Novos nucleosídeos antivirais: síntese e avaliação biológica

(1)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

MARALISE PERÍGOLO DE OLIVEIRA

Novos nucleosídeos antivirais: síntese e avaliação biológica

Recife

2014

(2)

MARALISE PERÍGOLO DE OLIVEIRA

Novos nucleosídeos antivirais: síntese e avaliação

biológica

Tese

de

Doutorado

apresentada

ao

Programa de Pós-Graduação em Inovação

Terapêutica, da Universidade Federal de

Pernambuco, para a obtenção do Título de

Doutor em Inovação Terapêutica

Orientador: Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta

Co-orientador: Prof. Dr. Jean Luc Décout

Recife

2014

(3)

Catalogação na fonte Elaine Barroso

CRB 1728

Oliveira, Maralise Perígolo de

Novos nucleosídeos antivirais: síntese e avaliação biológica/ André Seco Marques da Silva– Recife: O Autor, 2014.

289 folhas : il., fig., tab.

Orientador: Ivan da Rocha Pitta Coorientador: Jean Luc Décout

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Inovação Terapêutica, 2014. Inclui referências e apêndice

1. Agentes antivirais 2. Nucleosídeos 3. AIDS I. Pitta, Ivan da

Rocha (orientador) II. Décout, Jean Luc (coorientador) III. Título

615.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2016-180

(4)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

REITOR:

Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

VICE-REITOR:

Prof. Silvio Romero de Barros Marques

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO:

Prof. Francisco de Souza Ramos

DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

Profa_{. Maria Eduarda Lacerda Larrazábal da Silva}

VICE-DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

Profa_{. Oliane Maria Correia Magalhães}

COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA:

Prof. _{César Augusto Souza de Andrade}

VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA:

(5)

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome: Oliveira, Maralise Perígolo

Título: Novos nucleosídeos antivirais: síntese e avaliação biológica

Tese apresentada à Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutor em Inovação Terapêutica

Aprovada em: 22 / 12 / 2014

Banca Examinadora

Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta

Instituição: Universidade F ederal de Pernambuco

Assinatura:_________________________________________________ Prof. Dr. Jean-Luc DECOUT

Instituição: Université Jouseph Fourié

Assinatura:_________________________________________________ Profa. Dra. Marina da Rocha Pitta

Instituição: Universidade Federal de Pernambuco

Assinatura:_________________________________________________ Prof. Dr. Francisco Jaime Bezerra Mendonça Junior

Assinatura:_________________________________________________ Profa. Dr. Ricardo José Alves

Instituição: Universidade F ederal de Minas Gerais

Assinatura:_________________________________________________ Prof. Dr. Antônio Rodolfo de Faria

Assinatura:_________________________________________________ Prof. Dra. Ana Cristina Lima

(6)

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Mauro Maurício e Maria das Graças, que sempre estiveram ao meu lado e que são meus exemplos de vida.

Às minhas irmãs, Maise e Mauriane.

(7)

AGRADECIMENTOS

Aos professores Doutores Jean Luc Décout, Suely Lins Galdino, Ricardo José Alves, Ivan da Rocha Pitta, Maria do Carmo Alves de Lima, Vera Guarda pela orientação, amizade, confiança, apoio e incentivos constantes para realização deste trabalho e, sobretudo, pela inestimável contribuição à minha formação acadêmico-científica e pessoal.

As professoras Doutoras Cláudia Simões e Maíra Galdino pela colaboração na realização da avaliação da atividade biológica.

Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, do Departamento de Antibióticos da UFPE.

Aos meus amigos e colegas do Departément de Pharmacochimie Moleculaire da UJF-Grenoble-França.

Ao amigo Lucas Lopardi pela amizade e importante contribuição na realização dos experimentos de RMN.

A amiga Aline pela contribuição na realização do experimento de espectrometria de massa.

As minhas amigas Carol e Flavi pelo apoio e momentos que passamos juntas durante o doutorado sanduíche em Grenoble-França.

À Dominique pelo carinho, apoio e amizade. Agradeço por fazer parte da minha história.

Aos meus amigos, colegas e professores do Laboratório de Química Farmacêutica, da Escola de Farmácia da UFMG: Lucas, Ana Carolina, Stefânia, Flaviano, Bruno, Marcela, Saulo Andrande, Saulo, Thiago, Raquel, Dayara, Aline, Luan, professoras Renata e Thaís por me receber de braços abertos, pelos ensinamentos, pelos agradáveis momentos e pela colaboração direta ou indireta na realização de todas as etapas deste trabalho.

A todos aqueles não mencionados que, de alguma maneira, contribuíram de forma direta ou indireta na finalização deste trabalho.

(8)

RESUMO

A síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma doença infecciosa e desde que foi descoberta nos EUA, em 1981, a AIDS se espalhou rapidamente, sendo considerada uma epidemia mundial caracterizada por uma imunodeficiência severa, infecções oportunistas, neoplasia e um resultado fatal. Apesar de já ser empregado a multiterapia anti-HIV, tal tratamento farmacológico traz como inconveniente resistência já relatada aos antivirais e a toxicidade provocada por esses fármacos. Dessa forma, é um desafio para os pesquisadores a busca por fármacos mais eficazes e menos tóxicos.

A meta é minimizar o impacto dessa doença no Brasil e no mundo. Para tanto, conhecendo-se as propriedades dos tionucleosídeos, objetivou-se, no presente trabalho, a síntese, a caracterização e a avaliação da atividade antiviral e antitumoral de novos análogos tionucleosídeos da 5-metiluridina. A síntese dos análogos foi efetuada a partir de 2’,2-anidrotimidina. Reação deste composto com 2-(trimetilsilil)etanotiol na presença de carbonato de potássio, seguida da mesilação das hidroxilas de 3’ e 5’ forneceu o derivado dimesilado correspondente que, por reação com benzoato de sódio forneceu o tionucleosídeo 2’, 3’-didesidro correspondente, benzoilado em C-5’. Remoção do grupo benzoíla com hidróxido de potássio/metanol forneceu o nucleosídeo insaturado 2’,3’-didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-(2-trimetilsilil)etiltio)timidina. Substituindo-se o 2-(trimetilsilil)etanotiol pelo tiometóxido de sódio o tionucleosídeo insaturado correspondente foi obtido. Quando o derivado anidro foi submetido a reação com hidreto de sódio em DMF, seguida da reação do epóxido formado com 2-(trimetilsilil)etanotiol, obteve-se um intermediário de configuração D-xilo, contendo a cadeia sulfurada em C-3’. Reação desse

composto com carbonato de difenila em DMF, em presença de bicarbonato de sódio forneceu o derivado 2’,3’-insaturado correspondente, contendo o grupo fenoxicarbonila em C-5’. Esse intermediário foi convertido no tionucleosídeo insaturado correspondente de forma semelhante à descrita para a obtenção de 2’,3’-didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-(2-trimetilsilil)etiltio)timidina. Também nesse caso, a substituição de 2-(trimetilsilil)etanotiol pelo tiometóxido de sódio levou, ao final da síntese, ao tionucleosídeo insaturado contendo o grupo metiltio em

(9)

C-3’. Os produtos finais e alguns intermediários foram avaliados em testes de atividade citotóxica contra linhagem de células tumorais A549 (linhagem humana de câncer de pulmão). O intermediário 2’, 3’-didesidro benzoilado em C-5’ e derivado 2’,3’-insaturado contendo o grupo fenoxicarbonila em C-5’ destacaram-se entre os mais ativos da série, apresentando, respectivamente CC50 32,8 µM e 85,5 µM. Os testes de atividade contra o herpes vírus simplex

humano tipo I (HSV-I) estão em andamento. Os testes contra o HIV serão realizados oportunamente.

(10)

ABSTRACT

Acquired immune deficiency syndrome (AIDS) is an infectious disease and since its discovery in the USA in 1981, AIDS has spread rapidly and is considered a global epidemic characterized by severe immunodeficiency, opportunistic infections, cancer and a fatal outcome. Despite being already employed an anti-HIV multi-therapy, pharmacotherapy has drawbacks like viral resistance to antiviral drugs and drug toxicity. Thus, it is a challenge for researchers the search for more effective and less toxic drugs.The goal is to minimize the impact of this disease in Brazil and worldwide. To that end, knowing the properties of thionucleosides, the aim of the present work was the synthesis, characterization and evaluation of antiviral and antitumor activity of novel thionucleosides analogues of 5-methyluridine. Analogues synthesis was performed from 2', anhydrothymidine. Reaction of this compound with 2-(trimethylsilyl)ethanethiol in the presence of potassium carbonate, followed by mesylation of hydroxyl groups at 3' and 5' provided the corresponding mesylated derivative, which, by reaction with sodium benzoate, provided the corresponding 2',3'-didehydro, benzoylated at C-5'. Removal of benzoyl group with potassium hydroxide/methanol gave the unsaturated nucleoside 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxy-2'-(2-trimethylsilyl)ethylthio)thymidine. Replacing 2- (trimethylsilyl)ethanethiol by sodium thiomethoxide, the corresponding unsaturated thionucleoside was obtained. When the anhydro derivative was subjected to reaction with sodium hydride in DMF, followed by reaction of the epoxide formed with 2-(trimethylsilyl)ethanethiol, a D-xylo intermediate, with the

side chain at C-3' was obtained. Reaction of this compound with diphenyl carbonate in DMF in the presence of sodium bicarbonate provided the corresponding 2',3'-unsaturated derivative containing phenoxycarbonyl group at C-5'. This intermediate was converted to the corresponding unsaturated thionucleoside in a similar way to that described to obtain 2', 3'-didehydro-2',3'-dideoxy-2'- (trimethylsilyl)ethylthio)thymidine. Also in this case, replacing 2-(trimethylsilyl)ethanethiol by sodium thiomethoxide led to the unsaturated thionucleoside containing methylthio group at C-3'. Final and some intermediate compounds were evaluated for cytotoxicity activity against tumor cell line A549

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(human lung cancer strain). 2',3'-didehydro thionucleoside benzoylated at C-5' and 2',3'-unsaturated thionucleoside containing phenoxycarbonile group at C-5' derivative were the most active compounds in this series, presenting CC50

values of 32.8 µM and 85.5 µM, respectively. Tests for antiviral activity against human herpes simplex virus type I (HSV-I) are in progress. Anti-HIV screening will be conducted in the near future.

.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. As 10 principais causas de mortes no mundo em 2012 (WHO, 2014) ... 27 Figura 2. Estimativa do número de pessoas vivendo com AIDS em 2013 (UNAIDS, 2014) ... 28 Figura 3. Ciclo de vida resumido da replicação do vírus do HIV (Barbosa, AN 2013) ... 31 Figura 4.Estrutura da subunidade p66 e p51 e subdomínios da transcriptase reversa (L.MENEDEZ-ARIAS, 2010) ... 35 Figura 5. Incorporação de nucleotídeos e análogos de nucleotídeos naturais- Síntese e bloqueio da síntese de DNA viral ... 37 Figura 6. Fármacos anti-HIV – análogos de nucleosídeos inibidores da transcriptase reversa ... 39 Figura 7. Fármacos anti-HIV – análogos de nucleotídeos inibidores da transcriptase reversa ... 39 Figura 8. Fármacos anti-HIV – análogos não- nucleotídeos inibidores da transcriptase reversa ... 40 Figura 9. Estrutura do tionucleosídeo lamivudina e estavudina ... 41 Figura 10.Composto 67 ... 59 Figura 11. Espectro de RMN de 1_{H (400 MHz, CDCl}₃_{) do composto 63 obtido a}

partir do 66 ... 77 Figura 12. Espectro de RMN de 1_{H (400 MHz, CDCl}₃_{) do composto 63 obtido a}

partir do 65 ... 77 Figura 13. Espectro de RMN 13_{C de 63 usando a técnica J-Mod ... 78}

Figura 14. Espectro de RMN de 1_{H (400 MHz, CDCl}

3) RMN 13C (100 MHz,

CDCl3) do composto obtido após recristalização do derivado 84 ... 96

Figura 15. Comparação das constantes de acoplamento para os compostos 88 e 76 ... 103 Figura 16. Espectro de RMN para a tentativa de síntese do composto 81 a partir de 79 ... 108

(13)

Figura 17. Comparação das bandas no infravermelho dos compostos 102 e

produto formado na reação de cicloadição ... 121

Figura 18. Compostos 104 e 105 ... 122

Figura A.1 Espectro no IV de 61 ... 180

Figura A.2 Espectro de RMN de 1_{H (200 MHz, CDCl}₃_{) de 61 ... 181}

Figura A.3 Espectro de RMN de 13_{C (50 MHz, CDCl}₃_{) e DEPT 135 de 61 .... 182}

Figura A.6 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) de 13...185

Figura A.7 Espectro de RMN J-Mod (100 MHz, CDCl3) de 13 ... 186

Figura A.9 Espectro de RMN 1_{H (400 MHz, DMSO-d} 6) de 64 ... 188

Figura A.10 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, DMSO-d} 6) e DEPT 135 de 64 ... 189

Figura A.11 Mapa de contornos COSY (400 MHz, DMSO-d6) de 64 ... 190

Figura A.12 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, DMSO-d6) de 64 ... 191

Figura A.13 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, DMSO-d6) de 64 ... 192

Figura A.16 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) de 15 ... 195

Figura A.17 Mapa de contornos COSY e expansão (400 MHz, CDCl3) de 15 ... 196

Figura A.18 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, CDCl3) de 15 ... 197

Figura A.21 Espectro de RMN de 1_{H (200 MHz, DMSO-d}₆_{) de 23 ... 200}

Figura A.22 Espectro de RMN de 13_{C (50 MHz, DMSO-d}₆_{) de 23 ... 201}

Figura A.24 Espectro de RMN 1_{H (200 MHz, DMSO-d} 6) de 25 ... 203

Figura A.25 Espectro de RMN de 13_{C (50 MHz, DMSO-d} 6) de 25 ... 204

Figura A.27 Espectro de Massas por IES de 16 (M = 530) ... 205

Figura A.28 Espectro de RMN de 1_{H (200 MHz, CDCl} 3) de 16 ... 206

(14)

Figura A.29 Espectro de RMN de 13_{C (50 MHz, CDCl}₃_{) de 16 ... 207}

Figura A.32 Espectro de RMN 1_{H (400 MHz, CDCl}₃_{) de 65 ... 209}

Figura A.33 Espectro de RMN de 13_{C (50MHz, CDCl}₃_{) de 65...210}

Figura A.37 Espectro de RMN 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) de 63 ... 213

Figura A.38 Mapa de contornos COZY (400 MHz, CDCl3) de 63 ... 214

Figura A.39 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, CDCl3) de 63 . ... 215

Figura A.40 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, CDCl3) de 63 ... 216

Figura A.42 Espectro de Masas por IES de 75 (M=356) ... 217

Figura A.43Espectro de RMN de 1_{H (400 MHz, CDCl} 3) e RMN de 13C de 75 218 Figura A.44 Espectro no IV de 70 ... 219

Figura A.45 Espectro de Massas por IES de 70 (M=288) ... 219

Figura A.46 Espectro de RMN de 1_{H (400 MHz, DMSO-d} 6) de 70 ... 220

Figura A.47 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, DMSO-d}₆_{) de 70 ... 221}

Figura A.48 Mapa de contornos COSY (400 MHz, DMSO-d6) de 70 ... 222

Figura A.49 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, DMSO-d6) de 70 ... 223

Figura A.51 Espectro de Massas por IES de 71 ... 224

Figura A.52 Espectro de RMN de 13_{C(400 MHz, DMSO-d}₆_{) de 71 ... 225}

Figura A.53 Espectro no IV 72 ... 226

Figura A.59 Espectro no RMN de 1_{H (400 MHz, CDCl} 3) de 74 ... 229

Figura A.60 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) e DEPT de 74 ... 230

(15)

Figura A.63 Espectro de Massas por IES de 84 (M=476)... 232

Figura A.65 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl}₃_{) e J-Mod de 84 ... 234}

Figura A.66 Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) de 84 ... 235

Figura A.67 Mapa de contornos HMQC e expansão(400 MHz,CDCl3) de 84 236 Figura A.68 Espectro no IV de 86 ... 237

Figura A.74 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) e J-Mod de 87 ... 242

Figura A.76 Mapa de contornos HMQC (400 MHz, CDCL3) de 87 ... 244

Figura A.78Espectro de Massas por IES de 76 (M=613) ... 245

Figura A.80 Espectro de 13_{C (100 MHz, acetona-d}₆_{) de 76 ... 247}

Figura A.83 Espectro de Massas por IES de 77 (M= 716) ... 249

Figura A.88 Mapa de contornos COSY e HMQC (400 MHz, CDCl3) de 88 ... 254

Figura A.89 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) de 88 ... 255

Figura A.91 Espectro de RMN 1_{H (400 MHz, CDCl} 3) de 80 ... 257

(16)

Figura A.95 Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) de 80 ... 261

Figura A.111 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl} 3) e J-Mod 102 ... 273

Figura A.112 Mapa de contorno HMQC (400 MHz, CDCl3) de 102 ... 274

Figura A.114 Espectro de RMN de 1_{H (200 MHZ, CDCl} 3) de 101 ... 276

Figura A.115 Subespectro DEPT 135 de RMN 13_{C (50 MHz, CDCl}₃_{) de 101 277} Figura A.116 Espectro no IV de 105 ... 278

Figura A.118 Espectro de RMN de 13_{C (100 MHz, CDCl}₃_{) e DEPT 135 de 105} ... 280

Figura A.121Espectro de RMN de 13_{C(100 MHz, CDCl} 3) e DEPT 135 de 104 ... 283

(17)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fármacos e Medicamentos antiretrovirais correspondentes registrados pelo FDA, de 1907 a 2013 ... 33 Tabela 2. Comparação entre os deslocamentos químicos de H-1’, H-3’, H-5’, C-2’ e C-3’ das substâncias 15 e 63 ... 74 Tabela 3. Comparação entre os deslocamentoss químicos de H-1’ a H-4’ e C-1’ a C-4’ de 15 e 74 ... 92 Tabela 4. Comparação dos deslocamentos químicos de H-5’, -COOO- para os compostos 74, 75 e 12 ... 95 Tabela 5. Avaliação biológica na série dos nucleosídeos saturados ... 130 Tabela 6. Avaliação biológica na série dos nucleosídeos insaturados ... 131

(18)

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Fosforilação do AZT por quinases celulares ... 38

Esquema 2. Conversão do 2-(trimetilsilil)etanotiol (TMSES) em dissulfetos mistos ... 43

Esquema 3. Síntese do nucleosídeo insaturado 2’,3’-Didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-(2’’-(trimetilsilil)etio)tiotimidina 17 ... 44

Esquema 4. Síntese do nucleosídeo 19 ... 45

Esquema 5. Eliminação cis ... 45

Esquema 6. Síntese de nucleosídeo insaturado 27 ... 46

Esquema 7. Introdução do grupo ciano em posição 3’ e síntese de nucleosídeo insaturado 30 ... 46

Esquema 8. Formação do nucleosídeo insaturado 33 via abertura do 2,2’-anidro 32 ... 47

Esquema 9. Fluxo de elétrons na reação de cicloadição [2 + 2] ... 48

Esquema 10. Formação de dicloroceteno in situ ... 49

Esquema 11. Síntese da 1-H-Ciclobuta[α]naftalen-2-ona ... 50

Esquema 12. Síntese de derivados de ciclobutanona com cloreto de dicloroacetila em hexano ... 50

Esquema 13. Síntese de derivados de ciclobutanona com cloreto de dicloroacetila e trietilamina em tetracloreto de carbono ... 51

Esquema 14. Cicloadição do limoleno com cloreto de dicloroacetila e trietilamina ... 51

Esquema 15. Síntese de derivados de ciclobutanona pela reação de cicloadição fotoquímica a partir de 50 ... 52

Esquema 16. Síntese de derivados de ciclobutanona pela reação de cicloadição fotoquímica a partir de 53 ... 53

Esquema 17. Obtenção de dissulfetos mistos a partir de 17 e formação do tiol 57 ... 55

Esquema 18. Esquema para a síntese de 2-(trimetilsilil)etanotiol 13 ... 56

Esquema 19. Esquema para a síntese de 17... 57

(19)

Esquema 21. Esquema para a síntese de 17 a partir de 15 ... 58

Esquema 22. Esquema para a síntese de 4 ... 60

Esquema 25. Esquema para a síntese de 63 a partir da 5-metiluridina ... 68

Esquema 26. Proposta de síntese para a obtenção do composto 63 ... 71

Esquema 27. Esquema para a síntese de 63 a partir de 15 ... 72

Esquema 28. Proposta de eliminação trans para formação do composto 63 . 73 Esquema 29. Esquema para a síntese de 63 a partir de 65 ... 75

Esquema 30. Esquema para a síntese de 15 a partir da hidrólise de 63 ... 78

Esquema 33. Esquema para a síntese de 73 a partir da hidrólise de 72 ... 83

Esquema 34. Esquema para a síntese do nucleosídeo 75 e derivados ... 89

Esquema 36. Esquema proposto para a obtenção do derivado insaturado substituído em posição 3’ 75 ... 93

Esquema 37. Esquema para a síntese de 84 e 75 ... 94

Esquema 38. Composto obtido a partir da recristalização em metanol do composto 84 ... 96

Esquema 39. Esquema proposto para a formação de 87 ... 99

Esquema 41. Proposta mecanística para a obtenção de 78 ... 102

Esquema 42. Esquema de síntese para o composto 78 a partir do nucleosídeo 77 ... 105

Esquema 43. Esquema para a síntese do nucleosídeo insaturado 81 a partir de 80 ... 106

Esquema 44. Esquema para a síntese do nucleosídeo insaturado 81 a partir de 79 ... 107

Esquema 47. Proposta de síntese para a obtenção de nucleosídeos bicíclicos ... 115

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Esquema 48. Esquema de síntese para a obtenção de 100 ... 116 Esquema 49. Esquema de síntese para a obtenção de 101 ... 116 Esquema 50. Proposta de síntese para a obtenção de 90 ... 117 Esquema 51. Proposta de proteção da base para a obtenção do nucleosídeo bicíclico 103 ... 118

(21)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

[α]D Rotação específica

Acetona-d6 Acetona deuterada

AIBN Azobisisobutironitrila Ar-H Hidrogênio Aromático Ars Hidrogênios aromáticos

Bz Benzoíla

CC50 Concentração citotóxica 50%

CCD Comatografia em Camada Delgada CDCl3 Clorofórmio deuterado

CNPq Consellho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

COSY Correlation Spectroscopy

ET _{Estado de transição}

δ Deslocamento químico

d dupleto

dd Dupleto duplo

DCA Ácido dicloroacético

DDT Ditiotreitol

DEPT Distortionless enchancement by polarization transfer DMAP 4-Dimetilaminopiridina

DMF N,N-dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

DMTrCl Cloreto de 4,4’-dimetóxitritila DNA Ácido 2’-desoxiribonucléico

Eq Equivalente

FDA Food and Drug Administration

FF Faixa de Fusão

FM Fórmula Molecular

(22)

Hz Hertz

HIV Human Immunodeficiency Virus

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IES Ionização por Electrospray

INCA Instituto Nacional do Câncer

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento escalar spin nuclear-spin nuclear J-Mod Exponentially Damped J-Modulation Profile

LPSF Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos

m Multipleto

MHz Mega Hertz

MM Massa Molar

MsCl Cloreto de mesila

OMS Organização Mundial de Saúde PBMCl Cloreto de p-metoxibenzila

RF Fator de Retenção

RMN 1_H _{Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio}

RMN13_C _{Ressonância Magnética Nuclear de Carbono}

RNA Ácido Ribonucléico

s Simpleto

t Tripleto

TBDPS Tert-butildifenilsilila

TMS Tetrametilsilano

TMSE 2-(Trimetilsilil)etanotiol UJF Université Jouseph Fourié

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais UFPE Universidade Federal de Pernambuco

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 24 2 OBJETIVOS ... 25 2.1 Geral ... 25 2.2 Específicos ... 25 3 REVISÃO DA LITERATURA ... 26 3.1 AIDS ... 26 3.1.1 Epidemiologia ... 27 3.2 HIV ... 29 3.2.1 Ciclo de replicação do vírus HIV ... 30 3.3 A Terapêutica da AIDS ... 32 3.3.1 Agentes antivirais utilizados contra HIV ... 31 3.3.2 Enzima Transcriptase Reversa ... 35 3.3.3 Inibidores da Transcriptase reversa ... 38 3.3.3.1 Inibidores análogos de nucleosídeos ... 38 3.3.3.2 Inibidores análogos de nucleotídeos ... 39 3.3.3.3 Inibidores não nucleosídeos ... 40 3.4 Nucleotídeos insaturados 2’,3’-didesoxi-2’-(2’’-(trimetilsilil)etiltio) timidina

e 2’,3’-didesoxi-3’-(2’’-(trimetilsilil)etiltio)timidina: intermediários chave para a síntese de tionucleosídeos ... 41 3.5 Síntese de nucleosídeos insaturados ... 44 3.6 A reação de cicloadição [2 +2] ... 47 3.6.1 Síntese de Ciclobutanonas a partir de nucleosídeos insaturados ... 51 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 54 4.1 CAPÍTULO 1Novos métodos de síntese de nucleosídeos insaturados em posição 2’,3’ e com substituinte alquiltio em posição 2’ ... 54 4.1.1 Apresentação ... 55 4.1.2 Plano de Síntese ... 56 4.1.3 Resultados e discussão ... 60 4.1.3.1 Síntese do nucleosídeo insaturado com o grupo 2-(trimetilsilil)etiltio em posição 2’ ... 60 4.1.3.1.1 Síntese de 2-(trimetilsilil)etanotiol 13 ...60 4.1.3.1.2 Síntese do sulfeto sililado 15 ... 62 4.1.3.1.3 Tentativa de síntese do composto 17...66

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4.1.3.1.4 Síntese do derivado insaturado 63 a partir da 5-metiluridina...68 4.1.3.1.5 Síntese do derivado 63 a partir do composto 15 ... 71 4.1.3.2 Síntese do nucleosídeo insaturado com o grupo tiometil em posição 2’...79 4.1.4 Conclusão ... 84

4.2 CAPÍTULO 2 Síntese de nucleosídeos insaturados em 2’,3’ com

substituinte alquilsulfeto em posição 3’ ... 86 4.2.1 Apresentação ... 87 4.2.2 Plano de Síntese ... 88 4.2.3 Resultados e discussão ... 91 4.2.3.1 Síntese do nucleosídeo insaturado com o grupo 2-(trimetilsilil)etiltio em posição 3’ ... 91 4.2.3.1.1 Síntese do derivado 74 ... 91 4.2.3.1.2 Síntese dos derivados insaturados ... 93 4.2.3.2 Síntese do nucleosídeo insaturado com o grupo tiometil em posição 3’... ... 109 4.2.4 Conclusão... 112 4.3 CAPÍTULO 3 Reações de cicloadição com nucleosídeos insaturados em 2’,3’... ... 113 4.3.1 Apresentação... ... 114 4.3.2 Plano de Síntese... ... 115 4.3.3 Resultados e discussão... ... 117 4.3.4 Conclusão... 125 4.4 CAPÍTULO 4 Avaliação Biológica... ... 126 5 PARTE EXPERIMENTAL... ... 133 6 CONCLUSÕES... ... 171 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 172 APÊNDICE A – Espectro de RMN 1_H,13_{C, Espectro no infravermelho e Massas}

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Introdução 24 ________________________________________________________________________

1 INTRODUÇÃO

A síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma doença infecciosa, e desde que foi descoberta nos EUA, em 1981, a AIDS se espalhou rapidamente, sendo considerada uma epidemia mundial caracterizada por uma imunodeficiência severa, infecções oportunistas, neoplasia e um resultado fatal (BARRE-SINOUSSI et al., 1983).O tratamento farmacológico, apesar de já ser empregado da multiterapia anti-HIV (CUNICO et al., 2008), traz como inconveniente o fato da resistência viral aos antivirais e a toxicidade provocada pelos fármacos. Dessa forma, é um desafio para os pesquisadores a busca de moléculas mais eficazes e menos tóxicas, bem como a busca por novas alternativas terapêuticas para o tratamento da AIDS.

Os nucleosídeos, foco de estudo deste trabalho de pesquisa, foram introduzidos na terapêutica da AIDS a partir da década de 1980. Desde então, contínuas e intensas pesquisas têm esclarecido, em parte, o mecanismo de ação e os alvos biológicos desse grupo de moléculas, o que vem contribuindo para a descoberta, o planejamento, identificação e preparação de novas substâncias com propriedades antivirais.

Os nucleosídeos despertam o interesse de vários pesquisadores por vários motivos. Dentre esses, merecem destaque: (i) apresentam um amplo espectro de atividades biológicas, como atividades antivirais e antitumorais; (ii) possuem diversos alvos biológicos: capacidade de interagir com o DNA, inibem enzimas, com por exemplo, transcriptase reversa, integrase, e ribonucleotídeo redutase.

Neste trabalho foram desenvolvidas novas moléculas nucleosídicas com potencial atividade antiviral.

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Objetivos 25 ________________________________________________________________________

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

 Desenvolver novas moléculas para o tratamento da AIDS e câncer através da síntese de análogos sintéticos de nucleosídeos naturais que constituem o DNA, a partir da 5-metiluridina.

2.2 Específicos

 Explorar a química do enxofre e do silício para obtenção de nucleosídeos ativos a partir de 2-(trimetilsilil)etanotiol.

 Desenvolver novas rotas de síntese para a obtenção dos nucleosídeos insaturados em posição 2’,3’ e com o grupo 2-(trimetilsilil)etiltio em posição 2’.

 Síntetizar nucleosídeos insaturados em posição 2’,3’ e com o grupo 2-(trimetilsilil)etiltio em posição 3’.

 Síntetizar nucleosídeos insaturados em posição 2’,3’ e com o grupo tiometil em posição 2’ e 3’.

 Desenvolver nucleosídeos bicíclicos por meio da reação de nucleosídeos insaturados com dicloroceteno, gerado in situ a partir de cloreto de tricloroacetila ou cloreto de dicloroacetila, para a formação de derivado de ciclobutanona em posição 2’,3’ do nucleosídeo.

 Caracterizar as estruturas químicas por meio de técnicas espectroscópicas como espectroscopia no infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio, de carbono 13 e espectrometria de massas.

 Avaliar a atividade antiviral e antitumoral dos derivados nucleosídeos sintetizados.

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Revisão da Literatura 26 ________________________________________________________________________

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 AIDS

A síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) é uma doença infecciosa, e desde que foi descoberta nos EUA, em 1981, a AIDS se espalhou rapidamente, sendo considerada uma epidemia mundial caracterizada por uma imunodeficiência severa, infecções oportunistas, neoplasia e um resultado fatal (BARRE-SINOUSSI et al., 1983).

A doença é causada pelo vírus HIV (sigla em inglês para vírus da imunodeficiência humana), que compromete o funcionamento do sistema imunológico, impedindo-o de executar sua tarefa de proteger o organismo contra as agressões externas (por bactérias, outros vírus e parasitas) e contra células cancerígenas. Com o progressivo comprometimento do sistema imunológico, o corpo humano torna-se cada vez mais susceptível a doenças oportunistas (VAISHNAV et al., 1991).

Somente no sangue, esperma, secreção vaginal e leite materno o vírus do HIV aparece em quantidade suficiente para causar a moléstia. Para haver a transmissão, o líquido contaminado de uma pessoa tem que penetrar no organismo de outra. Isso pode acontecer durante a relação sexual, ao se compartilhar seringas, agulhas e objetos cortantes infectados, na transfusão de sangue contaminado, no momento do parto e até durante a amamentação (CUNICO et al., 2008).

Atualmente não existe uma vacina ou cura da AIDS, mas a introdução da multiterapia anti-HIV em meados dos anos noventa melhorou significativamente o prognóstico para pessoas infectadas com o acesso ao tratamento. No entanto, existem desvantagens importantes relacionadas com

(28)

Revisão da Literatura 27 ________________________________________________________________________ os fármacos utilizados, como por exemplo, a toxicidade, que limita a eficácia desses tratamentos. Além disso, a elevada taxa de mutação do vírus e a sua alta freqüência de recombinação, juntamente com a alta capacidade de replicação viral (cerca de 109 partículas virais produzidas por dia), promovem o surgimento de resistência viral aos medicamentos que, eventualmente, pode levar à falência terapêutica anti-retroviral em pacientes aderentes ao tratamento (ARIAS, 2010).

3.1.1 Epidemiologia

A AIDS está entre as 10 principais causas de morte durante a última década no mundo. Foi a 6º doença, em 2012, responsável por mais 1,5 milhões (2,7%) de óbitos no mundo em 2012 e 2013 (Figura 1) (WHO, 2014). No Brasil, a AIDS foi responsável por 11.896 óbitos em 2012 (Ministério da Saúde, 2013).

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Estima-se que, em 2013, 35 milhões de pessoas no mundo viviam com HIV, que 2,1 milhões de pessoas foram infectadas pelo HIV e 1,5 milhões de pessoas morreram de doenças relacionadas à AIDS (UNAIDS, 2014).

Na figura 2, encontra-se uma estimativa de pessoas vivendo com AIDS em determinado país no ano de 2013 (UNAIDS, 2014). Os países mais afetados pela doença são a África do Sul, Nigéria, Índia e o Kênia. No Brasil, 2% da população viviam com AIDS em 2013, assim como a Federação Rússia, Etiópia e China.

Figura 2 Estimativa do número de pessoas vivendo com AIDS em 2013 (UNAIDS, 2014)

Dos 2,1 milhões de novas infecções por HIV que ocorreram em 2013, 15 países respondem por mais de 75%. Em todas as regiões do globo, a maior carga da epidemia recai sempre sobre três ou quatro países. Na África sub-sariana, por exemplo, apenas três países – Nigéria, África do Sul e Uganda – respondem por 48% de todas as novas infecções por HIV (UNAIDS, 2014).

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Enquanto não se descobre a cura efetiva para a AIDS, vários esforços têm sido feitos para sua prevenção e controle, como por exemplo, pesquisas para o desenvolvimento de novos fármacos.

Na tentativa de se desenvolver fármacos antivirais mais potentes e menos tóxicos, os nucleosídeos têm despertado o interesse de vários pesquisadores.

3.2 HIV

O HIV, devido a sua incapacidade de auto-replicação, precisa infectar uma célula que servirá como hospedeira para produção de novos vírus. O HIV é recoberto por um “envelope” protetor. No centro ou núcleo do HIV está a parte mais importante do vírus, o genona ou material genético, acompanhado de proteínas- as enzimas: integrase, protease e transcriptase reversa- que aderem ao genoma e que realizam tarefas específicas para permitir que o vírus se multiplique. Nesse material genético, composto de RNA, é que fica o “mapa” contendo toda a informação necessária para a criação de novos vírus. O vírus de RNA, que sofre uma transformação para DNA para ser integrado ao genoma celular são chamados retrovírus. Por isso, os medicamentos para combater o HIV são os anti-retrovirais (ARVs).

Os alvos de infecção pelo HIV em humanos são células que apresentam receptores CD4 em suas superfícies, como macrófagos, e, principalmente, os linfócitos T- auxiliar do sistema imunológico e que se encontram em circulação na corrente sanguínea (BRITO, 2011). Tais receptores são glicoproteínas monoméricas da superfamília das imunoglobulinas que apresentam 4 domínios e são utilizados pelo HIV para adentrarem nas células alvo. Após infectar os linfócitos T CD4+, o HIV terá grande capacidade de replicação, muito maior que a capacidade do organismo humano de destruir as células infectadas.

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Existem dois tipos de HIV, HIV-1 e HIV-2, com similaridade genômica de apenas 40% (FERREIRA et al., 2010). O HIV-1 corresponde à estirpe viral responsável pela maior epidemia mundial e é mais virulento e mutável que o HIV-2, que causa a AIDS mais lentamente e está restrito, principalmente, à África Ocidental (HILL et al., 2012).

Os ARVs interferem no ciclo de vida e nos caminhos que o HIV toma para se replicar dentro da célula humana. Apesar de não conseguirem destruir completamente o vírus, os fármacos impedem que as células infectadas produzam novas partículas virais que podem, assim, infectar novas células (SCHEFFER, 2008).

3.2.1 Ciclo de replicação do vírus

O processo de entrada do vírus HIV começa com interações de alta afinidade da glicoproteína gp120 de superfície do vírus com a superfície dos receptores CD4 das células do hospedeiro como linfócitos T e macrófagos. Esta interação ocasiona mudanças conformacionais na gp120 que promove a participação de co-receptores, principalmente CCR5 ou CXCR4. Para a entrada do HIV na célula é necessária a ligação com estes co-receptores para ativar mudanças conformacionais na membrana e posterior fusão. Estes primeiros eventos ativam a glicoproteína trimérica gp41 que medeia a fusão das membranas viral e celular. A fusão leva à injeção do capsídio do HIV à célula e posterior liberação do seu material genético e de enzimas necessárias para a replicação (Figura 3).

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Figura 3 Ciclo de vida resumido da replicação do vírus do HIV (Barbosa, AN 2013)

Ocorre, então, a transcrição reversa do RNA genômico viral (formação do DNA a partir do RNA pela ação da enzima transcriptase reversa do HIV), que culmina na formação de uma dupla hélice de DNA viral. O DNA é transportado para dentro do núcleo celular, onde sofre clivagens específicas e é integrado ao DNA da célula do hospedeiro pela ação da enzima integrase. A ativação da célula hospedeira resulta na transcrição do DNA em RNA mensageiro, que é traduzido em proteínas virais. A enzima protease do HIV é necessária neste passo para clivar a poliproteína viral precursora em proteínas individuais maduras. O RNA e as proteínas virais agrupam-se na superfície celular como um novo vírion e são liberados para infectar outra célula.

À medida que o vírus vai se replicando, o número de linfócitos T-CD4+_é

reduzido e o sistema imunológico torna-se fragilizado. Perante o potencial catastrófico do vírus e partindo de conhecimentos acerca do mecanismo de replicação viral, fármacos antiretrovirais foram propostos para o tratamento da AIDS (GUIMARÃES, 2014).

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3.3 A Terapêutica da AIDS

3.3.1 Agentes antivirais utilizados contra o HIV

Menos de 10 anos após a descoberta do vírus HIV, a primeira terapia anti-retroviral foi utilizada. Depois desta data, diversos medicamentos ou combinações de medicamentos foram introduzidos no protocolo da multiterapia anti-HIV com o objetivo de melhorar a eficácia do tratamento e limitar os fenômenos de resistência.

Cada etapa de replicação do vírus envolve um tipo de enzima que constituem alvos para inibidores da replicação do HIV: transcriptase reversa, protease, integrase. Assim, os inibidores podem ser classificados em seis classes distintas baseadas em seu perfil molecular e mecanismo de resistência (ARTS & HAZUDA, 2014).

-análogos nucleosídeos da transcriptase reversa, -inibidores da transcriptase reversa não- nucleosídeos, -inibidores da protease,

-inibidores da integrase, -inibidores de fusão e

-antagonistas de correceptores.

De 1987 a 2013, foram aprovados mais 37 ARVs pelo FDA. O desenvolvimento e a aprovação do uso dos anti-retrovirais, bem como introdução da terapia combinada com ARVs ao longo dos últimos anos é mostrado na tabela 1 (FDA, 2014).

Sabe-se que no ciclo de vida do HIV há outros alvos possíveis, além dos alvos descritos e utilizados pelos fármacos atuais, o que tem possibilitado inúmeras pesquisas, como os inibidores da maturação, caso do bevirimat.

Neste trabalho, o objetivo foi desenvolver inibidores nucleosídeos tendo como alvo a enzima transcriptase reversa.

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Sigla Princípio ativo Marca de referência Classe Data de aprovação pelo FDA

Empresa fabricante

AZT Zidovudina Retrovir ITRN 19/03/87 Glaxo SmithKline

ddI didanosina Videx ITRN 09/10/91 Bristol Myers-Squibb

ddC zalcitabina Hivid ITRN 19/02/92 Hoffmann-La Roche

d4T estavudina Zeritavir ITRN 24/06/94 Bristol Myers-Squibb

3TC lamivudina Epivir ITRN 17/11/95 Glaxo SmithKline

SQV saquinavir Invirase IP 06/12/95 Hoffmann-La Roche

RTV ritonavir Norvir IP 01/03/96 Abbott Laboratories

IDV indinavir Crixivan IP 13/03/96 Merck Sharp & Dohme

NVP nevirapina Viramune ITRNN 21/06/96 Boehringer Ingelheim

NFV nelfinavir Viracelt IP 14/03/97 Hoffmann-La Roche

SQV Saquinavir* Fortovase IP 14/03/97 Hoffmann-La Roche

DLV delavirdina Rescriptor ITRNN 04/04/97 Pharmaci & Upjohn AZT+3TC Lamivudina+ zidovudina Combivir ITRN 17/09/97 Glaxo SmithKline

EFV evafirenz Stocrin ITRNN 21/09/98 Merck Sharp & Dohme

ABC abacavir Ziagen ITRN 17/12/98 Glaxo SmithKline

APV amprenavir Agenerase IP 15/05/99 Glaxo SmithKline

LPV Lopinavir + ritonavir Kaletra IP 15/09/00 Abbott Laboratories ddiE Didanosina entérica Videx EC ITRN 31/10/00 Bristol Myers-Squibb

- Abacarvir + zidovudina + lamivudina

Trizivir Combinção de classes

14/11/00 Glaxo SmithKline

TNV tenofovir Viread ITRN 26/10/01 Gilead Sciences

ATZ atazanacir Reyataz IP 20/06/03 Bristol Myers-Squibb

T20 enfuvirtida Fuzeon IF 13/03/03 Hoffmann-La Roche

- fosamprenavir Lexiva IP 20/10/03 Glaxo SmithKline

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- Abacavir + lamivudina Epzicon ITRN 02/08/04 Glaxo SmithKline

- Tenofovir + emtricitabina

Truvada ITRN 02/08/04 Gilead Sciences

TPV tipranavir Aptivus IP 22/06/05 Boehringer Ingelheim

- Efavirenz+emtricitabina +tenofovir Atripla Combinações de classes 12/07/06 Bristol Myers-Squibb Gilead Sciences

- darunavir Prezista IP 23/06/06 Tipotec/ Johnson &

Johnson

- maraviroc Selzentry ICCR5 06/08/07 Pfizer

- raltegravir Insentress Ii 12/10/07 Merck Sharp & Dohme

NVP Viramune XR nevirapine ITRNN 25/03/11 Boehringer Ingeleim

- Emtricitabine, rilpivirine, tenofovir disoproxil fumarate Complera Combinação de classes 10/08/11 Gilead Sciences

- rilpivirine Edurant ITRNN 20/05/11 Tibotec Therapeutics

- Elvitegravir, cobicistat,emtricitabine, tenofovir disoproxil fumarate Stribild Combinação de classes 27/08/12 Gilead Sciences

- dolutegravir Tivicay integras 13/08/13 GlaxoSmithKline

Tabela 1 Fármacos e Medicamentos antiretrovirais correspondentes registrados

pelo FDA, de 1987 a 2013

*Formulação do Saquinavir em cápsulas moles (gelatinosas) ITRN- inibidor da transcriptase reversa análogo ao nucleosídeo ITRNN- inibidor da transcriptase reversa não-análogo ao nucleosídeo IP- inibidor da protease

IF- inibidor da fusão Ii- inibidor da integrase

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3.3.2 Enzima Transcriptase Reversa

A transcriptase reversa tipo 1 (HIV-1) e tipo 2 (HIV-2) são enzimas heterodiméricas compostas de duas subunidades derivadas de um processo proteolítico de um precursor de poliproteína grande Gag-Pol. A HIV-1 TR é composta de subunidades de 66 e 51 kDa, denominadas p66 e p51, respectivamente (Figura 4).

A estrutura cristalográfica da enzima transcriptase reversa mostra que ambas as subunidades contém 4 subdomínios comuns: “fingers” (resíduos 1-85 e 118-155) , “palm” (resíduos 86-117 e 156-236), “thumb” (237-318) e “connection” (319-426) (Figura 4) (KOHLSTAEDT et al., 1992; JACOBO-MOLINA et al., 1993; HUANG et al., 1998).

Figura 4 Estrutura da subunidade p66 e p51 e subdominios da transcriptase

reversa (L.MENÉDEZ-ARIAS, 2010)

Transcrição é um processo que envolve a conversão de genoma de RNA viral de fita simples em DNA de cadeia dupla.

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A conversão do RNA viral em DNA viral fita dupla é um processo complexo em que todas as etapas são catalisadas pela transcriptase reversa. A enzima exerce um papel multifuncional com dois tipos de atividade polimerase do DNA.

A polimerase RNA dependente sintetiza uma cópia de DNA fita simples a partir do RNA viral e a polimerase DNA dependente sintetiza a fita dupla de DNA viral. A RNase H degrada a cadeia matriz de RNA. Durante a síntese da cadeia de DNA fita simples, a transcriptase reversa se liga ao RNA matricial formando um complexo binário. Esta etapa é seguida pela ligação de um desoxiribonucleosídeo 5’- trifosfato (dNTP) para formar um complexo ternário.

Após uma interação não seletiva entre os dNTPs (desoxiadenosina, despxiguanosina, desoxitimidina, desoxicitidina) e a enzima, uma segunda seleção é realizada para que apenas um dNTP possa se ligar a outro desoxiribonucleosídeo.

A incorporção e o posicionamento do nucleosídeo ao sítio ativo da enzima provocam uma mudança conformacional de p66 e a função 3’-OH do nucleosídeo natural da cadeia de DNA viral que está sendo sintetizada é então idealmente posicionada para realizar o ataque nucleofílico ao átomo de fósforo situado em posição 5’ do nucleotídeo conforme mostrado na figura 5.

A trancriptase reversa pode então se dissociar se a retrotranscripção é terminada ou sofrer uma translocação a fim de continuar o crescimento da cadeia de DNA viral.

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Figura 5 Incoporação de nucleosídeos e análogos de nucleosídeos naturais- Síntese e

bloqueio da síntese de DNA viral

Durante o processo de transcrição realizado pela transcriptase reversa, análogos de nucleosídeos naturais como, por exemplo, o AZT, pode ser incorporado pela enzima à cadeia de DNA e bloquear a síntese de DNA viral. Por não apresentar a função OH em posição 3’, os nucleosídeos não naturais não se ligam a uma próxima unidade nucleotídica, não dando sequência ao crescimento da cadeia de DNA a ser sintetizada (Figura 5).

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3.3.3 Inibidores da Transcriptase Reversa

Três classes de fármacos anti-HIV são inibidores da transcriptase reversa: -os análogos de nucleosídeo,

-os análogos de nucleotídeo e,

-os inibidores não-nucleosídeos da transcriptase reversa.

3.3.3.1 Inibidores análogos de nucleosídeos

Para exibir efeitos terapêuticos através da inibição da biossíntese dos ácidos nucléicos virais, os inibidores nucleosídeos modificados são transformados in vivo em trifosfatos por ação das quinases celulares. Por exemplo, o fármaco antiviral 3'-azido-2',3'-didesoxitimidina (AZT) 1 inibe a transcrição reversa do HIV após fosforilação para conduzir ao correspondente substrato 5'-trifosfato 2, como é mostrado no esquema 1.

Esquema 1 Fosforilação do AZT por quinases celulares.

Dentre os análogos de nucleosídeo, o AZT (Retrovir) foi o primeiro anti-retroviral aprovado pelo FDA para o tratamento anti-HIV em 1987. Após fosforilação pelas quinases celulares (Esquema 1), o fármaco entra em competição com o substrato natural da enzima, e ao ser incorporado ao DNA viral, impede o crescimento da cadeia dupla de DNA que está sendo sintetizada pela transcriptase reversa. O DNA incompleto não é capaz de assumir o controle do DNA da célula CD4 e produzir novas cópias do vírus.

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Dentre os inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa alguns são mostrados na figura 6.

Figura 6 Fármacos anti-HIV – análogos de nucleosídeos inibidores da

transcriptase reversa

3.3.3.2 Inibidores análogos de nucleotídeos

A primeira fosforilação é a etapa crucial para a formação dos metabólitos ativos dos inibidores nucleosídeos. Muitas substâncias não apresentam atividade devido à dificuldade de serem monofosforiladas. Com o intuito de contornar este problema, vários análogos nucleotídeos, como adefovir e tenofovir, foram sintetizados. Estes fármacos já possuem um grupo fosfato em sua estrutura e necessitam de apenas duas fosforilações para impedirem a transcrição do RNA em DNA e, portanto, impedir a replicação viral.

Os análogos de nucleotídeos em uso clínico são o adefovir (PMEA) e o tenofovir (PMPA) (CUNICO et al., 2008) (Figura 7).

Figura 7 Fármacos anti-HIV – análogos de nucleotídeos inibidores da transcriptase

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3.3.3.3 Inibidores não- nucleosídeos

Os inibidores não-nucleosídeos da transcriptase reversa do HIV são inibidores não competitivos que se ligam a um sítio alostérico da enzima. Como resultado desta interação, o sítio ativo responsável pela formação da dupla hélice de DNA tem sua mobilidade e flexibilidade restritas, que acarretam uma drástica redução da eficiência da enzima.

Apenas 3 fármacos dessa classe tinham sido aprovados pelo FDA até 2010, nevirapina (Viramune®), delavirdina (Rescriptor®) e efavirenz (Sustiva®) (Figura 8). Em 2011, outros dois fármacos foram aprovodos, nivirapine (Viramune XR®) e rilpivine (Edurante®). Devido ao potencial destes fármacos, são amplamentes usados como componentes da terapia anti-retrovial altamente ativa. A nevirapina é inclusive um dos poucos fármacos utilizados para prevenir a transmissão do HIV de mãe para filho.

Figura 8 Fármacos anti-HIV – análogos de não-nucleosídeos inibidores da

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3.4 Nucleosídeos

insaturados

2’,3’-didesoxi-2’-(2’’-(trimetilsilil)etiltio)timidina

e

2’,3’-didesoxi-3’-(2’’-(trimetilsilil)etiltio)timidina: intermediários chave para a

síntese de tionucleosídeos

As modificações químicas de nucleosídeos naturais e nucleotídeos conduziram a um grande número de fármacos especialmente com atividade antiviral e antitumoral (BERGSTROM et al., 1992; PÉRIGAUD et al., 2000; DE CLERCQ et al., 2000; FISCHER et al., 2000; VERNEKAR et al., 2014; TADEUSZ et al., 2014; SAUDI et al., 2014).

No campo dos nucleosídeos, nucleotídeos, e oligonucleotídeos, a química do enxofre tem se desenvolvido significativamente, com vista à obtenção de novos fármacos e substâncias úteis como ferramentas em estudos biológicos (WNUK, 1993; YOKOYMA, 2000; CHAMBERT et al., 2002; FERNANDEZ et al., 2001; JASAMAI et al., 2008; MOSSELHI et al., 2011; KIKICHI et al., 2013; KANANOVICH et al., 2014).

A explosão de interesse em tionucleosídeos começou com a descoberta, no início dos anos 1990, da Lamivudina-3TC 12 (Figura 9), que está entre os mais potentes inibidores do HIV (Human Immunodeficiency Virus) e HBV (Hepatitis B Virus) (PÉRIGAUD et al., 2000). Síntese de análogos de 3TC foi amplamente desenvolvida, bem como atividades biológicas desses compostos (WNUK, 1993; YOKOYAMA, 2000; CHAMBERT et al., 2002; FERNANDEZ et al., 2001; WILSON et al., 1995; GUMINA et al., 2002)

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Tionucleosídeos também são ferramentas interessantes para os estudos sobre os mecanismos enzimáticos (ROBINS, 1999; ROBINS et al., 1999; COVÈS et al, 1996; LE HIR DE FALLOIS et al., 1997) e, quando são incorporados ao RNA ou DNA, podem ser usados para o estudo da estrutura dos ácidos nucléicos e suas funções, por exemplo, ou para o estudo do mecanismo de catálise realizada por ribozimas (ECKSTEIN et al., 1996; GILLE et al., 2005; KUMAR et al., 2013). Na pesquisa de nucleosídeos antivirais e antitumorais, uma ou mais funções hidroxila da ribose e 2'-desoxirribose pode ser substituída por uma função tiol ou as funções correspondentes do dissulfeto misto que pode ser reduzida in vivo após a fosforilação, sendo que tais nucleosídeos podem interferir com a biossíntese de ácidos nucléicos em células virais e cancerosas (ROY et al., 2003; GERLAND et al., 2008).

A fácil oxidação de 2'-desoxi-2'-5'-difosfato tiouridina gerado in situ a partir do correspondente 2'-propildisulfeto se mostrou in vitro, ser um potente inibidor da ribonucleosídeo redutase 5'-difosfato (RDPR) por meio da reação da função 2'-tiol no sítio ativo (COVÈS et al.,1996; LE HIR DE FALLOIS et al., 1997).

Os nucleosídeos contendo dissulfetos mistos de alquila também mostraram-se atividade antiviral e /ou antiproliferativa (ROY et al., 2003; GERLAND et al., 2008). A fim de melhorar a síntese de nucleosídeos contendo uma função tiol no açúcar de fácil oxidação e dos seus dissulfetos mistos, um método de preparação de 2'-desoxi-2'-tionucleosídeos foi desenvolvido usando como intermediário o nucleosídeo 2'-desoxi-2'-(2-(trimetilsilil)etiltio)timidina (CHAMBERT et al., 2002; GERLAND et al., 2008; CHAMBERT et al., 2000; GERLAND et al., 2007).

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Os nucleosídeos com o grupo 2-(trimetilsilil)etiltio (TMSES) são eficientemente convertidos nos dissulfetos mistos correspondentes através de reação com tetrafluoroborato de dimetila(metiltio)sulfônio (CHAMNBERT et al., 2000) e/ou com cloretos de alquila e arila-sulfinila (GERLAND et al., 2007) (Esquema 2). Os dissulfetos mistos podem ser reduzidos in situ, por exemplo, com ditiotreitol (DTT), para conduzir ao correspondente tióis (COVÈS et al., 1996). Este método foi aplicado para a síntese de dissulfetos mistos a partir do nucleosídeo 2',3'-didesidro-2',3'-didesoxi-2'-(2-(trimetilsilil)etiltio)uridina, timina e citidina.

Esquema 2 Conversão do 2-(trimetilsilil)etanotiol (TMSES) em dissulfetos mistos.

Os nucleosídeos 2'-desoxi-2'-(2-(trimetilsilil)etiltio) podem ser também convertidos seletivamente com bons rendimentos para os correspondentes 2'-tiocianatos, por tratamento com brometo de cianogênio (CHAMBERT et al., 2002). Assim, a química dos nucleósidos TMSES permite a preparação de diversas drogas potencialmente antivirais e /ou nucleosídeos antitumorais (dissulfetos, tióis, sulfetos, tiocianatos).

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3.5 Síntese de nucleosídeos insaturados

A síntese de diversos nucleosídeos insaturados por meio da eliminação trans ou cis catalisada por base tem sido descrita.

A eliminação trans pode ser efetuada com o grupo abandonador sob a forma de um nucleosídeo cíclico anidro, mesila, halogênio ou éster (GUMINA et al., 2001; CHONG et al., 2003; JEANNOT et al., 2002; Zhu et al., 2003).

Gerland e colaboradores, em 2007, sintetizaram o nucleosídeo insaturado

17 a partir do 2’-desoxi-2’-[(2-(trimetilsilil)etil)tio]timidina 15 em quatro etapas

(Esquena 3). A síntese foi realizada a partir da proteção seletiva da função hidroxila na posição 5’ do nucleosídeo com cloreto de 4,4’-dimetóxitritila, seguida da ativação da função hidroxila em 3’ com cloreto de mesila. Posteriormente, na terceira etapa da síntese, foi realizada a desproteção em meio ácido, e por fim a eliminação em meio básico, obtendo então o nucleosídeo 17 com a insaturação em 2’,3’ e com a hidroxila em C-5’ livre (Esquema 3).

Esquema 3 Síntese do nucleosídeo insaturado

2’,3’-Didesidro-2’,3’-didesoxi-2’-[(2”-(trimetilsilil)etil)tio]timidina 17

A desidrohalogenação de 18 em meio alcalino realizada por Altona e colaboradores, conduziu à formação do nucleosídeo insaturado 19 com o átomo de cloro em posição 2’ (Esquema 4).

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Esquema 4 Síntese do nucleosídeo 19

A introdução de tiocarbamato em posição 3’ de 20 permitiu realizar a eliminação cis. O ataque ao próton em posição 2’ foi efetuado de maneira intramolecular, o que favoreceu a eliminação cis (Esquema 5) (MATSUDA et al., 1991).

Esquema 5 Eliminação cis

Nucleosídeos 2’,3’ insaturados foram sintetizados de acordo com a proposta de Discordia, 1996, a partir da convesão da 5-metiluridina no intermediário nucleosídieo trimesilado 22, seguida da reação deste intermediário com benzoato de sódio e introdução do átomo de bromo em posição 2’ para, então, formação do composto insaturado 26 por meio da redução com zinco (Esquema 6).

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Esquema 6 Síntese de nucleosídeo insaturado 27

A introdução do grupo ciano em posição 3’ por abertura de epóxido e a ativação da hidroxila sob a forma de mesilato foi realizada para a síntese do nucleosídeo insaturado 2’,3’ com o grupo ciano ligado em posição 3’ do nucleosídeo (Figura 7) (FAUL et al., 1997) .

Esquema 7 Introdução do grupo ciano em posição 3’ e síntese de nucleosídeo

insaturado 30

Em 1992, Czernecki e colaboradores, descreveram a síntese de um derivado nucleosídeo insaturado em 2’,3’ à partir do nucleosídeo com ligação dupla exocíclica em posição 3’. A formação do nucleosídeo insaturado ocorre via abertura do 2,2’-anidro (Esquema 8).

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Esquema 8 Formação do nucleosídeo insaturado 33 via abertura do 2,2’-anidro 32

3.6 A reação de cicloadição [2 +2]

A síntese orgânica utiliza as ciclobutanonas como intermediários sintéticos em numerosas transformações, para atingir produtos de grande importância biológica (WONG et al., 1986). A importância deste anel é ainda maior quando se considera que ele pode entrar em uma síntese não só como o meio, mas também como fim, pois se conhecem vários produtos naturais que contêm esta unidade com as mais diversas propriedades biológicas (LIMA & COELHO, 1997; ERNST & BELLUS, 1988). O método de escolha para a formação de ciclobutanonas é a cicloadição [2+2] entre cetenos e olefinas.

A interpretação mecanística para a reação de cicloadição aponta uma separação de carga e assincronia na formação das ligações no estado de transição. Pode ocorrer uma maior ou menor assincronia, em função da evolução da formação das ligações no estado de transição. Uma reação em que as ligações se formem simultaneamente levaria a um ET com nenhuma, ou muita pouca, separação de cargas. Em um outro caso extremo, onde exista a antecipação muito grande da formação de uma das ligações em detrimento da outra, pode haver a formação de intermediários iônicos dipolares. Moyano, Pericas e Valenti, 1990, explicam o movimento eletrônico envolvido, como mostrado no esquema 9.

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Esquema 9 Fluxo de elétrons na reação de cicloadição [2+2]

Como pode ser visto no esquema 9, essa reação envolve quatro pares de életrons, com dois processos diferentes que ocorrem simultaneamente (embora não com a mesma velocidade) (LIMA & COELHO, 1996). No primeiro processo, que é o mais avançado no estado de transição, ocorre um ataque nucleofílico do orbital πy da ligação 3-4 sobre o carbono da carbonila do ceteno (C1). O orbital πy da ligação 3-4 se transforma, então, em um orbital deslocalizado entre C4, C3 e C1 e termina a reação como o orbital σ da ligação 1-4 na ciclobutanona. Essa transformação é acompanhada pela conversão da ligação πy (1,5) carbono-oxigênio do ceteno em um par de életrons π desemparelhados tanto no estado de transição quanto na ciclobutanona formada. O segundo processo, que ocorre logo após desse estado de transição é o ataque nucleofílico do orbital πy dos carbonos olefínicos (1,2) do ceteno sobre o C3 do eteno, que ficou deficiente em elétrons no transcorrer da reação. Esta última transformação é rapidamente visualizada no estado de transição, onde este orbital está deslocalizado sobre C3. A deficiência eletrônica gerada em C1 é compensada pela transformação do par de elétrons desemparelhados πz do oxigênio do ceteno no orbital πz da ligação 1,5 na ciclobutanona (LIMA & COELHO, 1996).

O que se observa na grande maioria das reações de cicloadição [2+2] entre cetenos e olefinas é a ocorrência simultânea destes dois eventos, porém sempre com alguma separação de carga e assincronia na formação das ligações. São raros os casos em que a cicloadição [2+2] com cetenos não é considerada uma reação concertada, podendo-se observar um intermediário