Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Uma análise qualitativa da bioarquitetura do biofilme foi realizada utilizando imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Após o processo de desinfecção, os biofilmes sobre os discos foram lavados com PBS e cuidadosamente fixados com solução de Karnovsky 4% para manter a estrutura do biofilme. As amostras foram desidratadas numa série de lavagens de etanol (50, 60, 70, 80, 90 e 100% de etanol), durante 5 min cada. Em seguida, as amostras foram secas ao ar antes da pulverização catódica de ouro no tempo de 120 segundos (Fig. 11). A estrutura do biofilme foi visualizada utilizando um microscópio eletrônico de varredura (JSM 5600LV, JEOL, Tóquio, Japão), em modo de alto vácuo a 15 kV. As imagens foram obtidas com magnificação de 450 vezes, 5 e 7 mil vezes.

Fig. 11: Pulverização catódica de ouro das amostras para posterior visualização das mesmas em microscópio óptico de varredura (MEV).

5 Análise Estatística

Após análise dos dados pelo teste de Kolmogorov-smirnov, verificou-se a igualdade de variâncias e distribuição normal dos dados, os dados foram comparados por teste T de Student, com nível de significância de 5 % (SPSS Statistic 20.0).

6 Resultados

Comparando-se a contagem de microrganismos totais entre o grupo controle e experimental, notou-se que houve redução para o grupo exposto à irradiação por microondas (p<0,05) (Fig. 12; Tabela 1).

Analisando-se os microrganismos individualmente, foi possível observar que no grupo experimental houve diminuição efetiva na contagem destes (p<0,05), demonstrando não haver predileção por tipo de microrganismo neste método de desinfecção (p<0,05) (Fig. 12; Tabela 1).

As imagens por MEV ilustram a organização do biofilme multiespécie bem como os resultados da desinfecção por energia de microondas. Foi possível visualizar no grupo controle camadas densas dos microrganismos, com bioarquitetura organizada (Fig. 13 - a;b). Já para o grupo submetido à energia de microondas, as imagens ilustram a presença de biofilme desorganizado e a presença de células bem espaçadas (Fig 13 - c;d). A presença dos microrganismos na superfície dos discos do grupo experimental se justifica pela não remoção das células lisadas da superfície da amostra após o processo de desinfecção por irradiação de microondas (Fig. 13d; Fig. 14).

Espécies que compõem o biofilme multiespécies

S. mutans S. oralis C. albicans V. dispar A. naeslundii F. nucleatum Microrganismos totais

Controle 3,07E+07 a 8,98E+07 a 1,03E+04 a 7,16E+02 a 9,96E+07 a 7,76E+02 a 7,11E+07 a

Experimental 0,00E+00 b 0,00E+00 b 0,00E+00 b 0,00E+00 b 0,00E+00 b 0,00E+00 b 0,00E+00 b

Fig. 12: nº de microrganismos no grupo controle e experimental após ensaio

* indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre o grupo controle e o experimental * * * * * * *

A

_B

C

D

A: Grupo controle: aumento de 450 vezes. B: Grupo controle: aumento de 5000 vezes. C: Grupo experimental: aumento de 450 vezes. D: Grupo experimental: aumento 5000 vezes. Em A, nota-se a presença de biofilme distribuído por todo o espécime; em B, nota-se de forma densa

a presença de biofilme denso e organizado; Em C, pode-se averiguar a ausência de biofilme sobre a superfície da amostra, podendo-se notar as ranhuras advindas do processo de polimento do espécime (setas) e, em D, constata-se a presença de poucas células, lisadas, sobre a superfície da amostra (setas).

Fig. 14: Fotoeletromicrografias de espécime colonizado por biofilme multiespécies após tratamento com microondas (grupo experimental)

Legenda: Aumento de 7000 vezes. Nota-se a presença de células lisadas sobre a superfície da

Alguns estudos ressaltaram a importância da avaliação do método de desinfecção por meio de microondas em biofilmes multiespécies (Webb et al., 1998; Campanha et al., 2007), uma vez que a maioria dos experimentos utilizaram em suas metodologias apenas biofilme de Candida ssp. (Dixon et al., 1999; Banting e Hill, 2001; Campanha et al., 2007; Nappelenbroek et al., 2008; Sanita et al., 2008; Buergers et al., 2008; Kassab et al., 2009; Senna et al., 2010; Senna et al., 2012; Sanitá et al. 2012; Al-Saadi et al., 2014), Stafilococcus aureus (Altieri et al., 2012) ou diversos microrganismos cultivados separadamente em biofilmes monoespécies, tais como S. aureus, P. aeroginosa, B. subtilis (Silva et al., 2006; Mima et al., 2008; Dovigo et al., 2009) e S. gordonii (Webb et al., 1998). Na literatura, houve poucos autores que desenvolveram pesquisas com biofilmes multiespécies de forma conjunta, porém um estudo não especificou de forma clara as espécies de microrganismos cultivadas no experimento (Sesma et al., 2013), o outro utilizou-se apenas de espécies de Candida spp (Silva et al., 2012) e, Ribeiro et al., em 2009, espécies de Streptococcus spp e Candida spp. O biofilme multiespécies deste estudo foi desenvolvido de acordo com o modelo de Zurich (Guggenheim et al., 2001) e simulou as condições da microbiota oral permitindo uma melhor avaliação do processo de desinfecção por energia de microondas comparado aos biofilmes das pesquisas anteriores (Senna et al., 2010; Sanitá et al., 2012; Dantas et al., 2014). Foi o primeiro estudo, in vitro, a utilizar um modelo de biofilme multiespécies, desenvolvido sobre material de confecção de próteses (PMMA), que foram submetidos ao processo de desinfecção por microondas, permitindo, assim, a análise das mudanças ecológicas ocorridas neste biofilme que simula o da cavidade oral.

Por meio de análise de microscópio estereoscópico não se observaram formações de UFCs, indicando acentuada desinfecção das amostras submetidas à irradiação de microondas na potência de 450 W, por 3 min, estando de acordo com resultados de outros autores que também não averiguaram células viáveis após exposição de biofilme monoespécie de C. albicans à irradiação de microondas na potência de 450W, por 3 min (Senna et al., 2012) e 5 min. (Al-Saadi et al., 2014). Este processo ocorreu devido às alterações causadas pela irradiação na estrutura celular, modificação na permeabilidade da membrana e mortes das células (efeito térmico) ou por interação de moléculas bioquímicas com o campo eletromagnético que conduziram à lise celular abaixo da temperatura crítica de destruição termal, conhecido como efeito não térmico (Brondani et al., 2010). Campanha et al., em 2007, também constataram células prejudicadas pela irradiação de microondas (650 W/6 min.), observando-se liberação de

consequente inativação do fungo C. albicans. A redução no número de microrganismos totais e individuais no grupo experimental em relação ao controle, em nosso estudo, corroboraram com os resultados encontrados em pesquisas anteriores que apontaram o microondas como método efetivo para desinfecção de amostras com microrganismos (Rohrer e Bulard, 1985; Dixon et al., 1999; Sanitá et al., 2008; Senna et al., 2012; Dantas et al., 2014). Ribeiro et al., em 2009, relataram redução de S. mutans após irradiação de microondas em estudo in vivo, também estando de acordo com nossos achados.

Na literatura, autores que compararam energia de microondas com outros métodos de desinfecção de corpos de provas contaminados com microrganismos, obtiveram resultados promissores na efetividade do processo de desinfecção por meio da irradiação, estando de acordo com nossos resultados no quesito de sucesso do processo de redução dos seres colonizadores. Dentre os métodos comparados mais comuns de desinfecção pôde-se encontrar imersão dos espécimes em Hipoclorito de Sódio 0.02%, 0.0125% (Webb et al., 1998), 0.05% (Kassab et al., 2009), 1% (Altieri et al., 2012), 5,25% e 1:420 (Al-Saadi et al., 2104) ou em Clorexidina 0,2% (Banting e Hill, 2001; Kassab et al., 2009; Al-Saadi et al., 2012) e 2% (Altieri et al., 2012), bem como aplicação de antifúngico nas amostras e/ou palato, tais como Miconazol (Nappelenbroek et al., 2008) ou Nistatina (Banting e Hill, 2001; Silva et al., 2012; Sanitá et al., 2012). Além do grande desempenho do microondas em desinfectar espécimes, estudos também ressaltaram vantagens do método devido à simplicidade e rapidez na utilização (Rohrer e Bulard, 1985; Sanita et al., 2008), bem como por ser um meio barato, conveniente e prático (Banting e Hill, 2001), que também evita efeitos indesejáveis que estão presentes nos antifúngicos, tais como seleção natural, náuseas, vômitos, toxicicidade nefrológica, hepática, fungemia, pneumonia aspirativa (Silva el al., 2012) e alteração de cor da base das próteses (Kassab et al., 2009).

Análises em MEV das amostras do grupo experimental, após tratamento, revelaram presença de algumas células mortas, isso se deve ao fato de que apesar da energia de microondas lisar os microrganismos, esta não removeu completamente os microrganismos mortos da superfície, corroborando com conclusões de outros autores que afirmaram que houve menor eficiência de remoção de células mortas dos corpos de prova quando compararam com desinfecção por meio de higienizadores de próteses (Webb et al.,1998; Nappelenbroek et al., 2008; Sema et al., 2013). De modo que, a escovação manual das próteses, com escova macia,

de eliminar as poucas células mortas depositadas sobre a superfície.

Pesquisas apontaram que não houve diferenças estatísticas significantes entre métodos de desinfecções com microondas e aplicação de Nistatina (Sanita et al., 2012) ou Clorexidina 0,2%, a longo e curto prazo (Altieri et al., 2012), portanto, podemos ressaltar que o tratamento da candidose oral por meio de irradiação de microondas pode ser utilizado de forma segura como um meio alternativo, complementar e efetivo de desinfecção pelos usuários de próteses. Além disso, o microondas é um utensílio doméstico comum nos dias atuais, o que reduz gastos com compra de antimicrobianos por parte dos portadores de próteses bucais.

8 Conclusão

A energia de microondas pode ser considerada um eficiente método de desinfecção em biofilmes multiespécies desenvolvidos sobre a superfície de prótese dental.

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EXPERIMENTO 1 S. mutans S. oralis C. albicans V. díspar A. naeslundii F. nucleatum Microrganismos totais

Controle 3,13E+07 8,87E+07 1,32E+04 8,33E+02 7,47E+07 6,73E+02 6,73E+07

Experimental 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00

EXPERIMENTO 2 S. mutans S. oralis C. albicans V. díspar A. naeslundii F. nucleatum Microrganismos totais

Controle 3,03E+07 9,13E+07 8,53E+03 5,27E+02 1,33E+08 9,20E+02 7,60E+07

Experimental 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00

EXPERIMENTO 3 S. mutans S. oralis C. albicans V. díspar A. naeslundii F. nucleatum Microrganismos totais

Controle 3,03E+07 8,93E+07 9,27E+03 7,87E+02 9,07E+07 7,33E+02 7,00E+07

Legendas: aumento de 4500 vezes. Nota-se presença densa de biofilme na superfície do

espécime.

Fig. 15: Fotoeletromicrografias de espécime colonizado por biofilme multiespécies após o tratamento (grupo controle)

Legenda: aumento de 4500 vezes. Nota-se escassa quantidade de células mortas sobre a

superfície do espécime (setas).

Legendas: Estufa de anaerobiose (85% N2, 10% H2, 5% CO2) utilizada para incubação das

bactérias.

Legendas: Balança utilizada para dosagem da saliva em dois recipientes para centrifugação.

Fig. 17: estufa de anaerobiose

Legenda: Centrífuga MR23i, JOUAN, Colorado, USA, a 27,000g por 30 min a 4ºC.

Legenda: Discos em PMMA sendo submetidos à energia de microondas (450 W / 3 min.).

Fig. 19: Centrífuga utilizada para o processo de pasteurização da saliva.