1 INTRODUÇÃO
A malária é uma doença parasitária que causou inúmeros danos a milhões de pessoas nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Os impactos sociais, econômicos e políticos desta doença sobre a humanidade foram enormes, durante vários séculos. O subdesenvolvimento é uma constante nas áreas endêmicas, uma vez que a população doente fica com sua capacidade de trabalho sensivelmente diminuída. Esse impacto vem desde épocas remotas, haja vista que Hipócrates, em 314-37 a.C. já descrevia e caracterizava a malária clinicamente. A descoberta do agente etiológico se deu em 1880, por Charles Alphonse Laveran. O conhecimento do mecanismo de transmissão através de um vetor ocorreu muitos anos depois, pois acreditava-se que a malária era contraída através do ar contaminado (mal-aria). Em 1897, Ronald Ross descobriu oocistos no estômago de mosquitos que haviam se alimentado de sangue contaminado com malária. No ano seguinte, na Índia, Ross conseguiu transmitir a malária aviária, passando o plasmódio de ave a ave através de um vetor, um mosquito do gênero Culex Linnaeus, 1758. Esses estudos permitiram que Grassi, Bastianelli e Bignami concluíssem suas pesquisas sobre malária, descobrindo em 1899, que a transmissão da malária humana ocorre através da picada de mosquitos do gênero
Anopheles Meigen, 1818 (NEVES, 2004).
1.1. MALÁRIA NO MUNDO E NO BRASIL
No mundo, há pelo menos 107 países e territórios endêmicos de malária. O maior foco de transmissão é na África Sub-Sahariana onde ocorrem 90% dos casos do planeta. A malária é endêmica em 53 países da África, sendo que oito deles situam-se ao sul do continente. Nas Américas, a enfermidade é endêmica em
21 países, já na Europa em 04 e na região leste do Mediterrâneo aparece em 14, e ainda no sudeste Asiático. Estima-se que, em todo o mundo, a cada ano surjam cerca de 110 milhões de novos casos de malária, ocorrendo de 01 a 02 milhões de óbitos. Dentre os 21 países das Américas, 11 estão ao Sul: Argentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Paraguai, Peru, Suriname e Venezuela. Os outros 10 países são: Belize, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicarágua e Panamá, junto com República Dominicana e Haiti (WHO, 2005).
Essa doença caracteriza-se por desencadear acessos periódicos de febres intensas, que debilitam profundamente o doente. A malária provoca lesões no fígado, baço e em outros órgãos, além de anemia profunda devido à destruição maciça dos glóbulos vermelhos que são parasitados pelo Plasmodium para reproduzir-se (NEVES, 2004).
A malária é mundialmente um dos mais sérios problemas de saúde pública, é uma doença infecciosa febril, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero
Plasmodium, as quatros espécies que podem causar a malária humana são:
Plasmodium vivax Grassi & Feletti, 1989.
Plasmodium falciparum Welch, 1897.
Plasmodium malariae Laveran, 1922.
Plasmodium ovale Stephens, 1922.
As três primeiras ocorrem no Brasil, porém a última é restrita ao continente Africano, local onde esta espécie é a mais prevalente (OMS, 2005).
A malária está presente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (figura1), sendo que as maiores taxas de incidência são observadas na África (onde ocorrem 90% dos casos do globo), na Ásia e nas Américas (WHO, 2005).
Um elevado índice de morbidade afeta cerca de 300 a 500 milhões de pessoas a cada ano, contribuindo para uma elevada mortalidade, estimada em cerca de 1 milhão de óbitos anualmente. Diariamente, na África, morrem 3000 crianças e, todos os anos, ao menos um milhão e outras centenas milhões de pessoas adoecem gravemente, principalmente na África Subsaariana (WHO, 2005). Apesar, desses números, a malária, é hoje, uma doença focal na maior
parte do mundo. Apenas algumas regiões, em cada país, continuam apresentando transmissão natural da infecção.
Figura 1. Mapa da distribuição da malária no Mundo. Fonte: OMS, 2005.
Durante os primeiros anos do século XX, a transmissão da malária ocorreu em toda a América, desde o Canadá até Argentina e continua a existir. Calcula-se que 175 milhões de pessoas vivem em zonas com algum risco, onde 58% habitam em zonas de baixo risco, 24% em zonas de risco moderado e 18% em zonas de alto risco. Aproximadamente 87 milhões de pessoas vivem em zonas onde a transmissão ocorreu anteriormente e hoje estão expostas a um risco muito baixo de contaminação. No entanto, cerca de 70 milhões de pessoas habitam áreas de risco de transmissão de malária, envolve nove países que compartilham a selva pluvial amazônica (Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Peru, Suriname e Venezuela) [OPAS, 2004].
No Brasil, a malária é a mais expressiva das endemias. Está presente, principalmente na Amazônia, cujas condições climáticas, de hidrografia abundante, chuvas e enchentes freqüentes e ainda processos de ocupações desordenadas, favorecem criadouros dos vetores, (TADEI, 1986, 1993, 1999; TADEI et al., 1988, 1998; BARATA, 1995). Observa-se aumento nas notificações de casos da doença no segundo semestre do ano na Amazônia. Provavelmente, este fator está
associado ao período após as chuvas, pois estas propiciam condições para maior proliferação do mosquito responsável pela transmissão da doença.
Atualmente no Brasil, a malária está concentrada na região norte, que inclui os estados do Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins. Há também registros de casos no Maranhão e Mato Grosso. Dessa forma abrangendo todos os nove estados que formam a Amazônia Legal, totalizando 807 municípios e representando 99,5% do total de casos no país (MS, 2006).
No Brasil, até 1940, a malária atingia grande parte do território nacional e se constituía num verdadeiro desafio para a colonização. Não apenas para a Amazônia, mas para várias áreas litorâneas do sudeste e da bacia dos rios Paraná (estado do Paraná), São Francisco e Rio Doce (estado de Minas Gerais) (PESSOA, 1972).
Em 1965 foi adotada pelo Brasil, a estratégia de erradicação da malária preconizada pela OMS, baseada na ação intradomiciliar do Diclorodifeniltricloroetano (DDT) contra os anofelinos transmissores e no uso de drogas antimaláricas para esgotamento das fontes de infecção (seres humanos parasitados pelos plasmódios). Esta estratégia foi capaz de eliminar a malária em extensas áreas do território brasileiro (regiões Nordeste, Sudeste, Centro-Oeste e Sul) onde uma parcela significativa da nossa população vivia sob o risco de contrair a doença (LOIOLA et al., 2002).
No Brasil, o uso do DDT foi proibido desde 1985 (WHO, 1986; OPAS, 1986). A contínua aplicação dos inseticidas, em larga escala, levou as espécies de
Anopheles, a desencadearem o processo de resistência. O primeiro caso foi
observado em 1951, com A. sacharovi, na Grécia. A OMS, em 1958, listou 18 espécies resistentes ao DDT em todo o mundo (BROWN, 1986).
A partir da década de 70, os projetos de desenvolvimento da Amazônia, que tinha como escopo a abertura de estradas, construções de hidroelétricas, expansão de áreas de garimpo, entre outros, promoveram uma grande migração interna no território brasileiro, com alterações ambientais importantes e exposição de grande contingente populacional a área malarígena. Essa situação provocou a dispersão da infecção pelas regiões Norte e Centro-Oeste, com um aumento significativo do número de casos, passando-se a alcançar níveis de 450 a 500 mil casos anuais, culminando no ano de 1999, com o registro de 635.646 casos. As novas fronteiras para o desenvolvimento da Amazônia provocaram profundas
alterações ambientais, suportadas em um modelo econômico de crescimento que falhou em assegurar ao homem os mecanismos de proteção social (TADEI et al, 2007).
De acordo com os dados do SIVEP (Sistema de Vigilância Epidemiológica), no período de 1999 até 2002, nota-se redução gradativa de casos de malária na Amazônia Legal, em decorrência da intensificação das ações de combate a enfermidade. No entanto, não houve sustentabilidade e o registro de casos da doença voltou a crescer gradativamente no período de 2003 até 2005, com uma redução em 2006, da ordem de 60 mil, isto é, 10% de redução em relação ao ano de 2005.
A distribuição, por estados brasileiros, dos casos de malária registrados em 2006, demonstra que a ocorrência da doença não é homogênea, pois os estados do Amazonas, Rondônia, Pará e Acre foram responsáveis por 87,9% dos casos, sendo que três municípios, Cruzeiro do Sul, Manaus e Porto Velho, notificaram 22,5% desse percentual.
O desmatamento para extração de madeira, criação de gado, agricultura e assentamentos não oficiais têm contribuído para o aumento da transmissão da doença. Outro fator colaborador é o aumento dos criadouros do mosquito vetor da malária em função da atividade de piscicultura, com a construção de tanques artificiais, seja nos quintais dos domicílios ou nas periferias de diversas cidades da região Amazônica (TADEI, 2001; TADEI et al., 2004).
A variação dos indicadores do ano de 2006, em relação a 2005, mostra redução de casos em sete estados. A maior redução foi no estado do Tocantins, em torno de 47% dos casos. Entretanto, Acre e Amapá apresentaram incremento de 63,4% e 3,8%, respectivamente. Verificou-se que, apesar de a redução até 2002 ter sido expressiva, houve a partir desse ano um progressivo incremento, refletindo as dificuldades na sustentação das estratégias até então utilizadas para o controle da malária (MS, 2006).
Na Amazônia Legal, as infecções causadas pela espécie de P. vivax prevalecem. Em 2006, foram registrados em torno de 396 mil casos de malária causada por esta espécie, correspondendo a 73,4% das notificações (SIVEP, 2006). Este alto índice de infecção por P. vivax foi também observado por Tadei & Dutary-Thatcher (2000), analisando os anofelinos do Amazonas. Os autores
relataram mosquitos infectados por P. vivax duas vezes e meia a mais em relação a P. falciparum e quase trinta vezes a mais do que P. malarie.
A incidência parasitária anual (IPA) da malária na Amazônia Legal, no período de 2003 até 2006, ficou entre 18,3 a 26,6 casos por mil habitantes (hab.). Houve uma progressão deste indicador, no período de 2003 até 2005, e redução em 2006, quando se registrou incidência de 22,9 casos para cada 1 mil habitantes (hab.). Nesta região, no ano de 2006, os estados do Acre, Rondônia e Amazonas foram classificados como áreas de alta risco de transmissão (IPA>50/1.000 hab.), Roraima, Amapá e Pará como área de médio risco (IPA entre 10 – 49/1.000 hab.) e os estados do Mato Grosso, Maranhão e Tocantins de baixo risco (IPA<10/1.000 hab.). Quando comparadas as incidências dos anos de 2006 e 2005, todos os estados apresentaram redução, exceto o Acre (MS, 2006).
Cerca de 10% da população da Amazônia Legal, que corresponde a 2,4 milhões de pessoas, vive em áreas de alto risco de transmissão de malária, abrangendo 90 municípios. Esse total de municípios diminuiu 15,1% em relação ao ano de 2005, onde eram 106 municípios de alto risco de transmissão da malária nessa região (MS, 2006).
A situação epidemiológica da malária vem agravando-se com o acréscimo de casos em áreas urbanas (TADEI et al., 2007). A malária urbana e peri urbana, constituem um problema da mais alta relevância na Amazônia. A transmissão da doença é intensa na periferia dessas regiões, decorrente da proximidade com a mata marginal e a intensidade vai se reduzindo à medida que se adentra nos centros das cidades. A migração de populações entre áreas endêmicas e não endêmicas de malária, associada às condições socioeconômicas, contribuem com o aumento da incidência em áreas urbanas (TADEI, 1993, 2001; TADEI et al., 1998, 2007; ROCHA, 2002). Algumas cidades como Manaus/AM e Porto Velho/RO apresentam extensas áreas de aglomerados urbanos, principalmente em áreas de periferia, devido a migração em busca de oportunidades de trabalho. Como conseqüência, esses municípios concentraram 14,2% do total de casos de malária ocorridos na região amazônica, em 2006. Além desses municípios, é importante destacar também a região do Alto Juruá, no Acre, que foi responsável, em 2006, por 14,3% das notificações, com grande concentração de casos em área urbana (MS, 2006).
No estado do Amazonas, o índice de malária é crescente ao longo dos anos, com a ampliação dos espaços de transmissão, inclusive invadindo áreas historicamente de baixa prevalência. No período de 1999 a 2003, o comportamento da malária oscilou entre avanços e recuos. Em 2004 e 2005 houve, no estado, um incremento do índice de notificação da doença, apresentando os seguintes números de casos: 1999, 167.722; 2000, 96.026; 2001, 48.385; 2002, 70.223; 2003, 140.642; 2004, 147.349 e em 2005, 222.545. No ano de 2006, durante o mês de abril, houve uma redução de 42% nos casos de malária, o que significa que 15 mil pessoas deixaram de adoecer, mesmo assim ainda foi registrado um total de 540.000 casos na Amazônia Legal (TADEI et al., 2007).
De janeiro a outubro de 2007, segundo dados do SIVEP, foram registrados quase 369 mil casos de malária na região Norte do Brasil e, deste total, cerca de 45% no Amazonas, estado que lidera os casos da doença no país.
No município de Presidente Figueiredo, no período de 01/01/2004 a 31/03/2007, foram notificados 15.250 casos de malária vivax, de um total de 104.285 exames realizados. Dados do resumo epidemiológico (SIVEP) para o município de Presidente Figueiredo no ano de 2007, mostraram que foram realizados 28.203 exames de pesquisa de plasmódio, sendo 3.003 casos positivos e destes, 2.580 correspondem à malária por P. vivax.
De acordo com dados do SIVEP MALÁRIA, da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS), a incidência da doença na Amazônia diminuiu em 2007, entretanto continuou prejudicando o nível de saúde da população e o desenvolvimento socioeconômico da região.
1.2. VETORES DA MALÁRIA
No Brasil a malária é transmitida por fêmeas de mosquitos do gênero
Anopheles, destacando-se pela sua importância o Anopheles darlingi Root, 1926
(DEANE et al., 1948; DEANE, 1986; TADEI et al., 1988; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA et al., 1989; TADEI & DUTARY-THATCHER, 2000). Nem todas as espécies de Anopheles são transmissoras da malária humana. Entretanto, Tadei & Dutary-Thatcher (2000) comprovaram que A. darlingi (figura 2) é o principal vetor e que as demais espécies são vetores ocasionais, não desencadeando surtos epidêmicos.
Este gênero compreende cerca de 400 espécies, das quais apenas um número reduzido tem importância para a epidemiologia da malária, em cada região brasileira. Cinco espécies são consideradas vetores principais no Brasil (CABIANCA et al., 2000):
Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926.
Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis Lynch Arribalzága, 1878.
Anopheles (Nyssorhynchus) aquasalis Curry, 1932.
Anopheles (Kerteszia) cruzi Dyar & Knab, 1908.
Anopheles (Kerteszia) bellator Dyar & Knab, 1906.
Figura 2. Anopheles darlingi, principal vetor da malária no Brasil. FONTE: Laboratório de Malária e Dengue do INPA.
O Anopheles gambiae Giles, 1902 foi introduzido no nordeste brasileiro possivelmente em 1930, e lá esteve até 1940, causando, entre 1938 e 1939, uma das mais graves epidemias de malária registradas no Brasil. Trata-se de um mosquito africano, cujas fêmeas são altamente antropofílicas e endófilas. Suas larvas são normalmente encontradas em pequenas coleções de águas limpas no solo, pobres em vegetação e bastante expostas ao sol. As cacimbas, poços rasos feitos pelos nordestinos para obtenção de água, constituíram importantes focos
desse mosquito durante sua permanência no Brasil. No entanto, foi erradicado do país em 1940. Atualmente, o Anopheles gambiae é o principal vetor da malária na África (CONSOLI & LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, 1994).
Comumente chamados de mosquitos, muriçocas, carapanãs e pernilongos, esses organismos são insetos de pequeno porte e de corpo delgado, reconhecendo-se a existência de cerca de 3600 espécies (CROSSKEY, 1988). O desenvolvimento dos mosquitos ocorre por metamorfose completa (holometabólica), apresentando os estágios de ovo, larva, pupa e adulto. Durante o desenvolvimento a larva passa por quatro estádios L1, L2, L3 e L4, originando quatro ecdises e uma pupal. Os adultos são dióicos. Todos os estágios são aquáticos, com exceção do último (adulto). Cada espécie de culicídeo comporta-se como se representasse duas populações distintas, ocupando ecótopos diferentes. Na fase adulta, ocorre a reprodução e dispersão. (FORATTINI, 2002).
As fêmeas saem em busca de suas fontes alimentares, vertebrados incluindo os seres humanos, no período crepuscular. As espécies que procuram principal ou unicamente, o sangue de animais (mamíferos e aves, por exemplo) são qualificadas pela maioria dos especialistas como “zoófilas”, enquanto as que picam, freqüente ou preferencialmente, o ser humano, são ditas antropófilas. A antropofilia é condição fundamental para que uma espécie de anofelinos seja considerada vetora em potencial de malária humana. Anofelinos que costumam penetrar nas habitações humanas participam mais ativamente da transmissão da malária do que as espécies que permanecem, de preferência, no exterior (extra domicílio). Esse traço de comportamento, qualificado como domesticidade ou endofilia da espécie, é levado em consideração nos estudos epidemiológicos, fornecendo um dos parâmetros para medir a eficiência dessa espécie como vetora da doença e ajudando a planejar a aplicação de inseticidas no interior das casas (CABIANCA et al., 2000).
Tadei & Dutary Thatcher (2000), estudaram várias espécies de Anopheles
(Nyssorhynchus) na Amazônia a fim de se determinar sua importância na
transmissão da malária. Das 33 espécies de Anopheles, de ocorrência conhecida na Amazônia, apenas 8 foram encontradas infectadas por Plasmodium. O principal vetor - A. darlingi mostra acentuada antropofilia e um ciclo contínuo de atividade que dura a noite inteira, mas que tem picos ao anoitecer e ao amanhecer. O A.
podem mudar dependendo de uma série de fatores externos, densidade populacional e aqueles relacionados às atividades humanas (TADEI et al., 1993).
1.3. O CICLO DA MALÁRIA
O ciclo de vida do Plasmodium envolve uma fase no vetor e outra no hospedeiro que pode ser humano ou animal. O ciclo é do tipo heteroxênico, onde o homem é o hospedeiro intermediário e o mosquito o definitivo. No homem ocorre com reprodução assexuada do tipo esquizogonia, e no vetor com reprodução sexuada do tipo esporogonia (NEVES, 2004).
O ciclo tem início quando uma fêmea do gênero Anopheles, ao exercer a hematofagia, ingere as formas sanguíneas infectantes do Plasmodium, os gametócitos (figura 3). Estes se desenvolvem no estômago do vetor, onde o gametócito feminino amadurece e transforma-se no macrogameta e o gametócito masculino, por um processo de exoflagelação, dá origem a vários microgametas. Um microgameta e um macrogameta formam o ovo ou zigoto. Esta etapa dura em torno de uma hora, após o repasto infectante. Logo após, o ovo, que se encontra na luz do estômago, começa a migrar o epitélio estomacal, aonde irá encistar-se. A fase móvel chama-se oocineto e a fase encistada, oocisto. Por um processo de esporogonia, no interior do oocisto formam-se milhares de esporozoítos. Esses rompem a parede do oocisto, invadem a cavidade geral do mosquito e chegam às glândulas salivares. A essa etapa do ciclo, que ocorre no vetor, é dado o nome de Esporogonia e dura em torno de 4 a 15 dias, dependendo da temperatura e umidade do ambiente (NEVES, 2004).
O inseto, ao exercer novamente a hematofagia, inocula, juntamente com a saliva, 10 a 20 esporozoítos que caem na corrente sanguínea do homem e migram até os hepatócitos, iniciando o ciclo tissular ou pré-eritrocítico. No hepatócito se multiplicam completando a esquizogonia com a reprodução de milhares de merozoítos (10.000 para o P. vivax). Esta fase exoeritrocítica apresenta para cada espécie de plasmódio humano os seguintes tempos médios de evolução: P.
falciparum: 6 dias, P. vivax: 8 dias e P. malarie: 14 dias. Após este período, os
hepatócitos se rompem, liberando milhares de merozoítos que chegam até a corrente sanguínea para invadir as hemácias e iniciar o ciclo eritrocítico. O
merozoíto invade as hemácias, com o auxílio dos receptores moleculares, no caso específico do Plasmodium vivax, a proteína eritrocitária DARC (DARC, o inglês: “Duffy Antigen Receptor for Chemokines”). O ciclo eritrocítico desenvolve-se até que após completar a esquizogonia, ocorre o rompimento das hemácias liberando merozoítos que podem invadir novas hemácias ou diferenciar-se, para formar os gametócitos. Estas formas sanguíneas permanecem na circulação e são chamadas formas infectantes, pois o mosquito ao picar o homem infectado, ingere gametócitos dando início a um novo ciclo esporogônico.
Figura 3. Ciclo de vida do Plasmodium (Disponível em:<www.dpd.cdc.gov> Acessado em: 09/05/08).
A esquizogonia sanguínea se processa em intervalos regulares para cada espécie e está associada aos sintomas clínicos: P. falciparum: 36 a 48 horas (terçã maligna), P. vivax: 48 horas (terçã benigna) e P. malarie: 72 horas (quartã benigna).
A febre e o acesso malárico, juntamente com a anemia, são os três elementos patognomônicos da infecção malárica. O acesso malárico ocorre, com a intermitência característica para cada espécie de Plasmodium, após a febre intensa, caracterizado por: calafrios, calor e suor (NEVES, 2004).
1.4. O SISTEMA DE GRUPO SANGÜÍNEO DUFFY
1.4.1. A Proteína Duffy
O grupo sanguíneo Duffy foi descoberto quando Cutbush e Ikin detectaram, no início da década de 50, os primeiros anticorpos desse sistema. O anticorpo anti-Fya detectado no soro de um hemofílico politransfundido, recebeu este nome em homenagem ao paciente, Sr. Duffy, que reagia com 64% das 205 amostras de sangue testadas de indivíduos não aparentados na população inglesa. No ano seguinte, Ikin et al. (1951) descreveram o anti-Fyb, anticorpo que define o par antitéticos do antígeno Fya (CUTBUSH & MOLLISON, 1950; IKIN et al., 1951).
A Sociedade Internacional de Transfusão Sangüínea (ISBT, do inglês “International Society Blood Transfusion”) reconhece 29 sistemas de grupos sanguíneos que agrupam antígenos expressos na membrana externa dos eritrócitos (figura4). O Sistema de grupo sangüíneo Duffy é classificado pela ISBT pelo número 008 (GARRATTY et al., 2000; STORRY & OLSSON, 2004; DANIELS et al., 2004). Os antígenos eritrocitários são carboidratos ou proteínas localizados em glicolípides ou proteínas da superfície da membrana eritrocitária ou ainda em proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol, e atravessam uma ou múltiplas vezes a membrana da hemácia (NEOTE et al., 1994).
Um dos aspectos interessantes do Duffy é sua função de receptor de merozoítos de Plasmodium vivax e de Plasmodium knowlesi, que são, respectivamente, os agentes responsáveis por diferentes formas de malária no homem e no macaco (JENS et al., 2005). Essa função receptora foi colocada em evidência por Miller et al. (1975), mostrando a resistência dos eritrócitos Fy (a-b-) à invasão dos merozoítos de P. knowlesi que, naquela época, eram cultivados in
vitro. Em 1989, pesquisadores confirmaram os mesmos experimentos com o Plasmodium vivax e puderam concluir que a glicoproteína eritrocitária carreando os
determinantes Duffy é necessária como ligante no processo de invasão eritrocitária pelo merozoíto de Plasmodium vivax (BARNEWELL et al., 1989).
Figura 4. Modelo esquemático da membrana da hemácia e seus 29 sistemas de antígenos, incluindo a proteína eritrocitária Duffy com as sete hélices hidrofóbicas, um domínio amino-terminal extracelular, três alças citoplasmáticas e um domínio carboxi-terminal citoplasmático (REID, 2004).
A partir de 1989, com a purificação da proteína Duffy e a clonagem do cDNA, foi possível intensificar os estudos relacionados aos genes que codificam o antígeno Duffy (CHAUDHURI et al., 1989, 1993). Atualmente, sabemos que a glicoproteína Duffy é composta de 338 aminoácidos, e é expressa na membrana externa das hemácias, sendo um receptor de membrana heptahelical que possui uma massa molecular de 35-43 kDa (TANNER et al., 1988). A figura 4 mostra a proteína e a presença de sete hélices hidrofóbicas caracterizando um domínio amino-terminal extracelular, três alças citoplasmáticas e um domínio carboxi-terminal citoplasmático (CHAUDHURI et al., 1989; NEOTE et al., 1994).
A Glicoproteína Duffy (GPD) é N-glicosilada, a adição do sacarídeo ocorre no nitrogênio da amida das cadeias laterais do aminoácido Asparagina (Asn). Portanto, possui dois sítios de glicosilação, nos aminoácidos Asn 16 e Asn 27, e
NH2 NH2 NH2 NH2 NH2 COOH COOH COOH COOH P1 P Pk ABO Hh Lewis I GPA/GPB (MNSs) GPC/GPD (Gerbich) CD99 (Xg) CD147 (Ok) CR1 (CD35; Knops) CD239 (Lutheran, B-CAM) ICAM-4 (LW) ERMAP (Sc) CD44 (Indian) CD234 (Duffy) Band 3 (Diego) Rh Kx AQP-1 (Colton) Kidd AQP-3 (GIL) CD151 (Raph) AChE (Yt) Dombrock (ART4) DAF (CD55, Cromer) CD108 (JMH) Emm CD238 (Kell) Carbo hidratos- Citoplasma Exterior
essa variação do grau de N-glicosilação contribui para a faixa da massa molecular (CHAUDHURI et al., 1989).
A proteína Duffy, também chamada de DARC (DARC, do inglês: ““Duffy
Antigen Receptor for Chemokines”), é expressa na membrana de eritrócitos (RBC,
- do Inglês “red blood cell”) e em diversos tecidos não eritróides como rim, baço, coração, pulmão, músculo, duodeno, pâncreas, placenta, cérebro, intestino, glândula tireóide e em células de Purkinje do cerebelo, e pertence à subfamília de receptores de citocinas (HADLEY & PEIPER, 1997).
A proteína Duffy (CD234), pertence à classe de moléculas do Complexo de Histocompatibilidade Principal (CHP), tem como característica mais notável o seu enorme polimorfismo. O termo polimorfismo vem da genética de populações e significa que, numa determinada população, um lócus gênico é ocupado por duas ou mais formas alélicas (BERNHARD et al., 1990).
Em um estudo realizado em doadores de sangue na cidade de São Paulo, a freqüência fenotípica encontrada, para o sistema de grupo sangüíneo Duffy, foi de 19,8% em caucasóides e 14% em negros para o fenótipo Fy(a+b-). Quanto ao fenótipo Fy(a+b+), a casuística foi de 41,4% para caucasóides e 1,6% para negros. O fenótipo Fy(a-b+) observado foi de 37,8% para caucasóides e 17,5% para negros. Em caucasóides, a freqüência do fenótipo Fy(a-b-) foi de 1,1%, enquanto para os negros foi de 66,9%, sendo esse fenótipo considerado um marcador de raça negra (NOVARETTI et al., 2000).
Cavasini et al. (2006) analisaram os fenótipos Duffy de dois grupos de indivíduos, doadores de sangue e infectados com P. vivax, de quatro estados da região amazônica: Amapá, Pará, Rondônia e Acre. Os dados encontrados pelos autores mostram uma alta freqüência do fenótipo Fyab em infectados e uma freqüência significativa do fenótipo nulo em doadores de sangue. A tabela 1 mostra a freqüência fenotípica Duffy em doadores de sangue dos quatro estados estudados.
Tabela 1 – Freqüência (%) fenotípica Duffy em doadores de sangue em quatro estados da Amazônia - 2006. FENÓTIPOS Para Amapá Rondônia Acre TOTAL
Fya 32 37 26 26 30,25
Fyb 33 44 34 34 36,25
Fyab 27 28 37 37 32,25
Fy nulo 8 8 3 3 5,5
FONTE: CAVASINI et al. 2006.
1.4.2. O gene DUFFY , seus alelos e o equilíbrio gênico
O gene FY é constituído por dois exons e seu lócus foi mapeado no braço longo do cromossomo 1q22-q23, cujo produto do gene é uma glicoproteína ácida, chamada de glicoproteína Duffy (MATHEW et al., 1994). Existem dois produtos desse gene, o transcrito maior, com 336 aminoácidos, chamado beta e o menor, com 338 aminoácidos, chamado alfa (CHAUDHURI et al., 1993).
A figura 5 representa esquematicamente o gene de grupo sanguíneo Duffy, incluindo a região promotora e seus dois exons (CAVASINI et al., 2001).
O sistema consiste de quatro principais alelos, cinco fenótipos e cinco antígenos. Os alelos são FYA, FYB, FYX e FY; os fenótipos são Fy(a+b-), Fy(a+b+), Fy(a-b+), Fy(a-b+fraco) e Fy(a-b-) e os antígenos são Fya (Fy1), Fyb (Fy2), Fy3, Fy5 e Fy6 (PODO & CHAUDHURI, 2000).
Os antígenos Fya e Fyb são codificados por duas formas alélicas do gene
FY. Os alelos FYA e FYB diferem por uma simples substituição de bases no
nucleotídeo 125. No alelo FYA, a base é guanina (G) e no alelo FYB a base é adenina (A). Isso produz um códon para glicina no aminoácido 42 no alelo FYA, e um códon para ácido aspártico no alelo FYB (MALLINSON, 1995). Essa substituição de apenas um aminoácido na posição 42 caracteriza os antígenos Fya e Fyb (JENS et al., 2005).
Figura 5. Representação esquemática do gene FY, com sua região promotora GATA1 e dois exons. Os círculos em preto representam substituição de nucleotídeos e as setas indicam orientação dos iniciadores usados na genotipagem. (OLSSON et al., 1998). FONTE: CAVASINI et al., 2001.
Em 1965, foi descrito outro alelo no lócus DUFFY, FYX, co-dominante com o
FYA e recessivo com o FYB, relacionado com a fraca expressão do antígeno Fyb
(CHOWN et al., 1965). O alelo FYX foi, posteriormente, descrito com mais detalhes por Lewis et al. (1972) onde ficou demonstrado que esse alelo não produz um antígeno diferente dos outros do sistema Duffy, mas os eritrócitos é que reagem mais fracamente com soros anti-Fyb, em função de uma mutação no exon 2 (C265T). A mutação relativamente rara C265T no FYB, caracterizando o alelo FYX, responsável pela expressão muito baixa do fenótipo Fy(b) e que aparece em 2% dos caucasianos (PARASOL et al., 1998; TOURMAMILLE et al., 1998).
Uma outra mutação G298A encontrada no FYA e FYB, parece ser silenciosa. A alteração G298A provoca uma substituição de Alanina por Treonina no aminoácido 100, enquanto que a C265T muda o aminoácido Arginina por uma Cisteína na posição 89 do gene FY (TOURMAMILLE et al., 1998; PODO & CHAUDHURI, 2000).
O alelo FY, caracterizado por uma única substituição do nucleotídeo (T33C) da região promotora GATA-box do gene FYB, induz à não expressão do antígeno Fyb na membrana da hemácia. Este alelo pode aparecer em heterozigose ou homozigose: FYAFY; FYBFY e FYFY. Quando em homozigose, corresponde ao fenótipo nulo Fy(a-b-), resultando na ausência de expressão do antígeno Fyb apenas no eritrócito, não alterando a expressão dessa proteína em outros tecidos (TOURNAMILLE et al., 1995; IWAMOTO et al., 1996).
O resultado de eventos naturais na região Gata-box para o alelo FYAnulo foi encontrado em regiões endêmicas do Plasmodium vivax em Papua New Guinea (PNG) (ZIMMERMAN et al., 1999). Indivíduos heterozigotos FYAFYAnulo têm 50%
menos proteína Duffy expressa na membrana dos seus eritrócitos, quando comparados com indivíduos FYAFYA. Na PNG, uma significante redução de infecções por P. vivax foi observada em indivíduos heterozigotos para o alelo
FYAnulo, sugerindo que esse genótipo esteja associado à diminuição da susceptibilidade à infecção in vivo por P. vivax (KASEHAGEN et al., 2007).
Um trabalho avaliando a expressão da proteína Duffy nas hemácias de indivíduos portadores do alelo FYX, demonstra que os heterozigotos têm 50% menos antígeno Duffy nos seus eritrócitos e os homozigotos apresentam 1/10 desses antígenos expressos (YAZDANBAKHSH et al., 2000). Entretanto, Cavasini et al. (2007b), sugerem que esse polimorfismo do alelo FYX não está associado com a susceptibilidade à malária por P. vivax, pois não foram observadas diferenças estatísticas entre pacientes infectados e doadores de sangue, em seus estudos.
Castilho et al. (2004) estudaram 361 doadores de sangue, sendo 182 indivíduos com ancestrais africanos e 179 caucasianos. Os testes sorológicos determinaram o fenótipo Fyb(-) em 130 africanos e em 40 caucasianos, a maioria genotipada por PCR/RFLP como FY (mutação 33T>C) e FYX (mutação 265C>T/298G>A), respectivamente. Foram encontrados também, três indivíduos portadores de um novo polimorfismo de simples nucleotídeo (SNP, do inglês:
“Single Nucleotide Polymorphism”) com mutação 145G>T coexistindo com 265C>T
e 298G>A. Esse SNP é marcado pela substituição de Alanina (Ala) por Serina (Ser) no aminoácido 49 no primeiro segmento transmembrana do FYB, o que determina a diminuição na expressão dessa proteína (Fyb) nas hemácias desses indivíduos, observado por citometria de fluxo.
O teorema de Hardy-Weimberg foi formulado em 1908 pelos cientistas Hardy e Weimberg e tem o seguinte enunciado: “Em uma população infinitamente grande em que os cruzamentos ocorrem ao acaso e sobre o qual não há atuação de fatores evolutivos, as freqüências gênicas e genotípicas permanecem constantes ao longo das gerações”. A Lei de Hardy-Weimberg determina a freqüência com que os alelos aparecerão nas próximas gerações, com base na geração anterior (CABELLO & KRIEGER, 1997).
Essa teoria é válida quando não existe influência de fatores evolutivos atuando na população. São exemplos de fatores evolutivos: mutações, seleção natural e migrações. Se houver algum fator evolutivo que perturbe estas condições
então a população não estará em equilíbrio gênico e sim evoluindo. Dessa forma podemos detectar, na prática, se uma população está evoluindo, ou não, comparando, por exemplo, o quadrado da freqüência gênica com a freqüência do genótipo homozigoto (FYFY). Se estes valores forem diferentes a população não estará em equilíbrio, estará em evolução. Se forem muito próximos então a população estará em equilíbrio gênico para este gene (CABELLO & KRIEGER, 1997).
1.4.3. A Função Biológica da proteína Duffy
A discussão sobre a função dos antígenos eritrocitários Duffy iniciou-se quando Miller et al. (1976), observaram que os determinantes antigênicos Fya e Fyb poderiam ser receptores para Plasmodium knowlesi e que a resistência à invasão eritrocitária pelo merozoíto do P. vivax em negros, devia-se ao fato do fenótipo Duffy negativo ser freqüente nessa população.
O mecanismo de entrada no eritrócito pelo Plasmodium foi estudado em 1978, por microscopia eletrônica, e observado que a porção apical do merozoíto faz o contato inicial com o eritrócito, criando uma pequena depressão na membrana (figura 6).
Figura 6. Microscopia eletrônica mostrando a interação entre o complexo apical do merozoíto e RBC. (Disponível em: <www.impact-, malaria.com/.../images/meroEM.gif>. Acessado em: 18 de abril de 2008).
Essa área começa a espessar e forma uma junção com a membrana do parasito, então o merozoíto penetra no eritrócito por invaginação. Após a entrada completa do Plasmodium, o orifício de entrada fecha-se (AIKAWA et al., 1978). A invasão de hemácias pelos parasitos da malária ocorre quando o merozoíto liga-se à superfície de hemácias não infectadas. Este processo inclui fases de reconhecimento e ligação, seguidos por reorientação e penetração (BANNISTRE & MITCHELL, 2003).
Os estudos sobre citocinas e seus receptores convergiram para a investigação dos antígenos de grupo sangüíneo Duffy, demonstrando uma importante função fisiológica para os alelos dessa proteína. As quimiocinas, são citocinas com função de quimiotaxia, e que fazem parte da família das citocinas. E são divididas em duas grandes subfamílias que diferem nos dois resíduos cisteínas dos aminoácidos terminais que participam na ligação dissulfeto. Podem estar adjacentes (C-C) ou separados por um aminoácido (C-X-C). Cada quimiocina tem um receptor específico no qual se liga com alta afinidade (DOHLMAN et al., 1991).
Horuk et al. (1993) mostraram, em um estudo sobre receptores de quimiocinas multiespecíficos em eritrócitos humanos, que a IL-8 liga-se minimamente a eritrócitos Duffy negativos, que anticorpos monoclonais para antígenos Duffy bloqueavam a ligação de IL-8 em eritrócitos Duffy positivos e que a IL-8 também impedia a ligação e a invasão eritróide por P. knowlesi. Essas observações indicam que os antígenos de grupo sanguíneo Duffy são receptores de quimiocinas. Esta evidência foi comprovada por outro estudo que estabeleceu a relação entre receptores de quimiocinas em eritrócitos e o Duffy, através de alinhamento da seqüência da proteína Duffy com outros membros da família das quimiocinas. Foi visto que a organização dos dois exons do gene FY é a mesma encontrada nos genes de outros receptores de quimiocinas. A partir destes estudos, os antígenos Duffy foram denominados DARC (CHAUDHURI et al., 1994; NEOTE et al., 1994; MURPHY, 1994).
A IL-8 é ligante do DARC mais intensamente estudada, é de baixa massa molecular (aproximadamente 8 KDa) e é produzida pela maioria das células do organismo, particularmente macrófagos e células endoteliais envolvidas na migração celular. A IL-8 é conhecida como um potente indutor de quimiotaxia para neutrófilo (ROITTI, 1997). Após sua introdução na circulação, a IL-8 é rapidamente ligada ao DARC eritróide, ficando incapaz de ativar os neutrófilos e isso pode
funcionar como um limitante da estimulação de leucócitos pela diminuição da IL-8 sangüínea (DARBONNE et al., 1991).
A expressão aumentada do RNA mensageiro da proteína Duffy durante condições inflamatórias do rim, indica que esses antígenos são importantes em processos biológicos (LIU et al., 1999; SEGERER et al., 2003). A diminuição da função renal após transplante está mais associada à pacientes com fenótipo Fy(a-b-). Tal fato pode ocorrer devido à ausência de receptores DARC, que fazem o papel de atenuar os efeitos inflamatórios, agindo como um escoadouro de quimiocinas (AKALIN & NEYLAN, 2003). Esta e outras associações entre função-estrutura do DARC constituem num importante campo de investigação e associação entre as citocinas e o Duffy na fisiologia normal e patológica, pois o estudo da imunidade e os seus fatores são de extrema importância para conhecermos os mecanismos de defesa do organismo frente a diferentes patôgenos.
Outro ponto fundamental relacionado aos antígenos Duffy, é o reconhecimento de sua participação nas reações transfusionais e na Doença Hemolítica Peri Natal (DHPN) (LANDSTEINER, 1931; LEVINE et al., 1941). Os anticorpos anti-Fya e anti-Fyb são predominantemente da subclasse IgG1 e apenas 18% IgG2 e 25% da classe IgM (SZYMANSKI et al., 1982). Este fator é importante, pois esses anticorpos são capazes de ativar complemento e desencadear reação hemolítica pós-transfusional (DANIELS et al., 2002; KIM et al., 2004).
É possível detectar fetos em risco de desenvolver DHPN pela determinação do genótipo Duffy em líquido amniótico (HESSNER et al., 1999). Outra indicação para a genotipagem do Sistema Duffy foi colocada em evidência recentemente, quando Castilho (2007) descreveu a importância, no cenário clínico, da seleção de pacientes que podem, seguramente, receber transfusão de sangue com fenótipo Fyb(+), sem risco de desenvolver aloimunização, isto é, produzir anticorpos anti-Fyb.
O significado biológico do DARC nos eritrócitos inicialmente pareceu questionável, devido à falta de associação entre doenças e fenótipo Duffy negativo (PODO, 2000). Porém, vários trabalhos descrevem a freqüência dos polimorfismos eritrocitários que conferem parcial ou completa resistência à malária em populações amazônicas, como o grupo sanguíneo Duffy negativo (NOVARETTI et
al., 2000; CAVASINI et al., 2001, 2006, 2007b). Este é um campo de investigação de suscetibilidade genética à infecção, com importantes implicações, tanto para a compreensão da patogênese como para o controle da malária.
O Sistema Sangüíneo Duffy tem sido alvo de pesquisas pelo particular interesse fisiológico a ele relacionado, sendo considerado um dos mais interessantes loci cromossômicos para avaliar o impacto da pressão de seleção natural em diferentes regiões geográficas (Hamblin et al., 2002).
Portanto, estes dados confirmam a importância de se estudar a população amazonense, pois permite obter dados das freqüências alélicas existentes, avaliar se a população está em equilíbrio genético, com base na Lei de Hardy - Weinberg e ainda colaborar com demais estudos relacionados à transmissão da malária na Amazônia. Este foi o foco deste trabalho.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
- O Objetivo geral do trabalho foi analisar a ocorrência de genótipos e fenótipos do sistema de grupo sangüíneo Duffy em indivíduos de uma população exposta à infecção por Plasmodium vivax na Amazônia.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar a freqüência genotípica e fenotípica Duffy;
- Comparar a ocorrência dos alelos Duffy e a susceptibilidade à infecção por Plasmodium vivax;
- Avaliar o percentual de concordância dos genótipos e fenótipos Duffy; - Definir se a população estudada está em equilíbrio gênico de acordo com a Lei de Hardy - Weimberg.
3 MATERIAL E MÉTODOS
O protocolo de pesquisa foi submetido à análise do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (CEP-INPA), em 06/06/2006, sob o número do processo 046/2006 CEP-INPA, e aprovado por unanimidade em 19/06/2006, conforme Parecer Consubstanciado e Ofício 023/2006 - CEP/INPA (anexo A).
3.1 LOCALIDADE DE ESTUDO
Com base nos dados de positividade da malária em 2005, para o Estado do Amazonas, do SIVEP– Malária da SVS, o município de Presidente Figueiredo/AM, apresentou no período de 01/01/05 à 31/12/05, um total de 9.351 notificações, representando 4,12% do total de casos de malária no Amazonas. Esta localidade, o quarto município com o maior número de notificações de positividade para malária no ano de 2005, depois de Manaus (64.238), Careiro (17.009) e Rio Preto da Eva (10.144), sendo por isso selecionado para as coletas das amostras deste estudo. A Unidade Mista Hospitalar Gama e Silva (UMHGS) de Presidente Figueiredo, foi o ponto de coleta de dados e amostra de sangue deste projeto, denominada “Instituição Sediadora”.
O município de Presidente Figueiredo está localizado, aproximadamente, a 100 Km da cidade de Manaus na BR 174, conforme mostra a figura 7.
Figura 7. Mapa mostrando a localização (seta) do município de Presidente Figueiredo - AM. Disponível em: <http://maps.google.com> Acessado em 10 de outubro de 2007.
A amostragem para estudo foi composta por dois grupos – infectados e negativos. No grupo de Infectados incluímos os casos positivos para P. vivax, enquanto que no outro grupo participaram pacientes negativos para P. vivax.
O tamanho da amostra foi calculado estimando-se a proporção média de pacientes infectados no período de janeiro de 2004 até março de 2007, de acordo com dados do SIVEP Malária da SVS. Levando-se em conta que esta proporção média de pacientes infectados com P. vivax, no período considerado, foi de aproximadamente 0,146, fixamos uma precisão de 0,045 (4,5%) e um nível de confiança de 95% (HENRY, 1998).
Aplicando a fórmula abaixo (CALLEGARI-JACQUES & SIDIA, 2003), encontramos um tamanho mínimo de amostra (n*) igual a 232,66.
V(p) = (d÷z)2 = (0,045÷1,96)2 = 0,000527 n* = p×q÷V(p) = 0,146×0,856875÷0,000527 = 232,66
Onde:
p= 0,146 (prevalência média no período) q= 1-p = 0,856875
d= 0,45 (precisão)
z= 1,96 (nível de confiança de 95%)
Sobre o valor encontrado, que define o tamanho de amostra mínima (n*), foi feita uma correção para uma população finita (N) e, desta forma, obtivemos o valor exato de 232 para o “n”, como segue:
n = n*÷ (1+ n*÷N) = 232,66÷ (1+ 232,6591÷104285) = 232
Determinamos, ainda, uma correção para uma perda potencial de 5%. Assim, chegou-se a um valor final para o tamanho da amostra (nf) de 244, conforme o cálculo abaixo:
nf = n ÷ 0,95 = 244
Desta forma, ficou caracterizada uma amostragem por demanda espontânea, com um tamanho amostral (n) de 244.
3.1.1 Critérios de inclusão da amostra
Pacientes nascidos no Estado do Amazonas, maiores de 18 anos, de ambos os sexos, atendidos no Laboratório da UMHGS, com ou sem sintomatologia compatível para Malária e que concordaram em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE (apêndice A).
A amostra para o grupo de infectados positivo foi composta de pacientes com os critérios de inclusão e com teste da gota espessa positiva para o P. vivax e o grupo negativo, de pacientes com os critérios de inclusão e com teste da gota espessa negativa para o P. vivax.
3.1.2 Critérios de exclusão da amostra
Foram excluídos da pesquisa os pacientes que não atenderam os critérios de inclusão: pessoas que não concordaram em assinar o TCLE, os menores de 18 anos e os não naturais do Amazonas.
3. 2 COLETAS DAS AMOSTRAS
A cada participante foram explicados os objetivos do estudo, os procedimentos a serem realizados, a duração estimada do projeto, bem como a possibilidade de sair do estudo a qualquer tempo sem nenhum tipo de penalidade ou alteração no nível de atendimento de saúde recebido no município.
Foi solicitado aos participantes do projeto, na condição de objeto da pesquisa, que assinassem o TCLE e respondessem ao questionário (apêndice B) antes da coleta da amostra de sangue.
Coletamos 5 mL de sangue total venoso com anticoagulante EDTA 5% (ácido etilenodiaminotetracético) dos pacientes que procuram o hospital com suspeita de malária. Esta amostra foi acondicionada em refrigeração (2-8°C) até o momento da fenotipagem e extração do DNA (ácido desoxirribonucléico), não excedendo 3 dias.
3.3 O EXAME PARA PESQUISA DE PLASMÓDIO
O exame da Gota espessa para o diagnóstico de malária foi realizado no Laboratório de Análises Clínicas da Unidade Mista Hospitalar Gama e Silva (UMHGS), que participa do “Programa Nacional de Controle de Qualidade de Diagnóstico de Malária”. Este programa inclui um sistema de controle e revisão das lâminas, onde o laboratório de base, aquele realiza o diagnóstico da malária envia ao laboratório de revisão 100% das lâminas positivas e 10% das negativas. Este laboratório de revisão, após reavaliá-las, envia 30% das lâminas positivas e 10% das negativas para o Laboratório Central (LACEN) em Manaus/AM (MS, 2004). No
município de Presidente Figueiredo, ambos os laboratórios, de base e revisão, estão localizados na UMHGS.
Os programas de prevenção e controle de malária usam um índice conhecido como índice Kappa, que é um indicador do controle de qualidade. Este índice mede a concordância entre técnicas ou microscopistas levando em consideração a probabilidade de se obter acordos simplesmente por acaso (FLEISS, 1981). Em área endêmica espera-se uma concordância por índice Kappa, superior a 0,8 (MS, 2005). A UMHGS esteve com seu índice Kappa dentro dos valores esperados durante o período de coleta das amostras deste trabalho.
A Gota espessa continua sendo o padrão ouro para o diagnóstico da malária. Sendo o método adotado oficialmente no Brasil para o diagnóstico da doença. A técnica baseia-se na visualização do parasita através da microscopia ótica, após a coloração com corante vital (azul de metileno e Giemsa). Desta forma, permite a diferenciação específica dos parasitos a partir da análise da sua morfologia e pelos seus estágios de desenvolvimento, encontrados no sangue periférico. Essa metodologia é capaz de detectar densidades parasitárias muito baixas, de 10 até 20 parasitas/μL de sangue e está descrita no Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária (MDLM) da SVS do MS (MS, 2005).
Uma amostra de sangue (1μL aproximadamente) foi coletada diretamente por punção digital (figura 8) e a lâmina foi corada após a amostra estar totalmente seca. Para a secagem, as lâminas foram mantidas a temperatura ambiente por 10 minutos.
De acordo com MDLM, uma gota espessa adequada deve ter de 1 a 1,5 cm2 de superfície, que equivale, aproximadamente, de 500 a 800 campos microscópicos, quando se trabalha com aumento de 700 a 800 vezes. Nesse caso, é encontrada uma média de 10 a 20 leucócitos por campo (MS, 2005).
A parasitemia foi determinada analisando-se 100 campos microscópicos, conforme descrito a seguir: +/2: 40 a 60 parasitos contados nos 100 campos; +: 1 parasito por campo; ++: de 2 a 20 parasitos por campo; +++: de 21 a 200 parasitos por campo; ++++: mais de 200 parasitos por campo. Quando houve uma parasitemia menor de 40 parasitos por campo, os resultados foram expressos pelo número de parasitos contados nos 100 campos (MS, 2005).
Figura 8. Esquema demonstrativo da punção digital para coleta de sangue para confecção da gota espessa. Etapas: 1. Limpar o local de punção com álcool 70%, 2. Puncionar o local com uma lanceta, 3. Colocar uma gota esférica de sangue sobre a lâmina, 4. Espalhar o sangue formando um retângulo (1,2cm2). MDLM. MS, 2005.
3.3.1 Preparo de corantes e diluentes
Azul de metileno fosfatado
Azul de metileno medicinal em pó ...1,0g Fosfato de potássio monobásico ...1,0g Fosfato de sódio bibásico ...3,0g Misturar em gral seco.
Preparo da solução fosfatada de azul de metileno:
Pesar 1,0g da mistura acima e dissolver em 250mL de água destilada. Conservar a solução em pisseta (frasco plástico de lavagem).
Mistura de sais fosfatados para água tamponada Fosfato de potássio monobásico ... 4,0g Fosfato de sódio bibásico ... 6,0g Misturar em gral seco.
Preparo da água tamponada a 6/4:
Pesar 1,0g da mistura de sais fosfatados, acima descrita, e dissolver em 1000mL de água destilada. Conservar a solução em pisseta.
Solução alcoólica de Giemsa
Giemsa em pó ... 0,75g Glicerol PA ... 35mL Álcool metílico PA ... 65mL
Preparo da solução de Giemsa:
Colocar a solução num frasco com algumas pérolas de vidro e agitar várias vezes ao dia, até obter a homogeneização (aproximadamente sete dias). Esta solução deve ser feita em maior volume e mantida em estoque. Para o uso diário, a solução alcoólica deve ser colocada em frasco pequeno, tipo conta-gotas.
3.3. 2 Coloração pela técnica de Walker
Segundo o MDLM, a gota espessa é corada pela técnica de Walker (azul de metileno e Giemsa) que permite identificar, com facilidade e precisão, a espécie do plasmódio. Esse método possibilita também quantificar a intensidade do parasitismo, mediante a determinação da parasitemia por volume (μL). Os materiais necessários para a coloração são: placa de acrílico; pisseta com solução
fosfatada de azul de metileno; frasco conta-gotas contendo solução alcoólica de Giemsa e uma pisseta com água tamponada
A técnica de Walker, para coloração da gota espessa, inclui duas fases:
1ª fase: Desemoglobinização pela solução hipotônica de azul de metileno
fosfatado
• Aplicar a solução de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue, por dois segundos.
• Enxaguar a lâmina com água tamponada (suavemente).
2ª fase: Coloração pela solução de Giemsa
• Colocar a lâmina com o lado da gota voltado para a superfície da placa de coloração.
• Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante (50 μL de Giemsa) para 1mL de água tamponada. Homogeneizar.
• Aplicar esta solução na placa côncava de coloração, sob a lâmina invertida. • Deixar corar por 10 minutos.
• Enxaguar com água tamponada (suavemente). • Secar em temperatura ambiente.
3.4 FENÓTIPO DUFFY
A metodologia da fenotipagem Duffy foi utilizada com o objetivo de pesquisar a proteína Duffy expressa na membrana externa dos eritrócitos coletados dos participantes. Este dado foi utilizado para confrontar fenótipo e genótipo e avaliar o percentual de concordância entre eles.
As amostras de sangue foram submetidas à fenotipagem pelo teste de hemaglutinação, em cartões de gel (LAPIERRE et al., 1990), de acordo com as especificações descritas pelo fabricante. Os ID-Cartões “Fya” e “Fyb”, juntamente com os ID-Soros-Teste “anti-Fya” e “anti-Fyb” (figura 9), foram utilizados para determinação dos antígenos Fya (Fy1) e Fyb (Fy2). A metodologia “Micro Typing System (BI007270 03.06)” é descrita pela DiaMed-ID, fornecedora dos reagentes.
Figura 9. Reagentes usados para fenotipagem: ID-Cartões “Fya” e “Fyb”, e ID-Soros-Teste “anti-Fya” e “anti-Fyb” (DiaMed).
Preparamos uma suspensão de hemácias a 0,8% em ID-Diluente 2 (DiaMed-ID) e, desta, pipetamos 50uL para o microtubo do Card-ID Fya e Card-ID Fyb (DiaMed-ID), adicionamos ainda 50uL de soro teste ID correspondente. O Card-ID foi incubado por 15 minutos a 37°C no ID-Incubador. Após esta etapa, centrifugamos os cartões durante 10 minutos no ID-Centrifuge (1030 rpm) e analisamos os resultados da seguinte forma :
O teste é positivo quando os eritrócitos aglutinados formam uma linha vermelha sobre a superfície ou aglutinados dispersos no gel. A reação é negativa quando um botão compacto de eritrócitos é mostrado no fundo do microtubo (figura 10).
Reações positivas de + a +++ indicam a presença do antígeno correspondente. Reações fortemente positivas (++++) são raras, e as negativas indicam ausência do antígeno.
Figura 10. Cartão de gel mostrando a interpretação da reação positiva (aglutinados dispersos no gel) e negativa (botão compacto no fundo do microtubo) da fenotipagem. Amostra 133 fenotipada como Fyab: Fya(2+) Fyb(1+); 136 - Fya: Fya(1+) Fyb(-) e 29 - Fy nulo: Fya(-) Fyb(-).
3.5 GENÓTIPO DUFFY
A metodologia molecular, descrita anteriormente por Olsson et al. (1998), foi aplicada neste estudo para genotipar o Sistema Sanguíneo Duffy. Constitui-se em um método simples e rápido que possibilita identificar quatro possíveis alelos do lócus FY, através da técnica de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR), sem a utilização de enzimas de restrição.
3.5.1- Extração do DNA genômico dos leucócitos
O material utilizado para a extração do DNA foi sangue total (350 µL), coletado dos participantes. A extração foi feita à medida que as coletas foram sendo realizadas e o produto extraído estocado a -20°C, por aproximadamente seis meses, para o uso posterior. Para a extração do DNA foi utilizado o kit Easy-DNA (cat. no. K180001), da Invitrogen®, protocolo 2 (figura 11). Segundo o protocolo cada 10 µL de sangue total fornece um rendimento de 20-30 ng de DNA, O sedimento foi eluído com 150 µL de água deionizada conforme o protocolo.
3.5.2 - Quantificação e pureza do DNA
As concentrações e purezas de DNA foram estimadas através de análise espectrofotométrica em comprimento de onda ultravioleta (A260nm/A280nm), como
preconizado por Sambrook & Russel (2001). A leitura espectrofotométrica em 260 nm foi usada para quantificar do DNA extraído, isto é, determinar sua concentração (1D.O. = 50 µg de DNA dupla fita/µL). Enquanto, a razão entre as absorbâncias foi usada para avaliar a pureza do ácido nucléico.
Foram utilizadas extrações de DNA que apresentaram um grau de pureza maior ou igual a 1,6 e menor ou igual a 1,8. Todas as amostras (sedimentos eluídos) foram quantificadas e re-diluídas com água deionizada à mesma concentração (10 ng/µL).
3.5.3- Reação de Polimerização em Cadeia
A Reação de Polimerização em Cadeia (PCR, - inglês “polymerase chain
reaction”.) é uma técnica de biologia molecular na qual são empregadas pequenas
seqüências de oligonucleotídeos, denominados iniciadores. Estes em condições ideais de temperatura e substratos, como o DNA - alvo, os quatro desoxinucleotídeos e a enzima DNA polimerase, amplificam, em magnitude exponencial, o gene de interesse. Utilizando o equipamento de termociclagem, que reproduz os ciclos programados de temperatura, e a reação acontece. Por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida os seus produtos podem ser visualizados como bandas.
Para a amplificação dos alelos FYA, FYB, FY e FYAnulo, usamos os seguintes iniciadores: GATAFY2, FYAB2, FYAREV e FYBREV, as seqüências destes são mostradas na tabela 2.
Tabela 2 - Seqüência e Tm calculada dos iniciadores específicos utilizados na PCR.
PRIMER Seqüência de nucleotídeos 5’ → 3’ Tm (°C)
GATAFY2 CTCATTAGTCCTTGGCTCTTAC 64
FYAB2 CTCATTAGTCCTTGGCTCTTAT 62
FYAREV AGCTGCTTCCAGGTTGGCAC 64
FYBREV AGCTGCTTCCAGGTTGGCAT 66
Quatro reações foram preparadas para cada indivíduo, usando a seguinte combinação de iniciadores: GATAFY2 e FYAREV (A), GATAFY2 e FYBREV (B), FYAB2 e FYAREV (C), e FYAB2 e FYBREV (D). O primeiro par de oligonucleotídeos (A) amplifica o alelo FYAnulo (FYA com mutação Gata-box), e as demais combinações amplificam os alelos FY (FYB com mutação Gata-box), FYA e
FYB, respectivamente (tabela 3).
Tabela 3 - Combinação de iniciadores para detecção de quatro alelos Duffy e o tamanho em pares de bases do produto de cada amplificação. COMBINAÇÃO Iniciador For Iniciador Ver ALELO
DETECTADO
TAMANHO pb
A GATAFY2 FYAREV FYAnulo 711
B GATAFY2 FYBREV FY 711
C FYAB2 FYAREV FYA 711
D FYAB2 FYBREV FYB 711
FONTE: Olsson et al. (1998)
As temperaturas de anelamento das combinações foram estabelecidas através da técnica de gradiente, com base no cálculo da temperatura média de fusão (Tm, - do inglês: “melting temperature”), cujo objetivo foi de eliminar bandas inespecíficas. Essa técnica consiste em submeter iguais misturas reacionais a diferentes temperaturas, tendo como temperatura média a Tm calculada para cada iniciador.
A Tm é a temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado, e foi calculada através da fórmula de Wallace (onde A, T, G e C são as quantidades de cada base que compõe o iniciador):
Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)
A tabela 2 mostra o valor da Tm calculada pela fórmula de Wallace para cada oligonucleotídeo. O valor da Tm de uma molécula de DNA ou fragmento (iniciador) aumenta cerca de 0,4°C cada vez que a quantidade do par de bases nitrogenadas guanina-citosina (GC) aumenta 1%. Assim, cada molécula de DNA possui uma Tm característica que depende principalmente da proporção de bases GC. Uma vez que a energia necessária para abrir a fita de DNA, que contém
grande quantidade de GC é maior, pois entre as bases GC existem três ligações de hidrogênios, enquanto que no par adenina-timina (AT) são duas ligações de hidrogênio.
O termociclador Mastercycler gradient Eppendorff®, possui função “gradiente”, que permite que cada coluna de seu termobloco gere e mantenha uma temperatura própria, independente das demais.
A técnica de gradiente foi realizada inserindo uma temperatura central de 64 ºC, para uma função gradiente de G ±3, ou seja, o termociclador distribuiu entre as doze colunas do termobloco um espectro de temperatura correspondente a 3ºC acima e 3ºC abaixo da temperatura central programada. A temperatura calculada, pelo termociclador, para cada uma das colunas se encontra descrita na tabela 4.
Tabela 4 - Valores de temperatura (em ºC) para cada uma das doze colunas, baseado no cálculo, pelo termociclador, da função gradiente de G ±3 para uma temperatura central de 64ºC para as combinações A, B, C e D. Coluna Temperatura ºC Coluna Temperatura ºC Coluna Temperatura ºC
TA1 61,2 TA5 63,3 TA9 65,3
TA2 61,8 TA6 63,7 TA10 65,7
TA3 62,2 TA7 64,2 TA11 66,2
TA4 62,8 TA8 64,8 TA12 66.8
Foram preparadas dez reações de PCR da mesma amostra para ser testada em cada combinação (A, B,C e D) . Posteriormente os produtos foram analisados em eletroforese de agarose a 1,2%. Dessa forma, foi possível determinar a s temperaturas de anelamento ideal para cada combinação de iniciadores usados para genotipar o Sistema de grupo sanguíneo Duffy.
As amostras usadas na técnica de gradiente foram escolhidas com base na fenotipagem, isto é, para testar a combinação C foi usada uma amostra fenotipada como Fya, pois esta combinação amplifica o antígeno Fya. Da mesma forma foi realizado com as demais combinações.
Após determinar as temperaturas de anelamento ideais para cada combinação (A, B, C e D), as amplificações das 244 amostras coletadas foram realizadas conforme descrito a seguir:
Para cada combinação foram acrescentados controles negativos, constituídos da mistura de reagentes e água deionizada em substituição ao DNA. O controle positivo foi constituído de uma amostra previamente fenotipada como Fyab e confirmada pela genotipagem como sendo FYAFYB para as combinações C e D. No caso da combinação B, o controle positivo foi uma amostra fenotipada e genotipada anteriormente como Fy nulo.
Cada uma das 244 amostras foram testadas para as quatros combinações (A, B, C e D), conforme apresentado na tabela 3, em volume final de 10µL. Portanto, foram preparadas quatro misturas diferentes de reagentes, nas mesmas proporções. Para cada combinação foi feita uma mistura, pois o par de iniciadores era diferente para cada uma delas. Essa mistura era constituída de: 5 µL de DNA alvo (50 ng), 0,1 µL (0,2 µM) de cada iniciador (For e Rev, do inglês: “Forwed e
Reversed”), 0,2 µL (0,2 mM) de dNTP mix (Promega, USA), 0,4 µL (2 mM) de
MgCl2 e 0,1 µL (0,5 U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), 1 µL (1x) do tampão
da enzima (Invitrogen), e água deionizada para completar o volume reacional de 10 µL (tabela 5).
Tabela 5 – Concentrações e respectivos valores de reagentes usados na PCR. Reagentes concentração estoque Concentração final na reação Volume do tubo da reação (µL) Buffer 10X 1X 1,0 dNTP mix 10mM 0.2 mM 0,2 MgCl2 50mM 2 mM 0,4 Iniciador For 20µM 0,2 µM 0,1 Iniciador Rev 20µM 0,2 µM 0,1
DNA polimerase 5U/µL 0,5 U 0,1
DNA alvo 10ng/µL 50 ng 5,0
Água deionizada (H2O) q.s.p. 10 µL 3,1
TOTAL 10µL
FONTE: Olsson et al. (1998)
A etapa de amplificação para as combinações A, C e D da PCR foi realizada no equipamento Mastercycler gradient da Eppendorff®, sob as seguintes
condições: 96°C/4min; 10 ciclos de 94°C/20seg, 66°/1,5min; seguida de 20 ciclos de 94°C/20seg, 64,8°C/30seg e 72°C/1min; e 72°/5min. Para a combinação B, as condições da PCR foram as seguintes: 96°C/4min; 10 ciclos de 94°C/20seg, 66°/1,5min; seguida de 20 ciclos de 94°C/20seg, 65,3°C/30seg e 72°C/1min; e 72°/5min.
De posse dos produtos das amplificações, seguimos para a etapa da eletroforese para visualizarmos as bandas.
3.5.4 - Eletroforese de DNA em gel de agarose
O gel de agarose (Ultra Purê Agarose-Invitrogen) foi preparado a 1,2 % em Tampão TAE 1x (Tris-Acetato 40 mM, Ac. Acético 20 mM, EDTA 1 mM) fundido em microondas. Esperava-se que a temperatura da solução diminuísse para 55°C e então era vertida no suporte da cuba com pente apropriado para conter o volume apropriado (figura 12). O gel não foi preparado com brometo de etídio (BrEt), pois o corante de corrida utilizado (EnVISIONTM DNA Dye as Loading Buffer da AMRESCO) dispensa o uso deste.
Após a polimerização (cerca de 30 min), a cuba era preenchida com tampão TAE 1X. Os produtos da PCR foram aplicados no gel conforme demonstrado na Figura 13, após homogeneização de 3 µL do produto da PCR com 2 µL do corante de corrida (EnVISIONTM DNA Dye as Loading Buffer da AMRESCO). Foi utilizado DNA ladder como marcador de peso molecular (100 pb). A eletroforese era realizada a uma voltagem de 30 a 80 V, de acordo com o tempo de corrida.
Figura 13. Esquema mostrando a aplicação do produto da PCR e corante no gel.
A banda de 711bp correspondente ao produto amplificado foi visualizada no gel através de um transluminador de Ultravioleta (UV). Os resultados foram fotografados e armazenados em disquetes pelo equipamento Vilber Lourmat.
A reação negativa é definida pela ausência do fragmento de 711 bp e a positividade pela presença da banda (711 bp) em gel de agarose (1,2%) sob radiação UV. Em pacientes homozigotos, que possuem apenas um tipo de alelo em dose dupla, visualizamos apenas uma banda em uma das quatro combinações, enquanto que para heterozigotos, que possuem dois alelos diferentes, observamos bandas de 711 bp em duas das quatro combinações, após a eletroforese.
As figuras 14 e 15 mostra a interpretação dos seis possíveis genótipos detectáveis pela técnica aplicada, exceto os genótipos formados pelo alelo FYAnulo.
