DISSERTAÇÃO
Desenvolvimento de hidrogel semissólido contendo óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf carreado em nanopartículas poliméricas para o
tratamento tópico da herpes
KESSIANE BELSHOFF DE ALMEIDA
Niterói 2014
DESENVOLVIMENTO DE HIDROGEL SEMISSÓLIDO CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (DC.) Stapf CARREADO EM NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA O TRATAMENTO TÓPICO DA
HERPES
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense como requisito para obtenção do grau de Mestre.
Orientadora: Prof ª. Dr ª Deborah Quintanilha Falcão Co-orientadora: Dr ª Ana Cláudia Fernandes Amaral
Niterói 2014
A447 Almeida, Kessiane Belshoff de
Desenvolvimento de hidrogel semissólido contendo óleo essencial de Cymbopogon citratus (DC.) Stapf carreado em nanopartículas poliméricas para o tratamento tópico da herpes / Kessiane Belshoff de Almeida; Orientadora : Deborah Quintanilha Falcão. – Niterói, 2014 92 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, 2014.
1. Nanotecnologia. 2. Nanopartículas poliméricas. 3. Óleo essencial. 4. Cymbopogon citratus. 5. Poli (ácido lático-co-ácido-glicólico). 6. Vírus Herpes simplex.
CDD 616.522 CDD 616.552
DESENVOLVIMENTO DE HIDROGEL SEMISSÓLIDO CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon citratus (DC.) Stapf CARREADO EM NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS PARA O TRATAMENTO TÓPICO DA
HERPES
BANCA EXAMINADORA
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Profª. Drª. DEBORAH QUINTANILHA FALCÃO - Orientadora Universidade Federal Fluminense – UFF
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Profª. Drª. PRISCILLA VANESSA FINOTELLI Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
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Prof. Dr. HELVÉCIO VINÍCIUS ANTUNES ROCHA Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
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Profª. Drª. SAMANTA CARDOZO MOURÃO - Revisora Universidade Federal Fluminense – UFF
Niterói 2014
Agradeço a princípio a Deus por me dar força e sabedoria para conclusão de mais uma etapa essencial em minha vida.
Aos meus pais, Docinéa Luiza e Sebastião Ney, pela confiança depositada em meus estudos, compreensão nos momentos difíceis, preocupação em fornecerem uma adequada formação humana e profissional e, pelo amor incondicional sem o qual não seria possível a realização desta conquista. Dedico essa conquista a vocês.
À minha irmã Maryane por estar sempre ao meu lado em todos os momentos, me incentivando e dando força para enfrentar todas as dificuldades e angústias.
Ao meu namorado Vitor Veiga, pelo incentivo, carinho, compreensão pelas horas que nos faltaram de convívio, pelo apoio aos meus ideais e por compartilhar todos os momentos de minha vida.
À minha orientadora Prof ª. Dr ª Deborah Quintanilha Falcão pela confiança, dedicação, compreensão, disponibilidade e auxílio dispensados durante minha formação, bem como as oportunidades de aprendizado e crescimento científico ao longo da realização deste trabalho. Sou grata por tudo.
À minha co-orientadora Dr ª Ana Cláudia Fernandes Amaral por todo conhecimento científico e auxílio fornecido durante o trabalho, especialmente durante as análises do material vegetal; Ao Laboratório de Produtos Naturais e Derivados do Instituto de Tecnologia em Fármacos – Farmanguinhos – Fiocruz/RJ, em especial, à doutoranda Arith Ramos por todo apoio durante as etapas de extração e caracterização química do óleo essencial. À Prof ª. Dr ª Samanta Cardozo Mourão pelo auxílio diário, em especial na execução e interpretação dos resultados de perfil de liberação in vitro.
À bolsista de iniciação científica Juliana Lopes pelo auxílio durante a realização de todas as etapas essenciais do trabalho, pelo carinho, paciência e amizade.
Às técnicas Kamila e Nelise do Laboratório de Central Analítica da Faculdade Farmácia pela atenção e auxílio durante toda etapa analítica.
Aos laboratórios de Tecnologia de Produtos Naturais e de Biotecnologia de Alimentos pela utilização de suas instalações. À Universidade Federal Fluminense e ao Programa de Pós Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos a Saúde pela oportunidade de realização do curso.
À Prof ª. Dr ª Maria Tereza Vilela Romanos e à doutoranda Jéssica Cavalcanti do Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas, UFRJ, pela realização do ensaio de atividade anti-herpética das formulações, imprescindível para o sucesso desse trabalho.
Aos colegas de laboratório Anne Caroline e Rafael Portugal, pela amizade, carinho e colaboração na realização das análises de tamanho de partícula.
Aos companheiros de bancada do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica I por me permitirem crescer cientificamente e pessoalmente junto deles, e tornarem o trabalho ainda mais prazeroso.
Às minhas eternas amigas Ana Carolina Cavalini, Caroline Nicoletti, Edimara Silva, Kamila Pavão, Layla Almeida, Natália Borges, Paola Boechat, Patrícia Garcia, Paula Lacerda e Simone Santana por todo apoio, carinho e compreensão durante minha ausência.
À Erica Taylor por me ensinar a superar as dificuldades, as dúvidas e me fazer enxergar a vida com um novo olhar.
Aos amigos de trabalho Erick Bernardes e Aline Rimes por toda força, amizade e incentido, por muitas vezes acreditarem em mim em momentos em que eu mesma duvidava e por me apoiarem diretamente na realização desse trabalho. Às chefias dos Laboratórios BBraun S.A., que souberam compreender minhas ausências no trabalho durante os períodos de cumprimento das disciplinas do curso.
A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho.
tópicas semissólidas oferece uma alternativa tecnologicamente viável para modular a permeação do ativo, melhorar sua distribuição na superfície da pele, reduzir sua toxicidade e conferir proteção frente a fatores extrínsecos. O polímero poli (ácido lático-co-glicolídeo) (PLGA) tem sido amplamente empregado na preparação de nanossistemas carreadores de fármacos em função de suas pronunciadas características de biocompatibilidade e biodegradabilidade. O presente estudo objetivou desenvolver um hidrogel para incorporação do óleo essencial de Cymbopogon citratus (OECc) encapsulado em nanopartículas poliméricas e avaliar sua atividade frente ao vírus Herpes simplex (HSV) tipos 1 e 2. Inicialmente, procedeu-se a extração de OECc por hidrodestilação, seguindo-se sua caracterização química por Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada ao Espectrômetro de Massas (CGAR-EM). Nanopartículas contendo OECc (NPOE) e nanopartículas branco (NP) foram preparadas pela técnica de emulsificação-difusão do solvente empregando PLGA, como polímero, e álcool polivinílico (PVA) como estabilizante. A distribuição de tamanho e o potencial zeta das partículas foram avaliados, respectivamente, pelas técnicas de espalhamento de luz dinâmico e mobilidade eletroforética, e sua eficiência de encapsulação determinada após extração com solvente, empregando metodologia analítica desenvolvida por espectrofotometria UV-Vis. Após preparo e caracterização, NPOE foram incorporadas a gel hidrofílico de Carbopol® Ultrez 10 NF (HNPOE), a fim de investigar a estabilidade da formulação nanoestruturada frente ao armazenamento e o perfil de liberação in vitro do óleo a partir da nanopartícula. Adicionalmente, hidrogel base (HB), hidrogel contendo o óleo livre (HOE) e o mesmo contendo nanopartículas branco (HNP) foram desenvolvidos como controles. A atividade inibitória das formulações frente HSV-1 e -2 sensíveis ao aciclovir foi avaliada por redução do título viral em placa, utilizando-se células Vero como sistema hospedeiro, após prévia determinação da citotoxicidade das amostras. O rendimento do processo extrativo foi de 0,37% e a análise qualitativa do óleo por CGAR-EM exibiu o citral como seu constituinte químico majoritário, correspondendo a 89,57 % da área relativa do cromatograma. Partículas em escala nanométrica e potencial zeta negativo foram obtidas, com um conteúdo de OECc de 58,59 ± 0,85 mg/g e eficiência de encapsulação de 28,48% ± 0,40%. Os hidrogéis desenvolvidos exibiram características apropriadas para aplicação cutânea, as quais se mantiveram inalteradas durante os 60 dias de armazenamento a 4 °C. Cabe salientar que as formulações HNPOE e HOE apresentaram redução significativa (p<0,05, t-Student) no conteúdo de óleo volátil em relação ao teor inicial, permanecendo subsequentemente constante durante o estudo de estabilidade. A análise do perfil de liberação in vitro de OECc a partir das formulações demonstrou padrão bifásico, com burst inicial e posterior fase de liberação sustentada, onde NPOE seguiu modelo cinético de Hixon-Crowell, e HNPOE e HOE modelo de Higuchi. Além disso, as mesmas exibiram comportamento anômalo, dependente dos mecanismos de difusão e erosão polimérica. Na avaliação da atividade antiviral, HNPOE foi capaz de inibir mais eficientemente ambas as estirpes virais em concentração não citotóxica de óleo, inferior às empregadas nas demais formulações. Estes resultados evidenciam o potencial do nanogel em proteger, modular a liberação e otimizar a atividade do óleo essencial frente ao vírus Herpes simplex.
Palavras-chave: nanotecnologia, nanopartículas poliméricas, óleo essencial, Cymbopogon citratus, poli (ácido lático-co-glicolídeo), vírus Herpes simplex.
semisolid topical formulations offers a technologically feasible alternative to modulate the permeation of active, improve its distribution on the surface of the skin, reduce their toxicity and confer protection against extrinsic factors. The polymer poly (lactic acid-co-glycolide) (PLGA) has been widely employed in the preparation of drug carriers nanosystems due to their pronounced biocompatibility and biodegradability. The present study aimed to develop semisolid hydrogel incorporating of Cymbopogon citratus essential oil (CcEO) associated with polymeric nanoparticles and assess their activity against Herpes simplex virus (HSV) types 1 and 2. Initially, it was proceeded to extract the CcEO by hydrodistillation, following their chemical characterization by High-Resolution Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometer (HRGC-MS). Nanoparticles containing CcEO (NPEO) and white nanoparticles (NP) were prepared by emulsification-diffusion of the solvent using PLGA as polymer and polyvinyl alcohol (PVA) as a stabilizer. The size distribution and zeta potential of the particles were determined, respectively, by dynamic light scattering and electrophoretic mobility, and its encapsulation efficiency was given by solvent extraction technique, using analytical methodology developed by UV-Vis spectrophotometry. After preparation and characterization, NPEO were incorporated into a hydrophilic gel Carbopol® Ultrez 10 NF (HNPEO) in order to investigate the stability of the nanostructured formulation across the storage and in vitro release profile of the oil from the nanoparticle. In addition, hydrogel base (HB), hydrogel containing free oil (HEO) and the same unloaded nanoparticles (HNP) were developed as controls. The inhibitory activity of the formulations against HSV-1 and -2 sensitive to acyclovir was assessed by viral titer reduction using Vero cells as a host system after prior determination of the cytotoxicity of the samples. The yield of the extraction process was 0.37% and the qualitative analysis of the oil by HRGC-MS showed the citral as its major chemical constituent, accounting for 89.57% of the chromatogram relative area. Particles on the nanometer scale and negative zeta potential were obtained with CcEO content of 58.59 ± 0.85 mg/g and encapsulation efficiency of 28.48 ± 0.40%. The developed hydrogels exhibit suitable characteristics for cutaneous application, which remained unchanged during the 60 days of storage at 4°C. Is worth emphasizing that the HNPEO and HEO formulations showed a significant reduction (p<0.05, Student's t test) in the content of volatile oil in relation to the initial rate, subsequently remaining constant during the stability study. The analysis of the in vitro release profile CcEO from the formulations showed a biphasic pattern with an initial burst and subsequent sustained release phase, which followed NPEO kinetic model Hixon-Crowell, and HNPOE and HOE Higuchi model. Moreover, they exhibited anomalous behavior, dependent on the mechanisms of diffusion and polymer erosion. In the evaluation of antiviral activity, HNPEO was able to more efficiently inhibit both viral strains in the non-cytotoxic oil concentration lower than used in the other formulations. These results highlight the potential of nanogel in protecting, modulating the release profile and improve the activity of the essential oil against Herpes simplex virus.
Keywords: nanotechnology, polymeric nanoparticles, essential oil, Cymbopogon citratus, poly (lactic-co-glycolide acid), Herpes simplex virus.
Figura 1. Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a) fármaco dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz polimérica das nanoesferas; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz
polimérica das nanoesferas. P. 18
Figura 2. Métodos gerais de preparação de nanopartículas poliméricas e seus
principais mecanismos envolvidos. P. 20
Figura 3. Degradação hidrolítica do copolímero PLGA. P. 22 Figura 4. Gengivoestomatite herpética primária em criança. Pode-se observar
intensa inflamação na gengiva e múltiplas úlceras na mucosa labial. P. 31 Figura 5. Eczema herpético em criança de três meses de idade. P. 32
Figura 6. Herpes em neonato. P. 35
Figura 7. Herpes labial recorrente em indivíduo imunocomprometido. P. 36
Figura 8. Cymbopogon citratus (DC.) Stapf. P. 44
Figura 9. Estrutura química do citral, constituindo-se pela mistura dos isômeros
geométricos neral (a) e geranial (b). P. 45
Figura 10. Curva de calibração do óleo essencial de C. citratus diluído em DMSO,
obtida por espectrofotometria UV-Vis no comprimento de onda de 260 nm. P. 61 Figura 11. Curva de calibração do óleo essencial de C. citratus diluído em
PBS/LSS (1%), obtida por espectrofotometria UV-Vis no comprimento de onda de
240 nm. P. 61
Figura 12. Distribuição de tamanho das nanopartículas branco (1A) e contendo o óleo essencial de C. citratus associado (1B) medidos por espalhamento de luz
dinâmico. P. 64
Figura 13. Hidrogéis desenvolvidos: 1) hidrogel com nanopartículas de PLGA sem óleo essencial de C. citratus (HNP); 2) hidrogel com nanopartículas contendo óleo
(HNPOE); 3) hidrogel base (HB); 4) hidrogel com óleo essencial livre (HOE). P. 66 Figura 14. Estabilidade, sob-refrigeração, referente ao teor do óleo volátil de C.
citratus nos hidrogéis com óleo encapsulado em nanopartículas poliméricas (HNPOE) e com óleo livre (HOE). Ausência de diferença estatística entre as
formulações desenvolvidas em triplicata (p>0,05, t-Student). P. 68 Figura 15. Cinética de liberação in vitro do óleo essencial de C. citratus
encapsulado em nanopartículas de PLGA (NPOE), incorporado em sua forma livre à formulação de hidrogel (HOE), e incorporado à mesma formulação com prévia nanoencapsulação (HNPOE) (tampão salino-fosfato com lauril sulfato de sódio
(1%), pH 6,8, 37°C, 100 rpm, n=3). P. 70
Figura 16. Determinação da porcentagem de inibição viral das amostras testadas na
Tabela 1. Plantas medicinais com atividade anti-herpética. P. 39 Tabela 2. Composição dos principais constituintes do óleo de Cymbopogon citratus
por análises de CGAR-EM. O índice de retenção foi calculado e comparado com a
literatura. P. 60
Tabela 3. Valores de distribuição de tamanho das partículas, índice de polidispersão (IP), potencial zeta e eficiência de encapsulação (EE) das nanopartículas
poliméricas de PLGA obtidas por emulsificação-difusão do solvente. P. 62 Tabela 4. Características sensoriais dos hidrogéis de Carbopol® Ultrez 10 NF
desenvolvidos. P. 67
Tabela 5. Modelos matemáticos comumente utilizados para descrever as curvas de
dissolução de substâncias ativas. P.72
Tabela 6. Comportamentos cinéticos de liberação in vitro do óleo essencial de C. citratus a partir das formulações desenvolvidas. Coeficiente de determinação (R2), constante de velocidade de liberação (k) e expoente de difusão (n) obtido após
regressão linear em vários modelos matemáticos. P. 73
ANOVA - Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária β-CD - β-ciclodextrina
CC50 - Concentração citotóxica para 50% das culturas de células CE50 - Concentração efetiva para 50% das culturas de células
CGAR-EM - Cromatografia Gasosa de Alta Resolução acoplada ao Espectrômetro de Massas CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CMNT - Concentração máxima não tóxica
COECC50 - Concentração de óleo essencial citotóxica para 50% das células em cultura COECMNT - Concentração máxima de óleo essencial não tóxica
COECE50 - Concentração de óleo essencial efetiva para 50% das células D,L-PLA - Forma racêmica do poli (ácido lático)
DLS - Dynamic Light Scattering DMSO - Dimetilsulfóxido DNA - Ácido desoxirribonucleico
DST - Doenças sexualmente transmissíveis ECP - Efeito citopático
ED - Eficiência de dissolução EE - Eficiência de encapsulação FDA - Food and Drug Administration HB - Hidrogel base
HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico HIV - Vírus da imunodeficiência humana
HNP - Hidrogel com incorporação de nanopartículas branco
HNPOE - Hidrogel com incorporação de nanopartículas contendo óleo essencial HOE - Hidrogel contendo óleo essencial livre
HP-β-CD – Hidroxipropil-β-ciclodextrina HPMC – Hidroxipropilmetilcelulose HPV – Papilomavírus humano HSV - Vírus Herpes simplex
HSV-1 - Vírus Herpes simplex tipo 1 HSV-2 - Vírus Herpes simplex tipo 2
IS - Índice de seletividade
LAT - latency-associated transcript
LEDAC - Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas L-PLA - Forma levógira do poli (ácido lático)
MEM - Meio mínimo essencial de Eagle NP - Nanopartículas branco
NPOE - Nanopartículas contendo óleo essencial NLS - Nanopartículas lipídicas-sólidas
O/A - Óleo/água
OECc - Óleo essencial de Cymbopogon citratus OEs - Óleos essenciais
PBS - Tampão salino-fosfato
PBS/LSS (1%) - Tampão salino-fosfato com lauril sulfato de sódio a 1% (p/v) PC - Propionato de clobetasol
PCL - Poli (ε-caprolactona) PGA - Poli (ácido glicólico)
PHBV - Poli (3-hidroxibutirato co-valerato) PI - Percentagem de inibição
PLA - Poli (ácido lático)
PLGA - Poli (ácido lático-co-ácido glicólico) PVA - Álcool polivinílico
RDC - Resolução da Diretoria Colegiada RNA - Ácido ribonucleico
rpm - rotações por minuto SFB - Soro fetal bovino
SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida SNC - Sistema nervoso central
TCID50 - Concentração capaz de produzir efeito citopático em 50% das culturas de células TQ - Timidina quinase
2. EMBASAMENTO TEÓRICO P. 16 2.1. Nanotecnologia: Desenvolvimento de sistemas para a entrega de fármacos P. 16
2.1.1. Nanopartículas poliméricas P. 18
2.1.1.1. Nanopartículas poliméricas de PLGA P. 21
2.1.2. Formulações tópicas semissólidas contendo nanopartículas poliméricas P. 23
2.2. Vírus Herpes simplex P. 27
2.2.1. Estrutura e propriedades biológicas P. 27
2.2.2. Epidemiologia e transmissão viral P. 28
2.2.3. Manifestações clínicas P. 30
2.2.3.1. Gengivoestomatite herpética primária P. 30
2.2.3.2. Herpes orofacial recorrente P. 31
2.2.3.3. Herpes genital P. 31 2.2.3.4. Eczema herpético P. 32 2.2.3.5. Herpes gladiatorum P. 33 2.2.3.6. Panarício herpético P. 33 2.2.3.7. Herpes ocular P. 33 2.2.3.8. Herpes neonatal P. 34
2.2.3.9. Infecções herpéticas no sistema nervoso central P. 35
2.2.3.10. Herpes em imunocomprometidos P. 36
2.2.4. Agentes antivirais e as novas abordagens terapêuticas P. 37
2.3. Óleos essenciais P. 40
2.3.1. Encapsulação de óleos essenciais P. 41
2.4. Cymbopogon citratus P. 43
2.4.1. Óleo essencial de Cymbopogon citratus P. 45
2.4.1.1. Incorporação do óleo de C. citratus em sistemas de entrega P. 46
3. OBJETIVO P. 48 3.1. Objetivo Geral P. 48 3.2. Objetivos Específicos P. 48 4. METODOLOGIA P. 49 4.1. Material P. 49 4.1.1. Matérias-primas e reagentes P. 49
4.2. Métodos P. 51 4.2.1. Extração do óleo essencial de Cymbopogon citratus P. 51
4.2.2. Composição química do óleo essencial P. 51
4.2.3. Desenvolvimento de metodologia analítica P. 52
4.2.4. Desenvolvimento das nanopartículas poliméricas P. 53 4.2.4.1. Distribuição do tamanho e potencial zeta das nanopartículas P. 53 4.2.4.2. Determinação do teor de OECc e eficiência de encapsulação das
nanopartículas P. 53
4.2.5. Desenvolvimento dos hidrogéis P. 54
4.2.5.1. Estudo de estabilidade dos hidrogéis P. 54
4.2.6. Avaliação do perfil de liberação do óleo de C. citratus em modelo in vitro P. 55 4.2.7. Atividade Inibitória sobre os vírus Herpes simplex tipos 1 e 2 P. 56
4.2.7.1. Células e vírus P. 56
4.2.7.2. Avaliação da toxidade das amostras P. 56
4.2.7.3. Avaliação da atividade antiviral P. 57
4.2.7.4. Cinética de inibição viral P. 58
4.2.8. Análise estatística P. 58
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO P. 59
5.1. Óleo essencial de Cymbopogon citratus P. 59
5.2. Desenvolvimento de metodologia analítica P. 61
5.3. Desenvolvimento das nanopartículas poliméricas P. 62
5.4. Desenvolvimento dos hidrogéis P. 65
5.5. Avaliação do perfil de liberação do óleo de C. citratus em modelo in vitro P. 69 5.6. Atividade inibitória sobre os vírus Herpes simplex tipos 1 e 2 P. 75
6. CONCLUSÃO P. 80
1. INTRODUÇÃO
A constante busca por conhecimentos e tecnologias que permitam aperfeiçoar os sistemas terapêuticos convencionais através da redução dos efeitos adversos e da dose administrada, bem como pelo aumento da eficácia de fármacos, consiste no foco principal das pesquisas na área farmacêutica. Dentro desta ótica, a nanotecnologia surge trazendo inovações importantes para liberação de fármacos nos sistemas biológicos.
O tamanho nanométrico das partículas coloidais presentes nas formulações nanotecnológicas confere inúmeras vantagens para a entrega de moléculas bioativas, como aumento da solubilidade, controle de liberação e vetorização da substância a sítios biológicos específicos, proteção contra possíveis instabilidades, aumento da eficácia terapêutica e redução de efeitos adversos e da dose administrada.
Dentre os diversos nanossistemas atualmente disponíveis, destaque é dado às nanopartículas preparadas com polímeros sintéticos, como o poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), devido a suas acentuadas características de biocompatibilidade e biodegradabilidade, gerando subprodutos toxicologicamente seguros, sendo as mesmas administradas por diferentes vias.
A utilização de nanopartículas poliméricas como carreadores de ativos lipofílicos e a sua subsequente incorporação em géis hidrofílicos provêem formulações com apropriadas características para aplicação tópica, entre elas a formação de um filme homogêneo sobre a superfície da pele capaz de propiciar contato íntimo da substância ativa com o estrato córneo direcionando-a, assim, aos sítios lesados, a proteção cutânea contra toxicidade associada ao fármaco, e deste último frente à degradação, além da elevação de seu tempo de permanência sobre a pele.
As intercorrências infecciosas causadas pelos vírus Herpes simplex (HSV), sorotipos 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2), estão difundidas mundialmente, e segundo estudos epidemiológicos, 90% da população aos 40 anos de idade possuem anticorpos séricos contra pelo menos uma das cepas virais. O principal modo de contágio do HSV é através da exposição direta das membranas mucosas ou pele abrasiva às lesões ou secreções de um indivíduo com infecção primária ativa ou recorrente. A latência e a reativação são as principais características do vírus, as quais predispõem o hospedeiro a recorrências clínicas, advindas de estímulos diversos, manifestadas como lesões herpéticas nos sítios epidérmicos primários de infecção.
Importantes desafios são encontrados no tratamento do Herpes em virtude do surgimento de cepas virais resistentes, acrescendo-se ao elevado custo e toxicidade advinda do uso prolongado dos agentes antivirais de origem sintética. Devido aos entraves aos quais a terapia anti-herpética atual depara-se, é notória necessidade em se introduzir abordagens terapêuticas alternativas ou complementares capazes de contornar a resistência viral advinda do uso contínuo dos fármacos convencionais, bem como melhorar a penetração cutânea do ativo e consequente efeito biológico.
Neste cenário, as plantas medicinais, como frutos de intensas investigações científicas, ganham espaço como ferramentas promissoras para o controle do HSV por apresentarem uma fonte diversificada de substâncias químicas efetivas na inibição da replicação viral. Os óleos essenciais, obtidos a partir de diferentes espécies vegetais, são particularmente caracterizados por suas propriedades antimicrobianas, inseticidas e antivirais, podendo, assim, ser incorporados a preparações farmacêuticas para o tratamento de desordens cutâneas. Todavia, sua complexidade química e susceptibilidade a degradação, bem como sua lipofilicidade e elevada volatilização, requerem mecanismos capazes de melhorar sua estabilidade e torná-los terapeuticamente mais efetivos.
Cymbopogon citratus (DC.) Stapf é uma espécie herbácea originária da Índia, pertencente à família Poaceae, distribuída em regiões tropicais e subtropicais, incluindo o Brasil. O chá ou abafado das folhas é muito empregado na medicina popular por suas propriedades farmacológicas, atribuídas, principalmente, ao óleo essencial, constituído majoritariamente pelo citral, mistura isomérica dos monoterpenos neral e geranial. A atividade anti-HSV do óleo já foi previamente relatada (MINAMI et al, 2003), sendo posteriormente constatada através de experimentos in vitro realizados por nosso grupo de pesquisa.
Partindo-se dessa perspectiva, o presente trabalho foi delineado a fim de desenvolver formulações farmacêuticas semissólidas para entrega tópica do óleo volátil de C. citratus nanoencapsulado em matriz polimérica de PLGA, visando melhorar sua estabilidade e aumentar sua efetividade através do seu direcionamento aos sítios basais de infecção causada pelo vírus Herpes simplex.
2. EMBASAMENTO TEÓRICO
2.1. Nanotecnologia: Desenvolvimento de sistemas para a entrega de fármacos
Mundialmente, a progressão da nanotecnologia é notória, devido a seu amplo potencial de aplicação em diversos setores industriais e ao impacto que seus resultados podem oferecer ao desenvolvimento tecnológico e econômico. Esta rápida expansão da nanotecnologia deve-se ao fato dos materiais em nanoescala apresentarem novos comportamentos e/ou propriedades diferentes daqueles apresentados em escala macroscópica (DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006).
A multidisciplinaridade do campo científico nanotecnológico associa-se aos mais diversificados tipos de materiais, como polímeros, cerâmicas, metais, semicondutores, compósitos e biomateriais, estruturados em escala nanométrica para formar blocos de construção (building blocks) tais como clusters, nanopartículas, nanotubos e nanofibras, que por sua vez são formados a partir de átomos ou moléculas (MOGHIMI; HUNTER; MURRAY, 2005; DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006). Os nanomateriais possuem propriedades únicas em consequência de suas dimensões nanométricas conferindo-lhes características elétricas, catalíticas, magnéticas, mecânicas, térmicas ou de imagem que são altamente desejáveis para aplicações em setores comerciais (CHEN et al., 2009).
Sistemas coloidais que atuam como carreadores de fármacos, capazes de promover maior controle de liberação de agentes terapêuticos em relação às formulações convencionais, tanto por alteração de sua biodistribuição e captação tecidual, quanto em sua farmacocinética e farmacodinâmica são de grande importância para pesquisa biomédica e para indústria farmacêutica. O rápido crescimento das pesquisas e tecnologias neste campo decorre da necessidade de melhoria das terapias atuais, exigindo o uso de modalidades terapêuticas que permitam um transporte específico e eficiente de fármacos para tecidos alvo afetados pela doença (CRAPARO et al., 2011).
Os nanossistemas podem ser administrados por diferentes vias (oral, pulmonar, nasal, oftálmica, tópica, intravenosa) oferecendo uma série de vantagens para a entrega de agentes terapêuticos: proteção do fármaco no sistema terapêutico contra possíveis instabilidades no organismo, resultando em maior longevidade e estabilidade do agente terapêutico incorporado ao transportador; aumento da biodisponibilidade e da eficácia terapêutica; controle de liberação do fármaco pelo condicionamento a estímulos do meio (sensíveis a alterações de pH
ou de temperatura); redução da toxicidade e dos efeitos colaterais em razão da diminuição de picos plasmáticos de concentração máxima; possibilidade de direcionamento da ação do medicamento a alvos específicos; capacidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas; diminuição da dose terapêutica e do número de administrações, promovendo maior aceitação do paciente ao tratamento. (PANYAM; LABHASETWAR, 2003; KAYSER; LEMKE; HERNÁNDEZ-TREJO, 2005; YIH; PIMENTEL; MOSQUEIRA; SANTOS-GUIMARÃES, 2007; KUMARI; YADAV, S.K.; YADAV, S. C., 2010; CRAPARO et al., 2011).
Em contrapartida, existem algumas dificuldades a serem superadas no desenvolvimento de nanossistemas para a entrega de fármacos como a possível toxicidade, a dificuldade de produção devido a instabilidade física, a ausência de biocompatibilidade de alguns materiais utilizados, além do elevado custo de obtenção quando comparados às formulações farmacêuticas convencionais (KAYSER; LEMKE; HERNÁNDEZ-TREJO, 2005; PIMENTEL; MOSQUEIRA; SANTOS-GUIMARÃES, 2007).
O transporte biológico pode ser afetado por características físicas dos nanocarreadores incluindo tamanho, forma e flexibilidade, bem como propriedades químicas tais como incorporação de ligantes para o reconhecimento e ativação de receptores biológicos. Dessa forma, no desenvolvimento de sistemas nanoestruturados é de fundamental importância considerar a uniformidade de seus atributos físicos e químicos uma vez que, dependendo da carga da partícula, das propriedades de superfície e da hidrofobicidade, tais sistemas podem ser adsorvidos e/ou absorvidos preferencialmente a determinados órgãos e tecidos (KAYSER; LEMKE; HERNÁNDEZ-TREJO, 2005; ELSABAHY; WOOLEY, 2012).
Diferentes nanossistemas têm sido extensivamente estudados a fim de controlar a liberação de fármacos e, melhorar sua eficácia e seletividade. Nanopartículas poliméricas, emulsões submicrônicas (nanoemulsões e microemulsões), lipossomas e nanopartículas lipídicas têm sido os principais sistemas nanoestruturados empregados no desenvolvimento de nanomedicamentos e nanocosméticos por possuírem partículas de reduzidos tamanhos e de elevada área superficial, características estas desejáveis em aplicações farmacêuticas e cosméticas dermatológicas. Em adição, a possibilidade de aumentar a efetividade e a estabilidade de formulações contendo ativos lipofílicos, bem como sua liberação gradual em doses adequadas, apresentam-se como outras grandes vantagens (FLORES et al., 2011; WU; ZHANG; WATANABE, 2011).
2.1.1. Nanopartículas poliméricas
As nanopartículas constituídas por polímeros biodegradáveis têm atraído o interesse de muitos grupos de pesquisa pelo potencial na modificação e funcionalização de sua superfície com diferentes ligantes provendo liberação controlada e sítio-específica de agentes terapêuticos em resposta a estímulos fisiológicos ou externos específicos. Fato este que pode ser constatado pelo aumento do número de publicações nas últimas décadas (RAO; GECKELER, 2011; ELSABAHY; WOOLEY, 2012).
As nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos com diâmetro inferior a 1 µm formados por material de parede polimérico, geralmente biodegradável. O termo nanopartícula inclui as nanocápsulas e as nanoesferas as quais diferem entre si de acordo com a composição e a organização supramolecular (Figura 1). As nanocápsulas são estruturas vesiculares que possuem em sua constituição um invólucro polimérico disposto em torno de um núcleo oleoso, estando o fármaco dissolvido neste núcleo oleoso e/ou adsorvido à parede polimérica. As nanoesferas não apresentam óleo em sua composição, sendo estruturas matriciais esféricas compostas por uma rede de polímeros auto-organizados, onde o fármaco pode encontrar-se retido ou molecularmente disperso. (SCHAFFAZICK; GUTERRES, 2003; MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010; VRIGNAUD; BENOIT; SAULNIER, 2011).
Figura 1. Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas: a) fármaco
dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das nanocápsulas; c) fármaco retido na matriz polimérica das nanoesferas; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica das nanoesferas (Fonte: SCHAFFAZICK; GUTERRES, 2003).
Os polímeros biodegradáveis podem ser de origem natural ou sintética, e sofrem degradação in vivo, por ação enzimática ou não, gerando subprodutos biocompatíveis e toxicologicamente seguros eliminados por vias metabólicas normais (JAIN, 2000). Os
materiais poliméricos diferem conforme a velocidade e a forma de degradação, determinadas pela energia necessária para a quebra, e pela natureza da ligação. Polímeros que possuem na cadeia principal fortes ligações covalentes (C-C) e com grupos não hidrolisáveis requerem para degradação maior tempo e/ou presença de catalisadores. Já moléculas que apresentam grupos hidrolisáveis (C-O-C, C-N-C) sofrem degradação de modo mais rápido e eficiente (HASIRCI et al., 2001; DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006).
Nas últimas duas décadas têm crescido a utilização de polímeros biodegradáveis sintéticos em relação aos polímeros naturais tais como albumina, gelatina, alginato, colágeno e quitosana, uma vez que estes últimos possuem pureza questionável, problemas toxicológicos associados e duração relativamente curta da ação terapêutica do agente liberado, em detrimento dos polímeros sintéticos cuja liberação sustentada do agente terapêutico ocorre ao longo de um período de dias até várias semanas (JAIN, 2000; PANYAM; LABHASETWAR, 2003; KAYSER; LEMKE; HERNÁNDEZ-TREJO, 2005).
Na preparação de sistemas carreadores de fármacos os poli (ésteres) termoplásticos alifáticos, como poli (ácido lático) (PLA), poli (ácido glicólico) (PGA), poli (ε-caprolactona) (PCL), poli (3-hidroxibutirato co-valerato) (PHBV) e, especialmente, poli (ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), têm despertado enorme interesse devido às suas capacidades em atender a diversos requisitos da entrega de ativos, tais como biocompatibilidade, biodegradabilidade, cinética de degradação e propriedades mecânicas adequadas, bem como facilidade de processamento (JAIN, 2000; SAHOO; LABHASETWAR, 2003; CHEN et al., 2009). Adicionalmente, o PLGA foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para várias aplicações biomédicas, incluindo suturas cirúrgicas, implantes e próteses (JAIN, 2000).
A preparação das nanopartículas deve ser fundamentada em sua aplicação terapêutica, sítio-alvo (órgãos, tecidos, células ou organelas subcelulares) e via de administração. Embora a principal via de administração seja a intravenosa, há outras vias menos invasivas para a entrega de ativos a partir de nanopartículas poliméricas tais como as vias dérmica/transdérmica, oral e mucosa (ELSABAHY; WOOLEY, 2012).
Evaporação do solvente Emulsificação/difusão do solvente Nanoprecipitação Salting out Tecnologia de fluidos supercríticos Diálise Polimerizações Métodos gerais de preparação de nanopartículas poliméricas
Método de desloca mento de solvente Primeiro método, a emulsã o é convertida em na nopa rtículas
Simila r a na noprecipita çã o Modifica çã o do método de
emulsifica çã o/difusã o de solvente Versã o modifica da do método
de eva pora çã o de solvente
Método a migo do a mbiente Polimeriza çã o em microemulsã o Polimeriza çã o em miniemulsã o Polimeriza çã o em emulsã o Polimeriza çã o interfa cia l
Polimeriza çã o ra dica la r viva /controla da Electrospray
Moagem úmida Homogeneização a alta pressão Difusão do solvente quasi-emulsão
Separação de fase da emulsão Emulsificação espontânea/difusão do solvente
Precipitação pelo antisolvente supercrítico
Sepa ra çã o do solvente miscível em á gua a pa rtir da
soluçã o a quosa via efeito sa lting out Emulsões simples (O/A)
Emulsões dupla s ( A/O/A)
1. Expa nsã o rá pida da soluçã o supercrítica 2. Expa nsã o rá pida da soluçã o supercrítica em solvente líquido Difusã o do
solvente orgâ nico em meio a quoso
em presença ou a usência de surfa cta ntes: deposiçã o do polímero na interfa ce á gua-solvente orgâ nico
A fa se do solvente sa tura do em á gua e polímero é emulsifica da em soluçã o a quosa ,
leva ndo a difusã o do solvente pa ra a fa se externa e a forma çã o de na noesfera s
Comporta mento do nã o solvente miscível frente a o previa mente
miscível: desloca mento do solvente dentro da membra na seguido de
a grega çã o
Figura 2. Métodos gerais de preparação de nanopartículas poliméricas e seus principais mecanismos
envolvidos (Adaptado de BENNET; KIM, 2014).
Na literatura científica encontram-se descritos diferentes métodos convenientemente aplicados à preparação de nanopartículas poliméricas (Figura 2), sendo eles baseados na polimerização in situ de monômeros dispersos ou na dispersão de polímeros pré-formados (DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006; REIS et al., 2006; RAO; GECKELER, 2011).
Dentre os métodos baseados na dispersão de polímeros pré-formados, a emulsificação/difusão do solvente tem sido extensivamente descrita para encapsulação tanto de ativos hidrofílicos quanto lipofílicos. Nesta técnica, a fase orgânica constituída pelo polímero e solvente parcialmente miscível em água é dispersa, sob vigorosa agitação, na fase aquosa, previamente saturada com o solvente orgânico, e contendo o agente estabilizante. Após formação da emulsão, excesso de água é adicionado ao sistema, provocando a difusão do solvente para a fase externa, culminando na precipitação do polímero e consequente formação de partículas de reduzido tamanho. Finalmente, o solvente é eliminado por evaporação ou filtração. Dessa forma, são formadas nanoesferas ou nanocápsulas conforme adição ou não de óleo a fase orgânica. O controle de diâmetro das partículas pode ser alcançado pela intensidade e duração da homogeneização, pela concentração do polímero e do
agente estabilizante e pelo tamanho das gotículas da emulsão primária. Vantagens tecnológicas são atreladas a este método, como simplicidade, reprodutibilidade, facilidade de transposição de escala e distribuição granulométrica uniforme das partículas. Porém, a eliminação de grandes volumes de água e a possível perda do fármaco durante emulsificação são inconvenientes passíveis ao método (REIS et al., 2006; VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009; MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010).
Independentes do método de preparação são obtidas nanopartículas poliméricas na forma de suspensões coloidais aquosas, as quais possuem limitada aplicação industrial devido à baixa estabilidade físico-química quando submetidas a longos períodos de armazenamento. Dentre elas, destacam-se a agregação das nanopartículas no meio, resultando na formação de precipitados, a estabilidade do polímero, do fármaco e das matérias-primas e, ainda, a liberação prematura do ativo. Em adição, as formas farmacêuticas líquidas são mais propensas à proliferação microbiana, havendo a necessidade de adição de conservantes às formulações. Estes problemas físico-químicos e microbiológicos podem ser minimizados por meio da secagem das suspensões, sendo os métodos mais utilizados a liofilização (sublimação) e o spray-drying (aspersão ou nebulização) (SCHAFFAZICK; GUTERRES, 2003; MORA-HUERTAS; FESSI; ELAISSARI, 2010).
Dificuldades técnicas são encontradas na caracterização físico-química das nanopartículas poliméricas em função de sua natureza coloidal. A caracterização envolve a determinação da quantidade de fármaco associado às nanoestruturas e de sua cinética de liberação, avaliação da distribuição de tamanho das partículas e da massa molar do polímero, determinação do pH e potencial zeta, análise morfológica e a investigação da estabilidade em função do tempo de armazenamento. Esta caracterização fornece um conjunto de informações que podem conduzir a modelos descritivos da organização das nanopartículas a nível molecular, sendo dependente da composição quali-quantitativa das formulações e do método de preparação utilizado (SCHAFFAZICK; GUTERRES, 2003; DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006).
2.1.1.1. Nanopartículas poliméricas de PLGA
As nanopartículas poliméricas de PLGA têm recebido grande atenção nas pesquisas de polímeros biodegradáveis alternativos para entrega de ativos, uma vez que apresentam propriedades desejáveis, tais como, velocidade constante de biodegradação,
biocompatibilidade, baixa toxicidade, resistência mecânica e simplicidade de processamento, as quais facilitam sua utilização em diversos sistemas de distribuição de fármacos (ARMSTEAD; LI, 2011; ERBETTA et al., 2012).
Em relação aos demais polímeros bioreabsorvíveis, o PLGA requer menor tempo para completa degradação do copolímero, implicando em menor probabilidade de reações adversas decorrentes de fragmentos cristalinos liberados por polímeros, cujo tempo de degradação é excessivamente longo (MOTTA; DUEK, 2006). Sua estrutura química é altamente suscetível à reação de hidrólise em condições fisiológicas, produzindo metabólitos monoméricos biodegradáveis de ácido lático e ácido glicólico (Figura 3), associados a uma mínima toxicidade sistêmica (KUMARI; YADAV, S.K.; YADAV, S. C., 2010).
Figura 3. Degradação hidrolítica do copolímero PLGA (Adaptada de KUMARI; YADAV, S.K.;
YADAV, S. C., 2010).
O processo de degradação do copolímero de PLGA procede- se em dois estágios cuja velocidade sofre influência de parâmetros tais como relação ácido láctico e glicólico, massa molecular e a forma e estrutura da matriz (ERBETTA et al., 2012). No primeiro estágio ocorre a hidrólise aleatória de ligações ésteres do polímero havendo redução da massa molecular. As cadeias são rompidas pela hidrólise dos grupos ésteres, e os produtos de degradação, ácidos lático e glicólico, são eliminados por meio do ciclo de Krebs, como CO2 e
também excretado na urina. No segundo estágio ocorre perda de massa e variação na velocidade de quebra da cadeia polimérica (DURÁN; MATTOSO; MORAIS, 2006).
O polímero PLA pode apresentar-se em uma forma estereoregular opticamente ativa (L-PLA) e uma forma racêmica opticamente inativa (D,L-PLA). O L-PLA é encontrado na natureza na forma semicristalina devido à elevada regularidade de sua cadeia polimérica,
enquanto o D,L-PLA apresenta-se na forma amorfa em decorrência de irregularidades na estrutura da cadeia de polímeros, o que permite uma dispersão mais homogênea do fármaco na matriz polimérica, sendo preferencialmente utilizado em comparação ao L-PLA. Já o PGA é altamente cristalino devido à ausência dos grupamentos metila laterais presentes no PLA. O ácido lático é mais hidrofóbico que o ácido glicólico, assim copolímeros de PLGA ricos em lactato são menos hidrofílicos, absorvem menos água e, consequentemente, degradam mais lentamente (JAIN, 2000). A grande reatividade do glicolato em relação ao lactato faz com que o mesmo seja encontrado em maior proporção no polímero final do que na mistura inicial de monômeros (JAIN, 2000; ERBETTA et al., 2012). Diante deste contexto, o PLGA formulado com proporções monoméricas distintas é mais lentamente hidrolisado em relação ao mesmo na razão molar 50:50 (MOTTA; DUEK, 2006). Segundo Jain (2000), o copolímero formulado com razão molar 85:15 degrada em 5-6 meses, o 75:25 degrada em 4-5 meses e o 50:50 em 1-2 meses.
2.1.2. Formulações tópicas semissólidas contendo nanopartículas poliméricas
A administração tópica de fármacos oferece inúmeras vantagens em relação às vias tradicionais por prover liberação local sustentada, direcionar fármacos com baixa solubilidade oral, minimizar efeitos sistêmicos, propiciar o uso de moléculas bioativas com meia-vida curta e janela terapêutica estreita, ser de fácil aplicação, além de aumentar a confiança e adesão do paciente ao tratamento. Entretanto, a complexidade da pele enquanto barreira biológica, decorrente de sua constituição e da atuação do estrato córneo como principal obstáculo à efetiva penetração de fármacos nas camadas mais profundas, consolida importante objeção à terapia tópica (GUTERRES; ALVES; POHLMANN, 2007; LOVELYN; ATTAMA, 2011; MEENAKSHI, 2013).
Dessa forma, a utilização de tecnologias que viabilizem o alcance do ativo ao sítio infeccioso local em concentrações adequadas assume notável valia para transpor o inconveniente acima apresentado.
A nanoencapsulação torna-se uma atraente alternativa, por prover o controle de parâmetros inerentes às moléculas, tais como coeficientes de partição, difusão e solubilidade, estratégicos no aperfeiçoamento de formulações e no direcionamento do ativo à camada da pele onde ocorre sua ação terapêutica por redução de sua absorção sistêmica. O diminuto tamanho das partículas coloidais proporciona a formação de um ligeiro filme sob a pele, o
qual aumenta a hidratação e facilita o contato das substâncias lipofílicas com o estrato córneo promovendo sua permeação e liberação homogênea. Adicionalmente os nanossistemas, ao serem incorporados em bases semissólidas, garantem efeito protetor tanto ao ativo, frente à degradação química ou enzimática ao qual se apresenta susceptível, bem como à pele, prevenindo ou reduzindo reações de sensibilidade e irritação cutânea (BOUCHEMAL et al., 2004; GUTERRES; ALVES; POHLMANN, 2007; FÖRSTER et al., 2009).
A habilidade tecnológica das emulsões e géis em controlar a viscosidade, fornecendo características desejáveis a terapia tópica, faz delas as formulações mais empregadas. A incorporação de ativos nanoestruturados em bases semissólidas confere benefícios frente à sua incorporação na forma livre, como aumento no tempo de residência e penetração da substância biologicamente ativa na pele, redução do seu metabolismo nos tecidos, além de melhorar a estabilidade de ativos susceptíveis a degradação (GUTERRES; ALVES; POHLMANN, 2007).
Os hidrogéis são definidos como redes de polímeros capazes de absorverem grandes quantidades de água mantendo-se insolúveis devido à reticulação química ou física das cadeias poliméricas individuais (LIN; METTERS, 2006). Nos últimos anos, os géis hidrofílicos têm recebido acentuada atenção como sistemas de entrega de compostos bioativos por sua particularidade em combinar as propriedades das partículas em nanoescala e dos géis semissólidos, os quais possuem pronunciada hidrofilicidade, flexibilidade, versatilidade e biocompatibilidade. Nanocápsulas, lipossomas, nanopartículas sólido-lipídicas e microemulsões contendo ativos de diferentes naturezas têm sido incorporados ao ambiente inerte fornecido pelos géis hidrofílicos (HAMIDI; AZADI; RAFIEI, 2008; BATHEJA et al., 2011).
Os agentes geleificantes mais comumente empregados na preparação de hidrogéis tópicos contendo nanopartículas poliméricas são o Pluronic® F127 (MIYAZAKI et al., 2003), Natrosol® 250 M (LUENGO et al., 2006), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e Carbopol® 981 NF (BATHEJA et al., 2011), Carbopol® 940 (MILÃO et al., 2003; ALVES et al., 2007; PAESE et al., 2009) e Carbopol® Ultrez 10 NF (FONTANA et al., 2011; MARCHIORI et al., 2010; OURIQUE et al., 2011; FLORES, 2011).
Hidrogéis poliméricos de Pluronic® F127 contendo indometacina associada à nanocápsulas foram desenvolvidos por Miyazaki e colaboradores (2003), demonstrando sua
viabilidade em melhorar a permeação do anti-inflamatório não esteroidal através da pele quando comparada à formulação convencional com o fármaco livre.
Nanopartículas contendo ácido flufenâmico incorporadas a gel de Natrosol® 250M foram preparadas por Luengo e colaboradores (2006) visando mensurar sua potencialidade em prover a penetração e distribuição do ativo na pele. Maior controle de liberação do ácido flufenâmico e distribuição homogênea na superfície da pele foram providos pela sua incorporação em hidrogel nanoestruturado em relação à formulação com o mesmo não associado à nanopartículas.
Em 2011, Batheja e colaboradores desenvolveram nanoesferas, preparadas com triblocos de copolímeros derivados de tirosina, procedendo a sua incorporação em géis de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e Carbopol® 981 NF, a fim de avaliar o potencial da formulação na entrega tópica de ativos lipofílicos ao utilizar-se o promotor de permeação Azone. Neste estudo, as nanoesferas contendo diclofenaco de sódio foram dispersas uniformemente em gel de HPMC, mostrando elevada viscosidade e velocidade de liberação cumulativa três vezes superior à encontrada para o ao gel de Carbopol® 981 NF. Citotoxicidade e alterações no estrato córneo, comumente associadas ao Azone, não foram encontradas ao empregar-se o gel de HPMC contendo nanoesferas. Estudos de permeação in vitro e in vivo do gel nanoestruturado empregando o corante Vermelho do Nilo demonstraram deposição significativamente aumentada (1,4-1,8 vezes) do mesmo em comparação à formulação aquosa de nanoesferas, realçando sua efetividade no tratamento de desordens dermatológicas.
Os Carbopóis são polímeros do ácido acrílico que, após neutralização em meio aquoso, formam géis consistentes. São materiais não irritantes, atóxicos e destituídos de hipersensibilidade tópica. A estrutura do gel formado é definida pela extensão em que as macromoléculas se associam formando a rede polimérica. A forma ácida livre do polímero é identificada quando em presença de água, onde alterações de pH induzem a geração de cargas negativas as quais se interpõem ao longo da cadeia do polímero, desfazendo-a e expandindo-a (CONTRERAS; DIÉGUEZ; SORIANO, 2001; SAHOO, S.; PANI; SAHOO, S.K., 2014).
Em trabalho publicado por Milão e colaboradores (2003) foram desenvolvidos géis de Carbopol® 940 contendo diclofenaco associado a nanocápsulas, as quais permaneceram intactas durante três meses de armazenamento. Hidrogéis formulados com igual polímero e contendo nimesulida associada a nanoestruturas (nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsões)
foram preparados por Alves e colaboradores (2007), a fim de modular a penetração deste anti-inflamatório na pele humana. Por meio da técnica de difusão de Franz, os autores verificaram o acúmulo do fármaco no estrato córneo quando o mesmo encontrava-se associado à nanocápsulas e nanoesferas, havendo no caso das nanoemulsões permeação para a derme. Uma maior permeação de nimesulida nas camadas viáveis da pele humana foi factível ao gel hidrofílico contendo nanocápsulas de PCL em relação aos demais nanogéis e ao gel com o fármaco livre. Cabendo salientar que em formulação sem os nanocarreadores o fármaco não foi capaz de difundir-se a partir do veículo à superfície da pele, havendo 100% de retenção ao hidrogel.
Hidrogel de Carbopol® Ultrez 10 NF contendo o corticoide tópico propionato de clobetasol (PC) veiculado em nanocápsulas de núcleo lipídico foi desenvolvido por Fontana e colaboradores (2011). Neste trabalho, maior controle de liberação in vitro foi obtido pelo hidrogel nanoestruturado em comparação ao hidrogel com o fármaco livre, visto que houve redução na dose total administrada em doença cutânea sendo associada à presença do polímero PCL, além de prover maior eficácia dermatológica em modelo in vivo de dermatite de contato.
Maior atividade antiproliferativa e controle de liberação da dexametasona também foram obtidos por Marchiori e colaboradores (2010) ao proverem a encapsulação do fármaco em nanopartículas poliméricas, as quais foram posteriormente incorporadas em hidrogel de Carbopol® Ultrez 10 NF. Empregando o mesmo agente gelificante, Flores (2011) preparou nanogel contendo óleo essencial de Melaleuca alternifolia associado à nanocápsulas, o qual foi capaz de aumentar o efeito antiedematogênico do óleo a nível tópico, bem como conferiu maior proteção à pele frente aos danos induzidos pela radiação UVB.
A flexibilidade na utilização de preparações dermatológicas de Carbopol® Ultrez 10 NF incorporadas com pós secos por aspersão contendo tretinoína carreada em nanocápsulas de núcleo lipídico sem alteração na habilidade do nanossistema em proteger o fármaco da radiação UV foi demonstrada por Marchiori (2010).
Dentro da família dos Carbopóis, destaque é dado ao Carbopol® Ultrez 10 NF uma vez que possui melhores propriedades dispersantes em relação aos demais sendo capaz de fornecer elevada viscosidade em baixas concentrações, característico comportamento de fluidez, compatibilidade com muitos ingredientes ativos, propriedades bioadesivas, reduzida termossensibilidade e características sensoriais apreciáveis (CONTRERAS; DIÉGUEZ;
SORIANO, 2001; OURIQUE et al., 2011). Em função das vantagens acima apresentadas, este polímero foi escolhido para preparação dos nanogéis proposto no presente trabalho.
2.2. Vírus Herpes simplex
As infecções causadas por vírus apresentam-se como grandes desafios para a saúde global, especialmente pela emergência de cepas virais resistentes e de numerosos efeitos adversos associados ao uso prolongado dos agentes sintéticos disponíveis. Assim, é de grande interesse o desenvolvimento de alternativas seguras e eficazes para os fármacos antivirais convencionais (GALDIERO et al., 2011).
As infecções causadas pelos vírus Herpes simplex (HSV), sorotipos 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2), encontram-se amplamente difundidas no mundo, sendo incuráveis e persistentes durante toda a vida do hospedeiro, geralmente em sua forma latente. O HSV-2 é um patógeno sexualmente transmissível, infectando cerca de 500 milhões de pessoas mundialmente, sendo identificados anualmente aproximadamente 23 milhões de novos casos. O HSV-1 é ainda mais comum com uma soroprevalência >90% em muitos países (FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; BERNSTEIN et al., 2013).
Segundo dados epidemiológicos, o vírus Herpes simplex, o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o papilomavírus humano (HPV) apresentam forte sinergismo. A ocorrência de HSV-2 aumenta o risco de aquisição, excreção e transmissão de HIV, além de acelerar a progressão da infecção viral. Em mulheres positivas para o DNA de HPV, a presença de HSV-2 encontra-se relacionada a um aumento de 2,2 a 3,4 vezes no risco de carcinoma cervical invasivo (FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
2.2.1. Estrutura e propriedades biológicas
O HSV é um DNA-vírus pertencente à subfamília Alphaherpesviridae, apresentando quatro componentes básicos: a estrutura helicoidal de DNA em dupla hélice, envolvida por um capsídeo icosaédrico e circundada por uma substância amorfa (tegumento), além do envelope lipídico, em que se expressam as suas glicoproteínas de superfície. Os genes α, β e γ expressos permitem controlar, respectivamente, a tradução do genoma viral, a transcrição de proteínas essenciais para síntese do DNA viral e a saída das partículas virais a partir da célula infectada. Embora, os sorotipos HSV-1 e HSV-2 mostrem similaridades em suas sequências
de DNA, eles são distintos antigenicamente por possuírem diferentes proteínas de envelope (LUPI, 2000; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
Os herpesvirus possuem como características biológicas únicas, a latência e a reativação. A replicação viral inicia-se na epiderme, sítio primário de exposição, após a ligação do vírus às moléculas de heparan sulfato da membrana da célula hospedeira. O período de incubação viral é de cerca de sete dias. Em seguida, ocorre a propagação da infecção para as terminações nervosas livres com disseminação intra-axonal através de transporte retrógrado dos vírions, partículas infectantes básicas dos vírus, para os gânglios sensoriais paravertebrais, levando ao estabelecimento da latência viral. Alguns neurônios encontram-se produtivamente infectados, em detrimento a outros que não se encontram permissíveis à replicação, assim estes neurônios integram o DNA viral, porém sem produção de novas partículas virais infecciosas. O único produto viral detectado durante a latência é conhecido como LAT (latency-associated transcript), sendo um fragmento de RNA sintetizado pelo vírus. Os gânglios sacrais e trigeminais são os mais acometidos nas recorrências clínicas (LUPI, 2000; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; SALEH et al., 2011).
A latência crônica predispõe o hospedeiro a recorrentes períodos de reativação viral, resultantes de estímulos tais como estresse, fadiga, exposição ao calor, frio e a radiações, menstruação, intercurso sexual, febre, imunossupressão, administração de corticosteroides, cirurgia a laser, trauma tecidual local, entre outros. Uma vez reativado, o HSV migra ao longo de neurônios sensoriais até sítios inervados na epiderme, onde ocorre sua multiplicação, levando às recorrências clínicas caracterizadas por lesões herpéticas nos sítios primários de infecção. Geralmente, a infecção primária é mais invasiva que a recorrente devido à falta de imunidade celular e humoral do hospedeiro. As recorrências genitais causadas por HSV-2 são as mais frequentes, seguidas pelas oro-labiais causadas pelo HSV-1 (FALCÃO, 2007; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; LUGANINI et al., 2011).
2.2.2. Epidemiologia e transmissão viral
O HSV encontra-se disseminado mundialmente e, segundo estudos epidemiológicos, 90% da população aos 40 anos de idade possuem anticorpos séricos contra pelo menos uma das cepas do vírus. No Brasil cerca de 640 mil novos casos de herpes genital são diagnosticados anualmente (LUPI, 2000; CLEMENS; FARHAT, 2010).
O principal modo de contágio do HSV é através da exposição direta das membranas mucosas ou pele lesionada a secreções ou lesões de indivíduo com infecção primária ativa ou recorrente. O vírus pode ainda ser transmitido via gotículas respiratórias ou exposição a secreções mucocutâneas de hospedeiros assintomáticos, na ausência de doença clínica. Estima-se que somente 10 a 20% dos pacientes infectados se apresentem como portadores virais, até 60% dos indivíduos soropositivos possuem quadros assintomáticos ou oligossintomáticos não reconhecidos pelos pacientes como Herpes simplex. Este fato ajuda a entender como ocorre a propagação do vírus na população, pois possíveis recidivas são interpretadas como estados gripais, aftas ou infecções genitais inespecíficas, passando despercebidas (LUPI, 2000; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
O HSV-1 está associado primariamente a infecções orais, faríngeas, faciais, oculares e do sistema nervoso central, sendo geralmente transmitido via secreções orais e contato não genital. Porém, o aumento na incidência da infecção herpética genital pelo tipo 1 tem se tornado uma tendência atual, mostrando-se menos severa e recorrente que a infecção causada pelo tipo 2. Acometendo de 45 a 90% da população mundial, a prevalência viral varia de acordo com idade, raça, localização geográfica, e condições socioeconômicas, sendo maior o número de indivíduos infectados nos países menos desenvolvidos (LUPI, 2000; LOOKER; GARNETT, 2005; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; HOROWITZ et al., 2010).
Diferentemente do HSV-1, o HSV-2 está diretamente ligado a infecções ano-genitais dolorosas, sendo uma das infecções sexualmente transmissíveis com maior prevalência, fortemente correlacionada com a maturidade sexual e a promiscuidade. Contudo, podem ocorrer lesões orofaciais causadas pelo tipo 2, embora tenham pequeno impacto na saúde global. Dessa forma, os fatores estatisticamente importantes para disseminação do HSV-2 são a iniciação sexual precoce, gênero feminino, raça negra, baixo nível socioeconômico, reduzido nível de escolaridade, história prévia de doenças sexualmente transmissíveis (DST) (uretrites gonocócicas, uretrites por Chlamydia trachomatis e sífilis), multiplicidade de parceiros sexuais, prática do sexo orogenital, coito anal e relações homossexuais com penetração. A taxa de infecção pelo HSV-2 é bastante elevada na África, América Latina e Ásia, cerca de 30 a 60% da população comparando-se indivíduos de mesma faixa etária (LUPI, 2000; LOOKER; GARNETT, 2005; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; QUINN, 2011).
Posto que as duas cepas virais causem infecções genitais e orolabiais, faz-se necessário considerar a influência do sítio anatômico envolvido na frequência de reativação do vírus. A recorrência de lesões herpéticas genitais causadas por HSV-2 é superior à causada por HSV-1, já no caso de infecções extragenitais a recorrência causada por HSV-1 é maior (LUPI, 2000).
2.2.3. Manifestações clínicas
A grande maioria dos casos primários de HSV manifesta-se através de sintomatologia inespecífica, limitando a plena caracterização do quadro. As manifestações clínicas dependem, basicamente, do sítio de inoculação do vírus, da competência imunológica do hospedeiro e da cepa viral adquirida (LUPI, 2000).
As principais manifestações clínicas associadas às infecções causadas pelo vírus Herpes simplex são:
2.2.3.1. Gengivoestomatite herpética primária
Independentemente do tipo viral, o HSV afeta primariamente a pele e as membranas mucosas. A gengivoestomatite herpética primária (Figura 4) consiste na principal manifestação orofacial de infecção por HSV-1, sendo caracterizada por lesões vesículo-ulcerativas nas gengivas e mucosa bucal. A maioria das infecções são subclínicas, afetando tipicamente crianças com faixa etária de 1 a 5 anos, podendo mais raramente acometer adultos. A sintomática é frequentemente precedida ou acompanhada por ardência ou parestesia no sítio de inoculação, linfadenopatia cervical e submandibular, febre, mal-estar, perda de apetite, mialgias e disfagia. Após um ou dois dias, surgem no local de inoculação numerosas máculas eritematosas com vesículas agrupadas, acompanhadas de ardor, prurido e dor. Este quadro perdura por um período de 2 a 3 semanas, quando ocorre a reparação do quadro clínico (LUPI, 2000; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
Em indivíduos adultos, a infecção primária ocorre de modo diferente, pois envolve as tonsilas e a parte posterior da faringe (FALCÃO, 2007).
Figura 4. Gengivoestomatite herpética primária em criança. Pode-se observar intensa inflamação na
gengiva e múltiplas úlceras na mucosa labial (Fonte: FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
2.2.3.2. Herpes orofacial recorrente
Ainda que haja uma elevada prevalência do HSV-1 na população, na maioria das vezes a infecção primária apresenta-se assintomática ou com manifestações inespecíficas, tais como febre, ulceração e edema. A frequência de recorrência pode ser influenciada pelo sítio anatômico da infecção, a suscetibilidade genética, a imunidade, a dose inicial do inóculo e o subtipo viral. Embora o HSV-2 possa causar ocasionalmente uma infecção primária oral, a recorrência induzida por este subtipo viral é rara (FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
A herpes labial consiste na forma de recorrência predominante da herpes orofacial, a qual geralmente é precedida por um período prodrômico de dor, queimação, coceira ou formigamento, com duração de 6 horas, antes da erupção de múltiplas vesículas, principalmente nas bordas dos lábios, a qual ocorre em um período de cerca de 24 horas. Posteriormente, ocorre a progressão da lesão para pústula, necrose e crosta (GOMES, 2006).
2.2.3.3. Herpes genital
A herpes genital, como relatado anteriormente, pode ser causada pelos subtipos HSV-1 e HSV-2, porém as ulcerações genitais induzidas por HSV-2 são 6 vezes mais frequentes que as causadas por HSV-1. A transmissão viral pode ocorrer mesmo nos casos em que as lesões sejam imperceptíveis ou a infecção assintomática (GOMES, 2006; FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007).
