CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

(1)

CAMPILOBACTERIOSE

INTESTINAL

Instituto Biológico

16/08/10

Eliana Scarcelli Pinheiro

Pesquisadora Científica

Lab. Doenças Bacterianas da

Reprodução

Centro de Pesquisa e

Desenvolvimento de Sanidade

Animal

Disciplina IB-01-NC-020

Segurança Alimentar em

Produtos de Origem

Animal e Vegetal

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Campilobacteriose intestinal:

• Zoonose (gastrenterite)

causada por bactérias do

gênero Campylobacter

• Campylo = curvo

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• Família Campylobacteraceae

• Gênero Campylobacter:

• bastonetes Gram-negativos

• microaerófilos, não fermentadores

• móveis (flagelo polar)

• morfologia: curvos em forma de

vírgula, “S”, asa de gaivota ou em

espiral

Coloração de Gram. Aumento 1000x

Fonte:http://genetics.med.harvard.edu/~perrimon/campylobacter.html

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Espécie

C. jejuni

C. coli

C. lari

C. fetus subsp. fetus

Bactérias do gênero Campylobacter

Patogenia

Diarréia e septicemia em

humanos, abortamento em

humanos, ovinos, caprinos e cães,

Diarréia em primatas, cães, gatos,

mastite e enterite em bovinos

Diarréia em humanos e animais

Diarréia em humanos

Septicemia em humanos e

abortamento em ovinos

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Espécie

C. fetus subsp. venerealis

C. sputorum biotipo sputorum

C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis

C. upsaliensis

C. consisus

Bactérias do gênero Campylobacter

Patogenia

Abortamento e infertilidade

em bovinos

Cavidade oral humana - comensal

Diarréia em humanos

Enterite proliferativa suína

Diarréia em crianças, gatos e cães

Cavidade oral - gengivite

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Espécie

C. helveticus

C. lanienae

C. hominis

C. showae

C. hyoliei

C. hyointestinalis subsp.

lawsonni

Bactérias do gênero Campylobacter

Patogenia

Patogenia desconhecida – Fezes de gatos e cães

Patogenia desconhecida – Isolado de fezes de trabalhadores

de abatedouros de suínos

Patogenia desconhecida – Fezes de humanos saudáveis

Patogenia desconhecida - Cavidade oral humana

Patogenia desconhecida – Intestinos de suínos

Patogenia desconhecida – Estômago de suínos

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Mecanismos de patogenicidade:

• Nível intestinal:

a) Invasão (células Vero e HeLa) - diarréia

muco-hemorrágica

b) Produção de enterotoxina (CJT) (semelhante à LT de

Escherichia coli e à CT do V. cholerae) - diarréia aquosa

d) CDT – Toxina citoletal distensiva

e) Adesão (flagelo)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Infecção - Principais sintomas:

• Dose infectante 500 a 10

8

células

• Diarréia aquosa ou muco-sanguinolenta

• Flatulência

• Dor abdominal

• Febre

• Cefaléia

• Anorexia

• Náuseas e vômitos

• Artralgias

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Complicações

• Pancreatite

• Peritonite

• Artrite

• Septicemia

• Meningite

• Síndrome de Guillain-Barré (GBS)

(paralisia aguda neuromuscular)

Pós-infecção (10 a 15 dias):

C. jejuni sorotipos O19 e O41

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Transmissão

• Ingestão de alimentos contaminados

(principal via):

carne de aves

leite não pasteurizado

água

carne suína, bovina, ovina, caprina

frutas, legumes e verduras contaminadas

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Transmissão (outras vias)

• Contato direto animal-homem

• Contato pessoa-pessoa

• Transmissão perinatal

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Diagnóstico

• Exame direto das fezes em microscópio

• Cultura (Isolamento do agente):

Meios seletivos e/ou filtração (poro 0,65

µ

m)

Adição de sangue desfibrinado de carneiro ou cavalo

Atmosfera de microaerofilia (5% O

₂

e 5-10% CO

₂

)

Temperatura de incubação 37 a 42

o

C

Identificação bioquímica

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Diagnóstico

• Sorodiagnóstico:

Anticorpos detectáveis após o 5

o

dia de infecção

Utilizada em estudos epidemiológicos:

C. jejuni: 90 sorotipos

Sorogrupos mais frequentes: 2, 4, 8, 9, 10 e 36

• Biologia molecular

Detecção do DNA bacteriano nas amostras clínicas : PCR

(Reação em Cadeia pela Polimerase)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Diagnóstico

• Ágar sangue

apresentando

crescimento de

pequenas colônias

convexas e não

hemolíticas de

Campylobacter

jejuni

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Diagnóstico

• Fotomicrografia

eletrônica de

Campylobacter jejuni

evidenciando a

morfologia típica em

forma de vírgula e o

flagelo polar.

• Coloração de gram:

notar formas esféricas.

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Aumento 10.000 x

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Diagnóstico

1 2 3 4 5

Figura 1: Resultados obtidos pela PCR para detecção do gene da enzima

hipuricase de Campylobacter jejuni, 1) Marcador de peso molecular 100 pb; 2)

conteúdo gástrico de feto canino abortado; 3) amostra isolada de frango; 4)

controle positivo (Campylobacter jejuni CDC 913/PC-264); 5) Controle

negativo.

735 pb

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Tratamento

• Normalmente diarreia auto-limitante

(Dois a dez dias)

• Excreção do microrganismo:

Dois dias a três meses

• Nos casos mais graves: antibioticoterapia

Droga de eleição: eritromicina

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Campylobacter

sensível:

• Atividade de água (a

_w

): >0,97

• pH: 4,9 (mínimo) – 6,5 a 7,5 (ótimo) – 9.5 (máximo)

• Temperatura:

30

o

C (mínimo) – 42 a 45

o

C (ótima) – 47

o

C (máxima)

• Calor (pasteurização, escaldamento)

• Altas tensões de oxigênio

• Dessecação

• Aditivos (cloreto de sódio e nitrato de sódio)

• Desinfetantes (cloro, derivados do formol)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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• Ocorrência em Animais

Ocorrência em Animais

TABELA 2: Frequência de isolamentos de Campylobacter spp. de diferentes espécies animais e vegetais. Instituto Biológico, São Paulo, SP, 2000 a 2010.

Espécie Alfaces (comércio varejista) Suídeos (fezes) Frangos (carcaças) Bovinos (fezes) Ovinos / Caprinos (fezes) Gatos (fezes) Cães (fezes) Primatas (fezes) Total C. jejuni (F%) 02 (5%) 54 (12,3%) 50 (14,6%) 24 (1,8%) 10 (3,0%) 4 (9,1%) 8 (7,01%) 102 (24,2%) 254 (8,8%) C. coli (F%) 01 (2,5%) 119 (27,1%) 16 (4,7%) 1 (0,1%) 2 (0,6%) 2 (4,5%) 1 (0,88%) 21 (5,0%) 163 (5,1%) Total (F %) 03/40 (7,5%) 173/439 (39,4%) 66/342 (19,3%) 25/1292 (1,9%) 10/330 (3,0%) 6/44 (13,6%) 9/114 (7,89%) 123/421 (29,2%) 415/3022 (13,7%)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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• Ocorrência em Humanos

Ocorrência em Humanos

Brasil - estudos escassos

Síndrome de Guillain-Barré em São Paulo

1) Rocha et al., 2004

--Pacientes internados no Hospital Santa Marcelina de 1995 a 2002 com SGB.

- 55 homens e 40 mulheres:

-46% pacientes: relato de infecção respiratória antecedente à SGB

-12% pacientes: relato de infecção gastrintestinal antecedente à SGB.

-42% pacientes: relatos de vacinação, trauma, cirurgia ou gravidez antecedentes à SGB.

2) Scarcelli et al, 2007:

-PCR-RFLP de 70 estirpes de origem humana e animal

(Bovino, Cães, Frangos de corte, Primatas, Suínos e Caprinos):

Detectados 02 Humanos e 02 Primatas

Compatíveis com o sorotipo PEN O19: LIO 7

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

http://www.gifu-u.ac.jp/~kassei/guillain.html Figure 3 - Mimétisme moléculéculaire entre ganglioside

GM1 et lipopolysaccharide du Campylobacter jejuni. D’après « Yuki N - Molecular mimicry between gangliosides and lipopolysaccharides of Campylobacter jejuni isolated from patients with Guillain-Barre syndrome and Miller Fisher syndrome. J infect Dis 1997; S2 :S150- S153 ».

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• Ocorrência em Humanos

Ocorrência em Humanos

Brasil: O gênero Campylobacter é o segundo mais isolado, com

índices variando de 7 a 35%

Distribuição dos enteropatógenos bacterianos isolados no

Laboratório Fleury* de crianças menores de 4 anos de idade, no

período de janeiro de 1998 a abril de 2001:

EPEC... 39,2%

Campylobacter spp... 25,9%

Salmonella spp...25,1%

Shigella spp... 6,2%

EIEC... 0,9%

Aeromonas spp...0,2%

Outros... 2,5%

* Francisco, W . São Paulo, 2001. (Comunicação pessoal)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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• Ocorrência em Humanos

Ocorrência em Humanos

Estados Unidos: O gênero Campylobacter é o mais

freqüentemente isolado de pessoas com diarréia

(Altekruse,1999):

Campylobacter spp (45%)

Salmonella spp (30%)

Shigella spp (17%)

E. coli O157:H7(5%).

Zoonose - EUA /1999 – casos humanos 2.453.926

(CDC/USA)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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• Ocorrência em Humanos

Ocorrência em Humanos

União Européia:

Inglaterra – 34.000 casos/anos 1990 p/ 54.000 em 2000 ultrapassando 3,6 vezes a

ocorrência de Salmonella (Desai et al, 2001)

Dinamarca – 1992 a 1999 - 78/100.000 habitantes– triplicou o número de casos

(Nielsen et al., 2000)

República Tcheca – 20.000 casos relatados em 2000 – 200/100.000 habitantes

(Steinhauserova et al., 2002)

Japão:

1996 –2000 C. jejuni - 40,5% diarréias hemorrágicas (Obana et al., 2002)

2007 – 95 % das intoxicações alimentares associadas ao C. jejuni (Asakura et al.,

2007)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Prevenção e controle:

• Cozinhar adequadamente a carne, principalmente a de origem

avícola.

• Lavar corretamente as mãos depois de manipular qualquer carne

crua.

• Usar utensílios e superfícies limpas para preparar a carne crua e lavar

estes utensílios e superfícies completamente antes de utilizá-los no

preparo de outros alimentos.

• Somente beber leite fervido ou pasteurizado e água tratada ou

fervida.

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Tipo de Amostra Número C. jejuni C. coli Coliformes totais Água 1 escaldamento 14 0 0 14 (100) Água 2 evisceração 14 4 (28,6) 1 (7,1) 14 (100) Água 3 resfriamento 14 0 1 (7,1) 8 (57,1) Fezes 140 25 (17,9) 11 (7,9) -Fígado 140 14 (10) 1 (0,71) 140 (100) Coxa/ Sobrecoxa 140 33 (23,6) 14 (10) 140 (100) Total 462 76 (16,4) 28 (6,1) 306 (66,2)

Fonte: Castro et al., 1997

Tabela 1 – Frequência total de isolamentos bacterianos segundo o tipo de amostra

processada, São Paulo, 1997.

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Escaldamento

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Água de

evisceração

(30)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Entrada dos

tanques de

resfriamento

(31)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Cortes de frangos

nos tanques de

resfriamento

(32)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Carcaças pós-resfriamento prontas para o

empacotamento

(33)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Diarréia hemorrágica

(34)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

(36)

Epidemiologia Molecular

a)

Sequenciamento do produto amplificado do gene

fla A do C. jejuni:

Purificação dos produtos amplificados pela PCR

Sequenciamento

Análise das seqüências obtidas

Alinhamento e tradução das sequências de nucleotídeos

Análise: Clustal X (DENDROGRAMA)

Técnica muito discriminatória:

Setenta estirpes de Campylobacter jejuni isoladas de diferentes origens

animais (n=37) e de humanos (n=33) foram agrupadas em 44 subtipos

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

(37)

Fonte: Scarcelli et al., 2007

0.1 CampyloH11 CampyloP7 CampyloH10 CampyloC5 CampyloP9 CampyloP14 CampyloF4 CampyloH3 CampyloC1 CampyloF11 CampyloF2 CampyloF1 CampyloH20 CampyloH25 CampyloH9 CampyloH19 CampyloP1P2P3 CampyloH18 CampyloP12 CampyloC2 CampyloC4 CampyloP13 CampyloP4 CampyloP10 CampyloH30 CampyloH4 CampyloB1 CampyloH6 CampyloP6 CampyloH14 CampyloF5 CampyloCapr2 CampyloCapr1 CampyloH28 CampyloH13 CampyloF12 CampyloF8 CampyloH31 CampyloH21 CampyloS1 CampyloS2 CampyloH17 CampyloH16 CampyloF3 CampyloF10 CampyloH27 CampyloF7 CampyloF9 CampyloP11 CampyloH15 CampyloH26 CampyloH24 CampyloH12 CampyloH32 CampyloH29 CampyloF6 CampyloH1 CampyloH2 CampyloC3 CampyloH22 CampyloH23 CampyloP8 CampyloP15 CampyloLIOR7 CampyloP5 CampyloH7 CampyloH5 CampyloH8 CampyloH33 Campylo lari

Tabela 3: Subtipos de C. jejuni baseados na similaridade do

alinhamento e tradução das seqüências de nucleotídeos das 70

estirpes analisadas. São Paulo, 2007.

Subtipos

Estirpes de C. jejuni

S.1 H11, P7, H10

S.2 C5

S.3 P9

S.4 P14, F4

S.5 H3

S.6 C1, F11 F2, F1, H20

.

S.16 CAPR1, CAPR2, H28, H13

.

S.44 H8, H33

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

B= Bovino, C= Cão, F= Frango, H= Humano, P= Primata, S= Suíno, Capr= Caprino, Lior7= estirpe de referência

(38)

Fonte: Scarcelli et al., 2007

■

PCR-RFLP

■

b) PCR-RFLP do produto

amplificado do gene fla A do

Campylobacter jejuni;

■

Polimorfismos de comprimento dos

fragmentos de restrição baseados

nas seqüências do gene fla A frente

às enzimas de restrição Hae III,

Mbo I e Afa I

■

Técnica menos discriminatória, mas

também eficiente:

■

Setenta diferentes estirpes de

Campylobacter jejuni foram

agrupadas em 17 subtipos frente às

três enzimas de restrição (Afa I,

Mbo I e Hae III)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 1: Representação dos sete perfis da PCR-RFLP obtidos pela digestão da enzima Hae III frente à região variável V1 do gene fla A da subunidade da proteína flagelina: 1) Marcador 100 pb Ladder; 2) Fragmento amplificado de 702 pb correspondente ao gene fla A sem digestão enzimática; 3) Perfil 1 (ausência de sítio de restrição); 4) Perfil 2; 5) Perfil 3; 6) Perfil 4; 7) Perfil 5; 8) Perfil 6; 9) Perfil 7; 10) Marcador 100 pb Ladder.

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Subtipos (Fla-RFLP) baseados na combinação dos perfis das três enzimas

AfaI, MboI e HaeIII

Estirpes de C. jejuni Fla-RFLP 1 C1 C5 F2 F11 H9 H10 H11 H24 P7 F1 H19 H20 H25 Fla-RFLP 2 C4 C2 P3 P2 P1 P4 P10 P12 P13 H18

Fla-RFLP 3 F7 H13 H15 H26 H28 H30 H4 P11 Capr1 Capr2 Fla-RFLP 4 F8 H21 H17 S1 S2 H31 Fla-RFLP 5 F4 H3 P8 P14 F12 Fla-RFLP 6 F5 H6 H14 P6 Fla-RFLP 7 H7 P5 P15 Lior 7 Fla-RFLP 8 H1 H2 C3 Fla-RFLP 9 F3 H27 F10 Fla-RFLP 10 F6 H12 H32 Fla-RFLP 11 H22 H23 Fla-RFLP 12 H5 Fla-RFLP 13 H16 P9 Fla-RFLP 14 F9 Fla-RFLP 15 H8 H33 Fla-RFLP 16 B1 Fla-RFLP 17 H29

Tabela 4: Subtipos baseados na combinação dos perfis de restrição das três endonucleases de restrição AfaI, MboI e HaeIII aplicadas às 70 estirpes de Campylobacter jejuni isoladas de humanos de animais. São Paulo, 2007.

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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Subtipos Estirpes de C. jejuni

PFGE .1 H21, H17, F8, S1, S2, H31, H16, F3, F10, H27

PFGE .2 F9, F7, H32, F6, H1, H2, C3, P11, H15, H26

PFGE .3 P14, F4, H3, F12

PFGE .4 P1, P2, P3, H18, P12, C2, C4, P13, P4, P10

PFGE .5 H30, Capr2, Capr1, H28, H13, H4,

PFGE .6 F5, H6, P6, H14, H12

PFGE .7 C5, C1, F11, F2, F1, H20, H24, H11, P7, H10, P9, H25, H9, H19

PFGE .8 H22, H23

B= Bovino, C= Cão, F= Frango, H= Humano, P= Primata, S= Suíno, Capr= Caprino, Lior7= estirpe de referência

Tabela 5: Subtipos de C. jejuni e número de fragmentos de DNA por subtipo, obtidos pela técnica da eletroforese em campo pulsado (PFGE) aplicada às 70 estirpes de campo analisadas, mais a estirpe de referência. São Paulo, 2007

Figura 8: Eletroforese em campo pulsado (PFGE) dos representantes dos 8 padrões dos grupamentos das estirpes de C. jejuni clivadas com a enzima Sma I: Linhas 1 e 10 Marcador Lambda DNA PFGE (Amersham Biosciences); Linha 2) PFGE 1 (S1), 3) PFGE 2 (H1); PFGE 3 (F4); PFGE.4 (P1); 6) PFGE.5 (Capr1); 7) PFGE.6 (H6); 8) PFGE.7 (C5) e 9) PFGE. 8 (H22) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kb 533,5 388,0 291,0 145,5 48,5

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

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CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Tabela 1: Freqüência de agentes relacionados a distúrbios reprodutivos isolados de

1434 fetos abortados bovinos, no período de 1985 a 2008. São Paulo, 2008.

*17 por IFI e um por isolamento Bactérias abortivas Freq %

Brucella abortus 74 39,6 Staphylococcus aureus 37 19,8 Campylobacter fetus subsp

venerealis /fetus 24 12,8 Leptospira spp. 18* 9,6 Arcanobacterium pyogenes; 13 6,9 Salmonella spp 12 6,4 Listeria monocytogenes 2 1,1 Histophilus somni 2 1,1 Ureaplasma diversum 2 1,1 Mycoplasma spp. 1 0,5 Campylobacter jejuni 1 05 Rhodococcus equi 1 0,5 TOTAL 187 13,0

(42)

CAMPILOBACTERIOSE INTESTINAL

Bacteriológico de fetos ovinos, caprinos e caninos abortados examinados no período de 2004 a 2008, no Instituto Biológico:

Abortamento em ovinos:

26 fetos abortados: 1 Campylobacter fetus subsp. fetus

1 Arcanobacterium pyogenes 3 Escherichia coli

Abortamento em caprinos:

6 fetos abortados: 2 Campylobacter jeuni subsp. jejuni

2 Escherichia coli

 1 Abortamento em cadela: