Influência da desinfecção por energia de microondas em biofilme multiespécies sobre próteses totais

ANDRÉ GAZETTA DE MORAES

INFLUÊNCIA DA DESINFECÇÃO POR ENERGIA

DE MICROONDAS EM BIOFILME

MULTIESPÉCIES SOBRE PRÓTESES TOTAIS

INFLUÊNCIA DA DESINFECÇÃO POR ENERGIA

DE MICROONDAS EM BIOFILME

MULTIESPÉCIES SOBRE PRÓTESES TOTAIS

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia

de

Piracicaba

da

Universidade Estadual de Campinas como

parte dos requisitos exigidos para a

obtenção do título de Mestre em Clínica

Odontológica, na Área de Concentração em

Prótese Dental.

Orientador: Prof. Dr. Wander José da Silva.

Este exemplar corresponde à versão final

Da dissertação defendida pelo aluno André

Gazetta de Moraes e orientado pelo Prof. Dr.

Wander José da Silva.

Dedico este trabalho aos meus queridos pais, Sílvio e Marta, ao meu irmão, Gabriel, às minhas avós, Naide e Mafalda, a minha sobrinha, Sarah, e a Bianca, pessoas que venceram comigo os momentos difíceis por que passei e que compartilharam, neste ano, mais uma etapa importante de sucesso em minha vida: minha formação como Mestre em Prótese Dental.

oportunidade, amizade, atenção, suporte e pela competente orientação e dedicação no desenvolvimento deste trabalho.

Primeiramente, agradeço a Deus por zelar por nossas vidas e pelas oportunidades concedidas em Seu tempo.

À Universidade Estadual de Campinas, por meio de seu reitor Prof. Dr. José Tadeu. À Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas (FOP-UNICAMP), presente como vigente diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha

Henriques.

À Coordenadora dos Cursos de Pós-Graduação da FOP-UNICAMP, Profa. Dra.

Cínthia Pereira Machado Tabchoury.

À Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Clínica Odontológica da FOP-UNICAMP, Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz.

Aos docentes da área de Prótese Dental pelos ensinamentos transmitidos a nós alunos. Aos professores da área de Prótese Parcial Removível pela excelente organização e funcionamento de todo o departamento.

À Área de Bioquímica por ceder o uso dos equipamentos e laboratório para a pesquisa. À Profa. Altair Antoninha Del Bel Cury pelos ensinamentos e oportunidades concedidas.

À Profa. Célia Marisa Rizzatti Barbosa pelo carinho e transmissão de conhecimentos. À Profa. Renata Cunha Matheus Rodrigues Garcia, por ter sido uma ótima professora de graduação e pelo acolhimento inicial na pós-graduação.

Agradeço à Dra. Aline Araújo Sampaio pela parceria, amizade, tempo investido, correções, participações e a apoio nesta pesquisa.

Agradeço à Dra. Samilly Souza Evangelista pela competência, esforços, amizade, apoio, paciência, ensinamentos, dedicação e correções neste trabalho.

À Sra. Gislaine Piton, pela ordem e auxílio referentes ao laboratório de prótese. Agradeço a minha família, queridos pais Sílvio Gomes de Moraes Filho e Marta

Gazetta de Moraes, e companheira Bianca Belotto da Cruz pelos conselhos, alicerces e

paciência.

Agradeço aos amigos de graduação e pós-graduação por estarmos todos juntos nesta longa jornada.

e, embora a Candida albicans seja apontada como o principal agente etiológico, estudos recentes demonstram que sua virulência e patogenicidade é modulada pela presença de bactérias orais. Ao passo que, estudos de métodos de desinfecção de próteses totais devem considerar tal variedade microbiológica dos biofilmes orais. Desta forma, este estudo objetivou avaliar o efeito da irradiação de microondas na desinfecção de próteses totais colonizadas por biofilme multiespécies. Para tal, discos de polimetilmetacrilato (PMMA) foram confeccionados e padronizados quanto à rugosidade superficial. Estes espécimes foram aleatoriamente distribuídos em grupos controle e experimental, sem e com exposição à energia de microondas, respectivamente. Na sequência, sobre a superfície dos espécimes foi desenvolvido biofilme multiespécie, in vitro, composto por Actinomyces naeslunddi, Veillonella díspar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans e Streptococcus oralis e Candida albicans, pelo período de 64,5 horas. Em seguida, os discos foram fixados em bases internas de próteses totais as quais foram imersas em água destilada onde permaneceram por 3 minutos, na ausência de exposição à energia de microondas (grupo controle) ou, submetidos a exposição com potência de 450W por 3 minutos (grupo experimental). Após o tratamento, o número de microrganismos viáveis aderidos às superfícies dos discos foram avaliados pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC). Para análise estrutural do biofilme da superfície dos discos do grupo controle e experimental, foram obtidas imagens por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os dados foram comparados pelo teste T de Student, com nível de significância de 5 %. As contagens de microrganismos totais e individuais foram menores para

o grupo experimental em relação ao controle (p<0,05), comprovado também pelas imagens de MEV, as quais revelaram uma desorganização estrutural do biofilme e menor quantidade de microrganismos na superfície dos discos do grupo experimental e em contrapartida, para o grupo controle o biofilme encontrava-se espesso e organizado. Conclui-se que a irradiação por energia de microondas pode ser utilizada para a desinfecção de próteses totais, já que mostrou ser eficaz em um biofilme multiespécie.

The candidosis is the most common fungal infection in complete denture wearers and Candida albicans is the main etiological agent, although studies have demonstrated that its virulence and pathogenicity are modulated by the presence of oral bacteria and studies of denture disinfection methods do not consider such microbiological variety of oral biofilms. Thus, this study aimed to evaluate the effect of microwave irradiation on the disinfection of complete dentures colonized by multi-species biofilms. For this, polymethylmethacrylate (PMMA) discs were fabricated and standardized regarding its surface roughness. Then, specimens were randomly divided into control and experimental groups without and with exposure to microwave energy, respectively. Multi-species biofilms comprising Actinomyces naeslunddi, Veillonella díspar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis and Candida albicans were developed for 64.5 hours. After this, the discs were fixed in internal bases of dentures which were immersed in distilled water where they remained for 3 minutes in the absence of exposure to microwave energy (control group) or subjected to exposure with power 450 W for 3 minutes (experimental group). After treatment, the number of viable microorganisms adhered to the surfaces of the disks were evaluated by counting the colony forming units (CFU). Structural analysis of the biofilm surface of the discs of control and experimental group were obtained images by scanning electron microscopy (SEM). Data were evaluated by Student’s T test at 5% significance level. The total and individual microorganism counts were lower for the experimental group compared to the control (p<0,05), which was confirmed by SEM images, which revealed structural disruption of the biofilm and lower amount of microrganisms on the surface of the experimental group discs. In contrast, control group showed thick and organized biofilm. It is concluded that irradiation by microwave energy can be used for disinfecting complete dentures, as proved to be effective against to multi-species biofilm.

1 INTRODUÇÃO...11 2 REVISÃO DA LITERATURA...13 3 PROPOSIÇÃO...30 4 MATERIAL E MÉTODOS...31 5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...43 6 RESULTADOS...44 7 DISCUSSÃO...50 8 CONCLUSÃO...53 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...54 ANEXOS Anexo 1 – Estatística Final...57

Anexo 2 – Valores médios dos experimentos realizados...66

Anexo 3 – Imagens Metodologia...67

1 Introdução:

A candidose oral é caracterizada como uma infecção oportunista fúngica, aguda ou crônica, geralmente localizada na língua e/ou mucosas orais. Dentre as três formas clínicas principais (pseudomembranosa, eritematosa e hiperplásica) a mais comum é a pseudomembranosa, que se apresenta como placas brancas irregulares (Robbins & Cotran, 2010). A maioria das infecções ocorre em pacientes diabéticos (Sanita et al., 2012), imunossuprimidos, usuários de antibiótico de amplo espectro e, principalmente, em usuários de próteses bucais e com baixa higiene oral (Banting & Hill, 2001). Em indivíduos imunossuprimidos este quadro pode se tornar mais severo, podendo ocorrer infecção sistêmica e, embora raro, septicemia e consequente risco de vida (Banting & Hill, 2001; Webb et al., 1998).

Em relação a cavidade oral, a candidose oral acomete cerca de 25% a 65% dos usuários de próteses totais, estando envolvidos neste processo Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis (Webb et al., 1998), além de outros microrganismos dos gêneros Streptococcus, Lactobacillus, Bacteroides e Actinomyces (Webb et al., 1998). A adesão de microrganismos nas próteses totais facilita a colonização dos microrganismos no palato, ocasionando eritema e dano das mucosas sob estas próteses (Campanha et al., 2007; Sanitá et al., 2008). O tratamento da candidose oral é acompanhado da adequada higienização das próteses totais, que funcionam como reservatórios de microrganismos oportunistas, uma vez que resinas acrílicas apresentam irregularidades e poros em suas superfícies, que abrigam estes microrganismos e detritos, dificultando a adequada remoção por escovação mecânica (Lucena-Ferreira et al., 2014). Assim, a energia de microondas tem sido recomendada como método complementar de desinfecção das próteses.

Além da candidose oral, usuários de próteses possuem um maior risco de desenvolvimento de cáries e doenças periodontais nos dentes remanescentes, propiciado por biofilmes multiespécies presentes nas estruturas das próteses mal desinfectadas. Além disso, estes indivíduos, principalmente os mais idosos, também estão sujeitos a outros problemas associados ao biofilme, tais como halitose, pneumonia aspirativa, candidíase pulmonar e endocardite infecciosa (Zhang et al., 2016).

Dentre os diversos métodos de desinfecção, os mais comuns estão a imersão das próteses totais em soluções químicas, escovação mecânica e aplicação tópica na mucosa oral de antimicrobianos como a nistatina, clorexidina ou miconazol. Contudo esta aplicação é

eficiente na melhora dos sinais e sintomas da candidose, mas não necessariamente há erradicação do biofilme (Banting & Hill; 2001; Kulak et al., 1994). Os processos de desinfecção por meios químicos, tais como, imersão em gluraraldeído alcalino, peróxido de hidrogênio (Lucena-Ferreira et al., 2014), hipoclorito de sódio e formaldeído descrevem limitações como o tempo inapropriado gasto com a técnica (Rudd et al., 1984; Chau et al., 1995), a alteração de cor da prótese total, além da corrosão de componentes metálicos (Backenstose et al., 1977; Nordbo et al., 1983; Rudd et al., 1984; Ma et al., 1997). Apesar do método manual de remoção mecânica de biofilme ser eficiente, a escovação, além de poder causar irregularidades na superfície das próteses totais (Dovigo et al., 2009), não é uma prática utilizada de forma eficiente por usuários de próteses orais portadores de doenças crônicas e/ou sem habilidades manuais, sendo a maioria dos pacientes ou seus cuidadores incapazes de realizarem higiene bucal adequada, ocasionando maior aderência e crescimento de microrganismos, facilitando o desenvolvimento de candidoses e doenças bucais (Peltola et al., 2004).

Dessa forma, uma alternativa para os processos de desinfecção é a energia de microondas. Vários estudos demonstraram a eficiência desta técnica em promover alterações das estruturas celulares dos microrganismos e interações bioquímicas moleculares com o campo eletromagnético, ambos os mecanismos conduzindo à destruição celular, sendo o primeiro com temperaturas maiores que o segundo (Brondani et al., 2010; Campanha et al., 2007). Em adição, estudos demonstraram melhor desempenho da energia de microondas na desinfecção de próteses quando comparada às soluções de imersão como Hipoclorito de Sódio 0.02% e 0,0125% (Webb et al., 1998), Clorexidina 0,2% (Banting & Hill, 2001) e 0,12% (Al-Saadi, 2014), Hipoclorito 1% (Altieri et al., 2012) e Hipoclorito de Sódio 1:420 (Al-Saadi, 2014).

Desta maneira, a irradiação de microondas surgiu como alternativa para desinfecção de próteses dentárias e, consequentemente, prevenção e tratamento de candidose oral. Entretanto, apesar de diversos trabalhos avaliarem a efetividade da desinfecção por microondas (Verran et al., 1997; Waltimo et al., 1999; Dixon et al., 1999; Rohrer e Bular, 1985; Webb et al., 1998; Silva et al., 2006), a maioria utilizaram biofilmes monoespécie de Candida. No entanto, considerando que os biofilmes multiespécies são mais complexos e simulam melhor a microbiota oral, estudos com biofilmes multiespécies que avaliem a efetividade de desinfecção por microondas ganham relevância.

2 Revisão da Literatura:

2.1. Irradiação de microondas e o processo de desinfecção:

Silva et al., em 2006, fizeram um estudo com o propósito de avaliar a efetividade da irradiação por microondas na desinfecção de próteses totais contaminadas com 3 tipos de bactérias (Streptococcus aureus, Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa) e 1 fungo (Candida albicans). No primeiro dia, foram inoculados em béquer 107 cfu/ml em 10 ml de TSB, por 24 h/37 ºC, para cada microrganismo, sendo transferidos, no dia seguinte, 15 µL da suspensão de TSB para 200 ml de TSB estéril. Oitenta espécimes em resina acrílica foram confeccionados, contaminados com os microrganismos nestes béqueres de 200 ml e incubados por 48 h/37 ºC. Houve divisão em 2 grupos com 40 amostras cada, sendo o experimental submetido à energia de microondas (650 W/6 min./200 ml água) e o outro não irradiado (grupo controle). Após os tratamentos foram colhidas alíquotas de 25 µL das suspensões e diluídas de 10-3 _{a 10}-6 _{em placas com meios específicos para cultura de cada microrganismo, sendo}

incubadas por 48 h/37 ºC. Houve contagem dos microrganismos com um contador digital de colônias. Para as amostras irradiadas, houve acompanhamento de mais 7 dias de incubação a 37 ºC e interpretação por um avaliador quanto a presença ou ausência de crescimento de microrganismos. Os resultados apontaram esterilização das placas contaminadas com S. aureus, C. albicans e B. subtilis (grupo irradiado). Para as culturas de P. aeruginosa houve desinfecção eficiente quando comparadas com grupo controle, embora houve crescimento de alguns microrganismos em 2 placas. Após 7 dias, não houve crescimento visível nos béqueres com S. aureus e C. albicans, sendo observado turvação apenas em 3 béqueres (2 com P. aeruginosa e 1 com B. subtilis). Para o grupo controle houve crescimento substancial para todos os microrganismos, com a média de valores cfu/ml menor para C. albicans. Os autores concluíram que o tratamento com irradiação de microondas (650 W/6 min.) culminou em esterilização das próteses contaminadas com S. aureus e C. albicans e desinfecção das contaminadas com P. aeruginosa e B. subtilis, além do menor número de unidade formadora de colônia no grupo controle para C. albicans.

Campanha et al., em 2007, avaliaram a habilidade da irradiação de microondas na inativação de C. albicans e o dano na integridade da membrana celular. Próteses totais foram construídas de forma padronizada e esterilizadas. C. albicans (ATCC 10231) foram cultivadas em 600 ml de Tryptic Soy Broth (TSB), a 37 ºC em agitador rotativo. As colônias foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas a 108 _{células/ml em água destilada. Foi colocado uma}

energia de microondas a 650 W, por 6 min. (grupo ES). O grupo controle (CS) foi preparado de forma semelhante, com a diferença de manter a prótese imersa por 6 min., sem ser submetida à energia de microondas. Oito ES e CS foram preparados e tratados como descrito, havendo anteriormente determinação de células e contagem de proteínas, eletrólitos e DNA. Amostras de suspensões de CS e ES foram contadas por meio de absorção de corante de azul de metileno como indicativo de dano ou não às membranas das células. Houve diluições de 10-1 a 10-6 em NaCl 0,9% e adição de 0.5 ml de cada diluição em 55 µL do corante. Para o ensaio de viabilidade, 25 µL de ES e CS foram postos em placas de Agar Sabouraud Dextrose (ASD) nas diluições de 10-1 a 10-6 (incubação por 48 h/37 ºC) e, posteriormente, houve contagem das colônias com contador digital. Houve uso de espectrofotômetro para determinação da densidade ótica. Os resultados demonstraram que células do grupo controle não sofreram danos, enquanto que as do grupo experimental apresentaram-se prejudicadas. Não se detectou C. albicans viáveis no grupo de células irradiadas, enquanto que no grupo controle houve células sobreviventes variando de 1,6 x 108 a 5,4 x 108 cfu/ml. Houve conteúdo proteico liberado do grupo ES significantemente maior que no controle, bem como maior liberação de K+, Ca++ e DNA (dano da membrana celular). A densidade ótica do ES e CS tiveram forte correlação entre as suspensões, que produziram quase os mesmos resultados. Os pesquisadores concluíram que a energia de microondas inativou C. albicans e danificou a integridade da membrana celular, embora sejam necessárias investigações futuras com uma metodologia envolvendo biofilmes. Sanitá et al., em 2008, fizeram um experimento para avaliar a efetividade da energia de microondas na desinfecção de próteses totais inoculadas com American Type Culture Collection (ATCC), como cepas controle, e 5 espécies de Candida (C. albicans, C. dubliniensis, C. krusei, C. glabrata e C. tropicalis) isoladas de pacientes com HIV, sendo 3 de cada espécie. Foram confeccionadas 50 réplicas de próteses que foram postas em béqueres com 200 ml de TSB (Tryptic Soy Broth) com inóculo de 15 µL de cada cepa previamente incubadas por 24 h a 37 ºC. Vinte próteses foram divididas em dois grupos, controle e teste (n = 10), e ambos foram incubados por 24 h a 37 ºC. As próteses do grupo controle foram transferidas para béqueres com 200 ml de solução salina e para determinar o número de microrganismos presentes após centrifugação, nas diluições 10-1, ₁₀-2_,10-3 _{e 10}-4_{, amostras repetidas de 25 µL das suspensões}

foram transferidas para placas de Sabouraud Dextrose Agar (SDA) e incubadas por 48 h a 37 ºC. Para o grupo teste, as próteses foram colocadas em 200 ml de água destilada e submetidas à energia de microondas a 650 W, por 3 minutos. As próteses totais foram transferidas aos béqueres com 200 ml de solução salina e foram tratadas de forma igual ao grupo controle.

Foram realizadas contagens dos microrganismos com equipamento digital e para verificar a efetividade da esterilização a longo prazo, mais 7 dias de incubação a 37 ºC foram estendidos. Houve esterilização de todas as espécies de Candida após energia de microondas, bem como ausência de crescimento visível nos béqueres com TSB. No grupo controle, houve crescimento de cepas, sendo a contagem de C. glabrata maior que a das outras espécies, enquanto que para C. krusei foi significativamente menor. A média de cfu/ml para as cepas advindas dos pacientes com HIV foi significativamente maior que aquelas observadas para leveduras do ATCC. Após análise dos resultados, os pesquisadores concluíram que a irradiação de microondas pode ser um método simples, seguro, efetivo e barato para prevenir estomatite por prótese em pacientes imunodeprimidos e imunocompetentes.

Dantas et al., em 2014, com o propósito de avaliar o efeito da desinfecção de próteses, por microondas, na formação de biofilme com Candida spp, conduziram uma pesquisa envolvendo 90 amostras, com 3 tipos de resina acrílica, sendo 30 discos de cada marca (Classico, Onda-Cryl e QC-20). C. albicans (1), C. dubliniensis (2) e C. tropicalis (3) foram as espécies cultivadas para obtenção de suspensões microbiológicas padronizadas com concentração de 108 células/ml (determinada por meio de espectrofotômetro), uma vez que Candida spp são os microrganismos mais comuns para o desenvolvimento de estomatite protética. Utilizou-se placas em poliestireno com poços de fundo plano para produção do biofilme de Candida, obtendo-se, após sonicação, suspensões e diluições para posterior contagem de microrganismos. Após desenvolvimento do biofilme nos discos, houve divisões em 3 subgrupos (n = 10): 1: resinas irradiadas em triplicata; 2: resinas não irradiadas (controle positivo); 3: resinas sem contaminação (controle negativo). A energia de microondas utilizada foi 650 W/3 min. em 10 ml água estéril e, após sonicação e incubação (48 h/37 ºC), houve contagem dos microrganismos em placa por contador digital. Houve diminuição significante do número de células viáveis para todos os biofilmes formados pelas espécies de Candida. Concluiu-se então, que o tratamento por microondas demonstrou-se efetivo como método alternativo para desinfecção de diferentes tipos de resinas contaminadas por espécies de Candida.

2.2. Efeito da variação da potência e/ou tempo de exposição à energia de microondas:

Rohrer e Bulard, em 1985, fizeram um estudo para demonstrar que fungos, vírus, bactérias aeróbias e anaeróbias, além de esporos, podem ser mortos por energia de microondas, testando a possibilidade de desinfecção de próteses. Foram inclusos no estudo Stafilococcus aureus, S. epidermidis, Klebsiella penumoniae, Bacillus subtilis, Clostridium histolyticum,

Candida Albicans, vírus polio tipo 1 e hérpes simplex tipo 1. Suspensões individuais de cada microrganismo foi posta em tubos que foram submetidos à energia de microondas por 0 s, 30 s e 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 e 15 min. Então foi inoculado nutriente dentro dos tubos e houve incubação a 37 ºC, sendo avaliados crescimentos dos microrganismos em 24 h e 48 h, por meio de observação da turvação e cultura em placas. Também houve avaliação da esterilização de próteses contaminadas com suspensão de cada bactéria aeróbica e C. albicans, bem como um mix de bactérias com o fungo, sendo submetidas posteriormente à irradiação de microondas (720 W a seco e imersa em água) por 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 15 min. Os resultados demonstraram não crescimento de C. albicans após exposição de 8 minutos ao microondas. Mistura de bactérias aeróbicas e C. albicans contendo esporos de B. subtilis mostrou ausência de crescimento após 10 min. de exposição. Próteses em acrílico contaminadas com suspensões individuais de 4 bactérias aeróbias e C. albicans mostraram esterilização para todos os microrganismos após 8 minutos de irradiação. As próteses contaminadas com mistura com todas bactérias aeróbias e C. albicans foram esterilizadas após 10 min. Os autores concluíram que irradiação por microondas apresentou-se eficaz na esterilização de próteses dentais contaminadas com microrganismos, sendo potencialmente um método simples, rápido e não destrutivo, que pode prevenir infecções cruzadas em consultórios odontológicos.

Dixon et al., em 1999, com propósito de avaliar a eficácia da radiação de microondas contra Candida albicans em 3 materiais reembasadores de próteses, bem como a base de uma prótese em resina termopolimerizável e o efeito desta incidência na dureza dos materiais, conduziram um estudo dividido em 3 fases. Na fase 1, 45 amostras de 3 reembasadores foram selecionadas e esterilizadas, também foram realizados testes de dureza. Amostras foram colocadas em tubos com C. albicans e submetidas à rotação. Cada corpo de prova foi lavado com água estéril e colocado em caldo para levedura (Yeast Nitrogen Broth). Amostras foram agitadas e postas em microondas, a seco, por 5 minutos, em frequência de 60 Hz e outros corpos de prova não foram irradiados. As amostras foram postas em tubos de tioglicolato, a 37 ºC, por 2 semanas para averiguação da presença de C. albicans após a irradiação e após este período foram medidas as durezas. Na fase 2, 15 amostras de cada grupo, processadas de forma semelhante à fase 1, foram sujeitas à irradiação, imersas em água destilada, por 5 minutos e outras 15 amostras de cada grupo também foram avaliadas desta maneira, porém com 10 min. e 15 min. de tempo de exposições ao microondas e a seco. Testes de dureza antes e após os testes foram obtidos. Na fase 3, testes de dureza foram realizados pré e pós 5 ciclos de irradiação com os espécimes de cada material imersos em água. Além dos

autores concluírem que houve diminuição significante da dureza das amostras sujeitas a 5 ciclos repetidos de irradiação, também constataram ausência de C. albicans em todos os materiais (imersos em água), após tratamento com microondas.

Em 2008, Mima et al., avaliaram a efetividade de diferentes tempos de exposições ao microondas para desinfecção de resinas. Foram confeccionados 242 espécimes de resina, sendo que cada grupo de 60 amostras foram contaminadas com Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans ou Bacillus subtilis e incubadas por 24 h a 37 ºC. Cada grupo foi divido em 10 espécimes não submetidos à energia de microondas (controle) e 50 que foram sujeitos à irradiação (650 W) por 1, 2, 3, 4 ou 5 minutos, com as amostras imersas 200 ml de água. Após os tratamentos, houve diluições seriadas de 10-3 _{a 10}-6_{, transferência de}

25 µL para 4 meios seletivos e incubação dos corpos de prova por 48 h para posterior contagem, em microscópio ótico de varredura, das colônias formadas. Para as amostras irradiadas houve incubação por mais 7 dias das placas com meio de cultura para crescimento específico de cada microrganismo, averiguando-se presença ou ausência de crescimento deste. Os resultados apontaram esterilização para os tempos exposições de 3, 4 e 5 minutos. Para o tempo de 2 minutos, houve esterilização para as amostras contaminadas com C. albicans e desinfecção para os demais microrganismos. Para o tempo de 1 minuto, todos os microrganismos apresentaram crescimento em 48 h e também após 7 dias, mas quando comparados com o grupo controle, houve diminuição significativa no número de microrganismos. Para as amostras esterilizadas houve danos às estruturas das células e para as desinfectadas mantiveram-se intactas na análise das estruturas. O número de cfu/ml para P. aeruginosa e S.aureus foi significativamente maior do que o observado para C. albicans e B. subtilis. Observou-se ausência visível de crescimento das amostras nos tubos de TSB após 7 dias para os grupos submetidos às exposições de 3, 4 e 5 min. de irradiação. O aumento do tempo de exposição ao microondas relacionou-se com a melhora na efetividade do método. Os autores concluíram que 3 minutos de exposição à irradiação de microondas pôde ser usado como método de esterilização de resina.

Um experimento in vitro foi realizado em 2009, por Dovigo et al., com o objetivo de avaliar a efetividade da irradiação de microondas na desinfecção de próteses totais. Foram confeccionadas 70 próteses totais a partir de um modelo mestre, esterilizadas com óxido de etileno e armazenadas em béqueres com 200 ml de Tryptic Soy Broth (TSB). De forma individual, foram inoculados (107 _{cfu/ml) com Staphylococcus aureus (n = 20), Pseudomona} aeruginosa (n = 20) e Bacillus subtilis (n = 30) e incubados por 24 h a 37 ºC. Após incubação, 30 (n = 10 para cada bactéria) das 70 próteses não foram submetidas à energia de microondas

(controles) e as 40 remanescentes passaram pelo processo de irradiação de microondas (650 W/ 3 min.), sendo 10 próteses contaminadas com S. aureus, 10 com P. aeruginosa e 10 com B. subtilis. Outras 10 com B. subtilis passaram pelo processo de energia de microondas por 5 minutos. Alíquotas em replicata (15 µL) das suspensões foram postas em placas nas diluições de 10-3 a 10-6 nos respectivos meios seletivos para cada bactéria, sendo incubadas por 48 h a 37 ºC. Após este período foram quantificados os microrganismos. Finalmente, para avaliação da efetividade da energia de microondas a longo prazo as amostras que passaram pela irradiação foram colocadas em 200 ml de TSB e incubadas por mais 7 dias a 37 ºC. Para os grupos irradiados por 3 minutos, os contaminados por P. aeruginosa e S. aureus, não exibiram evidências de crescimento (48 h), bem como ausência de turvação após 7 dias. Para as próteses contaminadas com B. subtilis, submetidas a 3 minutos de irradiação, houve crescimento em 6 placas e turvação em todos os béqueres com TSB após 7 dias. Quando utilizado o tempo de 5 minutos, resultou em sobrevivência de bactérias em 2 placas e 2 béqueres. Houve significante diferenças quando comparados ao grupo controle, havendo menor número de microrganismos viáveis nos grupos irradiados, sem diferenças entre 3 e 5 minutos. Os pesquisadores concluíram que houve desinfecção por irradiação de microondas, após 3 e 5 minutos, para as próteses contaminadas com B. subtilis, bem como esterilização, após 3 minutos, das próteses contaminadas com os outros microrganismos.

Com o intuito de avaliar a efetividade clínica da energia de microondas na desinfecção de próteses totais, Ribeiro et al., em 2009, dividiram 30 pacientes em dois grupos com 15 indivíduos cada. Ambos foram submetidos a coleta, por meio de “swab”, de microrganismos da prótese maxilar, antes (controle) e depois da prótese ser exposta à irradiação por microondas. Após exposição, as soluções salinas tanto do grupo 1 (650 W/3 minutos) quanto do grupo 2 (650 W/2 minutos) foram diluídas de 10-1 a 10-3 em soluções salinas e alíquotas de cada diluição (25 µL) foram colocadas em meios seletivos para Candida spp., Streptococcus mutans, Staphylococcus spp. e um meio não seletivo. As placas foram incubadas por 48 h a 37 ºC e, posteriormente, as colônias formadas foram contadas. As espécies prevalentes antes da irradiação foram Candida spp. (76,6%), sendo a maioria C. albicans; Staphilococcus ssp. (20%) e Streptococcus mutans (53,3%). Os resultados demonstraram esterilização dos microrganismos no grupo 1 e desinfecção no grupo 2, embora houve uma significante diminuição do número de microrganismos após irradiação neste grupo, sendo C. albicans, Stafilococcus não aureus e Streptococcus mutans as colônias crescidas após 2 minutos

de energia de microondas. Os autores concluíram que irradiação de microondas por 3 min. pode ser usado para prevenção de contaminação cruzada.

Com o propósito de sintetizar e discutir vantagens e desvantagens do uso de microondas convencional para limpar e desinfectar próteses totais, Brondani et al., em 2010, realizaram uma revisão de literatura. Os levantamentos dos dados foram obtidos por meio de artigos focados em energia de microondas e desinfecção de próteses, através da pesquisa em meio a Pubmed Central, Cochrane, Google Scholar, Ovid MEDLINE e Scifinder Scholar. Foram considerados dois mecanismos de ação do microondas sobre os microrganismos: efeito térmico e não térmico. O primeiro relacionou-se com alterações na estrutura celular, modificação na permeabilidade da membrana e morte celular. O segundo relatou destruição dos microrganismos em temperaturas menores que o ponto de destruição termal, onde certas moléculas bioquímicas interagem com o campo eletromagnético e são conduzidas à destruição celular. A eficácia do método foi associada com o veículo de imersão das próteses quando irradiadas, tempo de exposição, potência do microondas e tipo de microrganismo presente na prótese. Segundo os autores, pareceu não haver um protocolo consistente estabelecido na literatura quanto ao uso do microondas para esterilizar ou desinfectar próteses, sendo ainda o método manual de limpeza considerado como ótimo para controlar infecção fúngica, entretanto este não é uma prática utilizada de forma eficiente pelos usuários de próteses.

A fim de verificar a efetividade da energia de microondas na desinfecção de próteses colonizadas por Candida albicans, em 2010, Senna et al., fizeram um experimento, in vitro, com discos de resinas, pequenos e grandes, colonizados com as leveduras e colocados no palato de próteses estéreis, que foram submersas em água destilada (200 ml) e submetidas à energia de microondas (temperatura medida no final do processo). Houve desenvolvimento de película adquirida para os espécimes por meio de saliva estéril filtrada em contato, por 30 minutos, antes da formação de biofilme de C. albicans por 72 h. Realizaram-se testes com potência de microondas a 900 W, 630 W e 450 W e após os espécimes serem submetidos à energia de irradiação, foram levados ao microscópio para contagem de leveduras. Os resultados apontaram que a área de biofilme analisada influenciou no processo de desinfecção, sendo necessário maior tempo de exposição nas amostras maiores. Para as amostras pequenas, 1 minuto, a 900 W de potência, foi necessário para desinfecção e 2 minutos a 450 W ou 630 W. Independentemente da potência do microondas, os corpos de provas mais largos foram desinfectados com 3 minutos de tempo de exposição. Com base nos resultados os autores concluíram que houve necessidade de maior tempo de exposição para desinfecção das amostras

maiores, logo houve influência do tamanho da área do biofilme no processo de tratamento das próteses no microondas.

2.3. Desinfecção por energia de microondas e antimicrobianos tópicos:

Nappelenbroek et al., em 2008, investigaram a efetividade da desinfecção por microondas de próteses úmidas no tratamento de estomatite. O estudo foi conduzido com 60 pacientes divididos em 4 grupos com 15 indivíduos cada: Grupo controle: informados a escovarem as próteses e acondicioná-las em água durante a noite; Grupo Mw: prótese maxilar submetida à energia de microondas (650 W/6 min.), 3 vezes na semana, por 30 dias; Grupo MwMz: prótese superior sujeita à irradiação de microondas (650 W/6 min.), 3 vezes na semana e aplicação de Miconazol, 3 vezes por dia, por 30 dias; Grupo Mz: aplicação do antifúngico na prótese e palato, 3 vezes por dia, por 30 dias. Houve coletas de células e culturas micológicas antes do experimento e em 15, 30, 60 e 90 dias, sendo incubadas por 48 h/37 ºC e, posteriormente, quantificadas por contador digital. A classificação da estomatite foi baseada em Newton. Os resultados demonstraram não diminuição da infecção por Candida no grupo controle, diferente do grupo MwMz e Mw que apresentaram, nos 15º e 30º dias, ausência do fungo e nos 60º e 90º dias, poucos micélios em 11 próteses (33,3% grupo Mw e 40% grupo MwMz), não havendo relevância clínica e estatisticamente significante. Para o grupo Mz, não houve significante diminuição de inflamação palatal e nem erradicação das leveduras nas próteses e palato. Os autores concluíram que o método de desinfecção por microondas foi efetivo no tratamento de estomatite, além de reduzir a reinfestação por Candida spp. nos tecidos ocupados pela prótese no período após a irradiação. Também ratificaram a ineficiência do antifúngico no tratamento de estomatite por prótese quanto utilizado de forma isolada.

Sanitá et al., em 2012, avaliaram, clínica e microbiologicamente, a efetividade da desinfecção por meio de microondas e nistatina de próteses de pacientes diabéticos controlados tipo 2, portadores de estomatite protética. As mucosas dos usuários de próteses maxilares foram classificadas segundo critério de Newton e critérios de inclusão e exclusão foram criteriosamente seguidos. Uma amostra de 40 diabéticos controlados foi dividida em 2 grupos com 20 pessoas cada: NYS (lavagem da prótese em 1 ml de suspensão de nistatina, por 1 minuto, 3 vezes ao dia, por 14 dias); MW (imersão da prótese em 200 ml de água destilada e irradiação desta com microondas há 650 W, por 3 minutos, 3 vezes por semana, por 14 dias). Com auxílio de um “swab”, houve coleta de microrganismos do palato dos pacientes e das próteses, posteriormente sendo colocado em 5 ml de solução salina 0.9%, sob agitação, e diluições de 10-1 a 10-3 foram realizadas para quantificar colônias de Candida. Alíquotas de 25

µL foram postas em placa com Sabouraud Destrose Ágar (SDA) e incubadas por 48 h/30 ºC. Um contador digital de colônias foi utilizado para contagem. Houve mensurações do número de microrganismos e avaliação das mucosas (fotografias) no início do experimento e após 14, 30, 60 e 90 dias. Os resultados apontaram redução dos sinais clínicos de estomatite e dos números de unidades formadoras de colônias (CFU) no palato e próteses para ambos os grupos (14º e 30º dia). Para os 60º e 90º dias, quando comparados ao início do experimento, não houve diferença estatisticamente significante quanto a redução de cfu no palato e prótese. Não houve diferenças significantes quanto aos resultados clínicos e microbiológicos entre os dois grupos. Ao final do tratamento, 40% dos pacientes foram curados da estomatite. A espécie predominante isolada foi Candida albicans (43% no palato e 75.5% nas próteses), seguida de C. tropicalis e C. glabrata. Os autores concluíram que ambos os métodos de desinfecções foram eficientes em reduzir o número de cfu/ml e os sinais clínicos da estomatite por prótese, sendo a irradiação por microondas tão eficiente quanto a nistatina. Também apontaram maior frequência de distribuição de C. albicans e C. tropicalis isoladas das próteses do que as obtidas do palato.

Em 2012, Silva et al., com o objetivo de comparar a efetividade dos métodos de desinfecção por irradiação de microondas e terapia antifúngica no tratamento de estomatite por prótese, conduziu um estudo envolvendo 60 indivíduos com estomatite por prótese, divididos em 3 grupos (n = 10). No grupo NYS os integrantes lavaram as próteses com 1 ml de antifúngico tópico nistatina, 4 vezes ao dia, por 14 dias, já no grupo MW1 e MW3, os participantes foram orientados a imergirem suas próteses totais maxilares, respectivamente 1 e 3 vezes por semana, em 200 ml de água destilada estéril e submetê-las à irradiação por microondas a 650 W, por 3 minutos, por 14 dias. Após o experimento houve acompanhamento dos pacientes por 3 meses. Investigações microbiológicas foram realizadas com coleta de microrganismos, por meio de um “swab”, das próteses e do palato dos pacientes, e cultivo em meio de cultura para Candida spp. Também houve classificação das características da mucosa palatal, segundo critério de Newton, por meio de fotografias. Os resultados demonstraram que ambos os tratamentos obtiveram sucesso em tratar estomatite por prótese, uma vez que 65% dos pacientes melhoraram os sinais clínicos desta doença no período de 14 dias. Esta característica foi mantida até 60 dias, onde 50% dos pacientes apresentaram diminuição da estomatite. Quarenta e cinco a 60% dos indivíduos demonstraram diminuição na taxa de infecção em 90 dias. Segundo os autores, a desinfecção por intermédio de microondas demonstrou-se tão efetiva quanto terapia com antifúngico para tratamento de estomatite protética. Também afirmaram que por se tratar de um

meio físico de ação não apresenta risco de seleção de microrganismos resistentes, previne os efeitos adversos do antifúngico (náusea, vômitos, efeitos hepatotóxicos e nefrotóxicos, bem como menor custo) e, além da estomatite, também evita doenças sistêmicas como fungemia e pneumonia aspirativa por inativar outros microrganismos presentes no biofilme.

2.4. Desinfecção por energia de microondas e antimicrobianos de imersão:

A fim de fornecer dados aos estudos clínicos quanto ao controle de microrganismos associados à estomatite protética, desenvolvendo protocolo para o tratamento e prevenção desta, Webb et al., em 1998, avaliaram dois métodos de esterilização de próteses in vitro. C. albicans advinda de cultura de um freezer foi cultivada em caldo Sabouraud (SB) e Streptococcus gordonii isolado de placa dental foi cultivado em Brain Heart Infusion (BHI), ambos incubados por 24 h a 37 ºC. C. albicans foram inoculadas com SB em 10 próteses, acondicionadas em béqueres (48 h/37 ºC), sendo 5 próteses submetidas à energia de microondas e 5 utilizadas como grupo controle (não irradiadas). Houve exposições de 1, 2, 4, 6, 8 e 10 min. a 604 W e 350 W e, posteriormente, sonicação das próteses em solução de 0.9% cloreto de sódio e diluições seriadas de 10-1 a 10-4 em placas com Sabouraud Ágar. Após incubação por 48 h/37 ºC, houve contagem das colônias formadas. Para o grupo controle apenas houve imersão das próteses contaminadas em cloreto de sódio 0.9% e incubação por 48 h/37 ºC. De maneira similar, houve os mesmos procedimentos para S. gordonni, que foi incubado por 12 h a 37 ºC. Também houve 10 próteses que foram 5 imersas, por 8 h, em solução de Milton (Hipoclorito de Sódio) a 0.02% ou 0.0125% e 5 imersas em água destilada (controle), sendo submetidas aos mesmos procedimentos descritos acima quanto a diluições, sonicações, lavagens, incubações e crescimentos e análise de microrganismos. Quatro amostras contaminadas com C. albicans e 4 com S. gordonii foram submetidas à energia de microondas (350 W/6 min.) e analisadas em microscópio ótico de varredura (SEM). De forma semelhante, corpos de provas contaminados foram submetidos à imersão (8 h) em Hipoclorito a 0.02% e 0.0125% e analisados em SEM. Os resultados demonstraram efeito fungicida em próteses contaminadas com C. albicans e S. gordonni expostas à irradiação de microondas (604 W) por 2, 4, 6 e 8 min. e 6, 8 e 10 minutos (350 W). Com tempos de exposições de 1, 2 e 4 min. (350 W) e 1min. (604 W) houve sobrevivência de C. albicans e S. gordonni. Obteve-se sobrevivência de 100% de C. albicans, com 10 min. exposição, quando a potência do microondas foi a mais baixa. O efeito de 8h de imersão em hipoclorito a 0.02% e 0.0125% em próteses inoculadas com ambos microrganismos foi fungicida (C. albicans), resultando em sobrevivência de S. gordonni e maior eficiência na concentração de 0.02% da solução. Exames de imagens de SEM

revelaram que irradiação de microondas à 350 W/6 min. não removeram os microrganismos danificados da superfície das amostras, enquanto que hipoclorito de sódio a 0.02% diminuiu o número de células de C. albicans e S. gordonni da superfície das próteses. Os autores concluíram que irradiação de microondas (350 W/6 min.) pode ser um método mais efetivo de esterilização do que imersão em Hipoclorito de Sódio (8 h) 0.02%. Entretanto, o protocolo deve ser estendido para estudo clínico para avaliar efetividade dos dois tratamentos no controle de placa e estomatite protética.

Com a proposta de determinar a efetividade da energia de microondas para desinfecção de próteses totais superiores comparada ao procedimento de imersão destas em solução antimicrobiana, durante a noite, como adjunto no tratamento de candidíase oral, Banting & Hill, em 2001, conduziram um experimento com 34 pacientes usuários de próteses totais maxilares, que foram submetidos a teste citológico de células coletadas das próteses e mucosas e, sendo positivo para Candida albicans, foram alocados ao grupo controle (n = 19) ou grupo experimental (n = 15). Para determinar tempo de exposição apropriado no microondas foi feita escovação da prótese com solução antibacteriana, seguido de pré exposições destas a 90 s (dano à prótese), 60 s (desinfecção) e 30 s (pouco efeito) à irradiação de micro-ondas (850 W), sendo realizados esfregaços e coloração Gram antes e após cada tratamento e, posteriormente, estas lâminas observadas em magnificação de 400x. Suspensões de 0,5 ml foram pipetadas de 1.7 ml de solução sonicada com a escova em béquer, sendo postas em meio Sabouraud Ágar e incubadas por 48 h a 37 ºC (3 repetições). Ambos os grupos foram sujeitos à aplicação de Nistatina tópica, 3 vezes ao dia, por 14 dias, sendo o experimental submetido à 805 W/1 min, nos dias 1º, 5º e 10º e o controle à imersão das próteses em Clorexidina 0.2%, por 14 dias, com escovação destas com antibacteriano no 1º, 5º e 10º dias. No 14º dia, houve esfregaço citológico das próteses e palatos dos pacientes para averiguar presença de C. albicans, havendo a mesma averiguação em 1, 2 e 3 meses. No 14º dia, houve sucesso de desinfecção das próteses nos dois grupos (coloração negativa para quase todas as próteses). Houve recolonização das próteses progressivamente com o tempo, averiguando-se, após 3 meses, 8 (56%) das próteses do grupo experimental e 16 (84%) do controle presença de pseudohifas de C. albicans, sem diferenças estatisticas entre os grupos. Durante a fase de tratamento, não se observou pseudohifas nos esfregaços dos palatos dos pacientes. Após 3 meses, um (8%) paciente no grupo experimental e 12 (63%) no grupo controle demonstraram pseudohifas nos esfregaços citológicos, indicando infecção na mucosa palatal. O risco de infecção nos tecidos moles no grupo experimental foi ¼ grupo do controle. Em 3 meses, 33% dos sujeitos do grupo

do microondas e 58% do controle apresentaram esfregaços positivos para C. albicans no palato e próteses com diferença estatisticamente significante. Os autores concluíram que a energia de microondas foi mais efetiva que imersão em clorexidina 0.2% como método de desinfecção da forma invasiva de C. albicans em próteses. Recolonização e infecção, respectivamente das próteses e tecidos adjacentes, foram retardadas nos pacientes do grupo experimental em relação ao controle, sendo menos provável pseudohifas do fungo nessas estruturas. Também consideraram como barato o método de energia de microondas, conveniente, simples e prático para desinfecção de próteses totais.

Em 2008, Buergers, et al., realizaram um experimento, in vitro, com o objetivo de comparar a eficácia de 10 métodos de desinfecção de próteses colonizadas com C. albicans. Amostras circulares de reembasador de prótese (n = 132) foram confeccionadas e contaminadas com C. albicans, isoladas de humanos após crescimento em cultura, centrifugadas e lavadas com PBS. Houve incubação das amostras com as suspensões por 2.5 h a 37 ºC, sendo, posteriormente, submetidas a um dos métodos desinfecção: Peróxido de Hidrogênio 3% (10 min. imersão); Hipoclorito de Sódio 1% (10 min.); Glutaraldeído 2% (10 min.); Vinagre (10 min.); Listerine Coolmint (10 min.); Plax tricolsan 3% (10 min.); Pastilhas Bend a dent 2 Phasen (10 min.); Irradiação de microondas (800 W/6 min.) úmido e a seco; Amostra ao ar livre durante a noite e Solução tampão de fosfato (controle). Microscópio ótico de varredura (SEM) foi utilizado para validação morfológica das células e um aparelho de luminescência foi utilizado para relacionar intensidade de colonização dos fungos. Houve intensidade baixa de luminescência (poucos fungos viáveis) após imersão em hipoclorito, irradiação de microondas com água e pastilhas efervescentes higienizadoras, sem diferenças significantes entre estes grupos. Não houve diferença estatisticamente significante entre o grupo controle e os grupos de peróxido de hidrogênio, glutaraldeido, vinagre, Listerine, Plax, microondas (a seco) e espécies deixadas a seco durante a noite. Imagens do SEM mostraram diferentes morfologias de monocamadas de C. albicans nas superfícies investigadas. Os autores concluíram que apenas exposição ao hipoclorito de sódio 1%, energia de microondas (úmida) e a pastilhas efervescentes foram eficientes contra colonização de C. albicans.

Com o objetivo de avaliar e comparar o desempenho de um higienizador de prótese e irradiação por microondas na desinfecção de bases de próteses em resina acrílica confeccionadas por duas técnicas. Kassab et al., em 2009, conduziram um estudo com 32 amostras, sendo metade feitas de forma convencional e a outra metade por método de microondas. Candida albicans do interior de próteses superiores foram obtidas e inoculados

0,025 ml de suspensão destes fungos (106 células/ml) em béqueres com as amostras em resina, que foram incubadas por 2 h a 37 ºC. Após isto, 2 ml de caldo Sabouraud foi adicionado aos béqueres e estes incubados por 6 dias a 37 ºC. Os espécimes foram divididos em 2 grupos, ambos com 16 corpos de provas cada, sendo o primeiro grupo as resinas feitas de forma convencional, dividas em 4 subgrupos com 4 amostras cada: imersas em clorexidina 0.2% (50 ml); imersas em hipoclorito de sódio 0.5% (50 ml); imersas em água destilada (50 ml); submetidas à energia de microondas por 6 min., a 650 W (imersas em água). Para o grupo dois as resinas foram confeccionadas pelo método de microondas e submetidas aos mesmos tratamentos realizados no grupo A. Após incubação por 24 h, foi mensurada a presença de biofilme de Candida por hemocitômetro e determinação de pH do meio. Resultados demonstraram que o número inicial de Candida albicans foi diminuído após tratamento com clorexidina, hipoclorito de sódio e microondas, sem diferença estatisticamente significante entre ambos (grupo A). Para o grupo B, também houve diminuição no número de Candida após o experimento, sem diferenças significantes entre clorexidina e hipoclorito de sódio, entretanto o subgrupo submetido à energia de microondas apresentou diferença estatisticamente significante, obtendo desinfecção das resinas em menor grau quando comparado aos outros dois subgrupos. Os pesquisadores concluíram que Clorexidina 0,2%, Hipoclorito de Sódio 0.5% e irradiação de microondas foram efetivos para desinfecção de próteses, entretanto, Clorexidina 0.2% foi a mais efetiva.

Em 2012, Altieri et al., avaliaram a eficácia de duas soluções higienizantes de próteses e irradiação de microondas na desinfecção de próteses contaminadas com Stafilococcus aureus resistente à Meticilina. Confeccionaram-se 36 réplicas de próteses maxilares, que foram polidas e estocadas em água destilada. Foram preparadas as culturas de bactérias S. aureus, advindas do ATCC, ajustando-se a suspensão à densidade padrão de 0.5 McFarland, por meio de um turbidímetro, que correspondeu à 107 celulas/ml em 10 ml de TSB. As próteses foram colocadas em 200 ml de TSB com alíquota de 100 microlitros da suspensão bacteriana e foram incubadas por 24 h a 37 ºC. As 36 réplicas foram divididas em 4 grupos com 6 próteses cada: grupo controle (não desinfectado); grupo com Hipoclorito de Sódio 1% (10 min. imersão); grupo com Clorexidina 2% (10 min. imersão); grupo submetido à irradiação de microondas (650 W/3 min.). Após os tratamentos, houve agitação das suspensões em 200 ml de solução salina e diluições seriadas de 10-3 _{a 10}-6_{, transferindo-se 25 µL para placas de cultura,}

seguido de incubação de 48 h/37 ºC. Então, quantificaram-se os microrganismos por meio de contador de colônia digital. Após 7 dias, analisou-se a efetividade dos métodos desinfecção a

longo prazo, por meio de averiguação da turvação de meios coletados dos grupos experimentais estocados em 200 ml de TSB, a 37 ºC. O grupo controle mostrou crescimento substancial nas placas incubadas por 48 h, já os outros grupos não demonstraram crescimento de microrganismos, independentemente do método de desinfecção. Após 7 dias, não houve turvação dos meios com TSB que foram submetidos à irradiação de microoondas ou clorexidina 2%, diferente do grupo submetido à Hipoclorido de Sódio 1%, que sinalizou turvação em todos os béqueres. Com base nos resultados, os autores concluíram que imersão de prótese em solução de clorexidina 2% ou irradiação de microondas foram métodos eficientes na desinfecção de das próteses a curto e longo prazo, já a imersão em solução de hipoclorito de sódio apresentou-se eficiente para desinfecção em curto prazo.

Senna et al., realizaram um experimento, em 2012, para avaliarem a relação do efeito da adição de um limpador enzimático ao regime de desinfecção por microondas e a diminuição do tempo de irradiação das próteses, uma vez que estas podem sofrer distorções em altas temperaturas. Discos de polimetilmetacrilato (PMMA) com biofilme de Candida albicans foram inseridos na palatina de próteses totais e estas foram inseridas, por 3 minutos, em água destilada (DW) ou no limpador de prótese (DC), sendo a potência do microondas de 450 W. As amostras foram dividas nos seguintes grupos (n = 8): DW (0 min. de irradiação), DW + M1 (1 min. de irradiação), DW + M2 com 2 minutos e DW + M3 com 3 minutos de irradiação; amostras também foram imersas no limpador de próteses por 3 minutos com 0 (DC), 1 (DC + M1), 2 (DC + M2) ou 3 minutos (DC + M3) de energia de microondas. As temperaturas foram mensuradas após o término de cada ciclo, então os discos foram sonicados em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para desagregação do biofilme. Esta solução foi serialmente diluída em PBS e posta em triplicata em placas de Sabouraud Dextrose Agar (SDA), sendo realizada contagem das células viáveis em estereomicroscópio. Houve 64 próteses fabricadas com 6 nichos cada. Não houve células viáveis nas próteses irradiadas nos grupos (DC + M2), (DC + M3) e (DW + M3), sendo que o grupo (DC + M2) obteve menor temperatura. Os grupos (DC) e (DC + M1) apresentaram menor redução de leveduras do que (DW + M2), porém este também não foi efetivo. Não houve diferença significante para temperatura final entre água destilada e solução higienizadora. A utilização desta solução permitiu desinfecção mais rápida das próteses. Também não houve diferenças significantes na efetividade da desinfecção para os grupos DW, DW + M1 e os ensaios com (DC). Os estudiosos concluíram que houve efetividade na desinfecção de próteses com a associação de higienizador de próteses e energia de microondas (menor irradiação e temperatura).

Através de uma pesquisa realizada in vivo, em 2013, Sesma et al., analisaram quanto ao acúmulo e remoção de microrganismos, o efeito da energia de microondas na presença ou ausência de um produto químico para limpar próteses. Selecionou-se 15 pacientes edêntulos totais e portadores de próteses bimaxilares, que foram informados a seguirem dois métodos de desinfecção da prótese superior, durante 7 dias, com sequência aleatória dos protocolos, respeitando-se 30 dias de “washout” entre os métodos. Método 1 (MW+B): próteses foram submetidas à energia de microondas (700 W/3 min.), com vapor de 500 ml de água, uma vez ao dia e instruídos a escovação após refeições. Método 2 (MW+DC+B): Próteses sob irradiação de microondas, nas mesmas condições supracitadas, seguido de imersão em higienizador protético por 8h e escovação após alimentação. Dois fragmentos de 3 mm foram removidos das próteses anterior e posteriormente aos ensaios 1 e 2, sendo um para análise em microscópio e o outro para microbiológica. Alíquotas de diluições das amostras, após agitação por 60s, foram inoculadas em placas de Brucella ágar plus 5% e Sabouraud ágar e incubas por 10 dias, obtendo-se, posterior e respectivamente, contagem de bactérias e fungos viáveis. Resultados quantitativos, obtidos por meio da análise microbiológica, demonstraram efetividade de desinfecção das próteses em ambos os métodos 1 e 2, com redução de 99.2% e 99.5% das bactérias, respectivamente. Análise qualitativa no microscópio revelou lise celular em ambos métodos, porém o método 2, além de redução de número de microrganismos, também houve remoção do biofilme com microrganismos mortos. Os autores concluíram que o método 2 efetivamente removeu o biofilme remanescente após desinfecção das próteses.

Al-Saadi, em 2014, pesquisaram a efetividade de seis métodos de desinfecção de próteses. Coletou-se, com “swab”, microrganismos das próteses, que então foram postos em tubos com meio líquido de Sabouraud, onde havia 84 amostras estéreis em resina acrílica, que foram incubados por 72 h. Os corpos de provas foram divididos em 7 grupos: 1: irradiação de microondas a 900 W/5 min.; 2: energia de microondas a 450 W/5 min.; 3: Hipoclorito de Sódio 5.25% por 5 min.; 4: Hipolorito de Sódio diluído a 1:420 por 5h; 5: Digluconado de Clorexidina 0.12% por 5 h; 6: tabletes efervescentes por 15 min.; 7: água por 15 min. (controle). No grupo 1 e 2 as amostras foram imersas em 250 ml de água. Após os tratamentos os espécimes foram incubados por 30 minutos a 37 ºC e, posteriormente, foram agitados e 10 µL de cada solução salina foram incubados em placas com ágar Sabouraud, por 72 h a 27 ºC. Por meio de análise microscópica, houve contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC) de espécies de Candida. Os resultados demonstraram que os grupos 1, 2 e 3 foram eficientes em reduzirem as UFC de Candida em 100%, enquanto que os grupos 4, 5 e 6 reduziram,

respectivamente, 99.84%, 99.787% e 97.834%. Por meio de avaliação da adaptação das próteses em modelos de alumínio, averiguou-se alteração da estabilidade dimensional (gaps na região posterior) nas próteses submetidas à energia de microondas na potência máxima (900 W). Os pesquisadores concluíram que a energia de microondas (950 W e 450 W/ 5 min./250 ml água) e imersão em hipoclorito de sódio a 5.25%, por 5 min., demonstraram como métodos efetivos contra espécies de Candida, enquanto que os outros componentes estudados não apresentaram desinfecção efetiva. Próteses totais sofreram deformações quando expostas à energia de microondas na potência de 900 W, enquanto que outros métodos não causaram alterações dimensionais. Também ressaltaram a importância da potência do microondas, meio de imersão das próteses, bem como volume deste meio e tempo de irradiação quando utilizado microondas no processo de desinfecção.

Lucena-Ferreira et al., em 2014, avaliaram o efeito da imersão diária de discos em acrílico, contaminados com biofilme multiespécies, em higienizadores de próteses. Vinte e quatro amostras, em acrílico, foram preparadas em forma de discos (10 x 2 mm) e esterilizadas para posterior contaminação com biofilme composto por 5 bactérias (Actinomyces naeslundii, Veillonella dispar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans e S. oralis) e 1 fungo (Candida albicans). O preparo do inóculo foi feito por cultivo individual em Columbia Blood Agar suplementado com 5% de sangue de carneiro desfibrinado por 72 h a 37 ºC. As colônias formadas foram colocadas em 9 ml de meio FUM com glicose 0.3%. Após 15 h de incubação, alíquotas foram transferidas para novo meio FUM e incubadas por mais 7 h (bactérias em incubadora anaeróbica e C. albicans em aerobiose). As culturas finais dos microrganismos foram ajustadas a Densidade Ótica 550 de 1.0. Misturas de volumes iguais dos microrganismos

foram preparadas. Para formação do biofilme nos discos, estes foram incubados em 2 ml de saliva não estimulada por 4 h (formação de película adquirida), sendo esta previamente esterilizada por pasteurização: centrifugação (27,000 g, 4 ºC, por 30 min.); supernadante transferido para banho maria a 60 ºC por 30 min.; centrifugação novamente e congelamento a -20ºC do supernadante. As amostras com películas adquiridas foram transferidas para os poços contendo 0,225 ml do mix de espécies e 1,8 ml de meio (70:30 (v/v) mistura de saliva e meio FUM 0.3% glicose - adesão) e incubadas por 64,5 h a 37 ºC. Os meios foram trocados em 16.5 h e 40.5 h com mistura 70:30 (v/v) de saliva e meio FUM com 0.15% glicose e 0.15% sacarose (crescimento biofilme), sendo as amostras lavadas em solução salina entre as trocas de meio. Amostras do grupo experimental foram imersas em higienizador de prótese por 3 min, por 7 dias e as do grupo controle não houve tratamento, sendo todas os biofilmes analisados nos dias

1, 4 e 7, nos quesitos números de microrganismos e concentração de polissacarídeos. Análises em microscópio confocal (CLSM) e de varredura (SEM) foram realizadas. Para este último, duas amostras de cada grupo foram fixadas durante a noite em solução de Karnovsky, sendo o biofilme das amostras desidratados por meio de banho em etanol por 5 min., seriadamente em 60%, 80% e 90%, e 10 min em etanol 100%. Após secagem foram metalizadas com ouro. A contagem total de microrganismos e individual de bactérias do grupo experimental foi reduzida quando comparada ao grupo controle no período total. Para ambos os grupos, a contagem total de microrganismos e S. mutans aumentaram após 7 dias e A. naeslundii aumentou após este período para o grupo experimental. F. nucleatum diminuiu no grupo controle, e não houve diferença para S. oralis. Comparado ao grupo controle, que houve diminuição de células de C. albicans durante o período e ausência destas após 7 dias, o experimental apresentou maior número deste fungo no biofilme. Biofilme mais poroso e com aspecto irregular se apresentou no grupo experimental comparado ao outro grupo nos dias 4 e 7. Concentração de polissacarídeos foi significativamente maior no grupo experimental após 7 dias. Os autores concluíram, após análise dos resultados, que houve diminuição do número total de microrganismos quando houve exposição ao higienizador de próteses, mas aumentou a contagem de C. albicans.

3 Proposição:

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da irradiação de microondas na desinfecção de próteses totais colonizadas por biofilme multiespécies.

4 Materiais e Métodos:

4.1. Delineamento Experimental

Foi realizado um experimento in vitro, cego quanto às análises dos resultados em relação aos grupos controle e experimental e randomizado quanto à distribuição das amostras nestes grupos. Discos de polimetilmetacrilato (PMMA) foram confeccionados e padronizados quanto à rugosidade de superficie. Os discos foram aleatoriamente distribuídos em grupos controle e experimental, com e sem exposição à energia de microondas, respectivamente. Sobre os discos de PMMA foram desenvolvidos biofilmes multiespécies composto por Actinomyces naeslunddi, Veillonella dispar, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutans e Streptococcus oralis e Candida albicans, pelo período de 64,5 horas. Após este período, os discos foram encaixados em bases internas de próteses totais, as quais foram imersas em água destilada onde permaneceram por 3 minutos, na ausência de exposição à energia de microondas (grupo controle) ou submetidos à exposição com potência de 450 W por 3 minutos (grupo experimental) (Senna et al., 2010). Após o tratamento, os discos foram sonicados individualmente em solução salina a 7 W por 30 s, para desagregação do biofilme. O sonicado foi utilizado para fazer a diluição seriada em meios de cultura seletivos e para microrganismos totais. Em seguida, as placas para F. nucleatum, V. dispar e microrganismos totais foram incubadas por 72 h, a 37 ºC em estufa de anaerobiose e, as placas para S. mutans, S. oralis, A. naeslundii e C. albicans em estufa de microaerofilia por 48 h a 37 ºC. O número de microrganismos viáveis aderidos as superfícies dos discos foram avaliados pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/ml). Para análise estrutural do biofilme da superfície dos discos do grupo controle e experimental, foram obtidas imagens por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Esse estudo possui aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (Protocolo No. 039/2014) devido a necessidade de uso de saliva humana.

4.2. Preparação dos espécimes

Quarenta e dois discos de PMMA (10 mm x 2 mm) foram confeccionados a partir de resina acrílica termopolimerizável (QC-20 PMMA; Dentsply Ltd., Weybridge, England) manipulada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando-se uma matriz metálica padrão (Fig 1). Os discos foram padronizados quanto à rugosidade de superfície através do polimento dos discos realizado por meio de uma politriz horizontal (modelo APL-4; Arotec, São Paulo, Brasil) utilizando-se lixas de óxido de alumínio com granulações de 320,

400 e 600 em ambos os lados (Fig 2). Posteriormente, estes foram submersos em água destilada por 48 h a 23 ± 1,0 ºC para liberação de monômero residual.

Fig 1: Matriz metálica sendo utilizada para confecção dos discos em PMMA

Fig 2: Politriz horizontal utilizada para polimento dos discos em PMMA

Para mensuração da rugosidade de superfície utilizou-se o rugosímetro (Surfcorder SE 1700; Kosaka Laboratory Ltd., Kosaka, Japão) com diâmetro da ponta ativa de 2 µm, precisão de 0.01 µm de resolução e velocidade de 0.5 mm/s, sob pressão constante de 0.07 N. Três leituras ao longo de 0.8 mm nos corpos de provas foram obtidas em ambas as superfícies e a média aritmética da rugosidade de cada disco foi calculada, obtendo-se um valor de 0,32 ± 0,03 µm (Ra). A rugosidade de superfície foi utilizada para padronização dos discos utilizados nos experimentos.

Os discos foram colocados em placas de 24 poços e a esterilização destes foi realizada por imersão em hipoclorito de Sódio 5% pelo período de 20 minutos. Em seguida, foram transferidos para outra placa de 24 poços onde permaneceram em água estéril por 20 minutos, em banho de ultrassom (modelo T740; Thornton-INPEC Eletrônica, Vinhedo, Brasil). Após esterilizados, os discos ficaram armazenados em placa de 24 poços estéril e vedada até o início dos experimentos.

4.3. Confecção das réplicas das próteses totais superiores

Por meio de um modelo mestre metálico padrão, foram confeccionadas 6 réplicas de próteses totais superiores em resina acrílica termopolimerizável, que após reação de presa, foram submetidas aos procedimentos de acabamento e polimento e imersas em água, por 48 h a 23 ± 1,0 ºC, para liberação de monômero residual. As réplicas possuíam 7 nichos (11 mm x 2 mm) para acomodação dos discos com biofilme na etapa de desinfecção (Fig. 3). As próteses foram esterilizadas por óxido de etileno (ACECIL Comércio e Esterilização de Óxido de Etileno Ltda, Campinas, Brasil) (Senna et al., 2010).

4.4. Coleta de saliva

Foram selecionados para a coleta de saliva estimulada os voluntários que preencheram os seguintes critérios de inclusão: ser saudável e não fazer utilização de antibióticos, antifúngicos, antissépticos bucais ou medicamentos que possam alterar o fluxo salivar nos 3 meses prévios à coleta. Os voluntários foram solicitados a realizarem, em jejum, a coleta da saliva não estimulada pelo período de 1h em tubos Falcon. Após a coleta, os tubos com saliva permaneceram congelados a -20 ºC. Após vários dias de coleta, a saliva foi descongelada e o seu pool pausteurizado. Para pausterização da saliva, um total de 500 ml de saliva foi centrifugado (MR23i, JOUAN, Colorado, USA), a 27,000 g por 30 min a 4 ºC onde, o precipitado foi descartado e o sobrenadante permaneceu a 60 ºC por 30 min em banho-maria (Fig. 4). Em seguida, a saliva foi centrifugada novamente a 27,000 g por 30 minutos a 4 ºC. O

Fig. 3: Réplica da prótese total superior confeccionada em resina acrílica termopolimerizável e nichos para alocação dos discos de PMMA.

pellet resultante foi descartado e a saliva transferida para novos tubos Falcons estéreis e estocada a -20 ºC até o início do experimento. (Guggenheim et al., 2001).

Após o processo de pasteurização da saliva, três alíquotas da saliva recém pausterizada foram semeadas em meio sólido de Columbia Blood Ágar (CBA) com 5 % de sangue de carneiro desfibrinado e incubados, aeróbica e anaerobicamente, a 37 ºC, com o intuito de confirmar a esterilidade da mesma. Após 72 h, constatou-se ausência de unidades formadoras de colônias (UFC), ratificando a esterilização da saliva.

4.5. Preparo do inóculo

O biofilme multiespécie foi desenvolvido de acordo com o modelo de Zurich (Guggenheim et al., 2001). Cinco espécies de bactérias foram utilizadas no experimento, sendo elas Actinomyces naeslunddi OMZ745, Veillonella dispar OMZ493, Fusobacterium nucleatum OMZ596, Streptococcus mutans UA 159 e Streptococcus oralis OMZ 607 e uma espécie de fungo Candida albicans OMZ 110, todos obtidos do departamento de Bioquímica da Faculdade