DEDICATÓRIA
“Dedico este trabalho aos meus pais, a quem chamo de verdadeiros amigos, pois através deles surgiu minha oportunidade de crescer e amadurecer diante das diversas experiências de vida que passei. Por terem me dado a vida e me criado com tanto amor e dedicação. Também dedico este trabalho aos meus irmãos Mateus e Laura, e à Taíze, minha namorada”.
Agradecimentos
Ao professor Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Orientador e amigo, agradeço por ter me recebido em seu laboratório, por ter acreditado e me dar confiança para realizar esse objetivo, por me ajudar nos experimentos, nos inúmeros momentos de dúvidas, por me dar incentivo e me guiar na formação de um pesquisador sério.
Ao professor Dr. Carlos Musso, agradeço pelos ensinamentos didáticos em Anatomia Humana e pela realização da pré-banca deste trabalho.
Aos professores que realizaram a minha pré-banca.
Ao professor Dr. Elliot Kitajima e sua equipe de laboratório por ceder o uso do microscópio eletrônico durante a realização dos experimentos.
Aos técnicos de laboratório e amigos Marcos Aurélio e Nori pelo auxílio nos serviços de rotina para a realização dos experimentos de microscopia eletrônica.
À coordenação de pós-graduação, em especial a Líliam pela atenção e cuidados com as documentações exigidas ao longo desses dois anos.
À secretária do departamento de Anatomia, Ana Floriana pela atenção e ajudas diversas.
Aos professores do departamento de Anatomia pela amizade e incentivo durante a minha pesquisa.
Ao técnico de laboratório de Anatomia Jorge, do Centro Universitário Vila Velha (UVV) pela amizade, ajuda nas montagens de aulas e pelas longas conversas que tivemos durante a minha graduação de Fisioterapia.
Aos Meus pais Edmo e Terezinha que sempre me apoiaram e ainda continuam a me incentivar na busca dos caminhos que eu escolho, independente de entenderem ou não os rumos, hora tranqüilos, hora conturbados que experencio, seja na vida pessoal ou na vida profissional. Muito obrigado, amo vocês dois!
Aos meus irmãos Mateus e Laura por todo tipo de ajuda que me deram e por terem me entendido nos momentos críticos pelos quais passei na vida.
Aos meus queridos tios Márcio e Eliana pela amizade e ajuda incondicional que me deram para que eu alcançasse os meus objetivos. Meu sincero agradecimento.
Aos meus queridos tios Pedro e Bia, pela amizade, convívio e conselhos que me deram ao longo da minha vida. Meu sincero agradecimento.
À minha namorada Taize que sempre esteve ao meu lado, pela sua ajuda em vários momentos da minha vida. Pela sua companhia, carinho e amor.
Aos amigos de graduação de Educação Física Renan, Carlos Rodrigo, Didi e Leonardo, pela amizade que ainda temos e cultivamos, mesmo estando longe e seguindo caminhos diferentes.
Aos amigos Rogério Duarte e Melissa, pela amizade e risadas que demos durante o convívio que tivemos em Vitória.
Aos amigos André e Renata e sua filha Gigi, Christiane e Rodrigo, Karina e Marcelo, Raul e Cristina, Macedo e sua esposa, pela amizade sincera que temos e pelos alegres e bons momentos que tivemos aqui em Campinas e Boituva nesses dois anos.
Aos amigos do departamento de Anatomia e do IB-UNICAMP, Wilson, Renato, Cíntia, Ana Paula, Leslie, Wagner, Rafael, Amanda, Daniela, Isabela, Ivan, Flávia, Cândido, Rafael, Adriana, Alberto, Danilo e Roni.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Regeneração Nervosa Amanda, Amauri, Renata, Gabriel, Rafaela, Juliana, Sheila, Rodrigo, Roberta, Lucina, Jéssica, Camila, Aline e Suzana.
À Renata Zanon e Rafaela Chitarra pela adorável convivência no ambiente de trabalho, pela amizade concretizada e pela ajuda em meus experimentos ao longo da minha pesquisa.
À CAPES pelo apoio financeiro.
A todos que de alguma forma participaram desta vitória, meu muito obrigado. Todos, por algum motivo, estiveram presentes no momento certo.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS... xi
LISTA DE FIGURAS... xii
LISTA DE TABELAS... xiv
RESUMO... xvi
ABSTRACT... xvii
ESTRUTURA DA TESE... xviii
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 O Sistema Nervoso... 1
1.2 Motoneurônios Medulares... 3
1.3 Alterações neuronais após lesão nervosa... 5
1.4 Astrócitos e a astrogliose reativa... 7
1.5 Complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) no Sistema Nervoso Central... 10
1.6 Distrofia Muscular de Duchenne (DMD)... 12
2.1 Objetivo Gerais... 16
2.2 Objetivos Específicos... 17
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 18
3.1 Grupos de Animais... 18
3.2 Transecção do nervo isquiático... 19
3.3 Eutanásia dos animais sete dias após a transecção do nervo isquiático e processamento para imunoistoquímica... 20
3.4 Imunoistoquímica... 20
3.4.1 Análise quantitativa dos resultados... 22
3.4.2 Análise estatística... 22
3.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)... 23
3.5.1 Análise das secções ultrafinas... 25
4. RESULTADOS... 26
4.1 Expressão de MHC I após axotomia do nervo isquiático... 26
4.2 Imunorreatividade para sinaptofisina... 29
4.4 Alterações ultraestruturais na medula espinhal após axotomia...
4.4.1 Cobertura sináptica total... 36
43
4.4.2 Número de terminais pré-sinápticos/100 µm de membrana neuronal...
4.4.3 Porcentagem da cobertura sináptica de terminais F...
4.4.4 Porcentagem da cobertura sináptica de terminais S...
4.4.5 Porcentagem da cobertura sináptica de terminais C...
4.4.6 Número de terminais pré-sinápticos F /100 μm de membrana neuronal...
4.4.7 Número de terminais pré-sinápticos S /100 μm de membrana neuronal...
4.4.8 Número de terminais pré-sinápticos C /100 μm de membrana neuronal... 5. DISCUSSÃO... 44 47 47 48 49 50 51 57 6. CONCLUSÕES... 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 66 67
LISTA DE ABREVIATURAS
AT azul de toluidina
BSA albumina de soro bovino
GABA ácido gama-aminobutírico
GFAP proteína fibrilar ácida glial
IFN-γ interferon gama
MDX distrofia muscular ligada ao cromosso X
MELD músculo extensor longo dos dedos
MHC-I complexo principal de histocompatibilidade – I
MN motoneurônio
MPL músculo plantar longo
MS músculo sóleo
MTA músculo tibial anterior
PB tampão fosfato
PBS salina tamponada em tampão fosfato
RNAm ácido ribonucléico mensageiro
SNC Sistema Nervoso Central
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Secções transversais semi-finasde medula espinhal coradas com Azul de Toluidina (AT), em aumento de 20X... 24
Figura 2. Imunomarcação anti-MHC I uma semana após axotomia... 28
Figura 3. Imunomarcação anti-sinaptofisina uma semana após axotomia... 31
Figura 4. Imunomarcação anti-GFAP uma semana após axotomia do nervo isquiático... 35
Figura 5. Sequência de fotomicrografias eletrônicas utilizadas para a reconstrução de um motoneurônio alfa medular... 36
Figura 6. Ultraestrutura da superfície de motoneurônios alfa medulares... 39
Figura 7. Ultraestrutura da superfície de motoneurônios alfa medulares uma semana após a axotomia do nervo isquiático... 41
Figura 8. Representação da análise quantitativa da ultraestrutura das sinapses e da análise quantitativa da ultraestrutura do número de terminais/100 µm... 44
Figura 9 Representação da análise quantitativa da ultraestrutura dos terminais F, S e C e da análise quantitativa da ultraestrutura do número de terminais (F, S e C)/100 µm... 52
Figura 10. Gráficos mostrando a distribuição de frequência (em micrômetros) dos espaços entre os terminais sinápticos retraídos ao longo da membrana do corpo dos motoneurônios... 56
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Grupos experimentais... 19
Tabela 2. Comparação entre as médias da porcentagem Total de Cobertura Sináptica, computadas através da quantificação dos terminais pré-sinápticos em aposição com a membrana neuronal... 45
Tabela 3. Comparação entre as médias do Número de Terminais em Aposição/100µm, computadas através da quantificação do número de terminais pré-sinápticos em aposição em 100 µm da membrana neuronal... 46
Tabela 4. Comparação entre as médias da porcentagem Total de Cobertura de Terminal F, computadas através da quantificação dos terminais pré-sinápticos F em aposição com a membrana neuronal... 53
Tabela 5. Comparação entre as médias da porcentagem Total de Cobertura de Terminal S, computadas através da quantificação dos terminais pré-sinápticos S em aposição com a membrana neuronal... 53
Tabela 6. Comparação entre as médias do Número de Terminais F/100 µm, computadas através da quantificação dos terminais pré-sinápticos F em aposição em 100 micrômetros de membrana neuronal... 54
Tabela 7. Comparação entre as médias do Número de Terminais S/100 µm, computadas através da quantificação dos terminais pré-sinápticos S em aposição em 100 micrômetros de membrana neuronal... 54
RESUMO
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença de caráter recessivo, onde o cromosso X sofre mutações e não codifica o gene responsável pela produção da distrofina. Atinge aproximadamente 1 em cada 3500 nascidos vivos. A distrofina, juntamente com o complexo glicoproteína-distrofina, tem as funções de manter as ligações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, manter a integridade da membrana celular, promover a distribuição de forças laterais entre as fibras musculares e a comunicação entre o meio intra e extra-celular. A DMD é normalmente diagnosticada entre 2 e 5 anos de idade sendo caracterizada por degeneração progressiva e fraqueza da musculatura esquelética,que é substituída por tecido adiposo e fibroso. Os pacientes vão a óbito por volta dos 20 anos devido à falência estrutural e funcional do músculo diafragma e/ou cardíaco. Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular na DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, o terminal axonal, na junção neuromuscular, entra em um ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). Evidências recentes mostram que neurônios e células gliais expressam moléculas anteriormente tidas como exclusivas do Sistema Imunológico. No entanto, a presença desses elementos no (SNC) parece estar relacionada a outras funções. Um exemplo é o complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHC I) que apresenta papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e também é fundamental na resposta após uma lesão nervosa no adulto. Nesse contexto, estudos recentes sugerem que a expressão de MHC I desempenhe importante papel na manutenção das conexões sinápticas, bem como na comunicação neurônio/glia após lesão. No presente trabalho, foram utilizados camundongos MDX, que exibem lesões histológicas similares à distrofia muscular no homem e seu controle, C57BL/10, com o intuito de investigar os processos de plasticidade sináptica e astrogliose reativa no microambiente da medula espinhal. Para tal, os camundongos das duas linhagens foram submetidos a uma transecção unilateral do nervo isquiático. Uma semana após a axotomia, os animais foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinhais lombares processadas para imunohistoquímica (anticorpos para MHC I, Sinaptofisina e GFAP – Glial Fibrillary Acidic Protein) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os lados contralaterais à lesão foram utilizados como controle para cada linhagem. A imunohistoquímica mostrou aumento da expressão de MHC I e GFAP e diminuição da expressão de sinaptofisina no lado ipsilateral à lesão nas duas linhagens. Nos camundongos MDX, os lados contralateral (não lesionado) e ipsilateral (lesionado) apresentaram uma diminuição significativa da expressão de sinaptofisina e aumento significativo de GFAP em relação aos mesmos lados nos camundongos C57BL/10. Ainda, a análise ultraestrutural quantitativa indicou maior retração sináptica na linhagem MDX, antes e após a transecção do nervo isquiático. Através dessas observações, podemos sugerir que essa redução de sinapses nos motoneurônios alfa-medulares e aumento da astrogliose circunjacente aos neurônios alfa-medulares, seja decorrente da desconexão parcial entre o orgão alvo e o corpo neuronal durante o período de ciclos de
degeneração/regeneração muscular que ocorrem a partir das primeiras semanas de vida nos camundongos MDX. Estes ciclos podem repercutir retrogradamente nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, provocando uma série de alterações (como, por exemplo, o edema do corpo celular, a retração de terminações sinápticas, o deslocamento do núcleo para a periferia e a dissolução da substância de Nissl) denominadas cromatólise. Houve aumento da expressão de MHC I, em graus variáveis, nas duas linhagens. Os resultados da imunohistoquímica mostram uma correlação entre a reatividade glial subseqüente à axotomia e o processo de retração sináptica que ocorre ao nível da medula espinhal. Logo, reforçam a idéia de que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica.
ABSTRACT
The Duchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by muscle degeneration and structural defects in the neuromuscular synapse that are caused by mutations in dystrophin. It is an X-linkend recessive and progressive muscle-wasting disease. It affects approximately 1/3500 male births. Diagnosis of the DMD is usually made between the ages from 2 to 5 years old. Life expectancy is between the late teens and early twenties. At present, a lot is known about the muscular injuries in the Duchenne muscular dystrophy, but few studies are focused on the effects of the disease in the Central Nervous System, more specifically in the microenvironment surrounding the alpha motoneurons. The aim of this study was to investigate eventual synaptic alterations and glial reactivity changes in the microenvironment surrounding the alpha motoneurons in a Duchenne muscular dystrophy animal model, namely the MDX mice. In this sense, six weeks old, male, MDX mice, were subjected to the left sciatic nerve transection. The axotomy was performed after the cycles of muscular degeneration/regeneration, previously described in such model of muscular dystrophy. C57BL/10 mice were used as controls. Seven days after surgery, the animals were sacrificied and their lumbar spinal cords processed for immunohistochemistry (anti-MHC I, anti-Synaptophysin and anti-GFAP glial fibrillary acidic protein antisera were used. Overall MHC-I expression increased in both strains after axotomy. Nevertheless, MDX mice displayed a significantly smaller MHC I upregulation (MDX, 18,90 ± 0,60, mean + se; C57BL/10, 24,34 ± 1,06, p>0,05). Regarding GFAP expression, MDX showed a stronger astrogliosis in comparison to C57BL/10 mice (MDX, 16,0 ± 1,06; C57BL/10, 9,7 ± 0,43; p<0,01). In MDX mice the imunostaining demonstrated significant decreased of synaptophysin expression (MDX, 4,250778 ± 0,300686; C57BL/10, 5,694914 ± 0,283379; p< 0,05). Indeed, ultrastrutural quantitative analysis showed more intense synaptic detachment in MDX mice, indicating a reduction of synaptic activity before and after axotomy. We conclude that the reduction of active inputs to the alpha motoneurons and increased astrogliosis in MDX mice maybe associated with the cycles of muscle degeneration/regeneration that occur postnatally. Also, the decreased MHC I expression in MDX mice may indicate a lower regenerative potential after lesion.
ESTRUTURA DA TESE
O presente trabalho contém cinco capítulos, descritos a seguir:
O Capítulo 1 apresenta uma introdução do estudo, bem como os objetivos do mesmo;
O Capítulo 2 apresenta os Materiais e Métodos utilizados para a realização dos experimentos relacionados à tese;
O Capítulo 3 contém os resultados obtidos;
O Capítulo 4 discute os resultados, relacionando-os com os dados presentes na literatura;
O Capítulo 5 apresenta os futuros trabalhos relacionados com a distrofia muscular de Duchenne em nosso laboratório;
1. INTRODUÇÃO
1.1 O Sistema Nervoso
Os seres vivos, qualquer que seja o lugar que ocupem, são dotados das capacidades de sentir e mover. Essas capacidades se adicionam, nos vertebrados superiores, a um conjunto de faculdades novas, como os diferentes atos psíquicos e, ao conjunto formado, se compreendem pela denominação genérica de capacidade intelectual e afetiva. O conjunto dos órgãos destinados a estas funções constitui o sistema nervoso. O sistema nervoso também possui a função de controlar respostas motoras, interpretar informações sensoriais, mediar funções autonômicas, promover ajustes homeostáticos, além de organizar comportamentos através do aprendizado e memória (TESTUT e LATARJET, 1986; MACHADO, 2000).
Anatomicamente, o Sistema Nervoso (SN) pode ser dividido em duas partes: uma localizada dentro da cavidade craniana e canal vertebral, denominada de Sistema Nervoso Central (SNC); e a outra parte, denominada de Sistema Nervoso Periférico (SNP), localizada fora dos condutos citados acima (TESTUT e LATARJET, 1986).
O desenvolvimento embrionário do SNC se dá por um complexo processo iniciado pela formação da placa neural, que é constituída por um espessamento do folheto embrionário ectoderma. A placa neural cresce progressivamente até
formar um sulco longitudinal denominado de sulco neural, o qual se aprofunda para formar a goteira neural. Os lábios da goteira neural se fundem para formar o tubo neural. Após a formação do tubo neural, o ectoderma que não se diferenciou envolve o tubo neural, isolando-o, assim, do meio externo. A partir do ponto em que o ectoderma não diferenciado encontra os lábios da goteira neural forma-se de cada lado a crista neural, que se encontra dorso-lateralmente em relação ao tubo neural. O tubo neural dá origem aos elementos do sistema nervoso central, enquanto a crista neural dá origem aos elementos do sistema nervoso periférico (MACHADO, 2000).
Desde o seu início, o tubo neural apresenta calibre não uniforme. A parte cranial, que dá origem ao encéfalo, apresenta um maior calibre em relação à parte caudal, que apresenta com calibre uniforme e que constitui a medula espinhal (MACHADO, 200).
O SNC pode ainda ser dividido, morfologicamente, em substância branca e substância cinzenta. A substância branca está constituída por células da glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia), células ependimárias e fibras nervosas mielinizadas. Já a substância cinzenta está constituída por corpos celulares de neurônios, fibras amielínicas, células da glia (astrócitos e microglia) e células ependimárias. (MACHADO, 2000). No sistema nervoso suprasegmentar a substância branca está localizada centralmente, em relação à substância cinzenta, a qual forma o córtex cerebral. Já no SN segmentar, uma divisão metamérica do SNC, que inclui a medula espinhal, a substância branca está localizada na
periferia e a substância cinzenta, numa posição central. Assim, num corte transversal da medula espinhal, nota-se que a substância cinzenta apresenta a forma aproximada de um “H”, podendo ser identificadas duas colunas (anterior e posterior) de cada lado do plano sagital mediano. A coluna posterior possui neurônios responsáveis por receber estímulos sensitivos advindos das raízes dorsais dos nervos espinhais. A coluna anterior possui motoneurônios responsáveis pela inervação dos músculos estriados esqueléticos. Essas duas colunas encontram-se interligadas por uma zona intermediária, que nos segmentos torácicos e nos segmentos lombares altos apresentam-se em continuidade com as colunas laterais, as quais contêm neurônios motores pré-ganglionares responsáveis pela inervação simpática das vísceras (KANDEL et al., 2000).
1.2 Motoneurônios Medulares
Os motoneurônios constituem-se em um proeminente grupo de neurônios colinérgicos do SNC (WENDELL-SMITH et al., 1966). Os neurônios motores medulares podem ser classificados em dois tipos: motoneurônios-alfa, que possuem grande corpo celular, com diâmetro aproximado de 35μm no camundongo e inervam as fibras musculares extra-fusais; e motoneurônios-gama, que são menores, possuem axônios mais finos e inervam as fibras musculares intra-fusais (KANDEL et al., 2000). Os motoneurônios alfa e gama estão circundados por dendritos e terminais sinápticos (WENDELL-SMITH et al., 1966).
Os motoneurônios-alfa apresentam uma árvore dendrítica que pode receber até 100.000 terminações sinápticas (ULFHAKE e CULLHEIM, 1988). Na região da intumescência lombar da medula espinhal há um íntimo contato entre dendritos e motoneurônios adjacentes com terminais sinápticos (CONRADI, 1969). O complexo sináptico é definido, assim, como uma junção especializada entre duas partes neuronais: a membrana do terminal pré-sináptico (que contém vesículas sinápticas) e a membrana pós-sináptica, que contém uma quantidade variável de material eletrondenso (GRAY e GUILLERY, 1966).
Os terminais pré-sinápticos dos motoneurônios localizados na medula espinhal podem ser classificados em vários tipos, de acordo com a morfologia e tamanho de suas vesículas sinápticas (CONRADI, 1969). Os terminais sinápticos do tipo C, excitatórios e colinérgicos, estão localizados na superfície do corpo celular e região proximal dos dendritos, possuindo entre 3 e 7μm de comprimento. São os maiores terminais em aposição à superfície dos motoneurônios e apresentam grande número de vesículas esféricas com 35 e 50nm de diâmetro. Apresentam, também, uma cisterna localizada sob a membrana pós-sináptica denominada de cisterna sub-sináptica, estando esta, em continuidade com o retículo endoplasmático granular (característica que difere estes terminais sinápticos dos demais). Os terminais C não são observados em todos os motoneurônios. Por isso, a sua presença é suficiente para classificar uma célula nervosa como sendo um motoneurônio alfa (BODIAN, 1964; GRAY e GUILLERY, 1966; CONRADI, 1969). Mais quatro tipos de terminais sinápticos podem ser encontrados: S, T, F e M. Os terminais do tipo M (mono synaptic) são encontrados
exclusivamente na porção proximal dos dendritos (CONRADI, 1969). Os terminais do tipo S (Spherical) contêm vesículas esféricas com diâmetro entre 35-50nm. Os terminais do tipo T (Taxi) possuem as mesmas características, porém a fenda sináptica (espaço de 20-30nm que separa as duas membranas em oposição) apresenta-se mais espessa. O neurotransmissor encontrado nas vesículas sinápticas dos terminais S é o aminoácido excitatório glutamato. Os terminais do tipo F (Flattened) apresentam vesículas achatadas, sendo o neurotransmissor predominante a glicina e/ou GABA. Os terminais M possuem vesículas esféricas de 35 à 50nm de diâmetro, tendo como neurotransmissor o glutamato. (CONRADI, 1969; BRÄNNSTRÖM e KELLERTH, 1998).
1.3 Alterações neuronais após lesão nervosa periférica
O Sistema Nervoso Central (SNC) é sensível a agressões e sua capacidade regenerativa é limitada. Após uma lesão, na maioria dos casos, o tecido nervoso não se regenera. Quando há um processo reparativo, este ocorre de forma incompleta, deixando danos irreversíveis (MORAN e GRAEBER, 2004).
A estabilização e a manutenção dos circuitos neuronais do SNC constituem-se num processo complexo e pouco conhecido, o qual envolve milhares de neurônios interconectados precisamente por meio de sinapses (HUH
et al., 2000; BOULANGER et al., 2001). A plasticidade no SNC está relacionada
conexões quando necessário. Isso parece ser uma propriedade fundamental do SN. Dessa forma, após uma agressão, a plasticidade que ocorre no SNC promove uma remodelação estrutural e funcional de seus circuitos. Uma das modificações mais siginficativas após uma agressão que resulte na interrupção do contato entre o motoneurônio e as fibras musculares é a retração dos terminais pré-sinápticos da célula axotomizada (PURVES e LICHTAM, 1978; BRÄNNSTÖM e KELLERTH, 1998). Imediatamente após a lesão, os neurônios axotomizados apresentam uma perda significativa de inputs, diminuindo, ou até mesmo, cessando temporariamente a transmissão sináptica (TAKATA e NAGAHAMA, 1983). Ultraestruturalmente observa-se uma redução do número de contatos sinápticos no corpo dos motoneurônios alfa e na região proximal de seus dendritos, sendo os terminais excitatórios do tipo glutamatérgico os mais afetados (LINDÅ et al., 2000). A eliminação preferencial de terminais glutamatérgicos pode ser interpretada como uma forma de se evitar a excitotoxicidade mediada por este neurotransmissor. (LINDÅ et al., 2000; CULLHEIM et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2004). Nesta condição, o motoneurônio lesionado apresenta um domínio de inputs inibitórios. As alterações sinápticas observadas refletem uma reorganização ativa destas em resposta a lesão, o que leva a uma mudança metabólica de um estado de transmissão sináptica para um estado de recuperação dos axônios comprometidos pela lesão (LINDÅ et al., 1992; PIEHL et al., 1993; PIEHL et al., 1998; LINDÅ et
Com isso, a retração sináptica está relacionada a uma ação reparadora do motoneurônio a fim de bloquear a excitotoxicidade causada por terminais glutamatérgicos após lesões (LINDÅ et al; 2000).
1.4 Astrócitos e a astrogliose reativa
A glia, presente no microambiente medular, merece destaque durante os processos de plasticidade sináptica. Até pouco tempo, as células gliais eram consideradas apenas como elementos estruturais passivos, desempenhando papel pouco relevante na homeostasia do SN. Porém, novos estudos indicam que estas células são capazes de atuar efetivamente durante os eventos de transmissão e plasticidade sináptica (DEROUICHE et al., 2002; ARAQUE e PEREA, 2004). A ativação das células gliais é uma característica subseqüente a lesões no SNC e no SNP. A proliferação de astrócitos e microglia, decorrentes de processos degenerativos no SNC, tem como objetivo fagocitar fragmentos axonais e reestabelecer a homeostasia do tecido nervoso. Notadamente, há evidências de que as mesmas condições que ativam a microglia, também são responsáveis pela ativação dos astrócitos (ECHEVERRY et al., 2007). Esta resposta pode ser reconhecida pela hipertrofia da macroglia e aumento da expressão de GFAP (glial
fibrillary acidic protein). Funcionalmente, essa ativação é caracterizada pelo
aumento de fatores tróficos e uma variedade de citocinas (ECHEVERRY et al., 2007). A liberação desses fatores pode contribuir para a formação de tecido cicatricial no SNC (ALDSKOGIUS e KOZLOVA, 1998).
Os astrócitos apresentam projeções citoplasmáticas que representam de 70 a 80% de sua superfície de membrana, sendo particularmente abundantes ao redor das terminações nervosas (WOLFF, 1970), onde formam processos perissinápticos (DEROUICHE e FROTSHER, 2001). As projeções citoplasmáticas astrocitárias têm a capacidade de alterarem rapidamente os seus volumes, regulando, assim, o ambiente perissináptico (HANSON e RÖNNBÄCK, 1995). Assim, há evidências de que tais projeções astrocitárias sejam de grande importância na modulação da excitabilidade neuronal e, conseqüentemente, na transmissão nervosa (KANG et al., 1998; GROSCHE et al., 1999; ARAQUE e PEREA, 2004), conferindo a essas células um alto grau de sensibilidade a mudanças no microambiente do neurópilo (CASTONGUAY et al., 2001). Ou seja, os astrócitos possuem uma influência direta na estabilização e manutenção de contatos sinápticos, fornecendo, assim, um microambiente favorável ao processo de regeneração dos neurônios lesionados (EMIRANDETTI et al., 2006).
Acredita-se que os astrócitos, através de suas amplas funções, bem como da plasticidade (reestruturação) de suas projeções citoplasmáticas, sejam elementos fundamentais nos processos de plasticidade sináptica após uma lesão nervosa (ALDSKOGIUS et al., 1999). Paralelamente às alterações observadas nos motoneurônios axotomizados, os astrócitos também apresentam alterações morfológicas e funcionais características, que em conjunto, são denominadas de astrogliose, gliose reativa ou astrogliose reativa (McGRAW et al., 2001; PEKNY, 2001). Entre as mudanças celulares está o aumento da expressão de GFAP (ECHEVERRY et al., 2007), constituinte da rede de filamentos intermediários dos
astrócitos concomitantemente ao aumento do RNAm dessa proteína (TETZLAFF
et al., 1988).
Em reposta à lesão nervosa, os astrócitos também aumentam a expressão de moléculas de MHC I, de maneira semelhante aos neurônios axotomizados, o que parece ter importante função no processo de eliminação sináptica. A importância deste fenômeno foi verificado por OLIVEIRA et al. (2004), onde descreveram que camundongos deficientes para a expressão de MHC I apresentavam uma astrogliose reativa mais intensa após axotomia. Dessa forma, pode-se inferir que a expressão de moléculas de MHC I é capaz de influenciar o nível de resposta astroglial após a lesão, interferindo, portanto, no processo de plasticidade e regeneração sináptica (REIER et al., 1989).
Como a expressão da proteína GFAP é aumentada, caracteristicamente, em astrócitos próximos de motoneurônios lesionados (GRAEBER e KREUTZBERG, 1986; NORTON, 1999), esta se constitui num eficiente marcador de seus processos citoplasmáticos (PEKNY, 2001).
1.5 Complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) no Sistema Nervoso Central
O complexo MHC I é um heterodímero formado por uma cadeia polipeptídica alfa e outra cadeia beta, além de uma subunidade, a microglobulina beta 2 (THORSBY, 1999). Estas moléculas são proteínas transmembrana polimórficas encontradas na superfície de quase todas as células nucleadas (PLOEGH et al., 1981). BABBIT et al. (1985) propuseram que no SNC intacto, a expressão do MHC I é variável, sendo normalmente baixa. Em contraposição, HUH et al. (2000) observaram a expressão de moléculas MHC I em várias populações neuronais e, em seu estudo, apesar dos mecanismos intrínsecos do processo de plasticidade do SNC serem ainda virtualmente desconhecidos, propuseram um mecanismo envolvendo a expressão de MHC I. Esses autores demonstraram que camundongos transgênicos, incapazes de expressar MHC I, apresentavam uma falha no processo de segregação das aferências provenientes da retina para o corpo geniculado lateral, durante o desenvolvimento do sistema visual. Com esta observação os autores chegaram à conclusão de que o sinal proveniente do MHC I, produzido tanto pelos neurônios quanto pela glia circunjacente, é de fundamental importância para a remoção de conexões sinápticas extranumerárias durante o desenvolvimento do sistema visual.
Alguns estudos mostram que o trofismo do tecido nervoso também pode estar relacionado com a interação entre os neurônios e os linfócitos (HAMMARBERG et al., 2000). O reconhecimento dos antígenos pelos linfócitos T
é mediado por moléculas de MHC I. Os genes de MHC classe I são induzíveis em células gliais e neurônios durante infecções virais, inflamação, tumores e exposição à citocinas, como por exemplo, interferon-beta (IFN-β) (ZANON e OLIVEIRA, 2006). Esses mesmos autores demonstraram que o tratamento com IFN-β em camundongos C57BL/6J não interfere no nível basal de MHC I e não levou a qualquer efeito colateral que pudesse ser detectado em termos de mudanças comportamentais e morfológicas. Por outro lado, após uma axotomia do nervo isquiático, esses animais apresentavam uma elevação de 40% da expressão de MHC I em relação aos animais não tratados com IFN-β.
OLIVEIRA et al. (2004) investigaram a hipótese de que a eliminação sináptica após axotomia fosse, pelo menos em parte, dependente da presença do MHC I. Para isso, realizaram a transecção do nervo isquiático em camundongos deficientes para a expressão da proteína microglobulina beta-2, uma subunidade do complexo de MHC I. Uma semana após a lesão, os motoneurônios foram identificados e os terminais sinápticos em contato com o corpo celular analisados em nível ultraestrutural, calculando-se assim, a cobertura sináptica remanescente. Os resultados obtidos indicaram que os animais deficientes para a microglobulina beta-2 apresentaram uma maior eliminação sináptica, principalmente de terminais inibitórios, em comparação com os animais controle, indicando que em animais adultos, após uma lesão nervosa, o MHC I desempenha um papel fundamental na estabilização seletiva das sinapses inibitórias, contribuindo para que o processo de retração sináptica ocorra de forma específica. Tais alterações podem ter implicações funcionais, como por exemplo, o aumento de morte neuronal e/ou
diminuição da capacidade regenerativa dos neurônios lesionados (OLIVEIRA et
al., 2004). SABHA et al. (2008) propuseram que a expressão precoce de MHC I
promove eventos de plasticidade sináptica logo após a lesão, permitindo que os neurônios concentrem seu metabolismo na regeneração axonal, uma vez que ocorre uma redução significativa dos “inputs” pré-sinápticos. Esses mecanismos podem ter grande importância para a determinação da capacidade regenerativa axonal do neurônio axotomizado entre as linhagens MDX e C57BL/10.
1.6 Distrofia Muscular de Duchenne
As distrofias musculares fazem parte de um grupo de doenças degenerativas do sistema muscular, as quais são caracterizadas por degeneração muscular e alterações estruturais na junção neuromuscular. A forma mais comum é a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) (WHITEHEAD et al., 2006), que atinge aproximadamente 1 em cada 3500 nascidos vivos (BALABAN et al., 2005; JUDGE
et al., 2005; WITHEHEAD et al., 2006; RADLEY et al., 2007). É uma doença
determinada geneticamente onde o cromossomo X apresenta mutações na região Xp21 que codifica o gene responsável pela produção da distrofina (PEARCE, 2005).
A distrofina é uma proteína que está localizada adjacente ao sarcolema dos miócitos (ARAHATA et al., 1988; CHELLY et al., 1988; CARRETTA et al., 2001). Junto com o complexo glicoproteína-distrofina, tem as funções de manter as
ligações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, manter a integridade da membrana celular, distribuição de forças laterais entre as fibras musculares e comunicar o meio intra e extracelular (LOWE et al., 2006). A sua ausência é caracterizada por degeneração progressiva e fraqueza da musculatura esquelética, e uma inabilidade de reparação adequada do tecido muscular, sendo que este vai sendo substituído gradualmente por tecido adiposo e conectivo (WHITEHEAD et al., 2006).
A DMD é normalmente diagnosticada entre 2 e 5 anos de idade (BALABAN
et al., 2005) é inexoravelmente fatal e geralmente os pacientes morrem por volta
da segunda década de vida, devido ao comprometimento do músculo cardíaco e/ou do diafragma (JUDGE et al., 2005; WHITEHEAD et al., 2006).
A distrofia muscular de Duchenne é caracterizada, em camundongos MDX (sigla em inglês para distrofia muscular com mutação no cromossomo X), por um conjunto de degeneração de fibras musculares com intenso infiltrado inflamatório (NONAKA, 1998). A mionecrose nos camundongos MDX, frequentemente é precedida por um colapso e desprendimento do sarcolema da lâmina basal e subsequente degeneração da fibra muscular associada com extenso processo inflamatório. Macrófagos, linfócitos T CD4+ e T CD8+ representam os principais constituintes da população de células inflamatórias que cercam o processo de degeneração das miofibras (McDOWALL et al., 1990; SPENCER et al., 2001). Nesse aspecto, LAGROTA-CANDIDO et al. (2002) demonstaram que, durante o processo de degeneração muscular, há um acúmulo de células T CD4+ e TCD8+
nos músculos esqueléticos de camundongos MDX com 4 semanas de vida. Além disso, durante o período de regeneração muscular, há proliferação de linfócitos B e produção de IFN-β pelos linfócitos.
Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular ao longo do curso da DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no SNC, mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, os terminais axonais entram num ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). Este ciclo pode repercutir de forma retrógrada nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, ou seja, após uma lesão que resulte na interrupção do contato entre o motoneurônio com suas fibras musculares alvo, uma série de alterações ocorre no corpo celular do neurônio (como por exemplo, presença de edema no corpo celular, deslocamento do núcleo para a periferia do corpo celular e a diminuição da eletrondensidade juntamente com a dissolução dos corpúsculos de Nissl), sendo, em conjunto, denominadas cromatólise (ROMANES, 1946; LIEBERMAN, 1971; ALDSKOGIUS e SVENSSON, 1993).
PASTORET e SEBILLE (1994) demonstraram que, em camundongos MDX, a partir da segunda semana de vida algumas alterações nas fibras musculares são detectadas, como por exemplo, núcleo central (indicativo de regeneração da fibra muscular após uma degeneração) e infiltrados celulares. Isso ocorre, provavelmente, devido ao primeiro ciclo de degeneração/regeneração muscular. Na terceira semana de vida, essas alterações são disseminadas na maioria dos
músculos. Esses mesmos autores mostraram que na sexta semana de vida os músculos dos membros posteriores possuem por volta de 50% das suas fibras musculares com núcleos centrais.
No SNC de humanos e macacos a expressão da distrofina foi demonstrada por HUARD et al. (1992) no cerebelo, no córtex cerebral, no hipocampo e na medula espinhal. No entanto, LIDOV et al. (1993) demonstraram que nos camundongos a distrofina é expressa quase que exclusivamente nas células piramidais e nos demais neurônios do córtex cerebral e nas células de Purkinje. SBRICCOLI et al. (1995) sugeriram que a distrofina localizada no SNC tem uma importante função no desenvolvimento e manutenção nas propriedades estruturais e funcionais nas interligações entre os neurônios. Uma evidência de conexões anormais em cérebro de camundongos MDX adultos foi demonstrada, primeiramente, por CARRETTA et al. (2001).
SBRICCOLI et al. (1995) demonstraram que em camundongos MDX há uma diminuição do número de axônios do tracto córtico-espinhal. Essa alteração no tracto córtico-espinhal pode ser justificada através do papel desempenhado pela distrofina no córtex cerebral e pela completa perda da sua expressão no cérebro dos camundongos MDX. Ou seja, ela desempenha um importante papel na migração e maturação das células neuronais no córtex cerebral.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
O presente estudo teve como objetivo investigar, através de técnicas de imunoistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão, a cobertura sináptica dos motoneurônios alfa-medulares e a resposta astrocitária no microambiente medular em camundongos MDX com 6 semanas de vida submetidos à axotomia do nervo isquiático. Sabe-se que nessa idade os camundongos MDX apresentam grande quantidade de fibras musculares com presença de núcleo não periférico (característica de processos de regeneração muscular após ciclos de degeneração). Esses ciclos de degeneração muscular promovem uma desconexão parcial entre a fibra nervosa e a fibra muscular simulando, assim, uma lesão nervosa periférica parcial a qual pode repercutir, de forma retrógrada, diretamente sobre os corpos dos neurônios responsáveis pela inervação dessas fibras musculares degeneradas.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar a expressão de GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) na coluna anterior da medula espinhal em camundongos MDX e C57/BL10 (grupo controle) uma semana após a transecção do nervo isquiático;
Analisar, através de microscopia eletrônica de transmissão, a retração sináptica nos motoneurônios alfa-medulares nas duas linhagens, uma semana após a transecção do nervo isquiático;
Analisar a expressão de moléculas de MHC I sobre os processos de astrogliose reativa e plasticidade sináptica no microambiente medular após axotomia.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Grupos de animais
Para este estudo foram utilizados camundongos C57BL/10 e MDX (20-25g), machos com 6 semanas, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas. Os animais foram agrupados em gaiolas plásticas, com livre acesso à ração e água ad libitum, com controle de luminosidade (ciclo claro/escuro de 12h) e a uma temperatura de 21ºC. Os experimentos foram conduzidos seguindo-se as normas de ética na experimentação animal.
Os animais foram mantidos em Biotério próprio do Departamento de Anatomia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética na Experimentação Animal – CEEA – IB – Unicamp, protocolo número 1317-1.
Os grupos experimentais foram divididos de acordo com a linhagem e a técnica experimental utilizada, totalizando quatro grupos, como mostra a tabela abaixo (Tabela 1).
3.2 Transecção do nervo isquiático
Os camundongos foram anestesiados por injeção intra-peritoneal em condições de assepsia com cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (100mg/kg e 5mg/kg, i.p, respectivamente). Após a tricotomia da face posterior da coxa esquerda, foi realizada a incisão da pele (aproximadamente 1,5cm de comprimento) na região média da coxa, utilizando-se um bisturi. A pele e a musculatura da coxa foram cuidadosamente afastadas, expondo-se o nervo isquiático para realização da transecção ao nível do forame obturado. A secção foi realizada com uma microtesoura, sendo removido um segmento de 2mm do coto distal do nervo isquiático. O coto distal foi então desviado de sua direção natural com o intuito de evitar um realinhamento entre os cotos. A musculatura foi então reposicionada e a pele suturada com fio de sutura (ETHICON, mononylon 8-0). Após a cirurgia os camundongos foram mantidos no biotério do Departamento de Anatomia do Instituto de Biologia da Unicamp até o momento do sacrifício.
3.3 Eutanásia dos animais sete dias após a transecção do nervo isquiático e processamento da medula espinhal para imunoistoquímica
Os animais foram submetidos à eutanásia sete dias após a transecção do nervo isquiático com uma overdose de anestésico e em seguida submetidos à toracotomia. Visando a lavagem total dos vasos e órgãos, os animais foram perfundidos por via intra-cardíaca, com auxílio de uma bomba perfusora do tipo peristáltica contendo 20 ml de solução de salina tamponada e heparinizada (NaCl 0,9% em PB, pH 7,38). A fixação foi realizada pela subseqüente perfusão de 20ml de formalina a 10% em tampão fosfato de sódio 0,1M; pH 7,38.
Posteriormente à fixação, o conjunto contendo a intumescência lombar e raízes nervosas, foi extraído e dissecado e imersos na mesma solução fixadora utilizada na perfusão durante 12 horas a uma temperatura de 4ºC.
3.4 Imunoistoquímica
Seguindo-se a perfusão de solução salina tamponada e heparinizada, foi realizada a perfusão com formalina a 10% em tampão fosfato de sódio 0,1M; pH 7,38.
Passadas 12 horas de fixação em temperatura de 4º C, as medulas foram incluídas, com a extremidade caudal voltada para baixo, em Tissue-Tek (Miles
Inc., USA) e congeladas a – 40º C em isopentano resfriado em nitrogênio líquido. Dos blocos congelados com o material, foram obtidos cortes histológicos em criostato com 12μm de espessura. Uma vez estabelecido o nível do agrupamento de neurônios localizados na porção dorso-lateral da coluna ventral da medula espinhal, as secções foram transferidas para lâminas silanizadas e estocadas a – 20º C até a realização das imunomarcações.
Anteriormente à realização da imunoistoquímica, as lâminas foram climatizadas em temperatura ambiente, sendo então, em seguida, imersas e lavadas por três vezes em PB 0,01M, pH 7,4. Posteriormente, as lâminas foram incubadas em câmara úmida, onde os anticorpos primários foram aplicados, sendo o período de incubação variando de 12 a 18 horas, a uma temperatura de 4º C. Os anticorpos primários utilizados foram: cabra anti-GFAP (1:100, Santa Cruz); coelho anti-sinaptofisina (1:100, Dako) e rato anti-MHC I (1:100, Península).
Em seqüência à primeira incubação, as lâminas foram lavadas novamente em PB 0,01M, pH 7,4 (3 x 5 minutos) e, posteriormente, incubadas por uma hora com os adequados anticorpos secundários: coelho-CY-2, cabra ou anti-rato-CY-3 (Jackson Lab., USA; 1:250) diluídos em PBS/BSA por uma hora, em câmara úmida e temperatura ambiente. Os espécimes foram lavados novamente em PB 0,01M, pH 7,4, e montados com lamínula em glicerol/PB 0,01 (3:1) e armazenados em freezer, sob temperatura de -20º C.
3.4.1 Análise quantitativa dos resultados
As lâminas imunomarcadas foram observadas em microscópio invertido de fluorescência (Nikon TS100) acoplado a um sistema de fluorescência (Nikon – DMX1200F), utilizando-se filtros para fluoresceína (CY-2) e rodamina (CY-3). Foram capturadas três imagens representativas ipsilaterais e três imagens do lado contralateral da região ventral da medula espinhal de cada animal, com objetiva de 20x. Os níveis de brilho e contraste foram ajustados de forma padronizada utilizando o software Adobe Photoshop 6.0. Para cada imagem, quantificou-se, de forma sistemática, a densidade integrada de pixels em oito áreas representativas do núcleo motor lateral da medula espinhal ao redor dos motoneurônios, utilizando-se o software IMAGE-J (versão 1.33u, National Institutes of Health, USA). Calculou-se a média aritmética para essas oito medidas e, a partir da média da densidade integrada de pixels em cada lado da medula foi calculada a razão lado lesionado/lado não lesionado para cada secção medular analisada. Calculou-se, então, a média aritmética das razões sendo os resultados apresentados como média ± erro padrão.
3.4.2 Análise estatística
A partir dos valores obtidos, a média e o erro padrão em cada grupo experimental foram calculados. Os dados foram classificados como paramétricos e para sua comparação foi utilizado o teste t de Student, assumindo-se p<0,05 (*),
p<0,01 (**) e p<0,001(***) e utilizando-se as funções estatísticas do programa BioEstat.
3.5 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Nesta técnica foi utilizado fixador contendo glutaraldeído (2%) e paraformaldeído (1%) em PB 0,1M, pH 7,4.
Após a permanência das medulas espinhais lombares por 12 horas em temperatura de 4º C, estas foram lavadas três vezes em PB 0,01M, pH 7,4 e seccionadas longitudinalmente, através da fissura mediana anterior da medula espinhal. Os fragmentos colocados individualmente em frascos contendo PB, foram pós-fixados, por um período de duas horas, em solução de tetróxido de ósmio a 1%, diluído em PB 0,1M, pH 7,4.
Seguindo-se a pós-fixação, os fragmentos foram lavados em água destilada e desidratados em série crescente de álcool e acetona, sendo incluídos em resina (Epon, EMS).
Os blocos foram desbastados e secções semi-finas (0,5μm) obtidas e coradas com azul de toluidina (AT) 0,25% para a observação ao microscópio óptico (Figura 1).
Figura 1 – Fotomicrografias de secções semi-finas coradas com Azul de Toluidina (AT), em
aumento de 20X. Motoneurônios alfa-medulares ipsilaterais (IL) da coluna ventral da medula espinhal (Figuras 1A e 1C) e contralaterais (CL) à axotomia (Figuras 1B e 1D) são evidenciados. As setas indicam os corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares. Escala = 50μm.
Após a identificação da coluna anterior da coluna, os blocos foram retrimados para o isolamento da região contendo os motoneurônios a serem analisados. Em seguida, foram realizados cortes ultrafinos com espessura de 50nm (500Å: ultramicrótomo Leica Ultracut UCT). Esses cortes foram coletados em telas de cobre (“single slot grids”) recobertas com formvar e contrastados com acetato de
uranila 6% e citrato de chumbo. Os espécimes foram observados e documentados em microscópio eletrônico de transmissão (Leo 906), operando a 60KV.
3.5.1 Análise das secções ultrafinas
Neurônios com grandes corpos celulares (>35μm de diâmetro), encontrados no grupo motor lateral da coluna ventral da medula espinhal foram identificados como motoneurônios alfa medulares pela presença de pelo menos um terminal do tipo C (CONRADI, 1969). Os neurônios identificados como axotomizados, baseados na ocorrência de modificações cromatolíticas no corpo celular, tiveram a sua superfície digitalizada seqüencialmente com um aumento de 12.930X empregando-se uma vídeo câmera (MORADA) conectada a um sistema computadorizado (Zeiss). As imagens foram montadas seqüencialmente no software Adobe Photoshop 6.0.
Os terminais sinápticos em contato com o corpo celular dos motoneurônios foram identificados (F, S e C, segundo CONRADI, 1969) e quantificados por 100μm de membrana, pela porcentagem de cobertura da membrana e pelo número de terminais pré-sinápticos parcialmente retraídos. Também foram medidas as distâncias, na superfície neuronal, entre dois terminais pré-sinápticos consecutivos. Foram analisados 60 motoneurônios alfa medulares (quatro por animal, em 3 grupos de cinco animais: sem lesão – somente o lado esquerdo –, contralateral e ipsilateral à lesão).
4.0 RESULTADOS
4.1 Expressão de MHC I após axotomia do nervo isquiático
A expressão de MHC I foi mensurada sete dias após a axotomia. Na Figura 2 observa-se a imunorreatividade na região do núcleo motor lateral na coluna ventral da medula espinhal. Também é possível observar que a expressão basal de MHC I é baixa (contralateral à lesão) e, geralmente, está restrita às regiões perivasculares (Figura 2B e 2D).
Os resultados, apresentados em densidade integrada de pixels, revelaram um aumento diferencial da expressão de MHC I, nas duas linhagens. As Figuras 2A e 2C representam o lado ipsilateral à lesão (C57BL/10 e MDX, respectivamente). A expressão de MHC I foi significativamente superior na linhagem C57BL/10, com um aumento aproximado de 37% em relação à linhagem MDX (C57BL/10, 24,34 ± 1,06, média + EP; MDX, 18,90 ± 0,60; p<0,05, Figura 2). Tendo-se em vista o possível papel do MHC I na sinalização entre os terminais pré-sinápticos e os neurônios motores, bem como na comunicação destes com a glia, a maior expressão de MHC I nos camundongos C57BL/10 pode favorecer o processo de regeneração em relação aos camundongos MDX.
Figura 2 – Imunomarcação anti-MHC I uma semana após axotomia. Figuras 2B-D, mostrando o
lado contralateral (CL) da coluna ventral da medula espinhal dos grupos axotomizados. Note uma menor expressão de MHC I nos dois grupos. As setas indicam os corpos celulares dos motoneurônios. Figuras 2A-C, mostrando o lado ipsilateral (IL) da coluna ventral da medula espinhal à lesão, mostrando aumento da expressão nas duas linhagens (indicado nas áreas demarcadas). Na linhagem C57BL/10, a marcação foi mais intensa ao redor dos neurônios, bem como no neurópilo adjacente. Escala = 50μm. (* = p<0,05)
Notadamente, a marcação para MHC I se mostrou restrita ao neurópilo (espaço entre os vasos e os corpos de neurônios e das células neurogliais – MACHADO, 2000) adjacente e à superfície dos motoneurônios axotomizados, indicando uma resposta à lesão tanto dos neurônios quanto da glia.
4.2 Imunorreatividade para sinaptofisina
A imunorreatividade da proteína sinaptofisina no núcleo motor lateral da coluna ventral da medula espinhal, sete dias após a axotomia do nervo isquiático, está demonstrada na Figura 3. Na Figura 3B destaca-se a marcação adjacente ao corpo celular dos grandes motoneurônios, onde foi possível observar uma densa reatividade a qual é atribuída ao grande número de sinapses com outros neurônios do SNC. Entretanto, nenhuma distinção da natureza dessas sinapses é possível nesse nível, uma vez que todo terminal pré-sináptico ativo apresenta em seu interior vesículas contendo sinaptofisina. Porém, é possível a realização de uma estimativa da cobertura sináptica em relação à membrana do motoneurônio baseando-se no nível da imunomarcação para sinaptofisina, como foi descrito por OLIVEIRA et al. (2004).
O lado sem lesão da linhagem MDX apresentou uma intensidade de expressão de sinaptofisina bastante reduzida, aproximadamente 27%, em relação ao mesmo lado na linhagem C57BL/10 (MDX, 7,24 ± 0,29; C57BL/10, 9,16 ± 0,36; p<0,05, Figura 3D - B, respectivamente).
Figura 3 – Imunomarcação anti-sinaptofisina uma semana após axotomia. Figuras 3B-D
mostrando o lado contralateral (CL) da coluna ventral da medula espinhal. Note a menor cobertura sináptica na linhagem MDX em relação à linhagem C57BL/10, confirmada pela análise quantitativa representada pelo gráfico F. Figuras 3A-C, lado ispsilateral (IL), uma semana após axotomia, mostrando uma diminuição geral da expressão da sinaptofisina ao redor dos neurônios axotomizados. Figuras 3E-G, análise quantitativa da densidade integrada de pixels entre os lados esquerdos e entre a razão ipsi/contralateral das duas linhagens, respectivamente. Note que entre os lados esquerdos há uma diferença significativa de cobertura sináptica entre os grupos, tendo o MDX uma perda maior que o C57BL/10. No gráfico G a razão entre os lados ipsi/contralateral mostra que não há diferença significativa entre os grupos. Figura H, esquema ilustativo das áreas amostradas na quantificação da imunomarcação anti-sinaptofisina. Escala = 50μm. (** = p<0,01).
Ao analisarmos a expressão de sinaptofisina ipsilateral à lesão observamos que a densidade da imunomarcação na linhagem MDX é significativamente menor, em torno de 34%, em relação à linhagem C57BL/10 (MDX, 4,25 ± 0,30; C57BL/10, 5,69 ± 0,28; p< 0,05, Figuras 3C–A respectivamente). No entanto, ao analisarmos a razão ipsi/contralateral uma semana após a axotomia, podemos constatar que não houve diferença significativa entre as linhagens pesquisadas (MDX, 0,60 ± 0,02; C57BL/10, 0,63 ± 0,02; p>0,05, Figura 3G).
4.3 Astrogliose reativa após axotomia
A Figura 4 mostra a imunorreatividade das linhagens estudadas para GFAP. As imunomarcações foram utilizadas para analisar o grau de astrogliose reativa ao nível do núcleo motor lateral da coluna ventral da medula espinhal após axotomia do nervo isquiático.
Contralateral à lesão, a linhagem C57BL/10 mostra ocorrência de menor imunorreatividade, demonstrando a presença de prolongamentos astrocitários GFAP-positivos no microambiente próximo aos grandes motoneurônios do nervo isquiático. Já na linhagem MDX, contralateral à lesão, a imunomarcação foi, aproximadamente 49,5% maior em relação ao mesmo lado na linhagem C57BL/10 (MDX, 7,09 ± 0,35; C57BL/10, 4,75 ± 0,22; p<0,001, Figuras 4C-A, respectivamente). Nos segmentos medulares afetados pela axotomia do nervo isquiático foi evidenciado um aumento significativo na atividade dos astrócitos,
sendo demonstrado pela presença de astrogliose. Isso foi evidenciado com destaque na linhagem MDX, que teve uma reatividade, aproximadamente, 65,2% maior em relação ao C57BL/10 (MDX,16,00 ± 1,06; C57BL/10, 9,70 ± 0,43; p<0,001, Figura 4D-B, respectivamente). No entanto, ao analisarmos a razão ipsi/contralateral uma semana após a axotomia, podemos constatar que não houve diferença significativa entre as linhagens pesquisadas (MDX, 2,30 ± 0,06; C57BL/10, 2,10 ± 0,07; p>0,05, Figura 3).
Figura 4 – Imunomarcação anti-GFAP uma semana após axotomia do nervo isquiático. Figuras
4B-D, contralateral (CL) à lesão. Note um aumento da astrogliose na linhagem MDX em relação à linhagem C57BL/10, confirmada pela análise quantitativa representada pelo gráfico F. Figuras 4A-C, ipsilateral (IL) uma semana após a axotomia. Observe o aumento da imunomarcação especialmente ao redor dos motoneurônios axotomizados, indicando uma possível comunicação entre os neurônios lesionados e a glia. Observe que esse fenômeno está mais proeminente na linhagem MDX. As setas indicam os corpos celulares dos motoneurônios. Escala = 50μm. (*** = p<0,001).
4.4 Alterações ultraestruturais na medula espinhal após axotomia
As fotomicrografias eletrônicas referentes a cada motoneurônio estudado foram montadas seqüencialmente, conforme mostra a Figura 5. Após a reconstrução dos motoneurônios, os seus terminais pré-sinápticos foram classificados (botões tipo F, S ou C).
Figura 5: Sequência de fotomicrografias eletrônicas utilizadas para a reconstrução de um
Foram considerados para o estudo, apenas os motoneurônios identificados como alfa pela presença de pelos menos um terminal pré-sináptico colinérgico (tipo C) em aposição à superfície da membrana neuronal.
A localização dos neurônios estudados na medula espinhal e as diferenças ultraestruturais entre os grupos sem lesão, controle e axotomizado estão demonstradas nas Figuras 6 e 7.
Figura 6: Localização e ultraestrutura da superfície de motoneurônios alfa medulares. A – desenho
esquemático de um segmento lombar da medula espinhal demonstrando o núcleo motor lateral onde se encontram os motoneurônios que fazem parte da constituição do nervo isquiático. Em detalhe, um motoneurônio (Mn) com terminais pré-sinápticos (T) em aposição à membrana neuronal. B – cobertura de um neurônio não lesionado da linhagem C57BL/10. C – cobertura sináptica de um neurônio não lesionado da linhagem MDX. Note algumas retrações e projeções astrocitárias (setas) entre os terminais e a membrana do neurônio. Aumento: 12930X. Escala = 2μm.
Figura 7: Ultraestrutura da superfície de motoneurônios alfa medulares uma semana após a
axotomia do nervo isquiático. A – cobertura sináptica de um neurônio do grupo C57BL/10 contralateral à lesão (controle). B – cobertura sináptica de um neurônio do grupo MDX contralateral. Note que há algumas retrações e projeções astrocitárias (setas) entre a membrana neuronal e os terminais parcialmente retraídos. C – cobertura sináptica de um neurônio do grupo C57BL/10 axotomizado (Ipsilateral à lesão). As retrações e projeções astrocitárias nesse grupo encontram-se aumentadas de forma significativa em relação ao lado contralateral da mesma linhagem uma semana após a lesão. D – neurônios axotomizados (Ipsilateral à lesão) da linhagem MDX, uma semana após a lesão. Aumento: 12930X. Escala = 2μm.
A análise ultraestrutural dos espécimes provenientes dos animais não operados (sem lesão) revelou uma ampla cobertura sináptica da membrana neuronal (Figuras 6B e 6C). Porém, na linhagem MDX foram observadas algumas alterações ultraestruturais ao redor dos motoneurônios alfa medulares (Figura 6C). Uma semana após a axotomia do nervo isquiático, evidentes alterações ultraestruturais foram observadas no microambiente adjacente aos motoneurônios alfa-medulares. Além disso, os neurônios afetados apresentaram alterações que indicavam cromatólise, como por exemplo, o deslocamento do núcleo para a periferia do corpo neuronal e diminuição da eletrondensidade do citoplasma, compatível com a dissolução dos corpúsculos de Nissl.
Após a lesão, muitos terminais pré-sinápticos estavam parcialmente ou totalmente retraídos. Projeções gliais delgadas também foram frequentemente identificadas em contato com a membrana pós-sináptica, preenchendo o espaço entre os terminais sinápticos e a membrana pós-sináptica. Essas estruturas foram identificadas como astrócitos devido a sua baixa eletrondensidade.
4.4.1 Cobertura sináptica total
A análise quantitativa mostrou uma redução da cobertura sináptica nos grupos lesados (ipsilateral à lesão) e, também, nos grupos MDX sem lesão (não operados) e MDX controle (contralateral à lesão). As diferenças foram mais expressivas para o grupo MDX lesado (34,51 ± 1,74 p<0,01) em relação ao grupo C57BL/10 lesado (42,14 ± 2,05), resultando, portanto, 18% menor cobertura sináptica em relação à linhagem C57/BL10. Nos grupos sem lesão e controle, a linhagem MDX apresentou cobertura sináptica significativamente menor em relação à linhagem C57BL/10 (MDX sem lesão, 41,32 ± 2,29; C57BL/10 sem lesão, 54,01 ± 1,59 p<0,001 e MDX controle, 40,42 ± 2,29; C57BL/10 controle, 55,16 ± 2,69, p<0,001, Figura 8A). Ainda no estudo comparativo, ao se analisar os grupos MDX sem lesão e MDX controle os mesmos não apresentaram diferença estatística (Figura 8A). Porém, quando esses grupos foram comparados ao grupo MDX lesado os resultados mostraram uma significativa redução de cobertura sináptica nos animais lesados (MDX sem lesão, 41,32 ± 2,29; MDX lesado, 34,51 ± 1,74 p<0,01 e MDX controle, 40,42 ± 2,29; MDX lesado, 34,51 ± 1,74 p<0,05, Figura 8A). Na linhagem C57/BL10 foi observado resultado estatístico semelhante ao encontrado na linhagem MDX, quando comparados os grupos sem lesão e controle (Figura 8A). Ao se analisar as comparações entre os grupos lesado e sem lesão, e lesado e controle, pôde-se constatar menor cobertura sináptica com diferença significativa (p<0,001 e p<0,05, respectivamente, Figura 8A).
Figura 8: Análise quantitativa da ultraestrutura das sinapses e da análise quantitativa da
ultraestrutura do número de terminais sinápticos/100µm. A – mostra em porcentagem, a cobertura sináptica nos grupos sem lesão, controle (CL) e lesado (IL) nas duas linhagens estudadas. B – apresenta o número de terminais pré-sinápticos em aposição em 100μm de membrana neuronal entre os grupos sem lesão, controle (CL) e lesado (IL) nas duas linhagens estudadas.
4.4.2 Número de terminais pré-sinápticos/100 µm de membrana neuronal
O número de terminais pré-sinápticos/100 µm em aposição com a membrana neuronal no grupo MDX lesado foi significativamente menor em relação ao grupo C57BL/10 lesado (MDX lesado, 33,50 ± 0,83 terminais/100μm de membrana neuronal; C57BL/10 lesado, 39,30 ± 0,49, p<0,001, Figura 8B). Nos grupos sem lesão e controle (contralateral à lesão), a linhagem MDX apresentou significativa diminuição de terminais em aposição com a membrana em relação à linhagem C57BL/10 (MDX sem lesão, 44,54 ± 0,75; C57BL/10 sem lesão, 50,30 ± 0,74, p<0,001 e MDX controle, 43,72 ± 0,55; C57BL/10 controle, 48,57 ± 0,49, p<0,001, Figura 8B). Ao se analisar os grupos MDX sem lesão e MDX controle os mesmos não apresentaram diferença estatística (Figura 8B). No entanto, quando estes foram comparados ao grupo MDX lesado os resultados mostraram uma
significativa diminuição de terminais sinápticos nos animais lesados (MDX sem lesão, 44,54 ± 0,75; MDX lesado, 33,50 ± 0,83 p<0,001 e MDX controle, 43,72 ± 0,55; MDX lesado, 33,50 ± 0,83 p<0,001, Figura 8B). A análise entre os grupos sem lesão e controle na linhagem C57/BL10 mostrou resultado estatístico semelhante ao encontrado na linhagem MDX (Figura 8B). Já a comparação entre os grupos sem lesão e controle com o grupo lesado, na linhagem C57BL/10, pôde-se constatar diferenças significativas com menor número de terminais no grupo lesado (C57BL/10 sem lesão, 50,30 ± 0,74, C57BL/10 lesado, 39,30 ± 0,49, p<0,001 e C57BL/10 controle, 48,57 ± 0,49, C57BL/10 lesado, 39,30 ± 0,49, p<0,001, Figura 8B).
Tabela 2: Comparação entre as médias da % Total de Cobertura Sináptica, computadas através
da quantificação dos terminais pré-sinápticos em aposição com a membrana neuronal. Abaixo de cada média, as letras maiúsculas indicam a significância estatística da comparação entre as médias obtidas nos 6 grupos experimentais. As médias com letras iguais não são estatisticamente diferentes dentro de um nível de significância de 0,05 adotado no Teste t de Student.
Tabela 3: Comparação entre as médias do Número de Terminais em Aposição/100µm,
computadas através da quantificação do número de terminais pré-sinápticos em aposição em 100µm da membrana neuronal. Abaixo de cada média, as letras maiúsculas indicam a significância estatística da comparação entre as médias obtidas nos 6 grupos experimentais. As médias com letras iguais não são estatisticamente diferentes dentro de um nível de significância de 0,05 adotado no Teste t de Student.
A cobertura sináptica de cada tipo de terminal e o número de terminais (F, S e C) pré-sinápticos em aposição em 100μm de membrana neuronal foram calculados e estão representados na Figura 9.
