AISLAN CRISTINA RHEDER FAGUNDES PASCOAL
Campomanesia adamantium e Campomanesia guaviroba:
fitoquímica e estudo in vitro e in vivo visando à determinação
da atividade biológica e toxicidade.
CAMPINAS
2015
RESUMO
O Brasil, dispondo de uma flora rica e diversificada, é uma potencial fonte de novas substâncias com atividade farmacológica e com menos efeitos colaterais. Neste trabalho realizou-se o estudo fitoquímico e a avaliação do potencial antiproliferativo in
vitro e atividade antitumoral in vivo, atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de Campomanesia adamatium, típica do bioma Cerrado e de Campomanesia guaviroba,
encontrada em áreas de Mata Atlântica. Preparou-se o extrato bruto etanólico a partir das folhas das espécies vegetais, realizou-se o fracionamento por extração líquido-líquido e o isolamento de alguns constituintes químicos por métodos cromatográficos. Determinou-se o conteúdo de fenólicos totais solúveis e de flavonóides totais por ensaios colorimétricos, a análise do perfil químico por ESI-MS/MS e a quantificação de compostos fenólicos por UHPLC-MS nos extratos e frações. Foi possível identificar: ácido gálico, 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona, dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxi-chalcona, miricitrina e quercetina em C. guaviroba e ácido gálico, 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona (cardamonin), 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona, quercetina, quercitrina e miricitrina em C. adamantium e isolar dois compostos de C.
adamantium, cardamonin e miricitrina. Extratos e frações apresentaram atividade
antiproliferativa in vitro frente a algumas linhagens celulares tumorais e a fração diclorometânica de C. guaviroba apresentou baixa toxicidade aguda in vivo e atividade antitumoral in vivo. As frações diclorometânicas de C. adamantium e C. guaviroba apresentaram atividades antinociceptiva e antiedematogênica, semelhantes ao controle positivo Indometacina. Assim, este trabalho demonstrou o potencial farmacológico dessas espécies como a confirmação da presença de compostos fenólicos nesses extratos.
ABSTRACT
Brazil, featuring a rich and diverse flora, is a potential source of new substances with pharmacological activity and fewer side effects. This work was carried out to evaluate the in vitro anti-proliferative potential, in vivo antitumoural activity in a solid-tumor Erlich model and in vivo antinociceptive and anti-inflammatory activity of
Campomanesia adamatium, typical of the Cerrado biome, and Campomanesia guaviroba,
found in the Atlantic Forest. A crude ethanol crude extract of the leaves was prepared and a liquid-liquid partition was performed. Quantification of total phenolic compounds and flavonoids was determined by colorimetric assays. The chemical profile was determined by ESI-MS/MS and compounds quantified by UHPLC-MS. The extracts and fractions of these species have phenolic substances, including flavonoids and the analysis by ESI-MS/MS and UHPLC-MS allowed the identification of gallic acid, 2',4'-dihydroxy-5'-methyl-6'-methoxichalcone, 2',4'-dihydroxy-3',5'-di2',4'-dihydroxy-5'-methyl-6'-methoxichalcone, quercetin and miricitrin in C. guaviroba and gallic acid, 2 ', 4'-dihydroxy-6'-methoxichalcone, 2', 4'-diidroxi-5'-methyl-6'-methoxichalcone, quercetin, quercitrin and miricitrin in C.
adamantium. It was possible to isolate two compounds from C. adamantium, cardamonin
and miricitrin. The extracts and fractions exhibited antiproliferative activity in vitro against some tumor cell lines and the dichlorometanic fraction of C. guaviroba showed low acute toxicity and antitumor activity in vivo. The evaluation of the anti-inflammatory and antinociceptive activities of the dichlorometanic fractions of C. adamantium and C.
guaviroba showed similar activities to the positive control indomethacin. Thus, this work
demonstrated the pharmacological potential these species as confirmation of the presence of phenolic compounds in these extracts.
ÍNDICE
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS xviii
LISTA DE FIGURAS xix
LISTA DE TABELAS xxi
1. INTRODUÇÃO 23 2. REVISÃO DA LITERATURA 28 2.1. Família Myrtaceae 28 2.2. Câncer 32 2.3. Plantas e quimioterápicos 34 2.4. Inflamação 34 2.5. Plantas e anti-inflamatórios 47 3. OBJETIVOS 52 4. MATERIAL E MÉTODOS 53
4.1. Coleta e identificação do material vegetal 53
4.2. Preparação dos extratos brutos 53
4.3. Fracionamento dos extratos brutos 53
4.4. Análise do teor de fenólicos solúveis totais dos extratos e frações 54 4.5. Análise do teor de flavonoides totais (flavonóis e flavonas) dos extratos e frações
55
4.6. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS 56
4.7. Quantificação por UHPLC–MS 56
4.8. Isolamento e identificação dos constituintes químicos 57 4.9. Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa frente a linhagens tumorais e linhagem não tumoral
59
4.10. Análises da expressão dos genes TNF-α e NF-kB1 em cultura de células de câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
61
4.11. Análises da fragmentação do DNA por citometria de fluxo em cultura de células de câncer pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
62
4.12. Ensaios in vivo com as frações dos extratos etanólicos brutos de C.
guaviroba e C. adamantium
63
4.12.1. Animais 64
4.12.2. Avaliação da toxicidade aguda 64
Ehrlich
4.12.4. Ensaios para avaliação do potencial antinoceptivo e anti-inflamatório 67
4.12.4.1. Teste de contorções abdominais 67
4.12.4.2. Edema de pata induzido por carragenina em camundongos 4.13. Análises estatísticas
68 69
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 70
5.1. Estudo fitoquímico 70
5.1.1. Fracionamento dos extratos brutos 70
5.1.2. Análise do teor de fenólicos solúveis totais e de flavonoides totais 70 5.1.3. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS 72
5.1.4. Quantificação por UHPLC–MS 75
5.1.5. Isolamento e identificação dos constituintes químicos 77 5.2. Avaliação do potencial antiproliferativo e antitumoral 83 5.2.1. Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa frente a linhagens tumorais e linhagem não tumoral
83
5.2.2. Análises da expressão dos genes TNF-α1 e NF-kB1 em cultura de células de câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
94
5.2.3. Análise por citometria de fluxo da fragmentação do DNA em cultura de células
99
5.2.4. Avaliação da toxicidade aguda 102
5.2.5. Ensaios em tumor sólido de Ehrlich 104
5.3. Avaliação do potencial antinoceptivo e anti-inflamatório in vivo 113
5.3.1. Atividade antinociceptiva 113
5.3.2. Atividade anti-edematogênica induzida por carragenina 115 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 7. PERSPECTIVAS 120 123 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 124 9. ANEXOS 150
Dedico este trabalho ao meu melhor amigo, companheiro fiel, meu marido, Vinicius e ao meu tesouro, meu filho João Gabriel.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por me darem forças nos momentos difíceis e por terem colocado no meu caminho pessoas que fizeram diferença neste meu aprendizado.
Obrigada Professor Dr. Marcos José Salvador por lá em 2008 ter me aceitado em seu grupo de pesquisa e me dado a oportunidade de seguir com meus estudos e sempre me incentivar quando propunha experimentos e mais experimentos, por nunca “podar” meus anseios.
Ao meu maior incentivador, Vinicius Pascoal, meu marido, que sempre compra minhas ideias, e me ajuda com suas opiniões e discussões sobre meus resultados. Ao meu filho, João Gabriel, luz da minha vida, que traz uma alegria estonteante para cada dia e que chegou bem juntinho do início do doutorado e que me mostrou que minha capacidade de conciliar vida profissional e meu papel de mãe. Vocês são meus tesouros! À minha mãe por me ajudar quando precisei, quando ela brincava com João para eu preparar seminários, estudar para as provas, etc.
Agradeço a todos da divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA e especialmente à Paula, Ana Lúcia e João Ernesto. Paula obrigada por me ensinar a lidar com os animais com toda a paciência do mundo e Aninha por sempre me ajudar quando precisei, tirando minhas dúvidas.
Begona e Professora Alexandra obrigada por toda ajuda! Rebeka Tomasin muito obrigada sempre! A todos do laboratório Multiusuário de Pesquisa Biomédica por me receberem tão bem e a disponibilidade de me ajudar, especialmente à Kelly, Thiago e à minha fiel “escudeira” Mariana, que pensei que ia me abandonar de tanto trabalho, mas
ela persistiu. Priscila e Professora Elan obrigada pela ajuda com os histopatológicos e Professor Léo por me ensinar com a gavagem dos animais, fazer mil perguntas nas apresentações e suas opiniões. Além de toda ajuda no meu trabalho, obrigada a todos por nossas conversas, pela boa convivência diária, pelos jogos da copa.
Agradeço à FAPESP, CNPq, CAPES, FAEPEX-UNICAMP e Proppi-UFF pelo suporte financeiro.
A todos que passaram pela minha vida nesses anos deixando meus dias melhores e colaboraram de uma maneira ou outra para meu trabalho, muito obrigada!
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
a.C. antes de Cristo
AAS ácido acetilsalicílico
AINES anti-inflamatórios não esteroidais Ca5 Ca6 C13 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona Carbono 13
Cae Extrato etanólico bruto de Campomaesia adamantium Caeb Fração butanólica do extrato etanólico bruto de C.
adamantium
Caed Fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de
C. adamantium
Caeh Fração hexânica do extrato etanólico bruto de C.
adamantium
Caehi Fração hidroalcóolica remanescente do extrato etanólico bruto de C. adamantium
Cge Extrato etanólico bruto de Campomaesia guaviroba Cgeb Fração butanólica do extrato etanólico bruto de C.
guaviroba
Cged Fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de
C. guaviroba
Cgeh Fração hexânica do extrato etanólico bruto de C.
guaviroba
Cgehi Fração hidroalcóolica remanescente do extrato etanólico bruto de C. guaviroba
COX ciclo-oxigenase
dC depois de Cristo
ESI-MS/MS Electrospray Ionisation tandem mass spectrometry
FFM Febre familiar do mediterrâneo
H Hidorgênio
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC HeteronuclearMultiple-Quantum Correlation IC inibição de crescimento IL-1 Interleucina-1 kV Quilovolt LOX lipo-oxigenase LT Leucotrienos
m/z relação massa/carga
MeOH-D Metanol deuterado
MHz MS
Mega Hertz
Espectrometria de massas
NCI Instituto Nacional do Câncer
NF-kB factor nuclear kappa B
nm Nanômetro
ºC graus Celsius
PN Produtos naturais
ppm partes por milhão
RMN ressonância magnética nuclear
RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
SN-38 7-etil-10-hidroxicamptotecina
TMS Tetrametilsilano
TNF-α Fator de Necrose Tumoral α
UHPLC Ultra high performance liquid chromatography
V Volt
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Substâncias isoladas de Taxus brevifolia. 37
Figura 2. Alcaloides da Vinca. 39
Figura 3. Estrutura química da camptotecina e derivados. 41 Figura 4. Estrutura química da podofilotoxina e derivados. 43 Figura 5. Esquema do fracionamento dos extratos etanólicos brutos das folhas de
Campomanesia adamantium e Campomanesia guaviroba. 54
Figura 6. Esquema do ensaio da avaliação antitumoral do modelo de tumor sólido de Ehrlich.
Figura 7. Esquema do ensaio da avaliação da atividade antitumoral do modelo sólido de Ehrlich, animais tratados via oral.
65 66 Figura 8. Esquema do ensaio de avaliação da atividade antinociceptiva induzida por ácido acético.
Figura 9. Esquema do ensaio da avaliação anti-edetamotênica induzido por carragenina.
66 69 Figura 10. Estruturas das substâncias identificadas no extrato bruto etanólico das folhas de Campomanesia guaviroba e/ou Campomanesia adamantium e em suas
frações. 74
Figura 11. Substância 5,7,3’,4’,5’-pentahidroxi-flavonol-3-O--L-ramnosídeo isolada e identificada na fração butanólica das folhas de C. adamantium. 78 Figura 12. Substância 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona isolada e identificada da fração butanólica das folhas de Campomanesia adamantium. 81 Figura 13. Gráfico da atividade antiproliferativa de C. guaviroba (Cge) e suas frações (Cgeh, Cged, Cgeb e Cgehi) e o quimioterápico doxorrubicina 85 Figura 14. Gráfico da atividade antiproliferativa de C. adamantium (Cae) e suas frações (Caeh, Caed, Caeb e Caehi) e o quimioterápico doxorrubicina. 88 Figura 15. Gráfico da atividade antiproliferativa de quercetina, quercitrina,
miricitrina e ácido gálico. 91
Figura 16. Gráfico da atividade antiproliferativa das chalconas Ca5 e Ca6 e o
quimioterápico doxorrubicina. 93
Figura 17. Análise de expressão do gene TNF-α1 por PCR em Tempo Real das
células NCI-H460. 96
Figura 18. Análise de expressão do gene NF-kB1 por PCR em Tempo Real das
células NCI-H460. 99
Figura 19. Porcentagem de células NCI-H460 com DNA fragmentado por análise
em citômetro de fluxo. 102
Figura 20. Desenvolvimento do tumor (mL) dos animais tratados via
intraperitoneal. 106
Figura 21. Evolução do tumor (mL) dos animais tratados via intraperitoneal. 108 Figura 22. Avaliação do volume do tumor dos animais tratados via oral. 110 Figura 23. Número de contorções abdominais dos animais em tratamento. 114 Figura 24. Evolução do aumento em porcentagem da espessura da pata dos animais
em tratamento. 116
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Constituintes químicos não-voláteis e atividades biológicas descritos na literatura para espécies do gênero Campomanesia (Myrtaceae). 31 Tabela 2. Conteúdo de fenólicos solúveis totais e de flavonoides totais do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e de suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e solução hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e
solução hidroalcoólica remanescente (Caehi). 72
Tabela 3. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de
Campomanesia guaviroba e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged),
butanólica (Cgeb) por ESI-MS/MS. 73
Tabela 4. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de
Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica
(Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcoólica remanescente (Caehi) por ESI-MS/MS. 74 Tabela 5. Substâncias quantificadas no extrato etanólico das folhas de
Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica
(Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcoólica remanescente (Caehi) e Campomanesia
guaviroba e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e
hidroalcóolica remanescente (Cgehi) por UHPLC-MS. 77
Tabela 6. Dados de RMN de 1H (200 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade, J, em Hz) e de RMN de 13C (50 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade) para o
flavonóide Caeb31. 80
Tabela 7. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e controle positivo doxorrubicina. 86 Tabela 8. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e de suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Caehi) e controle positivo
doxorrubicina. 89
Tabela 9. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL das substâncias identificadas nos etanólico bruto das folhas de C. guaviroba e C. adamantium e de suas frações (quercetina, quercitrina, ácido gálico) assim como o composto isolado Caeb31 (miricitrina) e controle
Tabela 10. Valores de concentração que leva à inibição de 100% do crescimento celular (TGI) em µg/mL da chalcona isolada de C. adamantium (Ca5 - 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona) e a chalcona identificada em C. guaviroba (Ca6- 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona) e controle positivo doxorrubicina. 94
1. INTRODUÇÃO
Os produtos naturais têm sido utilizados na medicina popular ao longo dos séculos para o tratamento de inúmeras doenças. As plantas, especialmente, têm demonstrado um papel importante no desenvolvimento da medicina tradicional (Cragg et
al., 2009). Registros na Mesopotâmia de 2600 anos a.C. documentam o uso de mais de
1000 derivados de plantas e muitos ainda são usados nos dias atuais no tratamento de tosses, resfriados, parasitas e processos inflamatórios (Borchardt, 2002). Atualmente, os medicamentos usados na terapia de inúmeras doenças são derivados direta ou indiretamente de vegetais, micro-organismos, organismos marinhos, vertebrados e invertebrados terrestres (Newman et al., 2000; Chin et al., 2006). Estudos demonstram que medicamentos derivados de produtos naturais são capazes de tratar 87% das enfermidades humanas, como as atividades antibacteriana, anticoagulante, imunossupressora e anticancerígena (Newman et al., 2003).
Analisando os medicamentos lançados entre os anos de 1981 a dezembro de 2010, 4,72% são medicamentos com princípios ativos isolados de produtos naturais enquanto 28,56% são produtos totalmente sintéticos. Porém, observando a origem dos outros produtos, 41,86% são moléculas de semi-síntese ou fármacos sintéticos com grupos farmacofóricos baseados em estruturas de produtos naturais (Newman et al., 2012). Dos 51 medicamentos anti-inflamatórios, nenhum foi isolado de plantas ou outra origem natural, 37 foram desenvolvidos a partir de síntese e 13 derivados de produtos naturais, especialmente pela semi-síntese e 1 produto biológico (derivado de proteína). Entre os 128 medicamentos anticâncer lançados no mesmo período, 12 eram produtos naturais
inalterados, 32 derivados de produtos naturais, 20 totalmente sintéticos e 35 semi-sintéticos ou que mimetizam o produto natural (Newman et al., 2012),
Recursos naturais com atividade anti-inflamatória são utilizados na medicina popular para o tratamento de febre, dor, enxaqueca e artrite ao longo da história. No início dos anos de 1800, o avanço nas pesquisas levou ao isolamento e identificação de bioativos puros, comumente referidos como produtos naturais (PN). Os primeiros compostos foram estricnina, morfina, atropina, quinina e colchicina (Cragg et al, 2014). Em 1826, E. Merck desenvolveu o primeiro produto natural puro comercial, a morfina. Este foi o início de uma nova era na medicina, onde fármacos poderiam ser purificadas a partir de plantas e administradas em dosagens precisas, independente da origem ou da idade do material vegetal (Newman et al., 2000; Cragg & Newman, 2001).
Em 30 dC, Celsius descreveu os quatro sinais clássicos da inflamação (calor, dor, rubor e tumor) e usava extratos de folhas da árvore Salgueiro para tratar esses sinais (Vane & Botting, 1987). Por muitos anos, as plantas contendo salicilatos foram utilizadas terapeuticamente até que com o desenvolvimento das pesquisas científicas, levou-se desenvolvimento do produto final derivado do ácido salicílico, o ácido acetilsalicílico (AAS ou Aspirina®) que foi lançada no mercado pela Bayer em 1899 e ainda é utilizada nos dias atuais (Zündorf, 1997). Outro exemplo de produto natural é a colchicina, alcaloide isolado de Colchicum autumnale, tem sido usada durante séculos na artrite gotosa aguda e nos últimos 50 anos ele tem sido empregado para um número crescente de doenças, como febre familiar do Mediterrâneo (FFM), esclerodermia, amiloidose e cirrose hepática (Ben-Chetrit & Levy, 1998). A quinina é outro alcaloide isolado de
antipirética, anti-inflamatória e analgésica (Sangeetha et al., 2011). A medicina tradicional chinesa e Ayurveda fazem uso de muitas plantas medicinais com propriedades anti-inflamatórias e são usadas por milhares de pessoas. Portanto, as misturas de ervas ou os princípios ativos isolados são alvo de muitos estudos.
Os quimioterápicos de origem vegetal presentes na terapêutica são um incentivo às pesquisas nesta área. A vincristina e vimblastina são bons exemplos de alcaloides, que foram isolados da Catharanthus roseus (L.) G. Don, conhecida também como Vinca, é utilizada pela população de Madagascar no tratamento de diabetes. Durante os testes de atividade hipoglicemiante, os extratos dessa espécie produziram granulocitopenia em consequência da supressão da medula óssea dos animais, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. Na atualidade, os medicamentos contendo vincristina ou vimblastina como fármacos são de grande utilidade no tratamento de linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e testículos e leucemia linfoblástica aguda infantil (Brandão et al., 2010). Espécies do gênero Podophyllum, tais como P. peltatum e
P. emodii, são utilizadas pelas populações nativas da América e da Ásia no tratamento do
câncer de pele e verrugas. Estudos levaram ao isolamento da podofilotoxina, uma lignana ariltetralínica, da qual foram obtidos o etoposídeo e o teniposídeo, cujos estudos experimentais permitiram a introdução desses na terapia para o combate ao câncer (Brandão et al., 2010). Em 2002, no bilionário mercado mundial farmacêutico, um terçodo lucro foi representado por apenas dois grupos de quimioterápicos derivados de produtos naturais, os taxanos e os derivados da camptotecina (Oberlis et al., 2004; Chin
O Brasil, dispõe de uma flora rica e diversa, é uma potencial fonte de novas substâncias com atividade farmacológica e com menos efeitos colaterais. Assim, realizou-se o estudo fitoquímico e a avaliação do potencial farmacológico de
Campomanesia adamatium, típica do bioma Cerrado e de Campomanesia guaviroba,
encontrada em áreas de Mata Atlântica. A família Myrtaceae, a qual o gênero
Campomanesia pertence, apresentam vegetais com importância alimentícia e medicinal,
tais como Psidium guajava L. (goiabeira), Eugenia uniflora (pitangueira) e Eucalyptus (eucalipto). Atividades biológicas descritas em Myrtaceae incluem as atividades anti-inflamatória, citotóxica, antinociceptiva e também de proteção da mucosa gástrica. Essas atividades, na maioria dos casos estão relacionadas com as atividades de flavonoides, que têm se mostrado eficaz em alguns casos (Sandhar et al., 2011).
Estudos com o gênero Campomanesia são recentes, entre os anos de 2004 e 2014, e foram descritas algumas atividades biológicas como potencial antinociceptivo, anti-inflamatório, protetor da mucosa gástrica e contra cepas de bactérias, fungos e protozoários (Markan et al., 2004; Bonilla et al., 2005; Cardoso et al., 2010; Brandelli et
al., 2013; Ferreira et al., 2013; Michel et al., 2014). Para confirmar seu uso popular,
estudos froam realiados com a espécie C. xanthocarpa, para confirmar seu uso popular, no tratamento de pacientes com hipercolesterolemia e os resultados demonstraram que pacientes que receberam esta espécie vegetal tiveram os níveis de colesterol total e LDL reduzido (Klafte et al., 2009). Com base em resultados anteriores em compostos fenólicos descritos no gênero, este trabalho se propôs avaliar o potencial antiproliferativo e anti-inflamatório em C. adamantium e C. guaviroba que são utilizadas na medicina popular. Em 2013, foi descrito a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de extratos
das folhas de C. adamantium cultivadas no estado de Minas Gerais (Ferreira et al., 2013) e estudos com extratos das folhas de C. guaviroba com potencial farmacológico e fitoquímico apresentados neste trabalho são inéditos, bem como a avaliação da atividade anticancer de fitoderivados das folhas de C. adamantium.
2. Revisão de literatura
2.1. Considerações gerais sobre a família MyrtaceaeDe acordo com APG III (2009) Myrtaceae pertence a Família das Dicotiledôneas, localizada na ordem Myrtales, no grupo Rosídeas, na subclasse Malvidis. A família compreende 121 gêneros distribuídos em 3800-5800 espécies de arbustos e árvores, distribuídas pela Austrália, Sudeste Asiático, e da área tropical para o sul da América e com poucas espécies na África (Wilson et al., 2001). As características da família são: folhas com glândulas com óleos essenciais, e flores com ovário médio a inferior, estames geralmente numerosos, floema interno e pontuações nos vasos do xilema (Conti et al., 1997; Wilson et al, 2001).
Estudos fitoquímicos realizados com algumas espécies de Myrtaceae mostraram a ocorrência de esteroides, terpenoides, óleos essenciais, flavonoides e taninos. O estudo de espécies de Mytaceae pode ser justificado pela diversidade estrutural dos constituintes químicos, complexidade taxonômica, importância alimentícia, medicinal e quanto às atividades biológicas: tais como anti-iflamatória, cicatrizante, anti-séptica, antidiarreica, antiulcerogênica, antioxidante e antimutagênica (Lorenzi & Abreu Matos, 2002; Di Stasi & Hiruma-Lima, 2002; Gonçalvez et al., 2005; Donatini et al., 2009; Neri-Numa et al., 2013). Os óleos essenciais de algumas Myrtaceae foram caracterizados quimicamente e avaliados quanto as atividades biológicas, sendo que na maioria das espécies estudadas, os óleos essenciais apresentaram principalmente atividade antifúngica e antibacteriana. Em alguns casos, há também relato de óleos essenciais de Myrtaceae com promissora atividade citotóxica, larvicida e antioxidante (Stefanello et al., 2011).
O gênero Campomanesia, a que pertence às espécies em estudo, está incluído na subfamília Myrtoideae (Cronquist, 1968; Landrun, 1986). As espécies desse gênero possuem diversificada importância econômica. Seus frutos comestíveis são consumidos por várias espécies de pássaros e mamíferos, sendo também usados na produção de doces caseiros, sorvetes, aguardente, licores e refrescos. É conhecida como “gabiroba” e utilizada popularmente como antidiarréico e antisséptico das vias urinárias (Piva, 2002). Há alguns estudos químicos e avaliação de atividade biológica in vitro e in vivo relacionada com a espécie C. adamantium. Suas folhas e cascas são usadas na medicina popular como antiinflamatórias, antidiarréicas, anti-sépticas das vias urinárias e para o tratamento da gripe (Coutinho et al., 2008; Pavan et al., 2009; Pascoal et al., 2011a). A atividade antioxidante dos extratos de C. adamantium foi avaliada pelo método do DPPH e cinco flavanonas e três chalconas foram isoladas do extrato alcoólico das folhas deste vegetal (Coutinho et. al., 2008). A atividade antituberculose também foi avaliada frente ao microrganismo Mycobacterium tuberculosis do extrato dos frutos de C. adamantium,
resultados esses que demonstraram a capacidade destes extratos de inibir o crescimento
deste microorganismo em concentrações variando de 7,8 a 62,5 µg/mL (Pavan et al., 2009). A atividade antioxidante foi também avaliada pelo método ORACFL e quatro flavonóis e três chalconas foram identificados no extrato bruto de C. adamantium, coletada em Curitiba (PR), Brasil (Pascoal et al., 2011a). As folhas desta espécie foram avaliadas quanto a sua atividade anti-inflamória e antinociceptiva in vitro e in vivo e os flavonóides quercitina, miricetina e miricitrina foram os constituintes identificados neste trabalho (Ferreira et al., 2013).
Quanto à C. guaviroba, estudos com o óleo essencial de suas folhas relataram a atividade antiproliferativa desta espécie frente a linhagens celulares de leucemia (Pascoal
et al., 2011b). Porém, até o presente momento, não foram encontrados relatos de
trabalhos na literatura acerca das propriedades farmacológicas com os contituíntes não-voláteis. Nas duas espécies em estudo não há relatos na literatura trabalhos sobre a atividade antiproliferativa em linhagens celulares tumorais in vitro e atividade antitumoral em modelos animais in vivo. A tabela 1 sumariza os constituintes químicos não-voláteis e atividades biológicas documentados em literatura para espécies do gênero
Tabela 1. Constituintes químicos não-voláteis e as atividades biológicas descritas na literatura para
espécies do gênero Campomanesia (Myrtaceae).
Espécie Parte da planta Atividades biológicas Substâncias identificadas ou isoladas
Referência
C. adamantium folhas in vivo anti-inflamatória e
antinociceptiva
quercetina, miricitrina e miricetina. Ferreira et al., 2013
C. adamantium frutos antimicrobiana 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavanona, dihidroxi-6-metilflavanona, 5,7-dihidroxi-8- metilflavanona, 5,7-dihidroxi-6,8-dimetilflavanona, 2’,4’-diidroxi-6’-metoxichalcona e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona Cardoso et al., 2010
C. adamantium frutos anti- Mycobacterium
tuberculosis 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavavona, 6-metilflavanona, 5,7-diidroxi-8- metilflavanona, 5,7-diidroxi-6,8-dimetilflavanona, 2’,4’-diidroxi-6’-metoxichalcone e 2’,4’- diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona Pavan et al., 2009
C. adamantium frutos inflamatória, anti-hiperalgésico e antidepressiva. 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavavona, diidroxi-6-metilflavanona, 5,7-dihidroxi-8- metilflavanona, 5,7-dihidroxi-6,8-dimetilflavanona, 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcone e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona Souza et al., 2014
C. adamantium folhas atividade antioxidante isoquercetrina, miricetina, quercitrina, quercetina,
2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona,
2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’- metoxichalcona e
2’,4’-dihiroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona
Pascoal et al., 2011a
C. eugenioides folhas anti- Staphylococcus aureus, C.
albicans, C. parapsicoides, C. tropicalis, Leishmania amazonensis, HSV-1, Polivírus
ND Moura-Costa et al.,
2012
C. lineatifolia sementes atividade antimicrobiana champanonas A, B e C Bonilla et al., 2005
C. lineatifolia folhas atividade antioxidante e prevenção de ulcerações
gástricas em ratos
quercitrina, catequina Madalosso et al., 2012
C. pubescens frutos atividade antimicrobiana 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavanona, dihidroxi-6-metilflavanona, 5,7-diidroxi-8-metilflavanona, 5,7-dihidroxi-6,8-dimetilflavanona, 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcone Cardoso et al., 2010
C. velutina folhas Atividade anti-inflamatória e atinoceptiva
miricitrina Michel et al., 2013
C. xanthocarpa frutos atividade antimicrobiana caracterização de flavonóides, saponinas e taninos
Souza-Moreira et al., 2011
C. xanthocarpa folhas Redução dos níves de colesterol total e LDL em pacientes e atividade antioxidante in vitro
caracterização de flavonóides, saponinas e taninos e terpenos
Klafke et al., 2010
C. xanthocarpa folhas anti-Trichomonas vaginalis ND Brandelli et al., 2013
C. xanthocarpa folhas hipoglicêmica e controle de peso
in vivo
ND Biavatti et al., 2004
C. xanthocarpa folhas gastroprotetora caracterização de flavonóides, saponinas e taninos
2. Câncer
O câncer é o termo utilizado para descrever um conjunto de mais de 100 doenças que se caracterizam por um crescimento descontrolado e podendo invadir tecidos adjacentes ou ainda podem cair na corrente sanguínea ou linfática, levando a formação de tumores secundários em diferentes partes do organismo (INCA, 2014; WHO, 2013a). Suas causas são variadas, podendo ser externas (radiações, vírus e xenobióticos) e internas (predisposição genética, desequilíbrio hormonal e deficiências do sistema imunológico) (Lopes et al., 2002).
O câncer pode levar anos para se desenvolver a partir de uma célula normal, sendo que apresentam um microambiente com caracteríticas como a perda de contato célula-célula, promoção de crescimento inadequado, a senescência, hipóxia, acidose, isquemia, entre outros (Gatenby & Gillie, 2008; Vendramini-Costa & Carvalho, 2012).
A iniciação do tumor a partir de uma célula normal envolve alterações irreversíveis no DNA ocasionada por carcinógenos, que ativam oncogenes e/ou inativação genses supressores de tumor. Em seguida, ocorre a promoção do tumor por agentes promotores, como estrogênio, progesterona, agentes infecciosos como o vírus da hepatite B e C, Helicobacter pylori, agentes químicos, como o tabaco e inflamação crônica, que levam ao aumento de divisões das células mutadas e reduz o processo de morte celular. A fase seguinte é a progressão do tumor, em que há um aumento da massa tumoral, invasão de tecidos e metástases, e acúmulo de novas mutações que podem deixá-lo mais agressivo e não responsivo às terapias disponíveis (Coussens & Werb, 2002; Karin & Greten, 2005; Weinberg, 2008; Vendramini-Costa & Carvalho, 2012).
Entre os anos de 2007 até 2030 está previsto um aumento de 45% no número de mortes por câncer no mundo. Estima-se que os novos casos na maioria dos países desenvolvidos, passem de 11,3 milhões em 2007 para 15,5 milhões em 2030. É a segunda maior causa de morte depois das doenças cardiovasculares, e evidências epidemiológicas apontam que essa é também uma tendência emergente no mundo menos desenvolvido (WHO, 2013b). Importante causa de doença e morte no Brasil, desde 2003, as neoplasias malignas constituem-se na segunda causa de morte na população brasileira, representando quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no Sistema de Informações sobre Mortalidade (INCA, 2014). O tratamento do câncer pode ser realizado por excisão cirúrgica, irradiação e quimioterapia, dependendo do tipo de tumor e do estágio de desenvolvimento da doença. A quimioterapia pode ser utilizada como terapia propriamente dita ou como adjuvante de outros tipos de tratamento (Rang et al., 2012).
Segundo estimativas realizadas bianualmente, em 2014 são esperados aproximadamente 576 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Os tipos mais incidentes de cânceres são os de pele não melanoma (182 mil casos novos), próstata (69 mil), mama (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil) e estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (INCA, 2014).
As principais classes de fármacos usados na quimioterapia contra o câncer atualmente incluem os antimetabólitos, que inibem principalmente a síntese de purinas (mercaptopurina, tioguanina, entre outros); agentes que inibem a formação de desoxirribonucleotídeos (hidroxiureia, fluoruracila); agentes que modificam o DNA por
alquilação (cisplatina); agentes que interagem com a topoisomerase II (bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, etoposídeo); agentes inibidores da síntese do RNA ou de proteínas (actinomicina D, vincristina e vimblastina) e os que interagem com a tubulina (taxanos) (Brandão et al., 2010; Rang et al., 2012).
Entretanto, para todos os grupos de agentes antitumorais apresentados existe uma alta incidência de efeitos adversos associados à elevada toxicidade. Ainda, a eficácia desta terapia contra o câncer pode ser comprometida pela resistência aos fármacos disponíveis (MDR = multidrug resistence ou resistência a multifármacos). A multirresistência é uma condição em que as células cancerosas são protegidas dos efeitos tóxicos de diversos medicamentos contra o câncer, com diferentes estruturas químicas e modos de ação. A ocorrência da MDR é muito acentuada, o que obriga o clínico a optar por terapias de associação de dois ou mais fármacos (Jendiroba et al., 2002). A MDR clássica caracteriza-se por alterações no gene MDR1 que codifica a glicoproteína P, canal responsável pela entrada e saída do fármaco na célula tumoral e outras (Aggarwal et al., 2006, Baguley, 2010). Outros mecanismos importantes de MDR incluem alterações na expressão e/ou síntese de enzimas-alvo (Beck, 1990), ativação ou degradação alterada do fármaco (Morrow & Cowan, 1990), reparo aumentado do DNA (Hammond et al., 1989) e falência dos processos de apoptose (Hannun, 1977; Liu et al., 2001). Deve-se destacar que alguns desses mecanismos de resistência a fármacos podem coexistir, promovendo um alvo tumoral refratário ao tratamento por fármacos (Teodori et al., 2002).
2.3. Plantas e quimioterápicos
Para a busca de compostos para o tratamento do câncer, centros de excelência em pesquisa desenvolveram programas de triagem para testar fármacos experimentais.
Como exemplo, nos Estados Unidos, o Instituto Nacional do Câncer (NCI), desde 1937 busca compostos potencialmente ativos para combater o câncer. Em 1955, o NCI formou uma organização para integrar recursos de laboratório com pesquisas clínicas visando o desenvolvimento de novos fármacos anticâncer (Cancer, 2014a).
As plantas e seus derivados deram um impulso aos medicamentos antineoplásicos. Taxus brevifolia é popularmente chamada de teixo do Pacífico ou teixo ocidental, é uma árvore da família de teixo (Taxaceae) e é encontrado do Alasca à Califórnia. Esta planta pode chegar a 25 metros e do extrato da casca desta espécie foi isolado e identificado em 1971 por Wani e colaboradores o composto paclitaxel (1) (Taxol®) (Figura 1), um diterpeno que mostrou uma potente atividade para o tratamento de certos tipos de câncer. A grande questão é que esta espécie cresce lentamente e leva em torno de 100 anos até que a casca seja colhida e para a extração de um quilo de taxol, precisa-se de cem toneladas de cascas de T. brevifolia, o que representa a utilização de cerca de 3000 árvores (Wani et al., 1971). Este fato levou ao desmatamento de populações selvagens e de espécies afins do gênero Taxus na tentativa de se obter paclitaxel (Encyclopaedia Britannica, 2014). Portanto, o uso de uma fonte natural para a obtenção desta substância teve de ser descartado, e a semi-síntese se tornou uma opção. Em 1980, foi descoberto que o paclitaxel age estabilizando microtúbulos (Schiff & Horwitz, 1980) e só em 1992, o paclitaxel foi aprovado pela FDA (Food and Drug Administration) (FDA, 2014).
Os extratos obtidos a partir de folhas da espécie Taxus baccata, conduziu ao isolamento da molécula de 10-desacetilbacatina III (10-DAB), que possui a estrutura química semelhante à estrutra do paclitaxel e também apresentou atividade anticâncer
(Denis et al., 1988). Portanto, a 10-DAB poderia ser transformada em paclitaxel e seu análogo docetaxel (2) (Figura 1). A vantagem de se utilizar esta técnica de produção é que se evita a corte de plantas, já que as folhas são renováveis (Denis et al., 1988). Em 1994, foi desenvolvida a síntese total de taxol (Nicolau et al., 1994; Holton et al., 1994). O taxol é o tratamento atual de escolha para o câncer de ovário, utilizado por via intravenosa e em combinação com outros fármacos anti-tumorais como a cisplatina ou carboplatina, nos casos em que o paciente apresenta metástases, e a cirurgia não é uma opção e tratamentos com terapias de platina padrão falharam (Thurston, 2007). Ele também é usado em câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama metastático e como terapia de segunda linha em pacientes com sarcoma de Kaposi (Drugs, 2014a).
O docetaxel age através da ruptura dinâmica dos microtúbulos em células cancerígenas altamente mitóticas e é capaz de interferir com o crescimento e proliferação de células de câncer (Drugs, 2014b). Inicialmente, esse medicamento foi indicado para o tratamento de câncer de mama, mas pode ser usado no tratamento do câncer do pulmão de células não pequenas, também de certos tipos de câncer da cabeça e pescoço e estômago e em conjunto com outros medicamentos (prednisona) para tratar alguns tipos de câncer de próstata (Thurston, 2006; Drugs, 2014b). Com base em estudos com pacientes com câncer de mama, foi sugerido que o docetaxel é mais ativo do que o paclitaxel, por possuir uma meia-vida mais longa, a captação celular mais rápida e com maior retenção intracelular (Riou et al., 1994).
Figura 1. Substância isolada de Taxus brevifolia, paclitaxel (1) e seu análogo docetaxel
(2).
Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) é uma planta nativa de
Madagascar, anteriormente descrita como Vinca rosea (L.), esta planta está espalhada por todo o mundo e é usada como planta ornamental (Van Bergen & Snoeijer, 1996). Na medicina popular, C. roseus é usado por seus efeitos como hipotensor, hipoglicemiante e por suas propriedades purgativas (Svoboda & Blake, 1975) além de seu principal uso é no tratamento de diabetes (Moudi et al., 2013). Os principais metabolitos secundários encontrados nestas espécies são taninos e alcaloides, e mais de 100 compostos têm sido descritos na literatura (Vega-Ávila et al., 2012). Estes alcaloides, que têm grande impacto econômico e terapêutico, são conhecidos como alcaloides da vinca, e entre eles, vinblastina (3), vincristina (4), vindesina (5), vinorelbina (6) (semi-sintética) e vinflunina
(7) são usados no tratamento de câncer (Figura 2). As propriedades antitumorais de C.
roseus foram descobertas por dois grupos independentes na década de 1950. O
mecanismo de ação dos alcaloides da vinca está associado ao bloqueio do ciclo celular, uma vez que estes compostos ligam-se aos microtúbulos, β-tubulina, que formam o fuso mitótico na célula, inibem a polimerização de microtúbulos no ciclo celular (Thurston, 2006). Vincristina é indicado para leucemia aguda, e também útil em combinação com outros agentes oncolíticos, no tratamento da doença de Hodgkin, linfomas malignos não-Hodgkin, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, e tumor de Wilms (Gragg et al., 2005; Thurston, 2006). Vinblastina é um medicamento usado principalmente na quimioterapia do câncer de bexiga e de outras condições, tais como linfoma, câncer testicular, câncer de mama ou sarcoma de Kaposi (Gragg et al., 2005; Thurston, 2006).
Figura 2. Alcaloides da Vinca: vinblastina (3), vincristina (4), vindesina (5), vinorelbina
(6), a vinflunina (7).
Originária do sul da China, a Camptotheca acuminata é uma árvore cujos extratos começaram a ser estudados na década de 1950. Na década de 1960, o alcaloide camptotecina (8) (Figura 3) foi isolado a partir de 20 kg de amostra de madeira e casca de C. acuminata (Wall et al., 1966). O uso clínico da camptotecina foi limitado devido à baixa solubilidade em água e o NCI decidiu formular uma solução intravenosa do sal de sódio da camptotecina, solúvel em água que pôde ser utilizado em ensaios clínicos. Em 1996, dois análogos da camptotecina, topotecano (9) e irinotecano (10), receberam a aprovação da FDA para serem usados contra câncer do
A camptotecina inibe uma proteína nuclear, a topoisomerase I (Topo I), que é uma enzima essencial para os processos celulares, pois inibe a re-ligação de DNA de cadeia simples (Hsiang et al., 1985; Husain et al., 1994).
O topotecano é um composto semi-sintético hidrófilo, com um grupo N, N-dimetilaminometil em C9 que é responsável pela melhoria da solubilidade em água. O seu mecanismo de ação está baseado no fato de que este composto inibe a formação de DNA na fase S do ciclo celular por inibição da topoisomerase I, que em seguida, impede a religação de ssDNA, afetando assim os processos de transcrição e de replicação (Staker et al., 2002). O topotecano é indicado para o tratamento de certos tipos de câncer de pulmão, de ovário e do colo do útero e tem demonstrado atividade favorável para o tratamento de metástases cerebrais (Wong & Berkenblit, 2004; Bruce
et al., 2011). E irinotecano é um análogo semi-sintético da camptotecina, que é
hidrolisado in vivo em a 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38), tornando-se um metabólito ativo (Thurston, 2006). SN-38 é 1000 vezes mais potente do que o irinotecano como um inibidor da topoisomerase I purificada in vitro (Rahier et al., 2005). É indicado para o tratamento de câncer colorretal avançado e é mais comumente administrado em perfusão intravenosa. Além disso, irinotecano foi avaliado contra e câncer de pulmão de não-pequenas células e células-pequenas, câncer de ovário e câncer de colo uterino e está sendo testado em ensaios clínicos recentes envolvendo pacientes com gliomas malignos (Gragg et al., 2005; Thurston, 2006).
Figura 3. Camptotecina (8) e derivados: topotecano (9) e irinotecano (10).
Outro estudo buscando agentes antitumorais em plantas com sucesso foi o com
Podophyllum peltatum também chamado Mayflower ou Mandrake, é uma planta
herbácea perene da família Berberidaceae, nativo do leste da América do Norte. Os rizomas secos são utilizados pelas suas propriedades medicinais no tratamento de verrugas genitais (Enciclopédia Britânica, 2014b). Podofilotoxina (11), um composto lignano, foi inicialmente isolado a partir de P. peltatum, e foi capaz de bloquear a mitose (Loike & Horwitz, 1976; Loike et al., 1978). P. emodi (syn. P. hexandrum Royle) é nativa das altitudes mais baixas e os arredores do Himalaia, e é uma boa fonte de podofilotoxina, já que seu rendimento é maior que em P. peltatum. Ainda a podofilotoxina é também encontrado em outras espécies como Linum, Dasylinum e
Estudos demonstraram que os derivados da podofilotoxina apresentam moderrada atividade anticancerígena, mas por causa de seus efeitos tóxicos seu uso foi proibido em 1950 (Greenspan et al., 1950; Leiter et al., 1950). A empresa Sandoz Pharmaceuticals iniciou estudos para síntese de derivados de podofilotoxina, em uma tentativa de se obter compostos anticancerígenos menos tóxicos. Em 1966 foi sintetizado o composto etoposídeo (12) e o posteriromente teniposido (13) em 1967, com maior atividade anti-neoplásica (Hande, 1998) (Figura 4).
O etoposídeo é utilizado para tratar o câncer de pulmão e dos testículos e atua sobre a enzima topoisomerase II, que está presente em todas as células. Esta enzima promove a quebra da cadeia dupla de DNA para que ocorra a sua duplicação. Devido à sua baixa solubilidade em água, foi desenvolvido o pró-fármaco fosfato de etoposídeo, e pode ser administrado de forma segura ao longo de períodos de curta duração (5-30 min), é farmacocineticamente equivalente ao etoposídeo e também possui toxicidade semelhante ao etoposídeo (Budman et al., 1994; Thompson et al., 1995; Kaul et al., 1995; Schacter, 1996). O teniposídeo é um análogo de etoposido e é usado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda em crianças quando os tratamentos de primeira escolha não são bem sucedidos (Drugs, 2014c; Thurston, 2006).
Figura 4. Podofilotoxina (11) e derivados etoposídeo (12) e teniposídeo (13).
A dificuldade do tratamento de alguns tumores sólidos e a pesquisa de compostos capazes de interagir seletivamente com as células neoplásicas, impulsiona os estudos na busca de novos agentes quimioterapêuticos em plantas. Além da busca por fármacos novos mais eficazes, há também uma preocupação com a extinção de espécies que nunca foram avaliadas para atividades biológicas e podem causar um impacto econômico nos países em desenvolvimento pelo na produção de novos de medicamentos nesta patologia.
2.4. Inflamação
A inflamação é a resposta do hospedeiro contra injúria em um tecido ou após a invasão de patógenos, cujo objetivo é a eliminação da causa inicial da lesão celular. Assim, a resposta inflamatória é um evento em que as células e mediadores trabalham para neutralizar e eliminar estímulos nocivos e manter a homeostase (Cotran et al., 2006; Medzhitov, 2010). Embora a inflamação seja essencialmente um processo fisiológico e benéfico, os processos inflamatórios podem levar a lesões teciduais quando respondem de maneira exacerbada ao agente agressor e estão envolvidos na patogênese e progressão de muitas doenças como asma, rinite, artrite, aterosclerose, esclerose múltipla e lesão de isquemia-reperfusão (McFarland & Martin, 2007; Waldburger & Firestein, 2009; Nathan & Ding, 2010; Eltzschig & Eckle, 2011; Mandhane et al., 2011; Van-Assche et al., 2011). A inflamação pode ser aguda ou crônica, dependendo do tempo de exposição ao agente agressor. Assim, inflamações que duram horas ou dias são consideradas agudas e se caracterizam por fenômenos exsudativos - permeabilidade vascular, com acúmulo de líquido na região inflamada (edema), fibrina, leucócitos, especialmente neutrófilos, e hemácias. As que persistem por semanas e meses, crônicas, se caracterizam por fenômenos proliferativos, com proliferação de vasos, fibroblastos, com migração e proliferação local de monócitos e linfócitos. A inflamação aguda pode evoluir para a resolução dos danos ou tornar-se crônica (Montenegro & Fecchio, 1999).
O processo inflamatório apresenta quatro sinais cardinais: calor, rubor, edema e dor. O calor e o rubor são decorrentes da vasodilatação que leva ao local afetado uma maior quantidade de sangue (hiperemia), e, portanto, há um aumento da temperatura pelo
aumento de sangue e há vermelhidão pela concentração de sangue. O tumor (edema) se dá pelo aumento da permeabilidade vascular que permite o extravasamento de líquidos, e a dor que é resultante da compressão dos nervos pelo tumor e pelos mediadores químicos liberados. Virchow, no século XIX acrescentou o quinto sinal da inflamação, a perda de função, que é consequência de vários fatores, especialmente do edema e dor, onde o órgão deixa de ser usado pelo desconforto causado pelo processo inflamatório (Montenegro & Fecchio, 1999).
A resposta inflamatória envolve vários eventos celulares e a liberação de inúmeras enzimas e mediadores químicos. As reações inatas podem se dividir em eventos vasculares e celulares no local que sofreu a agressão. Os eventos vasculares caracterizam-se por inicial vasoconstrição, caracterizam-seguido de vasodilatação, que provocam um aumento no fluxo sanguíneo (calor e rubor) e por alterações na permeabilidade vascular, conduzindo ao extravasamento de exsudato para o interstício, por mediadores, produzidos a partir do plasma e das células. Os leucócitos circulantes aderem-se ao endotélio vascular e migram para o tecido intersticial em direção ao local da lesão, sob sinalização de agentes quimiotáticos (citocinas e leucotrienos), e fagocitam o agente agressor e degradam o tecido que foi lesado (Coutinho et al., 2009).
Dentre os mediadores da inflamação, encontram-se histamina, metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), fator de ativação plaquetária, bradicinina, óxido nítrico, neuropeptídeos e citocinas. A histamina é armazenada no interior de lisossomas de mastócitos, basófilos e plaquetas (Montenegro & Fecchio, 1999). O ácido araquidônico é liberado dos fosfolipídios das membranas celulares pela ação da enzima fosfolipase A2, quando a célula sofre estímulos mecânicos,
químicos, físicos ou através de outros mediadores (Cotran et al., 2006). O ácido araquidônico livre é metabolizado pela enzima ciclo-oxigenase (COX) (isoforma COX-2) resultando na biossíntese de prostaglandinas e tromboxanos (prostanóides) e ou pela enzima lipo-oxigenase (LOX), dando origem aos leucotrienos (LT) (Botting, 2006; Rang
et al., 2012).
Nas células endoteliais do tecido lesionado a enzima NO sintase (NOS), forma indutível (i-NOS), produz óxido nítrico (NO) e este apresenta potente ação vasodilatadora, aumentando a permeabilidade vascular. Também atua como regulador do recrutamento de leucócitos e exerce ação citotóxica contra micro-organismos. Já as citocinas mais importantes no processo inflamatório são as citocinas pró-inflamatórias TNF-α (Fator de Necrose Tumoral α), IL-1 e IL-6 (Interleucina-1 e interleucina-6), liberadas por macrófagos ativados e vários outros tipos celulares, que favorecem a aderência leucocitária ao endotélio, aumentam a síntese de prostaciclina e desencadeiam uma cascata de citocinas secundárias. Já as citocinas secundárias atraem e ativam as células inflamatórias móveis (Cotran et al., 2006; López-Posadas et al., 2008).
Assim, o organismo age para que o agressor seja eliminado e o tecido danificado seja reparado. Porém, o processo inflamatório pode progredir com a formação de abscessos, quando um agente piogênico se instala no tecido, ou progredir para a inflamação crônica, quando esse processo é sempre ativado. A inflamação crônica desempenha um papel importante no stress oxidativo, e pode estar associada a inúmeras doenças como doença de Alzheimer, Parkinson, disfunções cardíacas, diabetes e câncer, doenças auto-imunes como artrite, aterosclerose, doenças do trato respiratório, como asma, rinite (Wellen & Hotamislgil, 2005; Medzhitov, 2010). O processo inflamatório
tem sido associado à carcinogênese pela atividade das lipo-oxigenases (Furstenberger et
al., 2006) e podem levar ao câncer de pâncreas, câncer de próstata, de mama, entre outros
cânceres (Tong et al., 2002; Ding et al., 2003; Matsuyama et al., 2004). Acredita-se que mais de 25% dos tipos de câncer estão relacionados a infecções crônicas e outros tipos de inflamação (Schetter et al, 2010).
2.5. Plantas com propriedades anti-inflamatórias
Os agentes anti-inflamatórios são fármacos utilizados para interferir no processo reacional de defesa do organismo, diminuindo a inflamação e tentando amenizar o desconforto do paciente. São divididos em glicocorticoides e anti-inflamatórios não – esteroidais (AINES).
Os glicocorticoides são hormônios esteróides, sintetizados no córtex da glândula adrenal, que afetam o metabolismo dos carboidratos e reduzem a resposta reduzem a resposta inflamatória (Hardman et al., 2003). Os glicocorticoides sintéticos são muito parecidos com os endógenos, modulam processos inflamatórios e imunológicos e agem inibindo da transcrição do gene da enzima ciclo-oxigenase-2 e à indução da proteína lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2 e reduzem a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1 (Rang et al., 2012). Indicados para doenças auto-imunes e na prevenção e/ou tratamento da rejeição de transplantes e alergias. Apresenta, principalmente com o uso em longo prazo, uma lista de efeitos colaterais indesejáveis como equimose e purpúria, face arredondada (chamada de fácies em lua), pelo acúmulo de gordura na região posterior do pescoço e das costas (chamado de corcova ou giba de búfalo) e pela distribuição irregular da gordura corporal, com predomínio na região
abdominal e tronco, alterações oftalmológicas, como a catarata e glaucoma, elevações no colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade) e triglicerídeos, e redução dos níveis de colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade) entre outros efeitos indesejados (Rang et
al., 2012).
Assim, os efeitos colateriais dos glicocorticoides limitam seu uso. Para a maior parte dos casos de processos inflamatórios são utilizados os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES) que atuam inibindo a enzima ciclo-oxigenase (COX), impedindo a formação de prostaglandinas, e de tromboxanos, mediadores do processo inflamatório (Rang et al., 2012). Atualmente existem mais de 50 medicamentos desta classe no mercado mundial, e a maioria inibe tanto a isoforma COX-1 quanto a isoforma COX-2. Assim, a atividade anti-inflamatória (e provavelmente analgésica e antipirética) esteja relacionada com a inibição da COX-2 e os efeitos indesejados principalmente no trato gastroinstestinal, seja pela ação sobre a COX-1 (Rang et al., 2012). Fármacos inibidores da COX-2 estão em uso terapêutico e apesar de apresentarem menos efeitos indesejados, ainda não são bem tolerados pelos pacientes quanto era esperado em relação aos efeitos indesejados quanto ao sistema gástrico. Além disso, estudos demonstraram efeitos dessa classe de medicamento sobre o sistema cardiovascular, como elevação da pressão arterial, podem predispor ao acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio (Rang et al., 2012, Harirforoosh et al., 2013).
Devido às reações adversas apresentadas pelas duas classes de medicamentos anti-inflamatórios, pacientes com dores crônicas e incapacitantes como artrite e artrose buscam alternativas de tratamento com os fitoterápicos. Fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de plantas medicinais e são obtidos empregando-se exclusivamente
derivados de droga vegetal e oferecem garantia de qualidade, tendo efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de uso para a população (ANVISA, 2014).
Diferentemente do tratamento do câncer, as plantas têm sido utilizadas em processos inflamatórios na forma de fitoterápicos e não como moléculas isoladas, como
Harpagophytum procumbens (garra-do-diabo) em casos de artrite reumatoide, Uncaria tomentosa (unha-de-gato) para osteoartrite e artrite reumatoide, Boswellia serrata em
casos de dor e rigidez em pacientes com artite, Pterodon pubescens (Sucupira), além de formulações de uso tópico com Arnica montana (arnica comum) e Solidago microglossa (falsa arnica) em inflamações agudas por trauma ou crônicas de doenças auto-imunes. Em 2005, foi lançado no mercado farmacêutico Acheflan®, indicado no tratamento local de processos inflamatórios nas formas farmacêuticas de aerosol e de creme, com pesquisa 100% nacional, do óleo essencial de Cordia verbenacea (erva-baleeira), padronizado em 2,3-2,9% do terpeno α-humuleno (Aché, 2014).
Ensaios clínicos com plantas medicinais para tratar a artrite reumatóide têm sido desenvolvidos. Assim extratos de Tripterygium wilfordii que já são usados na China em doenças auto-imunes, incluindo artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite e asma, vêm sendo aceitos pela medicina ocidental. Após resultados promissores em artrite reumatoide, iniciou-se o interesse nesta planta, que é rica em terpenóides, com três principais diterpenóides: triptólido, tripdióiido e triptonide, sendo responsáveis pela atividade imunossupressora e anti-inflamatória (Récio et al., 2012). Extratos de Boswellia
serrata Roxb. ex Colebr. (Burseraceae) foram estudados em casos de reumatismo
tipo moderada a grave, onde 66% dos pacientes mostraram bons resultados com pouco ou nenhum efeito indesejável. Outros ensaios foram realizados e indicaram que B. serrata foi clinicamente efetiva (Ernst, 2008).
Em pacientes com doença intestinal inflamatória, foram testadas cápsulas contendo Artemisia absinthium L. (Asteraceae) que levou à remissão completa dos sintomas em 65% dos pacientes (Omer et al., 2007) e o suco de Triticum aestivum L. (Poaceae) reduziu o índice de atividade da doença em geral e da severidade da hemorragia retal em pacientes (Ben-Arye et al., 2002).
Além da produção de fitoterápicos, as plantas por apresentarem um metabolismo secundário capaz de produzir mais de 200000 pequenas moléculas distintas que garantem vantagens para a sobrevivência e perpetuação da espécie em seu ecossistema (Pichersky & Gang, 2000), são uma fonte para a busca de novas moléculas, mais seguras, eficazes e com menos efeitos colaterais. A seleção de novas plantas baseada no conhecimento popular e etnofarmacologia, relações filogenéticas e taxonômicas e até mesmo escolha aleatória são estratégias que podem ser utilizadas para avaliação de atividades biológicas de extratos inicialmente in vitro e in vivo, combinados com técnicas para o isolamento e identificação destes metabolitos, demonstrando um vasto campo de pesquisa em plantas (Deng, 1985).
As principais classes de metabólitos secundários que têm demonstrado atividades biológicas são os compostos fenólicos (flavonas, isoflavonas, flavonóis, catequinas, tocoferóis, e ácidos fenólicos) e os terpenoides. Os compostos fenólicos, frequentemente, possuem propriedades anti-inflamatórias e anti-oxidantes, interagindo com as proteínas envolvidas na transdução de sinal e a expressão gênica, reduzindo a produção de
citocinas pró-inflamatórias através da inibição do sistema de complexo de NF-kB / IkB (factor nuclear kappa B – IkB) (Hanai & Sugimoto, 2009; Gautam & Jachak, 2009; Ríos
et al., 2009; Venkatesha et al., 2011).
Diversos terpenoides (lactonas sesquiterpênicas, cucurbitacinas, lanostanoides, triterpenoides e diferentes saponinas) também apresentam atividade anti-inflamatória (Yuan et al., 2006). As lactonas sesquiterpênicas inibem a atividade do NF-kB (Ghantous et al., 2010; Merfort, 2011), e cucurbitacinas têm apresentado sua atividade em inibir JAK-STAT e fator nuclear de células T ativadas (NF-AT) que apresentam funções relacionadas com a inflamação (Ríos et al., 2009). Os canabinoides, que são triterpenos, podem influenciar a produção citocinas e quimiocinas em um mecanismo para suprimir as respostas inflamatórias e com atividade anti-inflamatória e analgésica (Davis & Hatoum, 1983; Rahn & Hohmann, 2009; Cascio et al., 2010). Nos Estados Unidos e Canadá, Nabilone, composto derivado sintético, é indicado no tratamento das dores em pacientes com fibromialgia (Nascimento et al., 2013).
Assim o estudo de produtos naturais é uma área muito explorada e de grande potencial para a busca de novas moléculas com atividade farmacológica superior às encontradas no mercado, mas especialmente com menos efeitos colaterais.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geralO objetivo geral deste estudo foi avaliar o potencial farmacológico dos extratos de
C. adamantium e C. guaviroba em modelos experimentais de câncer e inflamação e a
identificação de metabólitos secundários presentes nestes extratos.
Foram objetivos específicos:
Realizar o estudo fitoquímico com o isolamento, purificação e identificação de alguns constituintes dos extratos bioativos, utilizando a avaliação da atividade antiproliferativa in vitro frente a linhagens tumorais para direcionar o estudo;
Proceder a análise quantitativa dos compostos detectados nos extratos e frações bioativos utilizando a técnica de UHPLC acoplada à espectrometria de massas;
Analisar in vitro se o efeito de morte celular ocorre por apoptose utilizando citometria de fluxo (fragmentação do DNA) e análise de expressão dos genes NFkB e TNF de extratos, frações e algumas das substâncias isoladas e identificadas nos extratos bioativos;
Avaliar in vivo a toxicidade aguda e a atividade antitumoral em tumor sólido de Erhlich em camundongos da fração que apresentou melhor atividade antiproliferativa em cultura de células in vitro;
Investigar in vivo a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória em camundongos nos modelos de contorções abdominais induzidos por ácido acético e de edema de pata induzido por carragenina da fração que apresentou melhor atividade antiproliferativa em cultura de células in vitro.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta e identificação do material vegetal
O material vegetal (folhas) da espécie C. adamantium foi coletado no Campus da UFPR em Curitiba (PR) pela Profa. Dra. Maria Élida Alves Stefanello (QO/UFPR), a identificação botânica foi realizada pelo Prof. Dr. Armando Carlos Cervi da UFPR e uma exsicata do vegetal encontra-se depositada no Herbário da UFPR. O material vegetal (folhas) de C. guaviroba foi coletado em Campinas (SP) pelo Prof. Dr. Ivany Ferraz Marques Valio (DBV-IB-UNICAMP). A identificação botânica foi realizada pelo Prof. Jorge Tamashiro (DBV-UNICAMP) e uma exsicata foi depositada no Herbário do IB-Unicamp.
4.2. Preparação dos extratos brutos
O material vegetal foi estabilizado e seco em estufa com ar circulante à temperatura de 40 °C, foi pulverizado e o pó foi submetido ao processo de maceração exaustiva com etanol em uma proporção pó/solvente de 1:5 (massa/volume) e o solvente trocado a cada 24 horas. O solvente das soluções obtidas foi removido sob pressão reduzida, obtendo-se os extratos etanólicos brutos das folhas. Estes extratos foram estocados em freezer a -80 oC.
4.3. Fracionamento dos extratos brutos
Os extratos etanólicos foram dissolvidos em metanol:água na proporção 9:1 (v/v) e submetidos à partição líquido-líquido com hexano. Acrescentou-se 40% de água à
