aula 11 genoma 2

(1)

Duplicação

Transferência vertical de genes;

Replicação semi-conservativa, simétrica, e bidirecional;

origem oriC;

envolve cerca a de 20 proteínas;

proteína DnaA (desnatura o DNA na origem em conjunto com

outras proteínas;

o restante da desnaturação é realizada pela helicase;

proteínas SSB (single-strand binding);

DNA primase;

topoisomerase IV (separa as duas moléculas filhas)

segregação envolve a proteína Spo0J que se liga a oriC e

move para os polos a origem de replicação durante a divisão

celular.

(2)

Replicação do DNA

-DNA se duplica antes da divisão celular -Replicação

Semiconservativa= cada cadeia parental serve como molde para síntese

da cadeia complementar

Geralmente simétrica= quando circular, o cromossomo permanece circular

durante toda replicação

Bidirecional= ocorre em ambas as direções a partir de uma única

(3)

(4)

Replissomo

topoisomerases

helicase

Proteínas

SSB

_{DNA polimerases}

Primase

(5)

Proteínas presentes na forquilha de Replicação de

E.coli

SSB Liga a fita simples de DNA

DnaB (helicase) Desenrola o DNA

Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNA DNA Polimerase III Sintese da fita nova

DNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os primers DNA Ligase Liga os fragmentos

DNA girase Superenrolamento

A helicase é uma enzima que quebra as ligações em ponte de hidrogênio entre as bases purinas ou

pirimidicas de ambas as cadias de DNA, fazendo com que estas se separem. Esta enzima move-se ao longo da cadeia dupla de DNA utilizando energia da hidrólise de ATP para separar as duas cadeias da molécula.

(6)

Origem de replicação

-

oriC

(sequência de bases rica em pares A+T)

-Reconhecida por proteínas que iniciam o complexo de duplicação

Replissomo

= complexo de mais de 20 proteínas diferentes

que atuam no processo de replicação

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

Replicação do DNA

Término da replicação= terC

Separação das moléculas catalizada Pela enzima topoisomerase IV

Endonuclease que cliva as Cadeias de DNA liberando-as

(12)

Segregação ou partição

-Extremamente eficiente= células bacterianas desprovidas de

nucleóide

-Detalhes do mecanismo não são conhecidos

-Estudos em E. coli Bacillus subtilis e Caulobacter crescentus

-Não foi encontrado aparato como aparelho mitótico

(microtúbulos, proteínas motoras)

(13)

Segregação ou partição

-Em Bacillus subtilis= proteína Spo OJ interage com sequências

próximas a região OriC

Movimento dos nucleóides acoplado a duplicação do DNA

Spo 0J = pode desempenhar papel do movimento dos nucleóides para os pólos da célula

(14)

(15)

DNA extracromossômico ou plasmídeo

Plasmídeo

-Molécula de DNA de fita dupla -Geralmente circular

-Tamanho variável= 2 a 200 kb

-Número de plasmídeos por célula varia (em geral plasmídeos maiores em menor número e menores em maior número de cópias)

-É estável e se mantém em estado autônomo na célula

-Duplicação semiconservativa e independente da duplicação do DNA cromossômico

(16)

-Origem de replicação= OriV

-Proteínas envolvidas na duplicação

-Proteína Rep= codificada por genes do plasmídeo

-Proteínas codificadas por genes cromossomais

-Replicação pode ser:

-Simétrica bidirecional -Simétrica unidirecional -Assimétrica unidirecional

Plasmídeo

Duplicação

(17)

São elementos facultativos ou acessórios (presença na célula não é essencial)

Plasmídeo

Podem conferir às células características fenotípicas adicionais -Fertilidade: capacidade de se conjugar

-Produção de bacteriocinas

-Resistência a drogas e íons de metais pesados -Resistência a radiação UV

-Utilização de carbohidratos

-Degradação de hidrocarbonetos -Produção de antibióticos

-Produção de fimbrias de adesão a tecidos e outras superfícies -Produção de enterotoxinas

-Produção de hemolisinas -Fixação de nitrogênio

(18)

(19)

Variabilidade genética nas

populações de procariotos

Variabilidade genética é importante para evolução

-Aparecimento de características fenotípicas novas

-Aumento da biodiversidade

Maior vantagem dos organismos em ambientes diferentes

Variabilidade em procariotos

Mutação

(20)

Mutação

Mudanças na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA

Substituição, deleção ou inserção de nucleotídeos

Produzem alelos variantes de um gene

Na maioria dos casos podem produzir mudança na

sequência de aminoácidos da proteína

(21)

-Erros no processo de duplicação do DNA

-Danos químicos ao material genético

-Alterações por elementos de transposição

(22)

Tipos de mutação que podem ocorrer em um gene

Substituição de bases

Mutações que alteram a sequência de leitura das bases

(frameshifts)

(23)

(24)

fenilalanin a leucina tirosina stop histidina glutamina asparagin a ácido aspártico ácido glutâmico leucina valina treonina alanina serina prolina glicina arginina arginina serina cisteína lisina stop triptofan o metionin a isoleucina

(25)

Substituição de bases

Frequentemente mutações de ponto (substituição de um nucleotídeo por outro)

Transições= purina por purina

(mais comuns) pirimidina por pirimidina

Transversões= purina por pirimidina vice-versa

(26)

Mutações silenciosas: códons sinônimos (código genético

degenerado);

Mutações missense (sentido alterado)

Mutações nonsense (sem sentido)

(27)

Substituição de bases

Mutação de ponto silenciosa

Mutação missense (sentido alterado)

Mutação nonsense (sem sentido)

(28)

(29)

Mutações que alteram a sequência de leitura das bases

(frameshifts)

A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A A C G C A G A T A T C A G C T A Quadro de leitura +1 Quadro de leitura +2 Quadro de leitura +3 Quadro de leitura -1 Quadro de leitura -3 Quadro de leitura -2 A C G C A G A T A T C A G C T A Fita de DNA

(30)

Mutações que alteram a sequência de leitura das bases

(frameshifts)

Inserção

(31)

(32)

Mutações espontâneas x mutações induzidas

Mutações espontâneas

=

Ocorrem sem participação de agente externo Geralmente causadas por:

-Erros na DNA polimerase

(raras=10-6 _{a 10-}11 _{por ciclo de duplicação= em determinado sítio)}

-Danos ao DNA a partir de hidrólise e desaminação

(mais comum= desaminação espontânea da citosina gerando o uracil)

-Elementos de transposição

Mutações induzidas

=

Ocorrem devido a ação de agentes externos -Radiação UV

(33)

Elementos de transposição

-Encontrados sempre associados a uma molécula de DNA e nunca de forma livre

-Apresentam geralmente terminais com repetições invertidas cujo tamanho varia de 8 a 48 pb

(34)

Elementos de transposição podem transpor-se:

-de uma posição para outra dentro de uma mesma molécula de DNA (transposição intramolecular)

-Ou para outra molécula de DNA diferente (transposição intermolecular)

-Transposição é frequentemente associada de duplicação da sequência de nucleotídeos do sítio alvo (sequência duplicada= 2 a 14 pb)

-Maioria dos elementos de transposição apresenta transposição múltipla randômica= inserção de forma aleatória

(35)

Classes mais frequentes de elementos

de transposição dem procariotos

Sequências de Inserção ou elemensto IS

(Sigla IS seguida de número: IS1, IS2, IS3…)

Transposons

Designados pela sigla Tn acompanhada de um número em itálicoTn1, Tn2

(36)

Sequências de Inserção ou elemensto IS

(Insertion sequence = IS)

-Encontradas em cromossomos, plasmídeos ou DNA de fagos -Geralmente menores que 2 Kb

-Só possuem genes relacionados com o processo de transposição= transposase

IS são elementos simples compostos de 700-1500 pb

(37)

IS Element

Length

(bp)

Inverted

Repeats

Target

Site size

No. of copies in

E. coli

chromoso

me

F plas

mid

IS1

768 20/23

9 5 - 8

IS2

1327

32/41

5

1 IS3

1258

39/39

3

5

2 IS4

1426

16/18

11, 12 or

14 1 or 2

IS5

1195

15/16

4 abundant

IS10 R

1329

17/22

9

(38)

Transposons

-Encontrados frequentemente em plasmídeos, mas podem estar integrados no DNA cromossômico ou DNA de fagos

-Geralmente maiores que 2 Kb

-Possuem outros genes além dos genes envolvidos com o processo de transposição

-Resistência a drogas é o fenótipo mais frequentemente associado aos transposons

(39)

[

24-40

]

5000 bp

-Transposons simples são elementos similares a sequências IS

-Contém segmentos de DNA flanqueados por sequências repetidas invertidas.

-No entanto o segmento de DNA codifica mais de um produto gênico

Transposon simples

(40)

Transpo

son

Antibiotic or other resistance

marker

Length

(bp)

Inverted

Repeat

Tn1

ampicillin

4957

Tn3

ampicillin

4957

38 bp

Tn501

Hg resistance

8200

38 bp

Tn7

trimethoprim, spectinomycin &

streptomycin

14000

30 bp

gamma-delta

6000

35 bp

(41)

-Tranposons compostos são segmentos de DNA flanqueados por

IS elementos nas extremidades.

-Somente um elemento IS possui transposase

-Elemento IS pode estar:

• mesma direção (repetições diretas)

• ou em direções opostas (repetições invertidas)

(42)

Transposon composto

Repetições diretas

(43)

Transpo

son

Antibiotic or other resistance

marker

Length

(bp)

Inverted

Repeat

Tn5

kanamycin

5700

IS50

Tn9

chloramphenicol

2638

IS1

Tn10

tetracycline

9300

IS10

(44)

Mecanismos de transposição

Transposição conservativa (não replicativa)

Transposon deixa o sítio aonde está inserido e

é inserido em uma nova região do cromossoma (sítio alvo)

Transposição duplicativa

(45)

Transposição conservativa

(não replicativa)

(46)

(47)

(48)

Elementos de transposição como

agentes mutagênicos

-Quando introduzidos na célula o número de cópias de transposons pode aumentar pelos mecanismos de transposição

Fixação do elemento na célula

Transferência para outros microrganimos

Eventos de transposição põe em risco a sobrevivência da célula Responsáveis por 5 a 15% da mutações espontânceas que ocorrem no genoma de procariotos

(49)

Mutações causadas por inserção de transposons

-Transposons podem ser inseridos dentro de sequências codificadoras de genes, de sequências reguladoras (ex: promotor)

-Transposons podem ser inseridos dentro de sequências

Devido a esta capacidade muitos transposons são usados

em laboratório para mutações no genoma de microrganismos

(50)

(51)

Mecanismos de transferência de DNA entre procariotos

Troca de material genético entre bactérias contribui para variabilidade

Geralmente resultante da recombinação de sequências homólogas (mediada pelo sistema de recombinação Rec)

-Bactérias recebem DNA exógeno

-Formação de merozigotos (diplóides parciais) -Recombinação

(52)

Mecanismos de transferência de DNA em procariotos

Transformação

Conjugação

Transdução

(53)

Transformação

DNA livre (oriundo de uma célula doadora= geralmente morta

e lisada), integra-se no genoma de uma célula receptora

Gram-positiva

Gram-negativa

ligação ligação passagem para o periplasma transporte e degradação fragmentação transporte e degradação

(54)

Etapas da transformação

-Formação de célula competente

-Adsorção do DNA as células receptoras

-Penetração do DNA

(55)

(56)

Formação de célula competente

-

Célula capaz de receber DNA exógeno

- Estado transitório em que acontece mudanças significativas no envelope celular= aparecimento de protéinas com funções variadas

Em Gram-positivas

-Organismos mais estudados: Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus sanguis e Bacillus subtilis

-Produção de fator de competência que se liga a proteína receptora na membrana e induz síntese de novas proteínas envolvidas no estado de competência (10 a 16 proteínas)

Em Gram-positivas

(57)

(58)

Adsorção do DNA às células receptoras

-

DNA liberado por células mortas (lise)

ou por células vivas (mecanismo de liberação não conhecido)

- Estado transitório em que acontece mudanças significativas no envelope celular= aparecimento de protéinas com funções variadas

(59)

Proteína receptora reconhece DNA

Outras proteínas formam estrutura que atravessa a parede celular

(permite acesso do DNA ao receptor)

Nuclease= degrada uma das fitas do DNA

DNA de fita simples passa por poro formado por proteínas envolvidas no transporte Incorporação a partir da Extremidade 3’

Gram positivas

: adsorção e penetração

Proteína de eclipse se associa ao DNA -Impede degradação por nucleases -Impede pareamento de bases

(60)

Gram negativas

: adsorção e penetração

Semelhante a gram positivas

No entanto DNA entra no periplasma através de poro na membrana

externa fomado por proteínas secretinas

(61)

Integração do DNA

-Recombinação entre DNA exógeno e endógeno

-Deve haver homologia de sequências= pareamento de bases

-Segmento de DNA endógeno será substituído por segmento

exógeno

(62)

Transfomação de bactérias

in vitro

-Eletroporação= células de bactéria submetidas a choque elétrico cria poros na membrana

-Via protoplastos= Protoplastos são células bacterianas sem parede celular

-Esferoplastos= Arqueas desprovidas de camada S ou pseudopeptidoglicana

-Choque térmico= Transformação em presença de CaCl₂ a OoC seguida de choque térmico a 42o_C

(63)

Conjugação

-DNA transferido de uma célula a outra por aparato de conjugação -Requer presença de plasmídeo de conjugação nas células doadoras

Plasmídeo F (fertilidade)

-Plasmídeos codificam moléculas ou estruturas presentes na superfície das células doadoras

Genes tra e trb

(64)

(65)

Etapas da conjugação

Estabelecimento de contato entre células

Diferente em Gram positivas e Gram negativas

-Célula doadora forma pilus sexual

(codificado por plasmídeo conjugativo)

-Pilus se liga a célula receptora:

-Tranferência do DNA -Estabilização de pares

(66)

(67)

Conjugação em bactérias gram positivas

-Plasmídeos em bactérias gram negativas podem promover conjugação em meio sólido ou líquido

-Mecanismo de conjugação em meio sólido não conhecido

-

Em meio líquido

= conjugação envolve resposta e ferormônios sexuais •Células receptoras secretam ferormônios sexuais

• Ferormônio se liga a receptor na célula doadora

•Células doadoras tornam-se aderentes= produção de substância de agregação colisão entre células (ao acaso)

(68)

Transferência do DNA

Etapas da conjugação

-Mecanismo mais estudado em gram positivas -Existência de dois complexos proteicos:

Relaxossomo

Gerado na oriT do plasmídeo

Contém proteínas codificadas pelo plasmídeo e pelo DNA cromossomal

Complexo de formação de pares (mpf)

(69)

-Enzima relaxase cliva uma ligação fosfodiéster em uma fita do plasmídeo na oriT

(origem de transferência)

-Após clivagem relaxase permanece ligada ao DNA na extremidade 5’ -Fita clivada é transferida para célula receptora- extremidade 5’

-Paralelamente ocorre:

-Separação das duas cadeias de DNA no plasmídeo -Duplicação do plasmídeo

(70)

(71)

Transferência de material cromossômico pode ocorrer

(com menor frequência)

Plasmídeo deve estar integrado

Bactérias que possuem plasmídeo Conjugativo integrado

Hfr (high frequency recombination) Alta frquência de recombinação

(72)

Transdução

Mecansismo de transferência de genes de bactérias mediado por bacteriófagos (ou fagos)

Bacteriófagos

-Vírus que infectam bactérias -Duas categorias;

Virulentos= lisam a célula

(73)

Capsídeo

-cabeça

-cauda

-apêndices

(74)

(75)

Ciclo biológicos

-Ciclo lítico

-Ciclo lisogênico

Ciclo lisogênico Ciclo lítico

Fago integrado

PROFAGO

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

Transdução Generalizada

(82)

(83)

(84)

(85)