Aula CQ Biofármacos - Cromatografia e Eletroforese_30-03-15

Prof. Theo Luiz Ferraz de Souza

Disciplina: Controle de Qualidade de Produtos Biotecnológicos

Departamento de Fármacos e Medicamentos Faculdade de Farmácia/UFRJ

Metodologias Bioanalíticas I:

Cromatografia e Eletroforese

Proteínas

Hemoglobina

Transtirretina (TTR)

Insulina

Paracetamol

Conjunto de técnicas de separação cujo princípio depende da

distribuição diferenciada dos componentes de uma mistura entre

duas fases: uma considerada estacionária (fixa) e a outra, móvel.

Diferenças na propriedades das fases móvel e estacionária

possibilitam com que os componentes da amostra se desloquem

através do material cromatográfico com velocidades desiguais

gerando a separação.

Forças Moleculares

Tipos de interação Energia (kJ/mol)

Espécies que interagem

Íon-íon 250 Somente íons

Íon-dipolo 15 Íons e moleculas polares Dipolo-dipolo 2

0,3

Moléculas polares estacionarias Moléculas polares em rotação Dispersão 2 Todos os tipos de moleculas Ligacao de hidrogenio 20 N,O, F a ligação é um átomo H

compartilhado

Métodos Cromatográficos - Princípios

 A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é

influenciado por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica,

bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade.

Métodos Cromatográficos – Utilização Geral

 Identificação de compostos (padrões)

 Purificação de compostos

As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas

considerando diversos critérios:

1. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico

2. Classificação pela fase móvel empregada

3. Classificação pela fase estacionária utilizada

4. Classificação pelo modo de separação

Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser

subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia

planar.

EM COLUNA: cromatografia líquida, gasosa e supercrítica.

PLANAR: Centrífuga, em papel e camada delgada.

Métodos Cromatográficos - Classificação

•Utilização de Gás

Cromatografia Gasosa (CG)

Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)

•Utilização de Líquido

Cromatografia Líquida Clássica (CLC)

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

•Utilização de Gás Pressurizado



Sólidas



Líquida (este pode estar simplesmente adsorvido sobre um

suporte sólido ou imobilizado sobre ele)



Quimicamente ligadas (Suportes modificados são considerados

separadamente,

como

fases

quimicamente

ligadas,

por

normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de

separação.



_Adsorção

(Duas substâncias ligadas por uma interface onde não ocorre solubilização) – Fase estacionária sólida



Partição

(Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas) – Fase estacionária líquida



Troca iônica



Exclusão



Misturas desses mecanismos.

CROMATOGRAFIA

Planar

Coluna

Papel

Líquida

Fluído

Supercrítico

Gás

Centrífuga Camada Delgada Gasosa Gasosa de Alta Eficiência Clássica Alta Eficiência



Compostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e ions metálicos



_{Princípio: partição (solubilidade)}



_{Quantidade de amostra necessária 10}

-3

_{a 10}

-6

_g



_{Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular}



_{F.M. - Sistema de solventes}



_{F.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)}



_{Métodos de detecção: físico-químicos}



Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) - problema : reprodutibilidade



_{Análise quantitativa: densitômetro, extração dos solutos}

Cromatografia Planar - Papel

Cromatografia Planar

Cromatografia em papel

Ascendente

Métodos Cromatográficos - Tipos

Cromatografia em papel

Descendente



Método rápido (20-40 min.)



_{Uso de diversos agentes cromogênicos}



Maior sensibilidade que C.P. (10

-9

_g)



Grande gama de compostos pode ser analisada



Método simples e barato



F.M. - sistema de solventes



F.E - Adsorventes (

sílica, alumína

, celite, amido)



Métodos de detecção: físico-químicos



Princípio: Adsorção Líquido-Sólido (polaridade)

Cromatografia Planar – Camada Delgada

Cromatografia Planar

Métodos Cromatográficos - Tipos

Cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–

Cromatografia Planar

Migração cromatográfica ou Fator de Retenção (R

_f

)

R

_f

= da/ds

Frente da progressão da fase móvel

Linha de aplicação da amostra

C. Papel

Vantagens:



técnica simples



não requer instrumentação sofisticada



baixo custo

Desvantagens:



uso limitado



alargamento de banda-difusão-



pouca alternativa de reveladores

C. Camada Delgada

Vantagens:

•maior sensibilidade

•mais rápido

•> repetibilidade

•< difusão

•> faixa de aplicação

•reveladores reativos

•permite aquecimento

Desvantagens

•degradação de compostos lábeis

devido á grande superfície de

exposição

•dificuldades na quantificação

Comparação

Cromatografia Planar – Desenvolvimento bidimensional

Métodos Cromatográficos - Tipos

Cromatografia líquida clássica:



Muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de

produtos de reações químicas.



_{As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina, entretanto}

estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase

estacionária líquida.



_{Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases}

estacionárias líquidas por partição.

C oncent raç ão Tempo ou volume Coletor de frações Tempo 1 Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Tempo 2 Tempo n Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações

Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com

base em propriedades moleculares como:

• massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade Amostra com diferentes componentes Resina embebida em tampão Tempo zero

Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica

Métodos Cromatográficos - Tipos

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE):



É uma técnica analítica usada para separar e quantificar

componentes numa mistura líquida.



A fase móvel (líquida) movimenta-se continuamente através da

coluna contendo a FASE ESTACIONÁRIA (sólido). O soluto interage

com as fases estacionária e móvel por adsorção, partição, exclusão

molecular, troca iônica.



As separações em CLAE podem se dar por adsorção (separação

sólido-líquido), partição (separação líquido-líquido) ou ambos.

Comparação de CLAE com métodos

convencionais

Critérios no desenvolvimento de cromatografia

moderna

•

Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado, caros.

Sistemas de injeção:válvulas de volumes definido

•

Colunas: recheios  materiais porosos com partículas de diâmetros o mais

homogêneo possível e de diâmetro igual ou menor a 10 um (em geral) Silica

e Alumina.

•

Colunas com fase ligada  silica como suporte

•

A) formação do éster silicato (Si-O-R)

•

B) formação da ligação siloxano (Si-O-SiR)

•

C) Ligação Si-C

Instrumentacao básica da CLAE:

Parâmetros cromatográficos e relações importantes

Tempos diferentes

de migração

Tempo de retenção para métodos cromatográficos

Especificações CLAE

N = L/H

N = Numero de prato teórico L = Comprimento da coluna H = Altura do prato

Análise qualitativa

Quais são os componentes presentes na amostra?

Comparar com padrão

Análise quantitativa

Métodos de determinação manual da área da distribuição

Análise quantitativa

Confiabilidade nos dados experimentais

Análises de Quantificação:

Calibração Externa

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: separação de moléculas pela massa molecular

géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica

géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:

separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar

separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

grãos (beads) da resina com poros grão da resina poroso

proteína grande proteína pequena Tampão “empurra” moléculas através da resina tubos

Moléculas com massas diferentes

Fluxo do tampão

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular

Abso rbâ ncia a 2 8 0 nm volume M edida da ativ . bio ló g ica Moléculas maiores Moléculas menores Kav Massa m ol ecu la r (kD) 20 40 60 80 100 120 mL 25 50 75 100 125 mL volume de eluição

Curva de calibração

traçado da medida de atividade biológica nas frações

Ler a massa correspondente

A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa

molecular de uma proteína em seu estado nativo

Resinas para Gel-Filtração

Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 Bio - Gel P - 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Bio - Gel P - 6 Policrilamida 1 - 6 Bio - Gel P - 10 Policrilamida 1.5 - 20 Bio - Gel P - 30 Policrilamida 2.4 - 40 Bio - Gel P - 100 Policrilamida 5 - 100 Bio - Gel P - 300 Policrilamida 60 - 400 Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO (kD)

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories

Moléculas pequenas

Moléculas pequenas

Proteínas

Proteínas

Células, partículas sub-celulares

Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o

tipo de moléculas ou partículas a serem separadas

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH.

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

DEAE

CM

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

Adsorção Eluição + + + + + + + +

Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna

Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

Na

+

_Cl

-

₊

A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 1) adsorção das proteínas com carga contrária à

resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga;

2) eluição das proteínas adsorvidas.

+ + + + + + + + + + +

No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):

Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina.

Mais frequentemente utiliza-se um aumento da

concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna.

PI ácido + básico -neutro -COOH -COO -NH₃ H+ + - H+ -NH₂

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Carboximetil~celulose

(trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose _{(trocadora de ânions)}

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição.

As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

_ = = _ + + + + + (+) (+) (+) (+) 0. 10 M 0. 15 M 0. 20 M Eluição NaCl Não retidas

DEAE

+ + 0. 10 M 0. 15 M 0. 20 M Eluição NaCl + (-) (-) (-) + + + _ ₌ = _ (-) Não retidas

CM

Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

Desprezar proteínas não retidas Lavagem Eluição pH 2,0 ou sal Antígeno A puro Anti-A interage apenas com a proteína A -Mistura de proteínas Coluna empacotada com ess gel

Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Adsorção Complexo Ag-AC é desfeito

Ex: cromatografia de imunoafinidade

Ligante grupo-específico Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG

Proteína G Região Fc de IgG

Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil- Cibacron Blue Várias enzimas, albumina

lisina Plasminogênio, RNA ribossomal arginina proteinases tipo tripsina

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo

- análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores

- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação”

- glutationa-S-transferase - poli-Histidina

2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Cromatografia de Partição

Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de

hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar.

Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos,

açúcares, lipídeos, etc.

Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30 kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico. AMOSTRAS Fase estacionária (suporte sólido)

X

Fase móvel (líquido ou gás)

- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel

Duas Possibilidades

- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária

Consiste de 2 sistemas:

Suporte: PAPEL

Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)

Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO

Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC)

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água

Detector

• Alta sensibilidade

• Resposta rápida para todos os compostos da amostra

• Insensível à mudanças na Fase móvel

• Insensível à mudanças de temperatura

• Resposta independente para a fase móvel

• Resposta linear

• Não deve destruir a amostra

• Fácil operação

•Detector UV-Vis (o mais utilizado)

•Detector de Fluorescência

•Detector de arranjo de diodos

•Detector de Índice de Refração

•Detectores eletroquímicos

•Outros: Espectrometro de Massas, FTIR, Espalhamento de

Luz, atividade optica

Detector

Os detectores de cromatografia líquida não são destrutivos, isto é, as

amostras podem ser coletadas para testes qualitativos posteriores de

.

Eletroforese

O pH do gel deve ser em torno de 9 para garantir que

praticamente todas as proteínas estejam em sua forma negativa e migrem em direção ao anodo quando a voltagem for aplicada.

Avalia a migração diferencial das proteínas através do campo elétrico, permitindo a separação por tamanho e por mobilidade eletroforética.

.

.

Utiliza géis de agarose ou poliacrilamida com tamanho de poros característicos.

A mobilidade das moléculas pequenas é maior do que a mobilidade das moléculas grandes.

.

 SDS-PAGE:

Utiliza-se o detergente SDS para desnaturar as proteínas, fazendo com que as proteínas apresentem

formas similares e razões carga/massa parecidas, permitindo a separação apenas pelas diferenças de

tamanho.

A utilização do redutor b-mercaptoetanol permite

avaliar proteínas de múltiplas subunidades.

.

A revelação dos géis de poliacrilamida é feita através de colorações específicas.

Nitrato de Prata

Eletroforese

.



Focalização isoelétrica:

Permite a separação das proteínas pelas cargas.

.

.

 Eletroforese Bidimensional:

.



Western-Blot:

Baseia-se na separação das proteínas através da eletroforese em gel. As proteínas após a separação são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose, onde são utilizados anticorpos específicos capazes de reconhecer e se

ligar à proteína de interesse .

- Holler, F.J., Skoog, D.A., e Crouch, S. R., Princípios de Análise Instrumental, Sexta Edição, Editora Bookman, 2009.

- Farmacopeia Brasileira, 5ª Edição, 2010.

Leitura Recomendada

# Chromatography

http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-fi/service-and-support/handbooks/

# PAGE

http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/GE_proteinelectrophoresis.pdf

# TWO GREAT Exemples in Biopharmaceuticals

http://www.uspbpep.com/

- Human Albumin - Assay (PAGE) / HMW / Peptide mapping

http://www.uspbpep.com/usp32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_m2992.html

- Insulin - Assay / HMW