located in Espírito

Santo, Brazil. Arabica samples were roasted in a domestic fluidized bed roaster (Fresh Roast SR500, USA) at 220 °C for 3, 4, 5, 6, and 8 min. The Conillon sample was roasted at the same conditions for 4, 5, 6, 8, 10, and 12 minutes. Roasting degrees were determined by weight loss percentage during roasting, as well as by comparison with color disks from the “Roasting Color Classification System” (Agtron-SCAA, Reno, NV, USA, 1995), following the standards used by the Brazilian Coffee Industries Association (ABIC). The moisture (w/w) of coffee beans was determined gravimetrically after oven drying at 105 °C, according to the official method of AOAC (AOAC, 2005).

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2.2. Coffee Brew Preparation

The green and roasted coffee beans were frozen in liquid nitrogen and subsequently ground. Coffee brews were prepared at 10% (w/v), in triplicate, by adding 40 mL of boiling water to 4 g of ground coffee. The material was vortexed for 10 seconds and then filtered through a paper filter (Whatman nº 1). Coffee brews were kept at -20°C until analysis. Soluble solids (w/v) of coffee brews were determined gravimetrically after oven drying at 105 °C, according to the official method of AOAC (AOAC, 1990).

2.3. Extraction and quantification of free chlorogenic acids and lactones

The coffee brews samples were clarified in triplicate by adding Carrez’s solutions, K2Fe(CN)6 (0.3 M) and Zn(OAc)2 (1.0 M). After 15 min the colloidal suspension was

filtered through paper filter (Whatman nº 1), yielding the clarified coffee brew, which was kept at -20 °C until analysis. Coffee brews were clarified in order to exclude high molecular weight compounds such as melanoidins. The contents of CGA and lactones (CGL) from cliarified coffee brews were determined in triplicate by LC-DAD-MS. The LC equipament (Shimadzu, Kyoto, Japan) comprised a LC-10ADvp quartenary pump, a CTO-10ASvp column oven, an 8125 manual injector (Rheodyne), with a 5 µL loop and a SPD M10Avp diode array detector (DAD). This LC sistem was interfaced with a LC MS 2010 mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) fitted with a electrospray ion source. The chromatographic separation was achieved using a C18 column Kromasil® (150 x 2.1 mm, 5 μm) maintained at a constant temperature of 40° C. The mobile phase used was a gradient between 0.3% aqueous formic acid (eluent A) and methanol (eluent B) with a flow rate of 0.2 ml/min, as described by Perrone et al. (2012). The identification of CGA and CGL was performed by their molecular weight. 3-CoQA, 5-CQA, 4-CoQA, 5-CoQA and their respective lactones were quantified using the molar extinction coefficient of 5-CQA standard. 3-FQA, 3-CQA, 4-CQA, 4-FQA, di-CQA and their respective lactones were quantified through their own molar extinction coefficient.

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2.4. Isolation of coffee melanoidins

The isolation of the intermediate molecular weight fraction (IMWF) and the high molecular weight fraction (HMWF) rich in melanoidins from the coffee brews was carried out by ultrafiltration process, according to Andrade and Morales-Delgado (2005). Aliquots of the samples were introduced into a ultrafiltration apparatus with MWCO of 3 kDa (Millipore, USA), subjected to centrifugation (4276.35 g, 4°C, 15 min), and then the retentate was successively washed with Milli-Q water, and recentrifuged. The obtained retentate was transferred to a new ultrafiltration apparatus with MWCO of 10 kDa and subjected to successive washings and centrifugations. The filtered and retained fractions of the second ultrafiltration step were lyophilized (Labconco, USA).

2.5. Antioxidant activity

The antioxidant activity (AA) of coffee brews, clarified coffee brews, and isolated melanoidins fractions (IMWF and HMWF) was assessed by FRAP (Ferric Reducing

Antioxidant Power) (Moreira et al., 2005) and TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Re et al., 1999) assays.

2.6. Determination of unbound, ionically bound, and covalently bound phenolic compounds in HMWF and IMWF

The unbound phenolics refer to those compounds that were not removed from the melanoidins after the washing procedure and may be seen as contamination of these fractions. They were measured in triplicate by LC-DAD after addition Carrez’s solutions to IMWF and HMWF, as described by Perrone et al. (2012). The material was dissolved in water (10 mg/mL) and Carrez’s solutions were added (1:100 v/v) for clarification. After centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-MS, using the same chromatographic conditions described in item 2.3.

The contents of ionically (non-covalently) bound phenolic compounds were determined in triplicate by LC-DAD-MS after treatment of melanoidins with saturated

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NaCl solution. Solutions containing 10 mg/mL HMWF and IMWF in 2 M NaCl were prepared and incubated for 12 hours. Subsequently, Carrez’s solutions were added to the mixture (1:100 v/v) and, after centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-MS (Delgado-Andrade & Morales, 2005; Perrone et al., 2012). The contents of ionically bound phenolic compounds was obtained by subtracting the contents of unbound (residual) phenolic compounds from the analytical results.

The contents of phenolic compounds covalently linked to melanoidins were determined in triplicate by LC-DAD (Perrone et al., 2012). The volume of 750 μL of 2M NaOH solution containing 2% (w/v) ascorbic acid and 20 mM ethylenediamine- tetraacetic acid was added to 750 μL of HMWF and IMWF solutions (10 mg/mL). After incubation for 1 h at 30 °C, 330 μL of 5M HCl and Carrez’s solutions (1:100 v/v) were added. After centrifugation, the supernatant was analyzed by LC-DAD-MS. The contents of covalently bound phenolic compounds was obtained by subtracting the contents of unbound (residual) and ionically (non-covalently) bound phenolic compounds from the analytical results.

2.7. Spectroscopic characterization of melanoidins by NMR

All HMWF and IMWF were analyzed by 1H NMR. The analysis were performed on a Bruker DMX-750 (Billerica, MA), with 500 MHz, and a cryogenic probe with 5 mm at a temperature of 300 K. Samples (10 mg) were dissolved in deuterium oxide (0.7 mL) prior to analysis. The presaturation technique was used. The HMWF of Arabica 1 coffee roasted for 5 min was also analyzed by 13C NMR, and NMR using two-dimensional heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiment, which was performed on the same equipment. Also the standard 5-CQA 1H NMR analysis were performed under the same conditions to confirm its chemical shift. All HMWF, IMWF and 5-CQA were scanned 16 times, equivalent to 5 minutes for each sample. The number of scans in HMWF of Arabica 1 coffee roasted during 5 min were 24,675 for 13C NMR, 128 for 1H NMR, 64 for HSQC, corresponding to a longer acquisition time, improving the ratio signal/noise and turning the peak area more precise. The signal or group of signals areas of interest were automatically integrated by the TopSpinTM software. The coupling constant was measured for each

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doublet. The chemical shift for all compounds ranged from 0 to 8.5 ppm in 1H NMR and from 0 to 220 ppm in 13C NMR. All 1H NMR, 13C NMR and HSQC specters are annexed.

3. Results and Discussion

3.1. Roasted coffee samples classification

The roasting of green coffee samples resulted in different color degrees: from very light to very dark roasts for Arabica 1 and 2 samples (with 13.9% to 22.0% of weight loss), and from very light to dark roasts for Conillon sample (with 15.6% to 22.5% of weight loss) (Table 1). These results are in agreement with literature data and occur due to loss of water combined to the wide variety of volatile organic compounds generated during roasting, which are responsible for the aroma of the ground coffee (Perrone, 2008).

3.2. Chemical characterization of coffee brews

The coffee brews presented on average 21.0 mg/ml of soluble solids in coffee Conillon and, on average, 18.6 mg/ml in coffee Arabica. (Table 1). From this content, 32.2% corresponded to melanoidins (IMWF and HMWF), considering all coffee samples. During the roasting process, melanoidins contents displayed a variable behavior, but in general, their content (6.4 mg/mL) was similar in both species. The same was observed in Vignoli et al. (2014), when it was obeserved that both species have simliar levels of melanoidins at the same point of roasting. All samples showed higher levels of HMWF than IMWF. Arabica coffee samples showed, on average, 67.5% and 32.5% of HMWF and IMWF in relation to the total of melanoidins, respectively. Also, Conillon coffee showed 80% of HMWF and 20% of IMWF. The maximum contents of melanoidins were observed in light and medium roasts of coffee samples (Figure 1), while dark and very dark roasts showed lower levels in both species. According to Bekedam et al. (2008), the roasting process causes a reduction in HMWF and IMWF polymerization, information that confirms the obtained results.