EFEITOS DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE DE CÉLULAS PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS NA SUPERFÍCIE DE FILMES DE ÁCIDO POLILÁTICO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA. VLADIMIR GALDINO SABINO. EFEITOS DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE DE CÉLULAS PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS NA . SUPERFÍCIE DE FILMES DE ÁCIDO POLILÁTICO. NATAL Julho 2020. EFEITOS DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NA PROLIFERAÇÃO E VIABILIDADE DE CÉLULAS PRÉ-OSTEOBLÁSTICAS NA . SUPERFÍCIE DE FILMES DE ÁCIDO POLILÁTICO. por. VLADIMIR GALDINO SABINO. Monografia Apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como Requisito Parcial à Obtenção do Título de Bacharel em Biomedicina.. Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza . NATAL Julho 2020. . Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN . Sistema de Bibliotecas - SISBI. Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de. Biociências - CB. Sabino, Vladimir Galdino. Efeitos do laser de baixa intensidade na proliferação e. viabilidade de células pré-osteoblásticas na superfície de filmes. de ácido polilático / Vladimir Galdino Sabino. - Natal, 2020. 32 f.: il. . Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande do. Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. . Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza. . 1. Biomateriais - Monografia. 2. Osteoblastos - Monografia.. 3. Laser - Monografia. I. Barboza, Carlos Augusto Galvão. II.. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. . RN/UF/BSCB CDU 620.1. . Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351. . UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA. A Monografia “Efeitos do laser de baixa intensidade na proliferação e viabilidade de células pré-osteoblásticas na superfície de filmes de ácido polilático” elaborada por Vladimir Galdino Sabino e aprovada por todos os membros da Banca examinadora foi aceita pelo Curso de Biomedicina e homologada pelos membros da banca, como requisito parcial à obtenção do título de. BACHAREL EM BIOMEDICINA. Natal, 17 de julho de 2020. BANCA EXAMINADORA. _________________________________________ Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza (Departamento de Morfologia – UFRN). _________________________________________ Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel. (Departamento de Odontologia - UFRN). _________________________________________ Prof. Dr. Raniere Fagundes de Melo Silveira. (Faculdade Maurício de Nassau - UNINASSAU). AGRADECIMENTOS. A Deus, inteligência suprema, causa primária de todas as coisas e que está em. tudo e em todos. . Ao meu Professor orientador Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza por todas as. oportunidades, pela confiança depositada em mim, conhecimento ofertado, pela. contribuição na minha formação profissional, ética e moral, e pela amizade a nível. pessoal, se tornando um grande amigo acima de tudo. . Aos meus pais e minha família por acreditarem em mim, pela paciência e apoio;. Aos meus colegas de laboratório e do grupo de pesquisa em Biologia Crânio-. Facial pela amizade e contribuições ao longo dessa jornada.. Ao Professor Dr. Hugo Alexandre e Dra. Ana Katarina pela amizade, ajuda,. receptividade e valiosos ensinamentos ao longo desses anos no laboratório de cultura. de células.. A todos os colegas do BIOPOL (DBQ-UFRN) que sempre me acolheram,. ajudaram e compartilharam suas bancadas.. Ao Prof. Dr. Paulo Souza Picciani e Talita Nascimento, do Instituto de. Macromoléculas da UFRJ, e ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Moura, do Departamento de. Ciências Animais da UFERSA, pela contribuição técnica e científica.. Ao Departamento de Engenharia de Materiais da UFRN, em especial o. LABMAT, pela disponibilidade para análise do material.. À UFRN pela excelente formação profissional e oportunidades ofertadas.. Ao Conselho Nacional do Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, pelo apoio. financeiro e investimento em pesquisa.. Aos meus amigos que conquistei na UFRN que dividiram todos os momentos. durante esse processo.. Agradeço à todas as eventualidades, casualidades e inspirações que fizeram. tudo isso possível.. RESUMO. O ácido polilático (PLA) é um biomaterial usado em muitas aplicações biomédicas e. mostra-se promissor na produção de arcabouços para engenharia de tecidos. A. irradiação com laser de baixa intensidade (LBI) tem sido sugerida como uma. ferramenta para promover a bioestimulação in vitro de vários tipos celulares. Nesse. contexto, o estudo teve como objetivo verificar a eficácia do LBI na proliferação de. pré-osteoblastos MC3T3-E1 cultivados em filmes de PLA. Os filmes produzidos foram. caracterizados em termos de hidrofilicidade por testes de ângulo de contato,. morfologia da superfície por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e. nanotopografia por microscopia de força atômica (AFM). As células MC3T3-E1 foram. cultivadas em três grupos: Controle - superfície plástica de poliestireno; PLA - filme de. PLA; e PLA + Laser - filme de PLA, com posterior irradiação das células com laser de. diodo (InGaAIP; comprimento de onda 660 nm; potência 30 mW; densidade. energética 4 J/cm²). A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio Alamar Blue nos. intervalos de 24, 48 e 72 h após a irradiação. No intervalo de 72 h, a viabilidade celular. foi avaliada pelo ensaio Live/Dead, os eventos relacionados à apoptose por marcação. com Anexina-V/PI e os eventos do ciclo celular por citometria de fluxo, enquanto a. morfologia celular na superfície de cada filme foi avaliada por MEV. Os filmes. produzidos apresentaram superfície lisa e regular, com rugosidade superficial média. (Ra) de 21,43 nm. Os resultados do ensaio bioquímico do Alamar Blue indicaram que. o grupo PLA + Laser exibiu maior proliferação (p<0,01) quando comparado aos grupos. Controle e PLA. Os ensaios Live/Dead e Annexina/PI indicaram aumento da. viabilidade celular no grupo PLA + Laser, que também apresentou maior porcentagem. de células (p<0.05) nas fases proliferativas do ciclo celular (S e G2/M). Esses achados. foram confirmados pela maior densidade celular observada no grupo PLA + Laser. através da análise por MEV. As evidências deste estudo corroboram a ideia de que o. LBI aumenta a proliferação de células MC3T3-E1 nas superfícies do PLA, sugerindo. que ele pode ser potencialmente aplicado na engenharia de tecidos ósseos.. Palavras-chave: Biomateriais, Polímeros, Laser, Osteoblastos, Proliferação Celular,. Viabilidade Celular. . . ABSTRACT. Poly(lactic acid) (PLA) is a biomaterial used in many biomedical applications and has. a promising future in tissue engineering scaffolds. Low level laser irradiation (LLLI) has. been suggested as a tool to promote in vitro bio-stimulation of various cell types. In. this context, this study aimed to verify the efficacy of LLLI on the proliferation of. MC3T3-E1 preosteoblasts cultured on a PLA film. The produced PLA films were. characterized in terms of hydrophilicity by contact angle tests, surface morphology by. scanning electron microscopy (SEM) and nanotopography by atomic force microscopy. (AFM). The MC3T3-E1 cells were cultured as three different groups: Control – cells. cultured on a polystyrene plastic surface; PLA – cells cultured on a PLA film; and PLA. + Laser – cells cultured on a PLA film and submitted to a single irradiation with diode. laser (InGaAIP; wavelength 660 nm; power 30 mW; energy density 4 J/cm²). Cell. proliferation by the Alamar Blue assay at 24, 48, and 72 h intervals after irradiation.. Cell viability was assessed by the Live/Dead assay, apoptosis-related events were. evaluated by annexin V/PI expression and cell cycle events were analyzed by flow. cytometry. Cell morphology on the surface of each film was assessed by SEM at 72 h.. The produced films displayed a smooth and regular surface, with an average surface. roughness (Ra) of 21.43 nm. Biochemical assay (Alamar Blue) results indicated that. the PLA + Laser group exhibited higher proliferation (p <0.01) when compared to the. Control and PLA groups. The Live/Dead and Annexin/PI assays indicated an increased. cell viability in the PLA + Laser group, that also presented a higher percentage of cells. (p<0.05) in the proliferative cell cycle phases (S and G2/M). These findings were also. confirmed by the higher cell density observed in the PLA + Laser group through SEM. images. The evidence from this study supports the idea that LLLI increases the. proliferation of MC3T3-E1 cells on PLA surfaces, suggesting that it can be potentially. applied in bone tissue engineering.. Keywords: Biomaterials, Polymers, Laser biostimulation, Osteoblasts, Cell. proliferation, Cell viability.. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS. °C Graus Celsius µg Micrograma µg/mL Micrograma por mililitro µL Microlitros µM Micromolar 3D Tridimensional AFM Microscopia de força atômica ATP Trifosfato de adenosina ATCC American Type Culture Collection cAMP Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico cm Centímetros CO2 Gás carbônico. DNA Ácido desoxirribonucleico EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético ET Engenharia de Tecidos FDA Food and Drug Administration FITC Isotiocianato de fluoresceína g Grama GPC Cromatografia de permeação em gel h Hora J/cm² Joules por centímetro quadrado LBI Laser de baixa intensidade LED Diodo emissor de luz M Molar MC3T3-E1 Pré-osteoblastos de linhagem murina MEV Microscopia eletrônica de varredura Mg Miligramas mg/mL Micrograma por mililitro min Minutos mL Mililitros mm Milímetros mM Milimolar mW Miliwatts NIR Infravermelho nm Nanometros PBS Solução tampão fosfato pH Potencial Hidrogeniônico PLA Poli (ácido lático) ROS Espécies reativas de oxigênio RPM Rotações por minuto SFB Soro fetal bovino UI/mL Unidades internacionais por mililitro UV-C Radiação ultravioleta de onda curta αMEM Minimum essential medium eagle alpha modification. . LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Caracterização da superfície dos filmes de PLA. A – Representação do ângulo de. contato de uma gota de água para avaliação da hidrofilicidade utilizando um goniômetro, obtido. um ângulo de 83,79° (superfície hidrofílica). B – Eletrofomicrografia da superfície dos filmes. de PLA em 2000X evidenciando uma superfície regular. C – Nanotopografia da superfície dos. filmes de PLA obtidas por AFM, apresentando alguns poros em escala nanométrica................18 . Figura 2: Resultados do ensaio de Alamar Blue dos diferentes grupos nos intervalos de 24, 48. e 72h (*p<0,05; **p<0,01 – teste de Mann-Whitney). Uma crescente redução no grupo. PLA+Laser ao longo dos intervalos evidencia uma proliferação celular comparada aos grupos. Controle e PLA..........................................................................................................................19. Figura 3: Fotomicrografias de fluorescências obtidas no Live/Dead Assay para o grupo controle. (A), PLA (B) e PLA + Laser (C) no intervalo de 72h com aumento de 400X. Em D – Avaliação. quantitativa dos grupos para o percentual de células mortas (**p<0,01; ***p<0,001 - teste de. Mann-Whitney). Em conjunto, as microfotografias e dados quantitativos evidenciam um menor. número de células mortas (marcadas em vermelho) no grupo PLA + Laser, além de um número. maior de células viáveis por campo (marcadas em verde). ........................................................20. Figura 4: Viabilidade celular dos diferentes grupos no intervalo de 72h avaliada por citometria. de fluxo a partir da marcação com Anexina V/PI. A – Grupo controle, B – Grupo PLA e C –. Grupo PLA + Laser. Q1 - células necróticas, Q2 – células em apoptose tardia, Q3 – Células em. apoptose inicial, Q4 – células viáveis. Um maior número de células viáveis é observado no. grupo PLA + Laser e uma diminuição nas subpopulações relacionadas a apoptose (Q3 e Q2) e. necrose (Q1) comparado com os grupos Controle e PLA. .......................................................21. . Figura 5: Perfil dos diferentes grupos no intervalo de 72h nas fases do ciclo celular (* p<0,05 –. teste de Mann-Whitney). Notadamente, um maior percentual de células em fase proliferativa. (S/G2/M) é observado no grupo PLA + Laser comparado com os demais grupos. ....................22. Figura 6: Eletromicrografias das MC3T3-E1 cultivadas sobre os filmes de PLA. A, C – Grupo. PLA com magnificações de 200 e 400X, respectivamente. B, D – Grupo PLA + Laser com. magnificações de 200 e 400X, respectivamente. O grupo irradiado exibe maior densidade. celular e células com morfologia mais arredondada em comparação com o grupo não. irradiado.............................................................................................................................. ......23. . ÍNDICE. 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 9. 2. MATERIAIL E MÉTODOS .................................................................................. 12. 2.1 Produção dos Filmes de PLA ....................................................................... 12. 2.2 Caracterização dos Filmes de PLA .............................................................. 12. 2.3 Desinfecção dos filmes ................................................................................ 13. 2.4 Cultivo Celular .............................................................................................. 13. 2.5 Irradicação com Laser .................................................................................. 14. 2.6 Ensaios Biológicos ....................................................................................... 14. 2.6.1 Ensaio de proliferação pelo Alamar Blue ............................................... 14. 2.6.2 Ensaio de Viabilidade Anexina/PI .......................................................... 15. 2.6.3 Ensaio de Viabilidade pelo Live/Dead Assay ......................................... 16. 2.6.4 Avaliação do Ciclo Celular ..................................................................... 16. 2.6.5 Análise da Integração célula-biomaterial ............................................... 17. 2.7 Avaliação Estatística .................................................................................... 17. 3. RESULTADOS ................................................................................................... 18. 4. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 24. 5. CONCLUSÃO .................................................................................................... 28. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 29. 9. 1. INTRODUÇÃO. Nos últimos anos, ocorreram avanços excepcionais na Engenharia de Tecidos. (ET), uma ciência que envolve três componentes principais: um scaffold (arcabouço),. que fornece uma estrutura e substrato para o crescimento e desenvolvimento do. tecido; uma fonte celular, para facilitar a formação de tecido necessária; e fatores de. crescimento ou estímulos biofísicos, para direcionar o crescimento e a diferenciação. celular no scaffold. Nesse campo, o tecido ósseo tem ganhado destaque na ET, sendo. uma das áreas que apresentam maiores avanços (MURPHY et al., 2013).. Os procedimentos cirúrgicos ortopédicos, incluindo scaffolds ósseos,. aumentaram nas últimas décadas, levando à aplicação de autoenxertos como padrão-. ouro para transplantes ortopédicos na medicina regenerativa óssea (GRÉMARE et al.,. 2018). Por esse motivo, a engenharia de tecidos ósseos tenta reproduzir e imitar o. meio natural, fornecendo células capazes de se diferenciar em osteoblastos, com um. ponto crítico: os biomateriais devem favorecer a adesão, a proliferação e a migração. celular, além da deposição de matriz extracelular (QUARTO e GIANNONI, 2016).. Os biomateriais, em geral, apresentam interações com as células e estas se. organizam em uma arquitetura tridimensional (3D) (KHAN e TANAKA, 2017).. Cerâmica, biopolímeros e polímeros sintéticos são as três principais classes de. biomateriais amplamente utilizados como estruturas de scaffolds (GAJEDIRAN et al.,. 2017). A esse respeito, o poli(ácido lático) (PLA) é um polímero sintético aprovado. pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos para uso humano como. em suturas, implantes ósseos e formulações para administração sustentada de. medicamentos (TYLER et al., 2016).. O PLA pertence à família de α-hidroxiácido e pode ser obtido a partir da. fermentação do amido, seguido da síntese por policondensação direta com ácido. lático ou polimerização de abertura de anel do dímero de lactídeo usando um. catalisador adequado. O PLA está disponível comercialmente e pode ser usado puro. ou associado com diferentes polímeros naturais e sintéticos, exibindo uma variedade. de aplicações biomédicas (SAINI, ARORA, KUMAR, 2016). Algumas características. do PLA como a alta resistência, o alto módulo de compressão e formação de. estruturas porosas, auxilia no desenvolvimento de arcabouços adequados, melhora o. transplante celular e o crescimento celular (PHAECHAMUD e CHITRATTHA, 2016).. 10. A laserterapia tem sido amplamente aplicado na biomedicina como ferramenta. para o tratamento de diversas lesões teciduais, por sua eficácia em promover uma. rápida proliferação celular e reparo ou regeneração dos tecidos (BLOISE et al., 2013).. O laser de baixa intensidade (LBI) refere-se ao uso de luz do espectro vermelho (600. a 700 nm) ou infravermelho (780 a 1100 nm), cujo os efeitos biológicos da energia do. laser dependem da dose e potência (DE FREITAS e HAMBLIN, 2016). A. monocromaticidade, coerência e direcionalidade fazem do laser uma tecnologia. proveitosa como adjuvante na área biomédica, sobretudo para a bioestimulação. celular, além da baixa potência (abaixo de 500 mW) que não causa aumento evidente. da temperatura no tecido tratado e, portanto, nenhuma alteração significativa na. estrutura tecidual (CARUSO-DAVIS et al., 2011). Em nível celular, é observado um. aumento da síntese de proteínas, migração e proliferação celular, além da ativação. de vias anti-apoptóticas e enzimas antioxidantes (DE FREITAS e HAMBLIM, 2016).. Os mecanismos moleculares associados à irradiação com LBI ainda não foram. completamente elucidados, embora haja fortes evidências de que este altere a. expressão e a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo bioenergético levando. à mudança no potencial redox celular, atividade de canais iônicos e alteração de. fatores de transcrição pela expressão gênica, entre outros (FARIVAR,. MALEKSHAHABI e SHIARI, 2014). A princípio, a absorção de luz por componentes. da cadeia respiratória tem sido considerada o principal mecanismo em nível celular,. quando usado luz no espectro vermelho e infravermelho. A citocromo c oxidase. parece estar diretamente envolvida, sendo o primeiro fotoaceptor da luz vermelha e. do infravermelho, além de modular os sistemas do estresse oxidativo, aumentando. também o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ATP, cAMP e ROS. (KARU, 2010). . O LBI tem se mostrado um método eficaz para promover reparo e modelagem. óssea após a cirurgia, aumentando as atividades de fibroblastos e osteoblastos. (MEDINA-HUERTAS et al., 2014). Além disso, o LBI também pode ser aplicado para. a aceleração do crescimento de células osteoblásticas (DEANA et al., 2018). Foi. demonstrado um efeito bioestimulador in vitro positivo do LBI em osteoblastos. cultivados em superfícies de placas de cultura de poliestireno convencionais. (KIYOSAKI et al., 2010; MIGLIARIO et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2017; STEIN et al.,. 2005) e em células cultivadas em superfícies de biomateriais, incluindo policarbonato. 11. de uretano (HSU et al., 2010), biosilicato (RENNÓ et al., 2010; PINTO et al., 2013;. FERNANDES et al., 2017), matriz dérmica acelular (CHOI et al., 2013) e scaffolds. porosos de hidroxiapatita (INCERTI PARENTI et al., 2013).. Recentemente, o LBI foi proposto como um quarto elemento para melhorar a. tríade da engenharia de tecidos, junto com células, scaffolds e fatores de crescimento. (Marques et al., 2016). No entanto, ainda não existem dados disponíveis sobre os. possíveis efeitos da irradiação com LBI em células de linhagem osteoblásticas. cultivadas nas superfícies do PLA, o que pode representar um avanço nas técnicas. de engenharia de tecidos ósseos. Assim, a hipótese de que o LBI promove a. proliferação de células pré-osteoblastos MC3T3-E1 cultivadas em filmes de PLA foi. testada neste trabalho. Para tanto, foram realizados ensaios de proliferação e. viabilidade celular in vitro, e a morfologia celular foi avaliada sob microscopia. eletrônica de varredura, visando avaliar a influência do LBI na atividade biológica. dessas células em contato com esse biomaterial.. 12. 2. MATERIAIL E MÉTODOS. 2.1 PRODUÇÃO DOS FILMES DE PLA. A massa molecular do PLA utilizado no estudo foi identificada por. Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), utilizando-se um Cromatógrafo Líquido. com Detector de Índice de Refração RID-20A (Shimadzu, EUA). Os ensaios de GPC. foram realizados com 5,6 mg de PLA (Natureworks, EUA) dissolvidos em 2 mL de. clorofórmio (Dinâmica, Brasil), com uma taxa de 1 mL/min a uma temperatura de 30. °C e utilizando um sistema de colunas contendo duas colunas e um pré-filtro.. Os filmes de PLA foram produzidos de acordo com o protocolo descrito por. Liang, Zhao e Chen (2008). Primeiro, 6 g de PLA em pellets foram dissolvidos em 600. mL de clorofórmio a 60 °C por 90 minutos sob agitação vigorosa. Em seguida, 30 mL. da solução foram distribuídos em placas de Petri (Ø 90 mm), que foram mantidas em. temperatura ambiente até a evaporação residual do clorofórmio e o desenvolvimento. de um filme fino. Finalmente, os filmes obtidos foram cortados com dispositivo. apropriado em espécimes circulares medindo 3,4, 1,0 e 0,6 cm de diâmetro, para uso. em placas de cultivo de 6, 24 e 96 poços, respectivamente, para realização dos. ensaios. . 2.2 CARACTERIZAÇÃO DOS FILMES DE PLA . Os filmes de PLA foram caracterizados quanto à espessura, hidrofilicidade,. morfologia e nanotopografia. Utilizando-se amostras aleatórias dos filmes (n=6), a. espessura média foi determinada por meio de um paquímetro digital (Model Digimess,. Brasil).. A hidrofilicidade foi obtida determinando o ângulo de contato (θ) de uma gota. de água na superfície do filme, realizada à temperatura ambiente, utilizando-se um. Goniômetro (modelo 500, Ramé-Hart Instrument Co., EUA). Para esse fim, o filme foi. cortado em amostras de 2×2 cm, que foram fixadas em uma superfície de metal. apoiada na base do aparelho. Uma gota de água de 20 µL foi posicionada na. superfície da amostra e a imagem foi capturada por uma câmera digital. Os valores. do ângulo de contato obtidos no ensaio representam as médias de três ângulos de. 13. repetição. A superfície do filme foi então classificada de acordo com os critérios de. Kota, Kwon e Tuteja (2004): super-hidrofílica quando θ≈0 °, hidrofílica quando θ <90 °. e hidrofóbica quando θ> 90 °.. A morfologia da superfície do filme PLA foi avaliada por microscopia eletrônica. de varredura (MEV). Os filmes foram submetidos a desidratação em álcool etílico,. metalização com ouro pela técnica de sputtering e análise em microscópio eletrônico. de varredura modelo SSX 550 Superscan (Shimadzu, Japão).. Para determinação da nanotopografia da superfície os filmes foram avaliados. em microscópio de força atômica (AFM) modelo SPM 9600 (Shimadzu, Japão), onde. foram obtidos os dados de quatro parâmetros de rugosidade: rugosidade média (Ra),. altura máxima do perfil de rugosidade (Rz), altura máxima de pico (Rp) e espaçamento. médio entre os picos (Rp/Rz).. 2.3 DESINFECÇÃO DOS FILMES . Antes da cultura celular, os filmes de PLA foram lavados (3 x 2 min) em uma. solução tampão de fosfato (PBS) e expostos à luz ultravioleta (UV-C) por 30 minutos. em uma câmara de fluxo laminar, seguido de incubação por 15 minutos em uma. solução de PBS contendo antibióticos e antimicóticos (400 UI/mL de penicilina, 400. µg/mL de estreptomicina e 1 µg/mL de anfotericina B; todos da Gibco, EUA).. Posteriormente, os filmes de PLA foram inseridos em placas de 6, 24 e 96 poços (de. acordo com o ensaio) e equalizados por imersão em meio α-MEM suplementado com. soro fetal bovino a 10% (FBS; Gibco, EUA) overnight à 37ºC e atmosfera de 5% de. CO2.. 2.4 CULTIVO CELULAR . Para o estudo foi utilizada uma linhagem de células pré-osteoblásticas MC3T3-. E1 derivadas de calvárias de camundongo, obtidas da American Type Culture. Collection (ATTC, EUA) e gentilmente cedidas pelo Laboratório de Biopolímeros. (BIOPOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. As células foram. cultivadas em garrafas de cultura (TPP, Suiça) de 75 cm² com 7 mL de meio α-MEM. suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibiótico e antimicótico. 14. (100 UI/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 0,25 µg/mL de anfotericina. B; todos da Gibco, EUA). Durante todo o tempo de cultivo as células foram mantidas. a 37°C em atmosfera umidificada, contendo 5% de CO2 e o meio trocado a cada 3. dias. Após a confluência (75% da área da garrafa), as células foram subcultivadas a. partir do uso de solução de tripsina-EDTA (0,25%-1mM, Gibco, EUA), centrifugadas e. distribuídas em novos frascos de cultura com meio fresco. . 2.5 IRRADIAÇÃO COM LASER. Os experimentos biológicos foram realizados em três grupos: . • Grupo Controle - células cultivadas na superfície plástica de poliestireno das. placas de cultivo e não submetidas à irradiação com laser; . • Grupo PLA - células cultivadas na superfície dos filmes de PLA e não submetidas. à irradiação com laser; . • Grupo PLA + Laser - células cultivadas na superfície dos filmes de PLA e. submetidas à irradiação com laser. . As células do grupo PLA + Laser foram submetidas a uma única irradiação com. laser de diodo InGaAIP (Kondortech. Brasil), comprimento de onda de 660 nm,. potência de 30 mW, densidade de energia de 4,0 J/cm², diâmetro de ponta de 0,01. cm2, no modo de ação contínua. Os grupos foram organizados para que entre os. poços contendo células um poço vazio estivesse presente a fim de minimizar a. dispersão não intencional de luz durante a aplicação do laser (GINANI et al., 2018).. A sonda de irradiação foi aplicada perpendicularmente à placa a uma distância de 0,5. cm das células e do filme de PLA. Cada irradiação foi realizada por 2 min 13 s.. 2.6 ENSAIOS BIOLÓGICOS . 2.6.1 Ensaio de proliferação pelo Alamar Blue . O Alamar Blue é um reagente que permite a avaliação da proliferação celular a. partir da redução do sal de resazurina a resofurina pela atividade metabólica. mitocondrial cuja a intensidade de redução é proporcional a quantidade de células. (sensibilidade de 50 células) e a leitura é realizada a partir da absorbância ou. 15. fluorescência. Para tanto, o experimento foi conduzido em quadruplicata (n=4) nos. intervalos de 24, 48 e 72h após a irradiação com laser, sendo as células cultivadas. em microplacas de 96 poços na densidade de 5 x 10³ células/poço. Em cada intervalo. de experimento, o meio foi removido, adicionado 200 µL da solução de Alamar Blue a. 10% dissolvido em meio de cultivo e as placas incubadas por 4 horas em condições. de cultura (37°C, 5% CO2 e atmosfera úmida). Após a incubação, o conteúdo dos. poços foi transferido para uma nova placa, as absorbâncias determinadas em leitor. de microplacas (Epoch, USA) a 570 nm (forma reduzida) e 600 nm (forma oxidada) e. a redução do Alamar Blue foi então calculada a partir da equação fornecida pelo. fabricante. . 2.6.2 Ensaio de Viabilidade Anexina/PI. Os efeitos do LBI na apoptose celular foram avaliados usando o FITC/Annexin. V Dead Cell Apoptosis Kit, a partir da marcação por anexina e iodeto de propídeo. seguida da detecção por citometria de fluxo. O experimento foi conduzido a partir do. cultivo em placa de 6 poços, em triplicata (n=3), na densidade de 2 x 105 células/poço. e analisado 72h após a irradiação com laser. Para isso, o meio de cultura dos poços. foi coletado em tubos, cada grupo poço foi lavado com PBS e o sobrenadante coletado. nos tubos, seguido da adição de 1 mL de tripsina em cada poço para soltar as células. aderidas. As placas então foram incubadas a 37°C por 5 minutos e a tripsina. neutralizada com a mesma quantidade de meio de cultura basal suplementado com. soro, sendo o conteúdo de todos os poços de cada grupo coletado. Em seguida, os. tubos foram centrifugados a 3000 RPM por 5 minutos, o sobrenadante descartado, o. pellet celular ressuspendido em 200 µL de tampão de ligação do kit, adicionado 3 µL. da anexina V e 1 µL do iodeto de propídeo (100 µg/mL), e os tubos incubados a. temperatura ambiente no escuro por 15 minutos. Após a incubação, a análise foi. realizada por citometria de fluxo (FACS Canto II, BD Biosciences, USA) a partir das. emissões em 520 e 600 nm e aquisição de 10 mil eventos. Os dados foram analisados. utilizando o software comercial Flow Jo (V.10) e então obtidos os gráficos das. populações celulares em gates.. 16. 2.6.3 Ensaio de Viabilidade pelo Live/Dead Assay. A viabilidade celular também foi determinada utilizando marcadores. fluorescentes a partir do uso do Live/Dead Assay Cytotoxicity Kit for mammalian cells. (Molecular Probes, USA). Inicialmente, as células foram cultivadas em placas de 24. poços, em quadruplicata (n=4), na densidade de 2 × 104 células. Decorridas 72 h da. irradiação, o meio de cultura dos poços foi removido, as células incubadas com 2 µM. de calceina AM (que marca o citoplasma de células vivas em verde) e 4 µM de. homodímero de etídeo (que marca o núcleo de células mortas em vermelho). Os filmes. foram lavados com PBS e observados no microscópio de fluorescência (Eclipse Ti-U,. Nikon Instruments, USA) utilizando filtros de excitação em 485 nm e 530 nm. Foram. obtidas para cada amostra imagens de 4 campos aleatórios, seguidas de tratamento. no software NIS-Elements (Nikon Instruments, USA), contando-se o número de. células mortas e vivas em cada campo, e posteriormente calculado a razão e o. percentual de células mortas em cada grupo experimental. . 2.6.4 Avaliação do Ciclo Celular . Os efeitos de LBI no ciclo celular foram analisados por citometria de fluxo a. partir da quantificação do DNA total das células por marcação com iodeto de propídeo.. Para isso, as células foram cultivadas em placas de 6 poços em triplicata (n=3), a uma. densidade de 2×105/poço, e avaliadas 72h após a irradiação com laser. Para isso, o. meio dos poços foi removido seguido de lavagem com PBS, seguido da adição de 1. mL de tripsina-EDTA (0,25%-1mM, Gibco, EUA), incubação a 37°C por 5 minutos,. neutralizado com meio de cultura gelado e o conteúdo dos poços transferidos para. tubos cônicos de 15 mL. A suspensão celular foi centrifugada a 3000 RPM por 5. minutos em centrifuga refrigerada a 4°C, o sobrenadante descartado. O pellet celular. ressuspendido em 5 mL de PBS gelado para lavagem celular e o processo de. centrifugação repetido. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as células. ressuspendidas 4 mL de solução de etanol 70% para fixação e incubadas a – 20°C. por 2 horas. Após a fixação, a suspenção celular foi centrifugada a 3000 RPM por 5. minutos e as células lavadas com PBS. O pellet celular foi ressuspendido em 200 µL. 17. de solução de RNAse (Gibco, USA) 0,2 mg/mL e Triton X (Sigma, USA) a 0,1 % em. PBS e incubados em banho-maria a 37ºC por 1 h. Após a incubação, o DNA celular. foi marcado com iodeto de propídeo na concentração de 600 µg/mL e as avaliações. foram realizadas no citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, CA,. EUA) a partir da emissão em 600 nm e aquisição de 10 mil eventos. . 2.6.5 Análise da Integração célula-biomaterial . A morfologia das células cultivadas na superfície do PLA foi avaliada em 72. horas por MEV. Após o período de cultura, os filmes de PLA foram lavados duas vezes. em PBS para remover as células não ligadas, fixadas em glutaraldeído a 2,5% (pH. 7,2) por 12 h, pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1% por 60 min e, finalmente,. lavadas em água destilada. As amostras foram então desidratadas em álcool etílico,. banhadas a ouro pela técnica de sputtering e examinadas sob um microscópio. eletrônico de varredura (Hitachi TM300, Hitachi, Japão) para avaliações descritivas da. morfologia celular nas superfícies dos filmes.. 2.7 AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA. As avaliações estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 8.0. (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Análises não paramétricas foram realizadas, pois. os dados não apresentaram distribuição gaussiana (teste de normalidade Shapiro-. Wilk, alfa = 0,05). As diferenças entre os grupos foram analisadas pelos testes de. Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando um intervalo de confiança de 95%. (p<0,05).. 18. 3. RESULTADOS. A massa molecular do PLA utilizado foi de 93,156 g.mol-1, obtida por GPC. A. escolha do PLA com esse peso molecular específico foi baseada em seu bom. desempenho na produção e processamento dos filmes. As medições usando um. micrômetro digital indicam que os filmes tinham uma espessura média de 294,6 ± 34,5. μm. No que se refere ao teste de ângulo de contato para avaliação da molhabilidade,. foi encontrado um valor de 83,79°, portanto, considerado uma superfície hidrofílica. (Figura 1-A). As imagens por MEV indicam uma superfície regular (Figura 1-B) e os. resultados da caracterização nanotopográfica por AFM (Figura 1-C) indicam um perfil. de rugosidade média da superfície (Ra) de 21,43 nm, altura máxima do perfil de. rugosidade (Rz) de 183,94 nm, altura máxima do pico do perfil (Rp) de 67,71 e. espaçamento médio entre os picos (Rp/Rz) de 0,36 nm, com pequenos vales.. Figura 1: Caracterização da superfície dos filmes de PLA. A – Representação do ângulo de contato de. uma gota de água para avaliação da hidrofilicidade utilizando um goniômetro, obtido um ângulo de. 83,79° (superfície hidrofílica). B – Eletrofomicrografia da superfície dos filmes de PLA em 2000X. evidenciando uma superfície regular. C – Nanotopografia da superfície dos filmes de PLA obtidas por. AFM, apresentando alguns poros em escala nanométrica. . Fonte: Autoria própria.. 19. Os dados de proliferação celular obtidos pelo ensaio bioquímico (Figura 2). apontam para uma maior proliferação celular no grupo PLA + Laser, apresentando. uma porcentagem de redução de Alamar Blue significativamente maior em. comparação aos outros grupos, principalmente nos intervalos de 48 e 72 h (p<0,01).. Não foram encontradas diferenças significativas (p>0,05; teste de Mann-Whitney). entre os grupos Controle e PLA ao longo do experimento.. Figura 2: Resultados do ensaio de Alamar Blue dos diferentes grupos nos intervalos de 24, 48 e 72h. (*p<0,05; **p<0,01 – teste de Mann-Whitney). Uma crescente redução no grupo PLA+Laser ao longo. dos intervalos evidenciam uma proliferação celular comparada com os grupos Controle e PLA. . Fonte: Autoria própria.. Os resultados do ensaio Live/Dead para os grupos experimentais são exibidos. na Figura 3. As imagens demonstram uma densidade mais alta de células viáveis no. grupo PLA + Laser, algumas exibindo uma morfologia mais arredondada, enquanto. as células dos grupos PLA e Controle apresentaram uma morfologia. predominantemente fusiforme. Uma análise baseada na marcação com calceína-AM. para células viáveis e no homodímero de etídio para células mortas permitiu o cálculo. de uma proporção de células mortas para o número total de células por campo,. revelando um aumento na viabilidade celular no Grupo PLA + Laser,. 20. significativamente maior do que nos grupos Controle (p<0,001) e PLA (p<0,01). A. marcação das células MC3T3-E1 não mostrou diferenças significativas na. porcentagem de células mortas entre os grupos Controle e PLA (p>0,05; teste de. Mann-Whitney).. Figura 3: Fotomicrografias de fluorescências obtidas no Live/Dead Assay para o grupo controle (A),. PLA (B) e PLA + Laser (C) no intervalo de 72h com aumento de 400X. Em D – Avaliação quantitativa. dos grupos para o percentual de células mortas (**p<0,01; ***p<0,001 - teste de Mann-Whitney). Em. conjunto, as microfotografias e dados quantitativos evidenciam um menor número de células mortas. (marcadas em vermelho) no grupo PLA + Laser, além de um número maior de células viáveis por. campo (marcadas em verde). . Fonte: Autoria própria.. 21. A viabilidade celular também foi avaliada pelo ensaio de apoptose-necrose. (anexina V/PI) por citometria de fluxo. A porcentagem de células viáveis foi maior no. grupo PLA + Laser (94%) quando comparado aos grupos PLA (90,7%) e Controle. (92,8%) (Figura 4). Além disso, o grupo PLA + Laser apresentou uma porcentagem. menor de células em relação à progressão para eventos de apoptose celular (Q2 e. Q3), demonstrando que o laser não causa danos celulares às células cultivadas nas. superfícies do filme.. Figura 4: Viabilidade celular dos diferentes grupos no intervalo de 72h avaliada por citometria de fluxo. a partir da marcação com Anexina V/PI. A – Grupo controle, B – Grupo PLA e C – Grupo PLA + Laser.. Q1 - células necróticas, Q2 – células em apoptose tardia, Q3 – Células em apoptose inicial, Q4 – células. viáveis. Um maior número de células viáveis é observado no grupo PLA + Laser e uma diminuição nas. subpopulações relacionadas a apoptose (Q3 e Q2) e necrose (Q1) comparado com os grupos Controle. e PLA.. Fonte: Autoria própria.. 22. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo permitiu identificar o percentual. de células nas fases proliferativas do ciclo. O grupo PLA + Laser exibiu porcentagens. aumentadas de células nas fases S e G2/M em comparação com os grupos Controle. e PLA (Figura 5), com diferenças significativas (p<0,05). Dado que as populações de. células classificadas nas fases S e G2/M compreendem células no próprio estado. proliferativo, esse achado reforça o efeito potencial do laser de baixa intensidade no. crescimento celular e também é consistente com os dados obtidos ensaio de Alamar. Blue. Não foram encontradas diferenças significativas (p>0,05; teste de Mann-. Whitney) entre os grupos Controle e PLA.. Figura 5: Perfil dos diferentes grupos no intervalo de 72h nas fases do ciclo celular (* p<0,05 – teste de. Mann-Whitney). Notadamente, um maior percentual de células em fase proliferativa (S/G2/M) é. observado no grupo PLA + Laser comparado com os demais grupos. . Fonte: Autoria própria.. 23. As imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura (Figura 6) indicam. que o grupo PLA + Laser exibiu maior densidade celular na superfície do filme, com. células assumindo uma morfologia redonda, enquanto as células do grupo PLA. mantiveram uma morfologia fusiforme.. Figura 6: Eletromicrografias das MC3T3-E1 cultivadas sobre os filmes de PLA. A, C – Grupo PLA com. magnificações de 200 e 400X, respectivamente. B, D – Grupo PLA + Laser com magnificações de 200. e 400X, respectivamente. O grupo irradiado exibe maior densidade celular e células com morfologia. mais arredondada em comparação com o grupo não irradiado.. Fonte: Autoria própria.. 24. 4. DISCUSSÃO. Os achados deste estudo indicam que os filmes de PLA produzidos exibem. uma superfície com hidrofilicidade favorável e satisfatória para adesão e proliferação. das células pré-osteoblásticas. É reconhecido que a adesão, migração e proliferação. de linhagens celulares é significativamente influenciada pelas propriedades físico-. químicas da superfície dos biomateriais utilizados em scaffolds para ET. A. molhabilidade, rugosidade e topografia desempenham um papel crucial nos. mecanismos básicos das interações célula-biomaterial (Deng et al, 2015). A escala. topográfica é um importante regulador do comportamento celular, e a nanotopografia. é mais relevante para o conceito de biomimética do que a microtopografia. Isso ocorre. porque as células existem in vivo em interfaces topográficas mais perto da escala. nanométrica do que da escala micrômetro (Lim et al, 2005). Os filmes produzidos. neste trabalho exibiram uma superfície relativamente homogênea, com valor de. rugosidade média 21.43 nm, o que se aproxima ao valor de 22.32 nm encontrado por. Jiao, Xu e Zhou (2012) e ao valor de de 34.00 nm por Dadashi et al (2014), ao. desenvolverem filmes de PLA pela técnica de evaporação de solvente. O método de. evaporação do solvente aplicado para obtenção dos filmes também permitiu a. formação vales em escala nanométrica, verificada pela AFM. A formação desses vales. está relacionada à evaporação do solvente em um ambiente úmido. As moléculas de. água do ar circundante condensam-se na superfície do filme de polímero e as gotas. de água agem como esferas, resultando em vales circulares após a evaporação. (Huang & Thomas, 2015). . Este é o primeiro estudo a relatar um efeito positivo do LBI na atividade. biológica de células pré-osteoblásticas MC3T3-E1 cultivadas em filmes de PLA,. conforme demostrado pelos ensaios de Alamar Blue, Live/Dead, avaliação de. apoptose/morte celular e ciclo por citometria de fluxo e avaliações morfológicas por. MEV. Quando submetidas a LLLI (660 nm; 30 mw; 4 J/cm²), as células MC3T3-E1. exibiram crescente proliferação e viabilidade celular ao longo do experimento. A. escolha deste protocolo de fotobiomodulação usando laser vermelho com. comprimento de onda de 660 nm foi baseada em estudos anteriores in vitro que. descreveram os efeitos positivos do laser vermelho na proliferação de células da. linhagem osteogênica, pré-osteoblastos (incluindo MC3T3-E1) e em células. osteoblásticas em condições de cultura regulares (Deana et al., 2018; Migliario,. 25. Pittarella, Fanuli, Rizzi, & Renò, 2014; Pagin et al., 2014; Oliveira et al., 2016; Oliveira. et al., 2017). Além disso, um estudo realizado por Tani et al. (2018) comparou a. potencialidade da fotobiomodulação no espectro vermelho (635 ± 5 nm) e . infravermelho (NIR, 808 ± 10 nm) e diodo emissor de luz (LED) azul/violeta (405 ± 5. nm) na viabilidade, proliferação, adesão e diferenciação osteogênica de osteoblastos. humanos e foi observado que, comparado ao NIR e ao LED, o laser vermelho aumenta. a expressão de vinculina, de marcadores osteogênicos (Runx-2, fosfatase alcalina,. osteopontina) e a deposição de nódulos mineralizados, sugerindo que o laser. vermelho pode ser uma opção potencialmente eficaz para promover ou melhorar a. regeneração óssea. . No que concerne à escolha da dose, esta é particularmente importante na. fotobiomodulação, pois uma aplicação específica de doses maiores ou menores que. o valor ideal pode resultar em ausência de efeito terapêutico. Sabe-se que na. fotobiomodulação doses mais baixas de luz geralmente são mais benéficas que altas. doses (Chung et al., 2012). A densidade de energia de 4 J/cm² foi escolhida neste. trabalho com base em um artigo anterior relatando aumento da proliferação de células. MC3T3 estimulado por laser vermelho com densidades de energia de 3 e 5 J/cm². (Pagin et al., 2014). Pacheco et al., (2013) demonstrou que o laser vermelho e. infravermelho de baixa intensidade a 90 e 150 J/cm² não estimula o crescimento de. células pré-osteoblásticas e Incerti Parenti et al. (2014) concluiu que densidades de. energia mais baixas (1 e 10 J/cm²) desempenham uma ação bioestimulatória nas. células. Assim, parece ser consenso que baixas doses de irradiação devam ser. usadas na estimulação da linhagem celular osteogênica.. Os mecanismos moleculares exatos do LLLI em células da linhagem. osteoblástica ainda não foram totalmente elucidados (Deana et al., 2018). Tem sido. sugerido que os fótons ativam a enzima citocromo c oxidase na cadeia respiratória. mitocondrial, promovendo aumento do potencial da membrana mitocondrial, levando. à produção de ATP e à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Esses. eventos bioquímicos têm sido apontados como responsáveis pelo controle da. proliferação, viabilidade, diferenciação e apoptose das células da linhagem. osteoblástica (Migliario et al., 2014). Além desses eventos, outras vias associadas à. ação molecular do LBI incluem beta catenina, ciclina D1 e proteína quinase ativada. por mitógeno (de Freitas & Hamblin, 2016). Os resultados do presente estudo. 26. sugerem que os mecanismos biológicos de irradiação a laser são mantidos quando. as células MC3T3 são cultivadas em superfícies de PLA.. A literatura contém um número limitado de estudos que investigam os efeitos. in vitro do LBI na adesão e proliferação de células cultivadas em diferentes. biomateriais e os resultados ainda são contraditórios. Nossos achados corroboram. relatados de Choi et al. (2013), que observaram um efeito positivo do LBI (1 J/cm²) na. sobrevivência e proliferação de células-tronco mesenquimais cultivadas em uma. matriz dérmica acelular, sugerindo o uso de LBI como uma abordagem interessante. para a engenharia de tecidos. Fernandes et al. (2017) mostraram que células. osteoblásticas cultivadas em um arcabouço de biosilicato associado ao ácido poli (D,. L-lático-co-glicólico) (BS/PLGA 80/20) e irradiadas com 10 J/cm² exibiram maior. viabilidade após 24, 48 e 72 h quando comparado a células não irradiadas. . Por outro lado, Rennó et al. (2010) utilizaram uma dose de 10 J/cm² para avaliar. a proliferação de células MC3T3-E1 cultivadas em biosilicato e observaram uma. menor proliferação celular quando comparadas ao grupo não irradiado. Este achado. possivelmente está relacionado a interferências do biomaterial (refração ou absorção. de luz) na ação do laser, um evento físico que não ocorre no filme de PLA. Incerti. Parenti et al. (2013) usaram uma dose de 2 J/cm² em células da linhagem. osteoblástica MG63 cultivadas em arcabouço poroso de hidroxiapatita e não. encontraram diferença significativa entre a proliferação de células irradiadas e não. irradiadas. Todavia, considerando o fato de os autores terem utilizado arcabouços. porosos, provavelmente as células cultivadas não receberem irradiação efetivamente,. um fenômeno não observado para o filme de PLA investigado no presente estudo.. Os ensaios de Live/Dead por microscopia de fluorescência e apoptose/morte. celular por citometria de fluxo com marcação de Anexina/PI revelaram uma tendência. crescente de viabilidade celular no grupo PLA + Laser. Tais achados corroboram as. conclusões de Sussai et al. (2010) e Chu et al (2018), que afirmaram que a. fotobiomodulação exerce efeitos positivos na prevenção da apoptose celular, por. supressão de vias envolvidas na morte celular. Outro achado particular é que a análise. do ciclo celular por citometria de fluxo demonstrou que o grupo Laser + PLA. apresentou maior porcentagem de células nas fases proliferativas do ciclo celular (S. e G2/M), quando comparado aos grupos Controle e PLA. Tal efeito foi relatado em. trabalhos anteriores em que concluíram que a fotobiomodulação aplicada às células. 27. ósseas pode ativar a síntese de proteínas reguladoras do ciclo celular, aumentando a. velocidade do ciclo mitótico ao intensificar a síntese de DNA (Bomfim, Sella,. Thomasini e Plapler, 2018).. Por fim, no que se refere aos aspectos morfológicos, as imagens obtidas por. MEV demonstram que as células MC3T3-E1 no grupo PLA + Laser assumiram uma. morfologia mais arredondada em comparação com uma morfologia fibroblástica no. grupo PLA, o que pode sugerir que o LBI também influencia o fenótipo celular.. Recentemente, Tani et al. (2018) demonstraram que a aplicação de laser vermelho. nas células Saos-2 resultou em um aumento da expressão de vinculina, uma das. proteínas reguladoras de diferentes processos críticos nos osteoblastos, incluindo. crescimento, migração e diferenciação, bem como manutenção de fenótipo.. Em vista dos resultados promissores do presente estudo e voltando à hipótese. proposta no início é possível afirmar que LBI é capaz de exercer efeitos biológicos. importantes e satisfatórios em células pré-osteoblásticas cultivadas em filmes de PLA,. utilizando os parâmetros técnicos já mencionados. Todavia, ainda se faz necessário. estudar as respostas decorrentes de outros efeitos do LBI no comportamento de. células de linhagens osteoblásticas cultivadas em arcabouços, sendo sugerido a. execução de experimentos mais longos, a influência nos fatores osteogênicos,. incluindo o colágeno tipo I, Runx-2, Osteopontina e Osteocalcina. Se tratando dos. biomateriais, modificações têm sido sugeridas para o melhoramento de aplicações,. principalmente se tratando da engenharia de tecidos ósseos. A associação de. polímeros, funcionalização de superfícies e incorporação de fatores de crescimento. são ferramentas de bastante destaque (da Silva et al., 2019). Por fim, a adoção dessas. estratégias possivelmente garantirá resultados ainda mais favoráveis nos. experimentos de engenharia de tecidos ósseos. . 28. 5. CONCLUSÃO. No presente estudo, a utilização do LBI nos parâmetros usados (potência de. 30 mW, comprimento de onda de 660 nm e densidade de energia de 4,0 J/cm²). promoveu um aumento da proliferação e viabilidade de células pré-osteoblásticas. MC3T3 cultivadas na superfície de filmes de PLA. Assim, foi identificado que o laser. exerce respostas favoráveis sobre o tipo celular estudado em contato com um. biomaterial que tem grande potencial, o que pode contribuir em futuros estudos in vitro. e in vivo para engenharia de tecidos ósseos.. 29. REFERÊNCIAS. BLOISE, Nora et al. Investigation of low-level laser therapy potentiality on proliferation. and differentiation of human osteoblast-like cells in the absence/presence of. osteogenic factors. Journal of biomedical optics, v. 18, n. 12, p. 128006, 2013.. BOMFIM, Fernando Russo Costa do et al. Influence of low-level laser irradiation on. osteocalcin protein and gene expression in bone tissue1. Acta cirurgica brasileira,. v. 33, n. 9, p. 736-743, 2018.. CARUSO-DAVIS, Mary K. et al. Efficacy of low-level laser therapy for body contouring. and spot fat reduction. Obesity surgery, v. 21, n. 6, p. 722-729, 2011.. CHOI, Kyuseok et al. Low‐level laser therapy promotes the osteogenic potential of. adipose‐derived mesenchymal stem cells seeded on an acellular dermal. matrix. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials,. v. 101, n. 6, p. 919-928, 2013.. CHU, Yu-Hsiu et al. Low-level laser therapy prevents endothelial cells from TNF-. α/cycloheximide-induced apoptosis. Lasers in Medical Science, v. 33, n. 2, p. 279-. 286, 2018.. CHUAH, Yon Jin et al. Combinatorial effect of substratum properties on mesenchymal. stem cell sheet engineering and subsequent multi-lineage differentiation. Acta. biomaterialia, v. 23, p. 52-62, 2015.. CHUNG, Hoon et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of. biomedical engineering, v. 40, n. 2, p. 516-533, 2012.. DADASHI, Saeed et al. Functional properties of biodegradable nanocomposites from. poly lactic acid (PLA). International Journal of Nanoscience and Nanotechnology,. v. 10, n. 4, p. 245-256, 2014.. da SILVA, Talita Nascimento et al. Controlling burst effect with PLA/PVA coaxial. electrospun scaffolds loaded with BMP-2 for bone guided regeneration. Materials. Science and Engineering: C, v. 97, p. 602-612, 2019.. de FREITAS, Lucas Freitas; HAMBLIN, Michael R. Proposed mechanisms of. photobiomodulation or low-level light therapy. IEEE Journal of selected topics in. quantum electronics, v. 22, n. 3, p. 348-364, 2016.. DEANA, Alessandro Melo et al. The impact of photobiomodulation on osteoblast-like. cell: a review. Lasers in medical science, v. 33, n. 5, p. 1147-1158, 2018.. 30. DENG, Yi et al. Effect of surface roughness on osteogenesis in vitro and. osseointegration in vivo of carbon fiber-reinforced polyetheretherketone–. nanohydroxyapatite composite. International journal of nanomedicine, v. 10, p.. 1425, 2015.. FARIVAR, Shirin; MALEKSHAHABI, Talieh; SHIARI, Reza. Biological effects of low. level laser therapy. Journal of lasers in medical sciences, v. 5, n. 2, p. 58, 2014.. FERNANDES, K. R. et al. Biosilicate/PLGA osteogenic effects modulated by laser. therapy: In vitro and in vivo studies. Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology, v. 173, p. 258-265, 2017.. GAJENDIRAN, Mani et al. Conductive biomaterials for tissue engineering. applications. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, v. 51, p. 12-26,. 2017.. GINANI, Fernanda et al. Low-level laser irradiation induces in vitro proliferation of stem. cells from human exfoliated deciduous teeth. Lasers in medical science, v. 33, n. 1,. p. 95-102, 2018.. GRÉMARE, Agathe et al. Characterization of printed PLA scaffolds for bone tissue. engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A, v. 106, n. 4, p. 887-. 894, 2018.. HSU, Shan-hui et al. The effect of laser preexposure on seeding endothelial cells to a. biomaterial surface. Photomedicine and Laser Surgery, v. 28, n. S2, p. S-37-S-42,. 2010.. HUANG, Chao; THOMAS, Noreen L. Fabricating porous poly (lactic acid) fibres via. electrospinning. European Polymer Journal, v. 99, p. 464-476, 2018.. INCERTI-PARENTI, Serena et al. Different doses of low-level laser irradiation. modulate the in vitro response of osteoblast-like cells. Journal of biomedical optics,. v. 19, n. 10, p. 108002, 2014.. INCERTI-PARENTI, Serena Incerti et al. Effect of low-level laser irradiation on. osteoblast-like cells cultured on porous hydroxyapatite scaffolds. Annali dell'Istituto. superiore di sanità, v. 49, p. 255-260, 2013.. JIAO, Yanpeng; XU, Jiqing; ZHOU, Changren. Effect of ammonia plasma treatment on. the properties and cytocompatibility of a poly (l-lactic acid) film surface. Journal of. Biomaterials Science, Polymer Edition, v. 23, n. 6, p. 763-777, 2012.. KARU, Tiina I. Multiple roles of cytochrome c oxidase in mammalian cells under action. of red and IR‐A radiation. IUBMB life, v. 62, n. 8, p. 607-610, 2010.. 31. KHAN, Ferdous; TANAKA, Masaru. Designing smart biomaterials for tissue. engineering. International journal of molecular sciences, v. 19, n. 1, p. 17, 2018.. KIYOSAKI, Takeshi et al. Low-level laser therapy stimulates mineralization via. increased Runx2 expression and ERK phosphorylation in. osteoblasts. Photomedicine and laser surgery, v. 28, n. S1, p. S-167-S-172, 2010.. KOTA, Arun K.; KWON, Gibum; TUTEJA, Anish. The design and applications of. superomniphobic surfaces. NPG Asia Materials, v. 6, n. 7, p. e109-e109, 2014.. LIANG, Yan‐Sheng; ZHAO, Wei; CHEN, Guo‐Qiang. Study on the biocompatibility of. novel terpolyester poly (3‐hydroxybutyrate‐co‐3‐hydroxyvalerate‐co‐3‐. hydroxyhexanoate). Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official. Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials,. and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for. Biomaterials, v. 87, n. 2, p. 441-449, 2008.. LIM, Jung Yul et al. Osteoblast adhesion on poly (L-lactic acid)/polystyrene demixed. thin film blends: effect of nanotopography, surface chemistry, and. wettability. Biomacromolecules, v. 6, n. 6, p. 3319-3327, 2005.. MARQUES, Márcia Martins et al. Photobiomodulation of dental derived mesenchymal. stem cells: a systematic review. Photomedicine and laser surgery, v. 34, n. 11, p.. 500-508, 2016.. MEDINA-HUERTAS, Rosa et al. The effects of low-level diode laser irradiation on. differentiation, antigenic profile, and phagocytic capacity of osteoblast-like cells (MG-. 63). Lasers in medical science, v. 29, n. 4, p. 1479-1484, 2014.. MIGLIARIO, Mario et al. Laser-induced osteoblast proliferation is mediated by ROS. production. Lasers in medical science, v. 29, n. 4, p. 1463-1467, 2014.. MURPHY, Ciara M. et al. Cell-scaffold interactions in the bone tissue engineering. triad. Eur Cell Mater, v. 26, n. 4, p. 120-132, 2013.. OLIVEIRA, Flávia A. et al. Low intensity lasers differently induce primary human. osteoblast proliferation and differentiation. Journal of Photochemistry and. Photobiology B: Biology, v. 163, p. 14-21, 2016.. OLIVEIRA, Flávia Amadeu et al. Low level laser therapy modulates viability, alkaline. phosphatase and matrix metalloproteinase-2 activities of osteoblasts. Journal of. Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 169, p. 35-40, 2017.. PACHECO, Pedro Silva et al. Laser phototherapy at high energy densities do not. stimulate pre-osteoblast growth and differentiation. Photomedicine and Laser. Surgery, v. 31, n. 5, p. 225-229, 2013.. 32. PAGIN, Marina Tochetti et al. Laser and light-emitting diode effects on pre-osteoblast. growth and differentiation. Lasers in medical science, v. 29, n. 1, p. 55-59, 2014.. PHAECHAMUD, Thawatchai; CHITRATTHA, Sasiprapa. Pore formation mechanism. of porous poly (DL-lactic acid) matrix membrane. Materials Science and. Engineering: C, v. 61, p. 744-752, 2016.. PINTO, Karina Nogueira Zambone et al. Effects of Biosilicate® scaffolds and low-level. laser therapy on the process of bone healing. Photomedicine and laser surgery, v.. 31, n. 6, p. 252-260, 2013.. QUARTO, Rodolfo; GIANNONI, Paolo. Bone tissue engineering: past–present–future.. In: Mesenchymal Stem Cells. Humana Press, New York, NY, 2016. p. 21-33.. RENNÓ, Ana Claudia Muniz et al. Effect of 830 nm laser phototherapy on osteoblasts. grown in vitro on Biosilicate® scaffolds. Photomedicine and laser surgery, v. 28, n.. 1, p. 131-133, 2010.. SAINI, P.; ARORA, M.; KUMAR, MNV Ravi. Poly (lactic acid) blends in biomedical. applications. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 107, p. 47-59, 2016.. STEIN, A. et al. Low-level laser irradiation promotes proliferation and differentiation of. human osteoblasts in vitro. Photomedicine and Laser Therapy, v. 23, n. 2, p. 161-. 166, 2005.. SUSSAI, Daniela Aparecida et al. Low-level laser therapy attenuates creatine kinase. levels and apoptosis during forced swimming in rats. Lasers in Medical Science, v.. 25, n. 1, p. 115-120, 2010.. TANI, Alessia et al. Red (635 nm), near-infrared (808 nm) and violet-blue (405 nm). photobiomodulation potentiality on human osteoblasts and mesenchymal stromal. cells: a morphological and molecular in vitro study. International Journal of. Molecular Sciences, v. 19, n. 7, p. 1946, 2018.. TYLER, Betty et al. Polylactic acid (PLA) controlled delivery carriers for biomedical. applications. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 107, p. 163-175, 2016.