Fernanda Caroline Aleixo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS

Fernanda Caroline Aleixo

APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE ELETROFORESE CAPILAR

PARA VERIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DA

HOMOGENEIDADE DE DOSAGEM EM MEDICAMENTOS

INDUSTRIAIS E MAGISTRAIS

Santo André

2016

Fernanda Caroline Aleixo

APLICAÇÃO DA TÉCNICA DE ELETROFORESE CAPILAR

PARA VERIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DA

HOMOGENEIDADE DE DOSAGEM EM MEDICAMENTOS

INDUSTRIAIS E MAGISTRAIS

Dissertação apresentada ao Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC para obtenção do Título de Mestre em Ciência & Tecnologia – Química. Linha de pesquisa: química analítica.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Zatkovskis Carvalho

Santo André

2016

4

Este exemplar foi revisado e alterado em relação à versão original, de acordo com as observações levantadas pela banca no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor e com a anuência de seu orientador.

Santo André, _______ de ___________ de 20____.

Assinatura do autor: _____________________________________

Dedicatórias

Dedico este trabalho aos meus pais

Dorival e Terezinha e meu irmão, Gabriel,

minha família, com suas qualidades e imperfeições. Amor imensurável.

Agradecimentos

À Deus, por me conceder ótimas oportunidades na vida e me dar condições para aproveitá-las.

Aos meus pais, pelo o incentivo, confiança, amor e carinho, por nunca me deixarem cair, por tudo que me ensinaram. Amo muito vocês.

Ao meu irmão, Gabriel, por me levantar quando precisei, me fazer sorrir ou morrer de rir nos momentos mais difíceis, pela amizade verdadeira, mais que um irmão, amo demais.

À minha avó, Paulina, por ser meu maior exemplo de força e resistência.

Ao meu orientador, Alexandre, por me acolher na UFABC, pelos ensinamentos, paciência, dedicação e orientação neste trabalho.

À professora Patrícia Dantoni, por todo auxílio e ensinamentos.

Às professoras Ivanise e Heloisa, que fizeram parte da banca de qualificação, pelas contribuições neste trabalho.

Aos professores Alberto Fracassi e Dosil Pereira de Jesus e a todos os seus alunos, por abrirem as portas de seu laboratório de pesquisa tão gentilmente para que eu pudesse trabalhar.

Aos técnicos e alunos do laboratório 406-3 da UFABC e do laboratório B-207 da Unicamp pela imensa ajuda durante o trabalho.

À minha teacher e amiga, Roberta Modulo, primeira pessoa a me citar o nome UFABC, por incentivar com carinho as minhas decisões, ser uma “psicóloga” paciente, me ouvir e torcer pelo meu sucesso, além dos ensinamentos.

À professora e amiga Patrícia Sampaio, pela dedicação comigo desde a graduação, por ser um exemplo inspirador de didática e competência para que eu chegasse até aqui, assim como o professor Marcio Palumbo, de quem nunca vou esquecer e agradeço por todo ensinamento.

Às minhas amigas do grupo de pesquisa, Edna e Fernanda, pela imensa ajuda durante toda a pesquisa e pela amizade.

Ao meu primo, João Henrique, que mesmo à distância, me apoia e me anima. Será um grande mestre.

Às minhas grandes amigas Raquel, Poliana, Emanuele, Ana Paula e Laryssa, pela amizade, momentos maravilhosos, carinho e incentivo, sou muito feliz por ter vocês em minha vida.

À todos os meus amigos e familiares em geral, que torceram por mim e contribuíram de alguma maneira neste trabalho.

À CAPES pela bolsa concedida.

“Nunca deixe que lhe digam que não vale a pena Acreditar no sonho que se tem Ou que seus planos nunca vão dar certo Ou que você nunca vai ser alguém” (Renato Russo) “Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância”.

(John F. Kennedy) “A verdadeira viagem de descobrimento não consiste em procurar novas paisagens, mas em ter novos olhos.”

RESUMO

Aleixo, F. C. Aplicação da técnica de eletroforese capilar para a verificação e

comparação da homogeneidade de dosagem em medicamentos industriais e magistrais. 2016 – 84 pg. Dissertação - Programa de Pós-Graduação em Ciência &

Tecnologia - Química. Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André.

No Brasil, onde a desigualdade social é evidente, nem todos os cidadãos têm acesso aos mesmos medicamentos. No entanto, algumas práticas como a distribuição de medicamentos pelo SUS, quebra de patentes, produção de genéricos e aviamento de medicamentos permitem que a população mais carente seja atendida em suas necessidades terapêuticas. Para que essas vantagens sejam efetivamente reais, deve-se garantir que a eficácia terapêutica dos medicamentos mais acessíveis seja similar à dos medicamentos de referência. Neste trabalho a técnica de eletroforese capilar foi utilizada para a comparação da qualidade de medicamentos. Desta forma, este trabalho constitui também um serviço público à população ao verificar comparativamente a qualidade de medicamentos de referência, genéricos, similares e magistrais utilizados para o tratamento de hipertensão, principalmente verificando a uniformidade de dosagem. A formulação escolhida para este estudo foi a associação de maleato de enalapril e hidroclorotiazida. Foram estudadas amostras do laboratório de referência, um genérico e um similar, na forma farmacêutica de comprimidos para administração via oral, além de duas formulações obtidas em farmácias magistrais, na forma farmacêutica de cápsulas. A identificação dos analitos foi realizada através da obtenção de espectros de absorção molecular. A exatidão do método de análise por eletroforese capilar de zona foi comprovada através de testes de recuperação realizados para todos os laboratórios analisados. A faixa aceita de teor de princípio ativo permitido pela farmacopeia brasileira é de 90 a 110% do valor declarado no rótulo do medicamento, condição satisfeita por todas as formulações testadas. Os testes de uniformidade de peso e dosagem das unidades de cada lote demonstraram que tanto os laboratórios industriais como os magistrais satisfazem os requerimentos da farmacopeia brasileira considerando 30 dias de tratamento, mesmo com grandes diferenças de preço ao consumidor.

Palavras-Chave: Eletroforese capilar, maleato de enalapril, hidroclorotiazida,

ABSTRACT

Aleixo, F.C. Use of capillary electrophoresis for test and comparison of dose

uniformity on medication from pharmaceutical industries and compounding pharmacies 2016 – 84 pg. Masters Thesis – PosGraduate Program in Science &

Technology - Chemistry. Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC, Santo André.

Since social differences are remarkable in Brazil, not all citizens have access to the same drugs. However, some health-related policies such as drug distribution by SUS, early patent break, generic manufacture and compounding pharmacies allows less wealth population to access their health treatment. To make these advantages real the therapeutic efficacy of those inexpensive formulations must be assured, as are the reference drugs. In this work the capillary electrophoresis technique was used to compare the quality of medicines. This way, this work also offers a public service to the population due to its comparative study of the quality of anti-hypertensive reference medicine, generics, similar and formulations from compounding pharmacies, accessing principally dose uniformity. Oral pills of the association of enalapril maleate and hydrochlorothiazide were chosen for this study, including a reference drug (patent owner), one generic formulation and one similar formulation. Capsules from two compounding pharmacies were also analyzed. Brazilian Pharmacopoeia preconizes drug approved if active substance assay is between 90 to 110% of label. Weight and dosage uniformity tests of each batch showed that both industrial laboratories as compounding satisfy the requirements of Brazilian Pharmacopoeia given 30 days of treatment, even with large differences in price to the consumer.

Keywords: Capillary Electrophoresis, enalapril maleate, hydrochlorothiazide,

Lista de Figuras

Figura 1. Representação da embalagem de um medicamento referência, genérico e similar, nessa ordem, da esquerda para a direita. ... 20 Figura 2. Representação da fórmula estrutural do enalapril e grupos dissociáveis [22]. ... 24 Figura 3. Representação da fórmula estrutural da hidroclorotiazida e grupos dissociáveis [23]. ... 25 Figura 4. Representação esquemática de um equipamento de CE. ... 27 Figura 5. Representação de um cartucho para acondicionamento do capilar no equipamento de eletroforese capilar. ... 28 Figura 6. Parede do capilar de sílica fundida: representação do EOF. ... 30 Figura 7. Princípio de separação em CZE. A – representação da velocidade eletrosmótica e velocidade eletroforética de cada íon, relacionada à sua carga e tamanho. B – representação da velocidade eletrosmótica somada à velocidade eletroforética, resultando na velocidade aparente. Cátions são atraídos pelo cátodo e migram mais rapidamente; cargas neutras migram junto com o EOF e ânions são detectados por último, devido a sua migração eletroforética que os levaria em direção do ânodo, caso não existisse um EOF. ... 32 Figura 8. Fórmula estrutural da cafeína. ... 40 Figura 9. Fórmula estrutural do ácido salicílico. ... 41 Figura 10. Espectro de absorção molecular entre 190 a 400 nm do maleato de enalapril 0,05 mg mL-1 dissolvido em tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1, pH 8,5; (a) padrão analítico; (b) amostra de comprimido de L2 (somente ENL 10 mg); (c) amostra de cápsula de F2 (ENL 10mg). ... 44 Figura 11. Espectro de absorção molecular entre 190 a 400 nm da hidroclorotiazida 0,05 mg mL-1 dissolvida em tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1, pH 8,5; (a) padrão analítico; (b) amostra de comprimido de L2 (somente HCTZ 25 mg) ; (c) amostra de cápsula de F2 (HCTZ 12,5 mg). ... 45 Figura 12. Sobreposição de eletroferogramas com separações em tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1 com diferentes pHs. A) 8,2; B) 8,5; C) 8,7; D) 9,0. Detecção UV em 214nm. Potencial de separação a 25 kV, temperatura 25ºC, injeção a 34,5 mbar por 5 segundos, capilar de sílica fundida com 50 μm de diâmetro interno e 60 cm de comprimento (50 cm efetivos). Picos: 1) Cafeína 1,0 mmoL-1 ; 2) HCTZ 1,0 mg mL-1; 3) ENL 1,0 mg mL-1; 4) Salicilato 1,0 mmoL-1. ... 46 Figura 13. Eletroferogramas de separação de ENL e HCTZ, 0,1 mg mL-1 cada. Condições de separação: eletrólito tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, pH 8,5. Detecção UV em 214 nm (A) e 260 nm (B). Para as demais condições de corrida e identificação dos picos, vide figura 12. ... 47 Figura 14. Curvas de calibração referente aos dias de testes de recuperação e uniformidade de dosagem de L2. A, ENL; B, HCTZ. ... 58

Figura 15. Curvas de calibração referente aos dias de testes de recuperação e uniformidade de dosagem de L2, considerando uma curva para cada pesagem. A, HCTZ; B, ENL. ... 58 Figura 16. Curvas de calibração 2, 3 e 4, considerando uma curva para cada pesagem. Curva 2: A1, HCTZ; B1, ENL. Curva 3: A2, HCTZ; B2, ENL. Curva 4: A3,HCTZ; B3, ENL. ... 59 Figura 17. Curvas de calibração 2, 3 e 4. Curva 2: A1, ENL; B1, HCTZ. Curva 3: A2, ENL; B2, HCTZ. Curva 4: A3, ENL; B3, HCTZ. ... 60 Figura 18. Sobreposição de eletroferogramas de uma amostra de cápsula de F1. Em A: solução da amostra sem diluição: HCTZ 0,5 mg mL-1 e ENL 0,2 mg mL-1. Em B, a mesma solução foi diluída em tampão tetraborato de sódio 2,0 mmol L-1, pH 8,5: HCTZ 0,25 mg mL-1 e ENL 0,1 mg mL-1. Eletrólito: tampão borato 20 mmol L-1, pH 8,5; potencial de separação a 25 kV, temperatura 25ºC, injeção 34,5 mbar por 5 segundos, capilar de sílica fundida com 50 μm de diâmetro interno e 40 cm de comprimento (30 cm efetivos). Picos: 1) Cafeína 1,0 mmoL-1; 2) HCTZ; 3) ENL; 4) Salicilato (padrão interno) 1,0 mmoL-1... 70 Figura 19. Comparação dos valores de teor médio de HCTZ encontrados em L1, L2, L3, F1 e F2, no teste de uniformidade (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 75 Figura 20. Comparação dos valores de teor médio de ENL encontrados em L1, L2, L3, F1 e F2, no teste de uniformidade (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 75

Lista de Tabelas

Tabela 1. Formulações estudadas e respectivas identificações... 37

Tabela 2. Parâmetros obtidos com a curva analítica de cada princípio ativo. ... 48

Tabela 3. Porcentagem de teste de recuperação para amostras do L1. ... 49

Tabela 4. Porcentagem de teste de recuperação para amostras do L2. ... 50

Tabela 5. Porcentagem de teste de recuperação para amostras do L3. ... 50

Tabela 6. Porcentagem de teste de recuperação para amostras de F1. ... 51

Tabela 7. Porcentagem de teste de recuperação para amostras de F2. ... 51

Tabela 8. Determinação de peso das unidades de comprimido de L1. ... 53

Tabela 9. Determinação de peso das unidades de comprimido de L2. ... 53

Tabela 10. Determinação de peso das unidades de comprimido de L3. ... 54

Tabela 11. Determinação de peso das unidades de cápsula de F1. ... 55

Tabela 12. Determinação de peso das unidades de cápsula de F2. ... 56

Tabela 13. Parâmetros estatísticos utilizados e respectivas análises. ... 57

Tabela 14. Injeção de padrão precedente ao teste de uniformidade de L2, em 21/01/2016. ... 61

Tabela 15. Injeção de padrão precedente ao teste de uniformidade de L1, em 01/02/2016. ... 62

Tabela 16. Injeção de padrão precedente aos testes de recuperação e uniformidade de F1, em 02/02/2016. ... 62

Tabela 17. Injeção de padrão precedente aos testes de recuperação e uniformidade de L3, em 03/02/2016. ... 63

Tabela 18. Injeção de padrão precedente aos testes de recuperação e uniformidade de F2, em 11/02/2016. ... 63

Tabela 19. Injeção de padrão precedente ao teste de estabilidade de L1, em 04/03/2016. ... 64

Tabela 20. Injeção de padrão precedente aos testes de estabilidade de F1 e L3, em 09/03/2016. ... 64

Tabela 21. Quantificação de comprimidos nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30) de L1. ... 65

Tabela 22. Teor médio de princípio ativo e valor de aceitação encontrado em L1, nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 66

Tabela 23. Quantificação de comprimidos nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30) de L2. ... 67

Tabela 24. Teor médio de princípio ativo e valor de aceitação encontrado em L2, nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 67

Tabela 25. Quantificação de comprimidos nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30) de L3. ... 68 Tabela 26. Teor médio de princípio ativo e valor de aceitação encontrado em L3, nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 69 Tabela 27. Quantificação de cápsulas nos testes de uniformidade de dosagem e estabilidade de F1. ... 70 Tabela 28. Teor médio de princípio ativo e valor de aceitação encontrado em F1, nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 71 Tabela 29. Quantificação de cápsulas nos testes de uniformidade de dosagem e estabilidade de F2. ... 72 Tabela 30. Teor médio de princípio ativo e valor de aceitação encontrado em F1, nos testes de uniformidade de dosagem (dia 0) e estabilidade (dia 30). ... 73 Tabela 31. Dados estatísticos relacionando os testes dos diferentes laboratórios. .. 74

Lista de símbolos e siglas e abreviaturas

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância à Saúde

BPFC – Boas Práticas de Fabricação e Controle de Qualidade cáps. – Cápsula

cp - Comprimido

HPTLC – Cromatografia em camada fina de alta eficiência HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência

LC-MS – Cromatografia a líquido – espectrometria de massas MELC – Cromatografia líquida de microemulsão

UPLC – Cromatografia líquida de ultra eficiência DPR – Desvio padrão relativo

CE – Eletroforese capilar

CZE – Eletroforese capilar de zona

F1 – Farmácia de manipulação da região de Jundiaí – SP F2 – Farmácia de manipulação da região do ABC – SP LIF – Fluorescência induzida a laser

EOF – Fluxo eletrosmótico HCTZ – Hidroclorotiazida

FSCE – Eletroforese capilar em solução livre L1 – Laboratório de referência

L2 – Laboratório genérico L3 – Laboratório similar LD – Limite de Detecção LQ – Limite de Quantificação ENL – Maleato de enalapril

REBLAS – Rede Brasileira de Laboratórios RDC – Resolução da Diretoria Colegiada UV-Vis – Ultravioleta-Visível

Tmédio – Teor médio

TE – Teste de estabilidade TR – Teste de recuperação TU – Teste de uniformidade VA – Valor de aceitação M – Valor de referência

Sumário

1. Introdução ... 17

1. 1. Histórico da fabricação de medicamentos no Brasil ... 17

1. 2. A regulamentação do brasileiro de medicamentos ... 18

1. 3. Associação de hidroclorotiazida e maleato de enalapril ... 22

1. 4. Eletroforese Capilar: princípios e aplicações ... 25

2. Objetivo ... 33

3. Parte Experimental ... 35

3. 1. Materiais e equipamentos ... 35

3. 2. Reagentes e soluções ... 36

3. 3. Critérios de escolha das amostras e descrição dos testes realizados .. 37

3. 3. 1. Determinação de peso médio ... 38

3. 3. 2. Identificação espectrofotométrica dos compostos ativos ... 38

3. 3. 2. Análises de teor, uniformidade de dosagem e estabilidade ... 39

3. 4. Aspectos gerais do método de eletroforese capilar usado ... 39

4. Resultados e Discussão ... 43

4. 1. Identificação espectrofotométrica dos compostos ativos ... 43

4. 2. Desenvolvimento e validação do método de eletroforese capilar ... 45

4. 2. 1. Estudo de condição de separação dos medicamentos em diferentes pH ... 45

4. 2. 2. Linearidade, limite de detecção e quantificação dos compostos ativos ... 47

4. 2. 3. Exatidão - Testes de recuperação ... 48

4. 3. Testes de uniformidade de peso ... 52

4. 4. Análises de teor, teste de uniformidade e estabilidade ... 56

4. 4. 1. Análise da amostra proveniente do laboratório referência ... 65

4. 4. 2. Análise da amostra proveniente do laboratório genérico ... 67

4. 4. 3. Análise da amostra proveniente do laboratório similar ... 68

4. 4. 4. Análise da amostra proveniente da farmácia de manipulação: Jundiaí – SP ... 69

4. 4. 5. Análise da amostra proveniente da farmácia de manipulação: Santo André – SP ... 72

16

4. 5. Análise comparativa entre os laboratórios ... 73

5. Conclusão ... 77

6. Referências Bibliográficas ... 79

1. Introdução

1. 1. Histórico da fabricação de medicamentos no Brasil

A vinda dos primeiros boticários ao Brasil ocorreu no período colonial, quando se deu início às atividades farmacêuticas no país. O primeiro boticário no Brasil foi o português Diogo de Castro. Os boticários comercializavam drogas e medicamentos nos comércios chamados boticas [1].

As boticas deram origem à farmácia e ao laboratório industrial farmacêutico, sendo autorizadas a se transformar em comércio a partir de 1640. Até a terceira década do século XIX foram usados os termos “botica” e “boticário”, onde o medicamento era produzido seguindo a farmacopeia e a prescrição médica [1].

O aparecimento da farmácia química foi um grande avanço tecnológico do ponto de vista terapêutico, em contrapartida à farmácia tradicional ou galênica (magistral). A indústria química farmacêutica brasileira nasceu e se desenvolveu no período de 1890 a 1950, ligada à saúde pública e às práticas sanitárias de prevenção e combate às doenças infectocontagiosas [2].

Nas décadas de 1940 e 1950, a expansão industrial no Brasil fortaleceu as indústrias farmacêuticas transnacionais, inserindo novos medicamentos no mercado brasileiro, fato que provocou um desaparecimento quase por completo das boticas que foram aos poucos substituídas por laboratórios farmacêuticos (responsáveis por pesquisas, síntese e produção de medicamentos) e farmácia (ou drogaria, onde se faz apenas dispensação de medicamentos) [1, 3].

Indústrias transnacionais dominam o mercado há muitos anos, porém, a partir da década de 1980, ocorreram mudanças importantes que alteraram o formato do mercado brasileiro, como a implementação da Lei de Patentes e dos Genéricos, tornando as indústrias nacionais fortes e competitivas [3].

Nesta mesma época, o Brasil se apresentava em uma situação de forte restrição às importações e controle de preços pelo governo, o que fez com que inúmeros medicamentos não fossem produzidos por muitas das indústrias. Este fato deu espaço para o ressurgimento das atividades magistrais no mercado brasileiro. Além disso, outros fatores foram responsáveis pelo crescimento das farmácias

magistrais, entre 1980 e 1990 como o aparecimento de distribuidoras que ofereciam matérias-primas fracionadas para as farmácias e acesso a novas tecnologias [3 - 4].

As farmácias manipulavam apenas formulações personalizadas, com prescrições de determinadas especialidades médicas até o final da década de 1990, quando, coincidindo com a entrada de medicamentos genéricos no mercado, passaram a manipular inúmeros medicamentos que atendiam à quase todas as especialidades médicas, incluindo formulações industriais. Foi neste período que surgiu a primeira regulamentação específica para as atividades de manipulação, a RDC-33, concomitantemente à um expressivo crescimento do número de estabelecimentos de manipulação no país. [3].

1. 2. A regulamentação do mercado brasileiro de medicamentos

Os medicamentos são classificados em oficinais (suas formulações constam nas monografias de farmacopeias ou formulários nacionais), especializados ou especialidades (prescrições farmacêuticas com marca privativa, apresentadas em embalagens próprias para dispensação ao consumidor) e magistrais (produzidos em farmácias de manipulação) [3].

Quanto à sua fabricação, os medicamentos disponíveis no mercado brasileiro podem ser classificados em industrializados e manipulados. Medicamentos industrializados ainda podem ser divididos em: de referência (ou inovador), genérico e similar [3].

A utilização das denominações genéricas constitui um dos mecanismos de regulação de preços dos medicamentos no Brasil o que levou a adoção dos medicamentos genéricos como política do setor de saúde e de economia do governo em 1993. A partir de 1999, com a entrada em vigor da Lei dos Genéricos essa política foi implantada efetivamente. A regulamentação da Lei dos Genéricos foi conduzida pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e introduziu novos conceitos, tais como a equivalência farmacêutica (comprovada por ensaios in

vitro) e a bioequivalência (comprovada por ensaios in vivo), estabelecendo um novo

padrão para o desenvolvimento e o registro de medicamentos no país [5].

Segundo a ANVISA, o genérico é um medicamento intercambiável com um produto inovador, que é efetivamente o primeiro produto registrado e detentor da

patente, considerado o medicamento de referência, pois sua biodisponibilidade foi determinada durante o desenvolvimento do produto e sua eficácia e segurança foram comprovadas por meio de ensaios clínicos antes da obtenção do registro para comercialização [5].

Medicamentos genéricos e similares (produzidos após a expiração ou renúncia da proteção patentária) devem ser caracterizados como um equivalente farmacêutico do medicamento de referência, devendo, de acordo com a legislação brasileira, cumprir os requisitos dos estudos de bioequivalência, de acordo com a legislação brasileira, para que possam ser registrados. A ANVISA define como equivalentes farmacêuticos, os medicamentos que contêm o mesmo fármaco, na mesma quantidade e forma farmacêutica, podendo ou não conter excipientes idênticos [5].

A diferença de um medicamento similar para um genérico, é que o similar pode diferir no tamanho e forma do produto, prazo de validade, embalagem e rotulagem, em relação ao medicamento referência e é representado por meio de uma marca comercial própria, diferente do genérico que apresenta apenas o nome do princípio ativo e uma tarja amarela com os dizeres “medicamento genérico” de acordo com a Lei 9.787/99, conforme representado na figura 1. O medicamento referência também apresenta nome comercial [6]

A comprovação de equivalência farmacêutica, somado ao cumprimento das Boas Práticas de Fabricação e Controle de Qualidade (BPFC), possibilita demonstrar experimentalmente que o medicamento genérico e o respectivo medicamento de referência são intercambiáveis, ou seja, um medicamento genérico pode ser dispensado no lugar de seu medicamento referência, assim como o inverso, pois ambos são considerados equivalentes terapêuticos, apresentando os mesmos efeitos clínicos e adversos, no mesmo nível de potencialidade [7].

Figura 1. Representação da embalagem de um medicamento referência, genérico e similar, nessa ordem, da esquerda para a direita.

O objetivo da farmácia manipulação não é produzir cópias dos produtos industrializados, mas sim oferecer medicamentos em concentrações ou formas farmacêuticas ajustadas aos pacientes que apresentam uma prescrição indisponível no padrão industrial, ou em casos de associação múltipla de fármacos [3, 8].

Assim, o medicamento manipulado é produzido, de forma individualizada, preparado para a necessidade de cada paciente em dosagens, composição, concentração e apresentação específicas. A manipulação permite a personalização terapêutica, associando diferentes princípios ativos, favorecendo a adequação de fórmulas, eliminando ou trocando componentes que causam alergia ou efeito indesejado ao paciente, por exemplo. Dessa forma, se evita a automedicação e o desperdício de medicamentos, uma vez que o médico prescreve uma combinação de doses exatas dos princípios ativos necessários ao paciente, em quantidade adequada ao tratamento. O mesmo medicamento pode ser feito em cápsulas, supositórios ou géis, entre outras formas farmacêuticas, de acordo com a preferência do médico ou do paciente [8, 9].

Qualquer princípio ativo liberado pela ANVISA pode ser manipulado, desde que ele não esteja protegido pela lei de patentes.

É de extrema importância a realização do controle de qualidade nas farmácias de manipulação para garantir a qualidade microbiológica e físico-química dos insumos utilizados e dos produtos acabados, idealizando a segurança e eficácia do

medicamento. Para a realização do controle de qualidade de matérias-primas e produtos acabados as farmácias de manipulação devem seguir parâmetros analíticos ditados pelas farmacopeias vigentes e cumprir as determinações propostas pela ANVISA, sendo que as obrigatoriedades estão definidas pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 67, de 08 de outubro de 2007 que revogou as Resoluções RDC nº 214, RDC nº 354 e RDC nº 33, referentes às Boas Práticas de Manipulação em Farmácias (BPMF) [10 - 12].

Os principais itens definidos pela BPMF incluem adequação das áreas físicas; elaboração e implantação de procedimentos operacionais; verificação da estrutura organizacional; treinamento de funcionários; treinamento para auto inspeção; montagem do manual de gestão da qualidade; orientação das medidas preventivas para contaminações cruzadas, entre outros [10].

Visando a qualidade dos produtos manipulados, dentre as exigências constam procedimentos mínimos para que a farmácia realize o controle de qualidade ao receber a matéria-prima, a partir de fornecedores qualificados. Mesmo com elevado grau de exigência, a RDC 67 sofreu complementação pela RDC 87 [12 -13], passando a exigir a padronização de excipientes para as formulações e, no mínimo uma vez a cada dois meses, a submissão de análises de uniformidade de conteúdo e teor de ativos para cápsulas com dosagem menor que 25 mg [14]. Estas análises podem ser realizadas pela própria farmácia ou por laboratórios terceirizados (preferencialmente da Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde – REBLAS) [10].

Apesar da redução de preço dos medicamentos com a implantação dos medicamentos genéricos industrializados, o segmento da farmácia magistral apresenta uma viabilidade financeira superior para o usuário, quando comparado com os demais setores farmacêuticos, ou seja, os medicamentos manipulados são economicamente mais vantajosos do que os de referência, genéricos ou similares. Em estudos realizados, foi constatado que, entre os menores preços cotados, todos estavam acima do menor preço dos manipulados, ocorrendo uma variação superior a 530% no medicamento referência, 189% no medicamento genérico e 173% nos medicamentos similares. Esta situação ocorre porque medicamentos industrializados agregam aos seus preços o custo de um rigoroso controle de qualidade e ainda, medicamentos de referência somam o custo da pesquisa e desenvolvimento [9].

Equipamentos modernos de análise química dificilmente estão presentes em farmácias de manipulação. Alguns fatores dificultam a prática do controle de qualidade pelas farmácias de manipulação tais como: alto custo, necessidade de investimento inicial para adequação de área física e aquisição de equipamentos básicos para a realização dos testes mínimos exigidos, necessidade de treinamento contínuo de pessoas, complexidade de algumas análises, entre outros [11]. Dessa forma, o controle de qualidade de cada lote não é realizado rigorosamente tal como fazem os laboratórios industriais.

Erros representativos em produtos manipulados geram preocupação dos órgãos de fiscalização em estabelecer normas de qualidade para estes insumos. A prática da manipulação de medicamentos, principalmente os de baixo índice terapêutico, como digitálicos, psicotrópicos e hormônios, é uma situação de risco potencial à saúde, preocupante no que se diz respeito à segurança do usuário. Foram descritos casos de intoxicação medicamentosa e reações adversas por digitálicos, benzodiazepínicos, levotiroxina, clonidina, colchicina, entre outros, incluindo casos que evoluíram para coma e óbito [9].

Requisitos mínimos são exigidos pela RDC N° 67, no Anexo II, quanto à manipulação de medicamentos de baixo índice terapêutico. Medidas que demonstram uma preocupação com a qualidade destes produtos, mas sozinhas não são suficientes para garantir a segurança da manipulação. Também se faz necessária uma fiscalização rigorosa para que os estabelecimentos respeitem a legislação. O fato dos estabelecimentos magistrais possuírem menores recursos financeiros que a indústria farmacêutica, leva a um grande questionamento quanto a qualidade dos produtos magistrais ser comparável ao padrão de qualidade dos produtos industrializados [9]. Este trabalho se propõe a trazer elementos que colaborem para responder a este questionamento.

1. 3. Associação de hidroclorotiazida e maleato de enalapril

O tratamento anti-hipertensivo tem como objetivo reduzir a morbidade e mortalidade, pois a hipertensão colabora para maior risco de acidentes cardiovasculares. As metas de valores de pressão arterial recomendados para pacientes hipertensos são de 130/80 mmHg, podendo ser diferente em alguns

casos, como para pacientes diabéticos, com doença renal ou em outras condições particulares [15].

Para que ocorra a normalização da pressão arterial, frequentemente são necessárias associações de mais de uma droga anti-hipertensiva, de diferentes classes terapêuticas, evitando alta dosagem de uma única substância. Os efeitos colaterais dependem das doses administradas, o que significa que a utilização de medicamentos anti-hipertensivos em doses baixas apresenta menor prevalência desses efeitos [15].

Dessa forma, fica evidente que ao utilizar associações fixas de anti-hipertensivos em baixas doses, a probabilidade de controle efetivo da pressão arterial é maior, pois haverá uma potencialização de efeitos associados os princípios terapêuticos. Além disso, a administração do medicamento uma única vez ao dia, em oposição a duas vezes, aumenta a adesão ao tratamento, uma vez que a probabilidade do paciente esquecer o horário da medicação sofre considerável redução [15]. Uma das associações fixas de medicamentos hipotensores em baixas doses mais importantes é maleato de enalapril (ENL), um inibidor da enzima conversora de angiotensina (ECA) e hidroclorotiazida (HCTZ), um diurético, apresentados nas figuras 2 e 3.

O nome comercial do medicamento de referência dessa associação é CO-RENITEC, produzido pelo laboratório MSD (Merck Sharp&Dohme). As formas farmacêuticas disponíveis são comprimidos simples para administração oral, em dosagens de 20 e 12,5 mg ou de 10 e 25 mg de maleato de enalapril e hidroclorotiazida, respectivamente. O ENL associado à HCTZ também está disponível como medicamento genérico, produzido pelos laboratórios Biossintética, Legrand, Germed, Teuto, EMS, Sigma Pharma, Medley, Novarts, Nature’s Plus e Merck e também nas farmácias de manipulação [16 - 18].

Figura 2. Representação da fórmula estrutural do enalapril e grupos dissociáveis [22].

O ENL tem fórmula molecular C20H28N2O5.C4H4O4, com massa molar de 492,52 g

mol-1 e apresenta pKa1 2,97 e pKa2 5,35. Qualquer variação de temperatura, umidade, luz e calor, induzem a degradação desse composto. O ENL é facilmente solúvel em metanol e pouco solúvel em água e cloreto de metileno [1]. A HCTZ tem fórmula molecular C7H8ClN3O4S2, com massa molar de 297,74 g mol-1 e apresenta

pKa1 9,09, pKa2 9,83 e pKa3 11,31. É muito pouco solúvel em água, solúvel em acetona, etanol e metanol [19 - 24].

Figura 3. Representação da fórmula estrutural da hidroclorotiazida e grupos dissociáveis [23].

Vários métodos têm sido descritos para a determinação de ENL em formas

puras e em preparações farmacêuticas, incluindo o uso das técnicas de espectrofotometria, espectrofluorimetria, eletroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) [25, 26]. Quanto à HCTZ, vários métodos têm sido relatados para a sua determinação, tais como espectrofotometria, por HPLC e cromatografia a líquido – espectrometria de massas (LC-MS) [27, 28]. Diferentes métodos foram relatados na literatura para a determinação de ENL e HCTZ associados em comprimidos, dentre os quais métodos espectrofotométricos, CE, cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC), métodos de HPLC para a sua determinação, quer isoladamente ou na presença de outros anti-hipertensivos, cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) e cromatografia líquida de microemulsão (MELC) [29].

1. 4. Eletroforese Capilar: princípios e aplicações

Eletroforese é a denominação de um fenômeno, definido como sendo a migração de espécies ionizadas, dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, devido ao efeito de um campo elétrico aplicado. Arne Tiselius desenvolveu essa técnica de

separação para o estudo de proteínas em soro, o que proporcionou a ele o prêmio Nobel em 1948 [30].

Jorgenson e Lukacs introduziram a CE em 1981, técnica que tem ganho cada vez mais importância do ponto de vista analítico. Simplificadamente, a CE é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius, porém com o uso de um tubo capilar, preenchido com um eletrólito [30].

Uma grande variedade de amostras pode ser determinada por CE, como hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidro e lipossolúveis, amino ácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos, entre muitos outros [30, 31].

A simplicidade instrumental é uma característica fundamental da CE. A figura 4 representa esquematicamente um equipamento de CE, composto por um sistema de injeção de amostra, uma coluna capilar, normalmente de sílica fundida, revestida externamente com poliimida, com dimensões de 20 a 100 μm de diâmetro interno, e 30 a 100 cm de comprimento, um par de eletrodos de platina, uma fonte de alta tensão (capaz de fornecer até 30 kV), um detector acoplado à própria coluna de separação e um computador com um software para aquisição e tratamento dos dados [30].

Por meio dos eletrodos, a fonte de alta tensão é conectada aos reservatórios que contém o eletrólito. O capilar é previamente preenchido com eletrólito de separação e, quando a amostra é introduzida, o potencial de separação é acionado, ocasionando a migração das espécies [32].

Figura 4. Representação esquemática de um equipamento de CE.

Os capilares são mantidos dentro de um dispositivo, presente nos instrumentos disponíveis comercialmente, denominado cartucho (ou cassete), que, embora representado na figura 5, varia de acordo com a marca e modelo do equipamento. O cartucho se destina a facilitar a inserção do capilar no instrumento e proteger a janela de detecção, no caso de detecção espectrofotométrica. A reprodutibilidade das separações é maior se realizado o controle de temperatura ao redor do capilar, o que minimiza os efeitos do aquecimento, sendo feito através da circulação de ar ou líquido refrigerante, que passam pelo cassete, onde se encontra o capilar, mantendo a temperatura constante [30].

Vários modos com diferentes mecanismos de separação são possíveis em CE e permitem a separação de diversos solutos, compreendendo íons inorgânicos e orgânicos pequenos, alcaloides, flavonoides, lipídeos, carboidratos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, microrganismos inteiros, etc [33].

Figura 5. Representação de um cartucho para acondicionamento do capilar no equipamento de eletroforese capilar.

Neste trabalho, utilizamos a eletroforese capilar de zona (capillary zone electrophoresis - CZE), também conhecida como eletroforese capilar em solução livre (free solution capillary electrophoresis, FSCE), que devido à sua facilidade de implementação e de otimização das condições experimentais, é o modo de separação mais utilizado em CE [34].

Na CZE, as espécies são separadas em função das diferentes mobilidades eletroforéticas, que são características de cada espécie e também função do efetivo grau de dissociação da espécie e respectiva solvatação, além de dependentes de grandezas relacionadas ao eletrólito, conforme expresso na equação 1 [35 -37].

Com a aplicação de um campo elétrico as espécies carregadas apresentam uma velocidade eletroforética, proporcional à respectiva mobilidade eletroforética e ao campo elétrico aplicado, conforme equação 2.

µ

=

Onde q é a carga do íon, η é a viscosidade da solução e r é o raio iônico solvatado.

V

= μ

E (equação 2)

Onde Ve é a velocidade eletroforética, e E é o campo elétrico aplicado. Além da velocidade eletroforética relativa à mobilidade eletroforética, a velocidade de migração de uma espécie em CE é também influenciada pelo fluxo eletrosmótico (EOF). A superfície da parede do capilar de sílica, conforme representado na figura 6, contém um excesso de cargas negativas (SiO-), resultante da ionização dos grupos silanóis (SiOH) quando em pH acima de 4. Uma dupla camada elétrica é então formada próxima à parede do capilar, constituída pelas cargas negativas fixas na parede e de cátions próximos à parede. Assim, a carga negativa da parede é neutralizada por uma camada de cátions, parte deles imóveis e parte móvel, esses constituindo a parte difusa da dupla camada elétrica [35 - 36, 38].

Em presença de um campo elétrico, ânions são atraídos para o ânodo e cátions para o cátodo, como demonstrado na figura 6. O excesso de cátions na parte difusa da dupla camada promove um movimento na direção do cátodo. Como esses cátions estão solvatados promovem a movimentação da solução como um todo, criando um bombeamento uniforme em toda e extensão do capilar que é justamente o EOF. A equação 3 descreve o cálculo da mobilidade do EOF [35, 37].

μ

= εξ / η

Onde

µ

ε

ξ

η

A velocidade do EOF é definida de forma similar à velocidade eletroforética, conforme equação 4.

V

= (εξ / η)E (equação 4)

De acordo com as equações 3 e 4 é possível perceber que a velocidade do EOF é dependente da composição do eletrólito de separação, com modulação

significativa em função do pH, pois abaixo de pH 4, a ionização dos grupos silanóis é baixa e a mobilidade do EOF é reduzida, enquanto que a partir de pH 9, a ionização dos grupos silanóis é máxima e a mobilidade do EOF apresenta também o seu nível máximo [35, 37].

Figura 6. Parede do capilar de sílica fundida: representação do EOF.

Ao se observar um eletroferograma, as velocidades de migração não correspondem à velocidade eletroforética das espécies, mas à soma vetorial da velocidade de cada espécie e do EOF, comum à todos, como observado na figura 7. Dessa forma o que observamos é o registro da velocidade aparente, conforme equação 5.

u

= u

+ u

Onde

u

u

e u

Assim, em CZE a velocidade dos cátions é aumentada pela ação do EOF, as espécies neutras são carregadas pelo EOF e apresentam exatamente a velocidade

do fluxo – esta observação é importante, pois na prática é importante medir a velocidade do EOF, o que é feito através de uma espécie neutra, o marcador de EOF. No caso dos ânions, a velocidade observada é menor que as respectivas velocidades eletroforéticas. Quando a velocidade do EOF é significativamente maior que a velocidade eletroforética de um ânion, este pode ser determinado concomitantemente com os cátions da amostra. Dessa forma, em condições ideais, cátions e ânions podem ser determinados em uma única injeção por CZE.

Em CE, as amostras podem ser introduzidas por injeção hidrodinâmica ou eletrocinética. Na injeção hidrodinâmica, com uma das extremidades do capilar imersa no reservatório da amostra, aplica-se uma pressão positiva ou uma pressão negativa na outra extremidade do capilar. Essas pressões podem ser originadas por desnivelamento ou por bombas de vácuo ou de ar. Na injeção eletrocinética, a amostra é introduzida através da aplicação de um potencial elétrico e a amostra é injetada por uma combinação da própria migração e pelo bombeamento do EOF [33].

Diversos princípios são utilizados para a confecção dos detectores utilizados em CE: espectrofotometria UV-Vis, fluorescência induzida a laser (LIF), espectrometria de massas (MS), amperometria, potenciometria e condutometria representam a maior parte das estratégias de detecção usadas.

Na prática o detector espectrofotométrico UV-Vis é o mais utilizado e a detecção pode ser direta ou indireta [37]. Na determinação de espécies que apresentam absorção na região do ultravioleta e/ou visível, o modo de detecção direta é adequado. Normalmente são utilizados compostos que não apresentam absorção nessa região como eletrólito de corrida. Já a detecção indireta é aplicada em CE para analitos que não apresentam absorção no UV-Vis, ou que a absorção tem baixa intensidade. Nesse caso, é necessário que um dos componentes do eletrólito apresente absorção na região UV-Vis, então se utiliza um cromóforo no eletrólito de corrida [37]. Para a detecção dos analitos de interesse desse estudo, ENL e HCTZ, a detecção por espectrofotometria no UV foi a utilizada.

Figura 7. Princípio de separação em CZE. A – representação da velocidade eletrosmótica e velocidade eletroforética de cada íon, relacionada à sua carga e tamanho. B – representação da velocidade eletrosmótica somada à velocidade eletroforética, resultando na velocidade aparente. Cátions são atraídos pelo cátodo e migram mais rapidamente; cargas neutras migram junto com o EOF e ânions são detectados por último, devido a sua migração eletroforética que os levaria em direção do ânodo, caso não existisse um EOF.

2. Objetivo

Avaliar comparativamente a qualidade de medicamentos de referência, genéricos, similares e magistrais contendo a associação ENL e HCTZ, estabelecendo como parâmetros de análise a identificação e determinação do princípio ativo, o teste de uniformidade de dosagem e estabilidade da formulação.

3. Parte Experimental

3. 1. Materiais e equipamentos

As pesagens foram realizadas em balança analítica de precisão (Marte, modelo: AY220, Brasil), com resolução de 0,0001 g e capacidade máxima de 210 g. Para o ajuste de pH foi utilizado um pHmetro digital (Instrutemp, ITMPA-210) equipado com eletrodo de vidro combinado de mesma fabricação. Para o preparo de diluições foram utilizadas micropipetas de capacidade variável (Gilson). Quando necessário, as amostras foram solubilizadas com auxílio de um banho ultrassônico Sanders Medical (modelo SoniClean 2PS). Para a obtenção de água ultrapura foi utilizado um purificador Heal Force (modelo NW).

Os espectros de absortividade molecular foram obtidos com um espectrofotômetro PG Instruments (modelo TV80+ UV/VIS) com cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, com leituras no intervalo de 190 a 400 nm de comprimento de onda.

Foram utilizados dois equipamentos de CE. Estudos prévios de condições de separação por CE e algumas análises foram realizados em equipamento Agilent 3D CE G1600AX equipado com sistema de detecção UV Vis e software para aquisição e tratamento de dados (Agilent ChemStation versão B.04.03), pertencente ao laboratório de pesquisa da Universidade Estadual de Campinas – Campinas, SP. A maior parte das análises foi realizada com um equipamento Beckman Coulter Instruments, modelo P/ACE™ MDQ (Fullerton, CA, USA) equipado com sistema de detecção de arranjo de diodos (PDA) e software para aquisição e tratamento de dados (32 Karat TM v. 8.0), do laboratório didático da Universidade Federal do ABC - Santo André ,SP.

O método para a análise de ENL e HCTZ foi desenvolvido com base na literatura [39 - 44] e adequado para as nossas amostras. Foram utilizadas as seguintes condições de análise: potencial de separação de 25 kV, temperatura 25ºC, injeção hidrodinâmica com aplicação de 34,5 mbar de pressão por 5 segundos, capilar de sílica fundida com 50 μm de diâmetro interno e 40 cm de comprimento

total, 30 cm até o detector. Os eletroferogramas foram obtidos em 214 e 260 nm de comprimentos de onda.

3. 2. Reagentes e soluções

Todos os reagentes utilizados são de grau analítico, sem purificação prévia: hidróxido de sódio, ENL, HCTZ, cafeína e ácido salicílico (Sigma-Aldrich), tetraborato de sódio, ácido bórico e metanol (MeOH) (Labsynth). Todas as soluções foram preparadas em água ultrapura com resistividade de 18.2 MΩ.cm.

As soluções estoque dos padrões de ENL e HCTZ foram preparadas, separadamente, na concentração de 1,0 mg mL-1 ou, para a construção das curvas de calibração, em uma única solução, na concentração de 0,5 mg mL-1, sempre em MeOH, com dissolução assistida por banho de ultrassom por 30 segundos. Para a construção das curvas de calibração os padrões foram diluídos em eletrólito, utilizando micropipetas de volume variável e balões volumétricos. Além das soluções dos padrões foram utilizadas também as seguintes soluções:

Soluções estoque:

- Hidróxido de sódio 3,0, 1,0 e 0,10 mol L-1 - Cafeína, 10 mmol L-1.

- Ácido Salicílico 10 mmol L-1. - Ácido Bórico 100 mmol L-1.

As soluções estoque foram armazenadas em geladeira por até 5 dias.

Soluções preparadas diariamente:

- Maleato de enalapril, 1,0 mg mL-1 e 0,5 mg mL-1. - Hidroclorotiazida, 1,0 mg mL-1 e 0,5 mg mL-1. - Hidróxido de sódio (NaOH), 1mol L-1.

- Hidróxido de sódio (NaOH), 0,1mol L-1. - Cafeína 1 mmol L-1.

- Ácido Salicílico 1 mmol L-1.

- Tampão tetraborato de sódio 20 e 2,0 mmol L-1, pH 8,5. Preparadas a partir do ajuste de pH de uma solução de ácido bórico com NaOH 3,0 mol L-1.

3. 3. Critérios de escolha das amostras e descrição dos testes realizados

Neste trabalho, foram escolhidos 3 laboratórios industriais fabricantes de ENL e HCTZ em associação fixa: o laboratório referência, um laboratório fabricante de medicamentos genéricos e um laboratório fabricante de marca similar, sendo nomeados L1, L2 e L3, respectivamente. Essas informações constam na tabela 1, assim como a localização da aquisição desses medicamentos, preço e quantidade. Todas as amostras apresentaram em seu rótulo a dosagem de 10 mg e 25 mg para ENL e HCTZ, respectivamente.

Tabela 1. Formulações estudadas e respectivas identificações.

Fabricante/Laboratório Local da Aquisição Preço Quantidade Sigla

Laboratório Referência Santo André - SP R$ 28,00 30 cp L1

Laboratório Genérico Santo André - SP R$ 14,00 30 cp L2

Laboratório Similar Jundiaí - SP R$ 21,00 30 cp L3

Farmácia de Manipulação 1 Jundiaí - SP R$ 26,50 60 cáps F1

Farmácia de Manipulação 2 Santo André - SP _{(2x RS 39,00)} R$ 78,00 2 formulações _{60 cáps cada} F2

Ainda foram escolhidas duas farmácias de manipulação para o presente estudo, sendo nomeadas F1, localizada na cidade de Jundiaí – SP, e F2, de Santo André - SP. As formulações foram obtidas mediante apresentação de receita médica, fornecidas para fins de pesquisa. Ambas foram manipuladas em quantidade para um tratamento de 60 dias. Essas informações e o preço das formulações constam na tabela 1.

As amostras da F1 foram produzidas associando ENL e HCTZ, na mesma dosagem dos laboratórios industriais estudados (ENL 10 mg e HCTZ 25 mg). Já as amostras obtidas da farmácia F2 não apresentaram os princípios ativos em associação, mas em formulações separadas, nas dosagens de 10 mg para o ENL e 12,5 mg para HCTZ.

Foram realizados os testes de identificação dos compostos por espectrofotometria de absorção molecular na região do UV, determinação de peso médio, determinação do teor do lote, teste de uniformidade de dosagem por CZE. As determinações de teor e uniformidade foram repetidas após 30 dias para

confirmação dos resultados e para avaliação da estabilidade das formulações em um período compatível com a duração da embalagem (normalmente 30 comprimidos para ingestão de uma dose diária).

3. 3. 1. Determinação de peso médio

Segundo a farmacopeia brasileira, a determinação de peso se aplica às formas farmacêuticas sólidas em dose unitária, como comprimidos, pastilhas, cápsulas duras e moles e supositórios, formas farmacêuticas sólidas acondicionadas em recipientes para dose unitária e a formas farmacêuticas sólidas e semissólidas acondicionadas em recipientes para doses múltiplas. A finalidade do teste é justamente verificar se as unidades de um mesmo lote apresentam uniformidade de peso [47].

Para determinar o peso individual, foram utilizados 20 comprimidos de ENL e HCTZ de um mesmo lote, os quais foram pesados individualmente em uma balança analítica. Em seguida, foram calculados o peso médio e a variação de peso de cada comprimido em relação ao peso médio. O procedimento foi realizado para cada um dos laboratórios industriais estudados. No caso das cápsulas, 20 delas foram pesadas antes e após remover o conteúdo de cada uma. O peso do conteúdo de cada cápsula foi determinado pela diferença de peso entre a cápsula cheia e vazia. Em seguida, foi determinado o peso médio do conteúdo das cápsulas, de cada formulação analisada, assim como a variação do peso de cada unidade em relação ao peso médio.

3. 3. 2. Identificação espectrofotométrica dos compostos ativos

Foram obtidos espectros de absorção molecular de padrão dos dois medicamentos em soluções distintas e nas amostras comerciais de ENL (10mg) e de HCTZ (25mg), na forma farmacêutica de comprimidos e também em cápsulas, sendo de ENL (10 mg) e HCTZ (12,5mg). Todas as amostras foram diluídas a 0,05 mg mL-1, em tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, pH 8,5 e todas as leituras foram realizadas com cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, no intervalo de 190 a 400 nm

3. 3. 2. Análises de teor, uniformidade de dosagem e estabilidade

Para cada laboratório, foi realizado o teste de uniformidade de dosagem (TU), avaliando-se 10 unidades de um mesmo lote de fabricação, na data de aquisição dos medicamentos, seguindo a metodologia determinada pela farmacopeia brasileira.

Cada comprimido (de L1, L2 e L3) foi dissolvido, sem pulverização prévia, diretamente em um balão volumétrico de 50 mL. Para auxiliar a desintegração dos comprimidos, 2 mL de água deionizada foram adicionados ao balão, ficando 2 minutos em banho ultrassônico. Após a desintegração total do comprimido, o balão foi avolumado com MeOH. A solução foi filtrada com uma seringa com capacidade de 3 mL e filtro PVDF 0,22 um (Millipore Millex-GV) para posterior injeção em triplicata.

No caso das cápsulas (de F1 e F2), após esvaziamento das cápsulas, em balões volumétricos de 50 mL, o conteúdo foi dissolvido em MeOH, seguido da filtração e injeção em triplicata para análise em CZE.

Como as amostras F2 não apresentaram os princípios ativos em associação, as análises foram feitas com a mistura do pó de uma cápsula de cada princípio ativo. O teor do lote foi considerado como sendo o valor médio do valor encontrado na respectiva análise de uniformidade. Já os testes de estabilidade (TE) foram realizados pela repetição do TU após um período de 30 dias utilizando os mesmos lotes de fabricação. Durante este período, todos os medicamentos foram armazenados conforme recomendações do fabricante: mantido na embalagem do produto, em temperatura ambiente (15 a 30°C), protegidos da luz e umidade.

3. 4. Aspectos gerais do método de eletroforese capilar usado

O condicionamento diário dos capilares foi realizado lavando primeiramente com água desionizada, por 3 minutos, seguido de 2 minutos com solução NaOH 1 mol L-1, 1 minuto com NaOH 0,1 mol L-1 e em seguida, com o eletrólito de corrida (tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1) por 10 minutos. Entre as injeções foi realizada a lavagem do capilar da seguinte maneira: lavagem por 0,5 minuto de

água desionizada, 0,5 minuto de solução NaOH 0,1 mol L-1 e 1,5 minuto com o eletrólito de corrida.

Para o monitoramento do tempo de migração do EOF foi utilizada cafeína, cuja fórmula estrutural está representada na figura 8. A cafeína é uma substância neutra na faixa de pH utilizada nas separações por CE e apresenta absortividade molar adequada para monitoramento do EOF nos comprimentos de onda utilizados nas análises.

Figura 8. Fórmula estrutural da cafeína.

Para correção de erros relacionados à imprecisão do volume injetado, comum à técnica de CE [31, 45], foi utilizada padronização interna, com a escolha do ácido salicílico para essa finalidade. A fórmula estrutural do ácido salicílico está representada na figura 9. Assim, para a determinação de ENL e HCTZ, as áreas dos respectivos picos foram divididas pela área do pico do padrão interno.

As condições ideais para escolha da substância usada como padrão interno são: ser similar ao analito a ser quantificado; ter absorção de luz na mesma região de comprimento de onda do analito; ter tempo de migração próximo a este analito; não fazer parte da amostra; não reagir com este ou outro componente da matriz e não co-migrar com todas as demais substâncias presentes na amostra na separação [45].

Figura 9. Fórmula estrutural do ácido salicílico.

A utilização de padrão interno é muito útil em análises eletroforéticas, onde a quantidade de amostra analisada ou a resposta do equipamento variam ligeiramente entre as análises, e, principalmente, para a correção de erros de injeção. Essas variações podem ocorrer, por exemplo, por mudanças de temperatura, variando o volume de injeção da amostra devido à consequente alteração de viscosidade, o que pode alterar a resposta do detector. Porém, a resposta relativa do detector ao analito e ao padrão, normalmente é constante para inúmeras condições [35, 45].

4. Resultados e Discussão

4. 1. Identificação espectrofotométrica dos compostos ativos

Espectros de absorção molecular foram obtidos com soluções padrão de cada um dos medicamentos estudados, ambos nas concentrações de 0,05 mg mL-1, na presença de tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, pH 8,5, o mesmo utilizado como eletrólito de corrida na separação por CE.

Posteriormente, realizou-se a varredura espectral de amostras comerciais de ENL e HCTZ, separadamente, na forma de comprimidos, nas dosagens de 10 mg e 25 mg, respectivamente. As soluções foram preparadas nas concentrações de 0,05 mg mL-1, para ENL e HCTZ, também na presença de tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, em pH 8,5.

Ainda foram analisadas amostras comerciais em cápsulas magistrais, também em separado, nas dosagens de 10 mg de ENL e 12,5 mg de HCTZ. As concentrações analisadas foram de 0,05 mg mL-1 para ENL e HCTZ, em presença de tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, em pH 8,5.

Os espectros de absorção molecular do ENL são apresentados na figura 10. A figura 10-(a) mostra que o ENL em solução padrão apresentou um pico máximo de absorção no comprimento de onda de 218 nm. A solução de amostra comercial de comprimido, figura 10-(b), apresentou pico de absorção em 213 nm e em solução de amostra comercial em cápsula em 218 nm, como apresentado na figura 10-(c).

A figura 11 apresenta os espectros de absorção molecular da HCTZ nas diferentes soluções analisadas. Observam-se três bandas principais de absorção de luz em todos os espectros. Na figura 11-(a), os máximos são observados em 231 nm, em 262 nm e em 317 nm. Já para a amostra comercial em comprimido na figura 11-(b), os picos se apresentaram em 228, 270 e 316 nm. E, finalmente, na amostra comercial em cápsula, na figura 11-(c), os comprimentos de onda de maior absorção foram 230, 267 e 316 nm.

Figura 10. Espectro de absorção molecular entre 190 a 400 nm do maleato de enalapril 0,05 mg mL-1 dissolvido em tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1, pH 8,5; (a) padrão analítico; (b) amostra de comprimido de L2 (somente ENL 10 mg); (c) amostra de cápsula de F2 (ENL 10mg).

Os espectros observados conferem com os da literatura [41]. Os resultados demonstram que, tanto o ENL quanto a HCTZ não sofrem alterações significativas com a presença de excipientes na solução, indicando que os comprimentos de onda correspondentes aos máximos apresentados poderiam ser utilizados na determinação por CE. A comparação dos espectros dos padrões e amostras serve como um teste de identificação dos respectivos compostos ativos.

Figura 11. Espectro de absorção molecular entre 190 a 400 nm da hidroclorotiazida 0,05 mg mL-1 dissolvida em tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1, pH 8,5; (a) padrão analítico; (b) amostra de comprimido de L2 (somente HCTZ 25 mg) ; (c) amostra de cápsula de F2 (HCTZ 12,5 mg).

Observa-se que existe uma região em comum em que os dois analitos apresentam absorção de luz, aproximadamente entre 210 e 220 nm, a qual pode ser utilizada para a detecção e separação simultânea de HCTZ e ENL.

4. 2. Desenvolvimento e validação do método de eletroforese capilar

4. 2. 1. Estudo de condição de separação dos medicamentos em diferentes pH

Para definir a melhor condição de separação de ENL e HCTZ associados em uma mesma amostra, na concentração de 1,0 mg mL-1, foi testado como eletrólito de corrida o tampão tetraborato de sódio, 20 mmol L-1, em diferentes valores de pH: 8,2, 8,5, 8,7 e 9,0. Soluções padrão, na concentração de 1,0 mg mL-1 foram injetadas juntamente com a cafeína 1,0 mmol L-1 e ácido salicílico 1,0 mmol L-1. Os eletroferogramas da figura 12 apresentam as separações em cada pH.

Figura 12. Sobreposição de eletroferogramas com separações em tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1 com diferentes pHs. A) 8,2; B) 8,5; C) 8,7; D) 9,0. Detecção UV em 214nm. Potencial de separação a 25 kV, temperatura 25ºC, injeção a 34,5 mbar por 5 segundos, capilar de sílica fundida com 50 μm de diâmetro interno e 60 cm de comprimento (50 cm efetivos). Picos: 1) Cafeína 1,0 mmoL-1 ; 2) HCTZ 1,0 mg mL-1; 3) ENL 1,0 mg mL-1; 4) Salicilato 1,0 mmoL-1.

Analisando os eletroferogramas da figura 12, observa-se que em pH 8,2, 8,5 e 8,7 o tempo de migração da HCTZ é menor do que de ENL, porém em pH 9,0, ocorre uma inversão, onde ENL passa a migrar mais rapidamente que HCTZ. Analisando o pKa do ENL (pKa1 2,97 e pKa25,35) e da HCTZ (pKa1 9,09, pKa2 9,83 e pKa3 11,31), infere-se que na faixa estudada não ocorre variação significativa do grau de dissociação de ENL, porém entre pH 8,2 e 9,0 a HCTZ se dissocia consideravelmente. Assim, em pH 9,0 ocorreu uma mudança no padrão de separação, pois a mobilidade da HCTZ foi alterada, ocorrendo inclusive alteração significativa no fator seletividade da separação.

O pH escolhido para a separação desses compostos foi de 8,5, que apresentou melhor resolução dos picos (eletroferograma B da figura 13) e menor ruído na linha de base.

Figura 13. Eletroferogramas de separação de ENL e HCTZ, 0,1 mg mL-1 cada. Condições de separação: eletrólito tampão tetraborato de sódio 20 mmol L-1, pH 8,5. Detecção UV em 214 nm (A) e 260 nm (B). Para as demais condições de corrida e identificação dos picos, vide figura 12.

Para a identificação dos picos, foram analisados registros em 214 e 260 nm, ou seja, em uma região de comprimento de onda onde os dois analitos tem absorção e em uma região onde somente um deles, a HCTZ, tem absorção, como observado no espectro de absorção molecular. Na figura 13, observamos a absorção de apenas um dos picos em 260 nm, correspondente a HCTZ. Logo, o menor pico (3) é correspondente ao ENL. Testes de spiking foram realizados para confirmação.

4. 2. 2. Linearidade, limite de detecção e quantificação dos compostos ativos

Foi realizado o estudo de linearidade para ambos os princípio ativos, onde foram medidos os sinais das amostras de concentrações conhecidas, entre 0,005 e 0,200 mg mL-1 dos padrões de ENL e HCTZ, com um total de 11 pontos na curva, com injeções em duplicata de cada pesagem, na análise por CZE.

As diluições foram realizadas em tampão tetraborato de sódio 2,0 mmol L-1, em balão volumétrico de 5 mL, a partir de solução estoque de ENL e HCTZ 0,5 mg mL-1, preparada no mesmo dia da análise.

A determinação de Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ) foi realizada pela avaliação da relação sinal analítico e o sinal de ruído da linha de base. Nesse caso é feita a comparação entre a altura de pico do analito em amostras com baixas concentrações e o ruído da linha de base destas amostras.

Mede-se a altura do pico do analito e relaciona-se com a concentração da análise para calcular a concentração correspondente ao ruído da linha de base, utilizando o desvio padrão da altura do ruído [45, 46].

O LD é a menor concentração do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob as condições experimentais estabelecidas. A razão sinal/ruído com valor 3 é considerada aceitável para estimar o limite de detecção [46].

O LQ é a menor concentração do analito, que pode ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis, nas condições experimentais utilizadas. Um exemplo de razão sinal/ruído típica é 10:1 [46].

A relação entre a concentração de ENL e HCTZ e a área do pico apresentou linearidade do método de acordo com o coeficiente de correlação obtido de 0,9995 para HCTZ e 0,9984 para ENL, como observado na tabela 2, assim como o LD e LQ que apresentaram adequados para as concentrações analisadas nas amostras.

Tabela 2. Parâmetros obtidos com a curva analítica de cada princípio ativo.

PARÂMETROS ESTATÍSTICOS HCTZ ENL

Equação da reta y = 6,0398x + 0,0288 y = 2,1839x + 0,0039

Correlação (R2) 0,9995 0,9984

Limite de Detecção (LD) 1,32 µg mL-1 8,16 µg mL-1

Limite de Quantificação (LQ) 4,41 µg mL-1 27,2 µg mL-1

4. 2. 3. Exatidão - Testes de recuperação

Para certificar a exatidão do método para cada matriz, foram realizados testes de recuperação (TR) para cada uma das formulações estudadas neste trabalho, entendendo-se que os excipientes podem se distinguir de uma formulação para outra.

O material pulverizado de 4 a 5 unidades de comprimidos/cápsulas de ENL e HCTZ foi cuidadosamente misturado para o TR.