UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
BRUNO SACCHETTO PAULO
ESTUDO BIOSSINTÉTICO DE CLUSTERS RELACIONADOS AO METABOLISMO SECUNDÁRIO DE STREPTOMYCES sp. B1
CAMPINAS 2017
BRUNO SACCHETTO PAULO
ESTUDO BIOSSINTÉTICO DE CLUSTERS RELACIONADOS AO METABOLISMO SECUNDÁRIO DE STREPTOMYCES sp. B1
Profa. Dra. Luciana Gonzaga de Oliveira
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO BRUNO SACCHETTO PAULO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LUCIANA GONZAGA DE OLIVEIRA.
CAMPINAS 2017
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química orgânica
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Química
Maria Lúcia Nery Dutra de Castro - CRB 8/1724
Paulo, Bruno Sacchetto,
P285e PauEstudo biossintético de clusters relacionados ao metabolismo secundário de Streptomyces sp. B1 / Bruno Sacchetto Paulo. – Campinas, SP : [s.n.], 2017.
PauOrientador: Luciana Gonzaga de Oliveira.
PauDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Pau1. Genome mining. 2. Expressão heteróloga. 3. Peptídeo não ribossomal. 4. Deleção de gens. I. De Oliveira, Luciana Gonzaga. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Biosynthetic studies of clusters related to secondary metabolism of
Streptomyces sp. B1 Palavras-chave em inglês: Genome mining Heterologous expression Non-ribosomal peptide Genetic deletion
Área de concentração: Química Orgânica
Titulação: Mestre em Química na área de Química Orgânica Banca examinadora:
Luciana Gonzaga de Oliveira [Orientador] Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva Fábio Cesar Gozzo
Data de defesa: 23-02-2017
Programa de Pós-Graduação: Química
Profa. Dra. Luciana Gonzaga de oliveira (Orientador)
Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva (DQ–UFSCar-São Carlos)
Prof. Dr. Fábio Cesar Gozzo (IQ-UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este exemplar corresponde à redação final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno BRUNO SACCHETTO PAULO, aprovada pela Comissão Julgadora em 23 de fevereiro de 2017.
Dedicatória Dedico essa dissertação de mestrado aos meus pais Laerte e Marina pelo apoio ao longo de cada desafio em minha vida.
"Acredita no melhor... tenha um objetivo para o melhor, nunca fiques satisfeito com menos que o teu melhor, dê o teu melhor, e no longo prazo as coisas correrão pelo melhor."
A Deus por tudo que me concedeu, pelos dias bons e também pelos ruins;
Ao meu pai Laerte, minha mãe Marina, meu irmão Nicolas e namorada Christiane, pelos conselhos, amor, carinho e por me ouvir sempre que preciso;
A Prof. Dra. Luciana Gonzaga de Oliveira, pela orientação desse trabalho, pelos ensinamento preciosos, pela paciência em conduzir essa dissertação e principalmente pela amizade e os bons conselhos durante o curso;
Aos amigos do Labbicomb Gabriela, Renata Sigrist, Rafael e Ana. Pelas risadas, companheirismo e pelo amor ao trabalho;
Aos amigos do Lafame Wanda, Daniel, Renata Parruca, Gisele e Isabela;
Aos Professores Maria Fátima, Fabio, André, Taicia e Ljubica por suas contribuições e sugestões edificantes;
Ao Célio e Priscila pelos auxílios e esclarecimentos com a espectrometria de massas;
Aos funcionários da CPG da química, Izabel, Isabela e Janaina pela ajuda e orientação durante o curso;
Ao meu amigo Davi pela amizade e companheirismo;
Ao Instituto de química UNICAMP pelo ambiente de trabalho, ao CNPq (Processo n°130933/2015-5) e FAPESP (2014/12727-5) pelo apoio financeiro.
Os microrganismos são fontes prolíficas de produtos naturais bioativos. Muitos desses organismos são responsáveis por produzir fármacos de grande importância nos dias de hoje sendo que o gênero Streptomyces representa um dos maiores produtores de moléculas com atividade antibiótica. O microrganismo endofítico Streptomyces sp. B1, isolado de Citrus spp., se mostrou ativo em ensaios de inibição frente a algumas linhagens patogênicas despertando interesse em relação ao seu metabolismo secundário. Para melhor conhecer o seu potencial biossíntetico essa actinobactéria foi completamente sequenciada utilizando-se a tecnologia Ilumina e uma análise bioinformática de seu genoma através da plataforma antiSmash permitiu a identificação de 37 clusters de genes para o metabolismo secundário. Entre eles foi possível identificar terpenos sintases, NRPS (sintetase de peptídeo não ribossomal), butirolactonas, tiopeptideos sintases, PKSs (sintases de policetídeos) do tipo I, II e III, além de híbridos entre PKS-NRPS. O objetivo desse trabalho é caracterizar a funcionalidade de um cluster que codifica provavelmente para um grupo de enzimas relacionadas a biossíntese de tiopeptídeos que possuem ampla atividade antibiótica. Para isso foi construída uma biblioteca genômica utilizando como vetor o pESAC13A, o qual foi introduzido em E. coli DH10B. Os organismos recombinantes, contendo a informação referente a tiopeptídeo sintase foram então selecionados por PCR e transferidos para 2 linhagens geneticamente engenheiradas de Streptomyces coelicolor (M1146 e M1152). O perfil metabólico foi avaliado e indica a produção de um metabólito derivado de peptídeo. Para entender qual a funcionalidade de um domínio de adenilação envolvido na biossíntese desse provável peptídeo ribossomal, realizamos também a deleção gênica desse fragmento na linhagem selvagem de forma a interromper sua produção ou gerar algum análogo biossíntetico. A análise de seu perfil metabólico em comparação à linhagem selvagem indicam uma diferença no perfil metabólico e além disso foi observado um aumento na produção de valinomicina, um ionóforo codificado por uma sintetase de peptídeo não ribossomal. Para estabelecer em nosso grupo um procedimento de transferência de grandes fragmentos de genes, foi utilizado um método rápido de clonagem in vitro baseado na metodologia isotérmica de assembly para obter um derivado do plasmídeo pSET152 com 25 kbp contendo a sintetase de peptídeo não ribossomal (NRPS) responsável pela biossíntese da indigoidina. Esse plasmídeo organizado inicialmente em E. coli DH10B foi transferido para 3 linhagens geneticamente engenheiradas de Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154) e as
heterólogos e realizamos deleções genéticas de orfs essenciais para uma via específica que possibilitou entender mais sobre sua funcionalidade global em Streptomyces sp. B1.
Microorganisms are prolific sources of natural bioactive products. Many of these organisms are responsible for producing drugs of great importance these days and the genus Streptomyces represents one of the largest producers of molecules with antibiotic activity. The endophytic microorganism Streptomyces sp. B1, isolated from Citrus spp., was active in inhibition assays against some pathogenic strains, arousing interest in its secondary metabolism. To better understand its biosynthetic potential, this bacterium was completely sequenced using Ilumina technology and a bioinformatic analysis of its genome through the antiSmash platform allowed the identification of 37 gene clusters for secondary metabolism. Among the gene clusters it was possible to identify terpenes synthases, NRPS (Non Ribosomal Peptide synthetase), butyrolactones, thiopeptide synthases, PKSs (Polyketide synthases) type I, II and III and hybrids between PKS-NRPS. The objective of this work is to characterize the functionality of a cluster that probably encodes for enzymes related to thiopeptides biosynthesis, known for the wide spectrum antibiotic activity. A genomic library was constructed using pESAC13A as vector and introduced into E. coli DH10B. Recombinant organisms were then selected by PCR and transferred to 2 genetically engineered strains of Streptomyces coelicolor (M1146 and M1152). The metabolic profile was evaluated and indicates the production of a peptidic metabolite. In order to understand the functionality of an adenylation domain involved in the biosynthesis of this probable ribosomal peptide, we also carried out the deletion of this fragment in the wild type to interrupt its production or generate some biosynthetic analogue. Comparison of the metabolic profile indicates a clear difference between wild type and the deleted mutant in addition to an increase in valinomycin production (nonribosomal peptide sinthetase codified ionophore). To establish a large gene fragment transfer protocol in our group, a rapid in vitro cloning method based on the isothermal assembly methodology was used to obtain a derivative of the 25 kbp plasmid pSET152 containing the non-ribosomal peptide synthetase responsible for the biosynthesis of indigoidine, this plasmid initially cloned into
E. coli DH10B was transferred to 3 genetically engineered strains of Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 and M1154), whose blots were confirmed by PCR. At the end of
this work we established a method for the complete transfer of biosynthetic genes to heterologous organisms and in addition, we performed genetic deletions of essential orfs related to specific pathways that made it possible to understand more about its functionality.
Figura 1. Origem das pequenas moléculas descobertas entre 1981 e 2010 que correspondem aos fármacos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration, EUA). Adaptado de (Newman & Cragg, 2012). ... 19
Figura 2. Estruturas dos antibióticos mais comuns encontrados no gênero Streptomyces. ... 20
Figura 3. Estruturas químicas dos metabólitos produzidos por diversas espécies de actinobactérias endofíticas.. ... 24
Figura 4. Rota biossíntetica proposta para a formação da indigoidina sendo A: domínio de adenilação; T: domínio de tiolação*; Ox: domínio de oxidação; TE: domínio de Tioesterase; adaptado de Walsh e colaboradores, 2012. ... 26
Figura 5. Biossíntese da tioestreptona por Streptomyces laurentii adaptado de (Liao et al., 2009). ... 28
Figura 6. Streptomyces sp. B1 cultivadas em SFM-ágar durante um período de 2 meses, a coloração azulada é um indicio da presença do pigmento conhecido como indigoidina. ... 47
Figura 7. Estrutura química da Bottromicina A, produzida por Streptomyces sp. BC16019 (Huo et al., 2012). ... 48
Figura 8. A organização estrutural de IndC mostrando as posições dos domínios de Adenilação (A), Oxidação (Ox), Tiolação (T) e Tioésterase (TE). ... 49
Figura 9. Região de 20 kbp hidrolisado pela enzima BglII e os genes presentes nessa sequência em negrito os relacionados a biossíntese da indigoidina. .. 50
Figura 10. Metodologia empregada para a construção do plasmídeo pBSIND (Zhou et al., 2015). ... 51
Figura 11. A) Triagem por PCR de colônia de E. coli DH10B/pBSIND amplificando a região central de indC (F/R_Center_Indigo) B) Ensaio de restrição para confirmar a construção correta do plasmídeo pBSIND. A enzima utilizada foi a Bglll os dois fragmentos esperados estavam na ordem de 5000 bp referente ao pSET152 e 20000 bp referente ao cluster 14. ... 52
Figura 12. A) Marcador de peso molecular 1 kb ladder Sinapse IncR tamanho de fragmentos de 500 bp a 10000 bp. B) Triagem por PCR de colônia de E. coli ET12567/pBSIND (Center_indigo_F/R) C) Triagem das colônias de Streptomyces
observado para o DNA de Steptomyces sp. B1 e a especificidade na triagem sustentam um forte indicio que inserção do plasmídeo no genoma do organismo heterólogo foi bem sucedida.
... 53
Figura 13. Cromatograma de pico base (BPC) obtido a partir do extrato metanólico das placas contendo Streptomyces sp. B1 de coloração azul... 55
Figura 14. Cromatograma extraído de íons m/z 271,05 obtido a partir do extrato metanólico das placas contendo Streptomyces sp. B1. ... 55
Figura 15. A) Espectro de fragmentação (MS/MS) referente ao [C10H8N4O4+Na]+ (m/z 271,05) os fragmentos detectados são condizentes com a estrutura da indigoidina. B) Proposta de fragmentação para a indigoidina encontrada no extrato metanólico de células de Streptomyces sp. B1. ... 56
Figura 16. Cluster biossíntetico da sintase de peptídeo ribossomal e a função de cada gene associado previsto pelo blastp. ... 57
Figura 17. Lactazóis produzidos por Streptomyces lactacystinaeus. .. 58
Figura 18. A) Determinação do tamanho do inserto por digestão com a enzima Notl B) Triagem por PCR e confirmação das regiões laterais (Thio_Left e Thio_Right) e central (Thio_center) do cluster 36 em ambos vetores (PAC9D e PAC20J) sendo a sigla ck referente ao controle positivo encontrado no DNA genômico de Streptomyces sp. B1.
... 60
Figura 19. A) Marcador de peso molecular 1 kb ladder plus (invitrogen). B) Fotodocumentação do PCR de colônia da linhagem E.coli ET12567 amplificando a região central (347 bp) do cluster 36 em ambos vetores foi possível observar a amplificação em comparação ao marcador de peso molecular. ... 61
Figura 20. Fotodocumentação da PCR do DNA genômico das linhagens Streptomyces coelicolor M1146 e M1152 modificadas pela integração do cluster 36.
... 61
Figura 21. A) A organização do orfF e a construção do plasmídeo pBSΔcal. B) Ensaio de restrição para confirmar a correta construção do plasmídeo pBSΔCal a enzima utilizada foi a NdeI que apresentou fragmentos da ordem de 3000 bp e acima de 8000 bp; também foi utilizada a enzima EcoRI que apresentou fragmentos da ordem de 1500 bp e acima de 10000 bp. ... 63
após 16h a 30 ºC é adicionado a placa 2 mL de uma mistura de ácido nalidíxico (250 µg) e apramicina (25 µg), buscando selecionar as colônias em que houve a recombinação adquirindo resistência ao antibiótico apramicina. ... 64
Figura 23.. Metodologia de deleção local (Kieser et al., 2000). ... 64
Figura 24. Triagem por PCR utilizando como molde o DNA genômico de Streptomyces sp. B1. Em caso de recombinação o amplicon de 380 bp é observado, em caso de retorno a linhagem selvagem o amplicon de 1340 bp é observado. ... 65
Figura 25. Triagem das colônias após o evento de recombinação; no primeiro canal temos o perfil do DNA de Streptomyces sp B1, no segundo canal temos o perfil do plasmídeo de deleção (P1), nas colônias 1 e 7 observa-se o retorno para o perfil da linhagem selvagem na colônia 2 observa-se o perfil da linhagem que incorporou a deleção, as demais colônias apresentam um perfil em 1° estágio em que se observa a integração da deleção e o perfil intacto do domínio de adenilação. ... 66
Figura 26. Cromatograma comparando em sobreposição o perfil da linhagem mutante Streptomyces sp. B1/pBSΔcal (laranja) e linhagem selvagem Streptomyces sp. B1 (azul). ... 67
Figura 27. Cromatograma do extrato metanólico das células comparando o perfil das linhagens heterólogas de Streptomyces coelicolor M1152 (azul/selvagem), (verde/PAC20J), (laranja/PAC9D). ... 68
Figura 28. Cromatograma do extrato metanólico das células comparando o perfil das linhagens heterólogas de Streptomyces coelicolor M1146 (azul/selvagem), (laranja/PAC20J), (verde/PAC9D). ... 68
Figura 29. Espectro de massas em destaque os íons dicarregados m/z 809,4844 e m/z 867,0079 obtidos dos extratos metanólicos de células de Streptomyces coelicolor (M1146 e M1152). ... 69
Figura 30. Espectro de massas em destaque os íons [M+H]+ (m/z 1617,9640), [M+H]+ (m/z 1732,0006) e os adultos de sódio [M+Na]+ (m/z 1639,9421) e [M+Na]+ (m/z 1753,9831) respectivamente. ... 69
Figura 31. Espectro de fragmentação (MS/MS) do íon m/z 809,4789 obtido do extrato metanólico de células de Streptomyces coelicolor (M1146 e M1152), as perdas de massas observadas são característicos de aminoácidos. Prolina (m/z 97,0607), Valina (m/z 99,0661), leucina (m/z 113,0874). ... 70
observadas são característicos de aminoácidos. Prolina (m/z 97,06), Valina (m/z 99,06), Glutamina (m/z 128,06). ... 70
Figura 33. Sequência de aminoácidos provenientes do orfE localizado no cluster 36, que provavelmente origina o tiopeptídeo em questão. ... 71
Figura 34. Cromatogramas comparando a intensidade do pico cromatográfica da valinomicina na linhagem selvagem (azul) e mutante (pBSΔcal/laranja).
... 72
Figura 35. Espectro de massas referente aos íons correspondentes a valinomicina. ... 72
Figura 36. Espectro de fragmentação (MS/MS) referente ao íon m/z 1128,61 [M+NH4]+, as perdas sequenciais de massas corresponde aos aminoácidos L-Valina (m/z 99,06), D-Valina (m/z 99,11) , ácido lático (m/z 72,01) e ácido-α-D-hidróxisovalerico (m/z 100,01). ... 73
Tabela 1. Vetores utilizados e suas respectivas aplicações ... 32 Tabela 2. Plasmídeos desenvolvidos com sua função e vetor derivado ... 32 Tabela 3. Antibióticos utilizados para seleção de colônias recombinantes ... 32
Tabela 4. Oligonucleotídeos utilizados na clonagem e triagem do cluster indigoidina sintetase ... 33
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados na triagem do cluster tiopeptideo sintase ... 33
Tabela 6. Oligonucleotídeos utilizados na deleção e triagem do cluster tiopeptídeo sintase ... 33
Tabela 7. Componentes e concentrações das reações de PCR ... 40 Tabela 8. Ciclos das reações de PCR... 41 Tabela 9. Condições de análise por eletronspray e condições no MS-TOF ... 44
Tabela 10. Prospecção da plataforma antiSmash para o metabolismo secundário de Streptomyces sp. B1, predizendo o tipo de enzima e a similariedade com clusters de busca ... 46
Tabela 11. Principais Genes contidos no cluster 14 em Streptomyces sp. B1 e suas funções previstas, evidenciando indA, indB e indC que estão presentes em todos organismos produtores de indigoidina. Predito pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information) ... 48
Tabela 12. Principais Genes que possivelmente participam da biossíntese de tiopeptídeos em Streptomyces sp. B1 e suas funções previstas ... 59
aa: aminoácidos
BpsA: blue pigment synthetase A DMSO: dimetil sulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucleico
LC-MS: cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas MRSA: meticilin resistant Staphylococus aureus
m/z: razão massa molecular por carga
NCBI: National Center for Biotechnology Information NRPS: Non-Ribosomal Peptide Sinthetase
OD: densidade optíca
PCR: reação em cadeia da polimerase PKS: polyketide synthase
PRSP: penicilin resistant Streptococcus pneumoniae SLIC: Sequence Ligation Independent Cloning VRE: Vancomicin Resistant Enterococci
1.0 Introdução ... 19
1.1 Streptomyces e sua importância farmacológica ... 19
1.2 A resistência microbiana ... 21
1.3 Metabolitos isolados de actinobactérias endofíticas ... 22
1.4 Estratégias para acessar produtos naturais de microrganismos através do genome mining ... 24 1.5 Biossíntese da Indigoidina ... 26 1.6 Biossíntese de Tiopeptídeos ... 27 2.0 Objetivos Gerais ... 29 2.1 Objetivos Específicos... 29 3.0 Parte Experimental ... 29 3.1 Materiais ... 30
3.1.1 Reagentes químicos e biológicos ... 30
3.1.2 Microrganismos utilizados ... 30 3.1.3 Meios de Cultivo ... 30 3.1.4 Vetores ... 31 3.1.5 Plasmideos ... 32 3.1.6 Antibióticos ... 32 3.1.7 Primers ... 33 3.2 Métodos em microbiologia ... 34 3.2.1 Condições de Cultivo ... 34
3.2.2 Armazenamento das linhagens ... 34
3.2.3 Preparo e transformação de células químicamente competentes ... 34
3.2.4 Preparo e transformação de células eletrocompetentes ... 35
3.2.5 Metodologia de clonagem rápida in vitro - SLIC ... 36
3.3 Métodos em biologia molecular... 39
3.3.1 Isolamento de DNA ... 39
3.3.2 Manipulações do DNA ... 40
3.3.3 PCR de colônia ... 41
3.3.4 Análise de DNA por eletroforese horizontal ... 41
3.3.5 Hidrólise com enzima de restrição ... 42
3.3.6 Triagem e construção da biblioteca genômica de Streptomyces sp. B142 3.4 Métodos químicos e analíticos ... 43
3.4.1 Extração dos metabólitos de Streptomycetos ... 43
3.4.2 Preparo de Amostra para análise em HRESIMS ... 43
4.0 Resultados e Discussões ... 44
4.1 Identificação, transferência para organismos heterólogos e análise do perfil metabólico do cluster 14 proveniente de Streptomyces sp. B1 ... 46
4.1.1 Identificação do cluster indigoidina sintetase de Streptomyces sp. B146 4.1.2 Construção do vetor contendo o cluster da indigoidina sintetase ... 49
4.1.3 Transferência do cluster Indigoidina sintetase de E. coli DH10B para Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154) ... 52
4.1.4 Cultivo e análise por LC-MS/MS de Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154) e Streptomyces sp. B1 ... 54
4.2 Identificação, transferência para organismos heterólogos e análise do perfil metabólico do cluster 36 proveniente de Streptomyces sp. B1 ... 57
4.2.1 Identificação do cluster tiopeptídeo sintase de Streptomyces sp. B1 57 4.2.2 Construção e transferência dos PACs 9D e 20J de E.coli DH10B para Steptomyces coelicolor (M1146 e M1152) ... 59
4.2.3 Deleção do domínio de adenilação do cluster tiopeptídeo sintase em Streptomyces sp. B1 ... 62
... 66
4.3 Identificação do ionóforo valinomicina por LC-MS/MS de Streptomyces sp. B1 (mutante e selvagem) ... 71
5.0 Conclusões e Perspectivas ... 73
6.0 Bibliografia ... 75
1.0 Introdução
1.1 Streptomyces e sua importância farmacológica
Os microrganismos possuem um amplo arsenal para a produção de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de grande importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos nos dias de hoje são produzidos por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces (Bérdy, 2005)
Em um levantamento realizado por Newmann & Cragg acerca dos fármacos, desenvolvido entre 1981 a 2010, pode-se observar que entre as 1130 pequenas moléculas aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration, EUA), como fármacos, cerca de 57% possuem identidade nos esqueletos encontrados em produtos naturais sendo 13% produtos naturais de origem macromolecular (proteínas ou peptídeo) (B), 22% produtos naturais com alguma etapa sintética (ND), 12% mimetizando produtos naturais (S/NM), 4% produtos naturais (N) e 6% produtos naturais de origem botânica (NB) (Figura 1).
Figura 1. Origem das pequenas moléculas descobertas entre 1981 e 2010 que correspondem aos fármacos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration, EUA). Adaptado de Newman & Cragg, 2012.
13% 4% 0% 22% 29% 12% 4% 10% 6% B N NB ND S S/NM S* S*/NM V
Em particular, o gênero Streptomyces produz cerca de 39% do total de metabólitos microbianos, sendo que 73% destes apresentam alguma atividade antibiótica. Entre os produtos naturais provenientes desse gênero, as classes de estruturas mais comuns encontradas (Figura 2) são os macrolídeos (eritromicina 1), antraciclinas (doxorubicina 2), poliéteres (salinomicina 3), aminoglicosídeos (kanamicina 4), estreptotricinas (estreptotrisamina 5), actinomicinas (dactinomicina 6), lipodepsipeptídeos (daptomicina 7), tiopeptídeos (tioestreptona 8) e peptídeos quinoxalinos (echinomicina 9) (Bérdy, 2012).
Figura 2. Estruturas dos antibióticos mais comuns encontrados no gênero Streptomyces.
Durante a era conhecida como Golden age ou Hero age que compreende os anos entre 1940 – 1950 os principais grupos de antibióticos de uso clínico foram descobertos,
sendo pertencentes principalmente ao gênero Streptomyces. Essa influência representou cerca de 70 – 80% dos compostos conhecidos durante essa época (Bérdy, 2005).
No entanto, após essa época foi observado um declínio no surgimento de novos fármacos com atividade antibiótica. Os principais motivos apontados são a alta taxa de re-isolamento de substâncias já conhecidas e o alto custo de prospecção desses metabólitos, gerando um descredito aos microrganismos como principais produtores de moléculas com atividade farmacológica. Posteriormente, com os avanço da química combinatória observou-se uma elevada ineficiência das bibliotecas de compostos puramente sintéticos em atuar nos organismos vivos. Apesar de muitas vezes serem efetivos em ensaios laboratoriais os poucos alvos promissores apresentaram dificuldades em atingir o alvo in vivo devido a permeabilidade do fármaco na parede celular. Nesse contexto, as pesquisas direcionadas ao desenvolvimento de moléculas hoje são comprovadamente inspiradas pelos produtos naturais, assim como o desenvolvimento de novas ferramentas para acessar a informação do genoma dos microrganismos produtores de moléculas bioativas (Bérdy, 2012).
1.2 A resistência microbiana
Embora os antibióticos tenham inovado o tratamento médico reduzindo, portanto, a mortalidade por agentes patogênicos, o uso indiscriminado desses fármacos levam a seleção de microrganismos resistentes que em pouco tempo são capazes de transferir a resistência para outros organismos e proliferar no meio que habitam. Apesar dos diversos antibióticos em uso clínico a mortalidade por agentes infecciosos tende a aumentar e, portanto, existe a continua necessidade de produção de novos fármacos antimicrobianos (Clardy et al., 2006).
O número de organismos patogênicos resistentes aos antibióticos comerciais chega a 70% nos dias de hoje sendo que a mortalidade por essas infecções multirresistentes varia entre 50 a 80%. Somente nos Estados Unidos são contabilizados 2 milhões de pessoas infectadas por esses microrganismos sendo que a mortalidade chega a 100.000 por ano (Bérdy, 2012). Uma projeção para o ano de 2050 é que o continente africano já supere a marca de 4 milhões de mortes e a américa latina próximo de 300.000 mortes ao ano.
Esses fatos relevantes motivam a necessidade de buscar novas entidades com atividade antibiótica. Para isso algumas estratégias podem ser praticadas na pesquisa em produtos naturais, tais como utilizar organismos que atuam em ambientes únicos e inexplorados, como é o caso das bactérias endofíticas que atuam em simbiose com plantas.
Microrganismos que são submetidos constantemente a interações metabólicas com outros organismos e que habitam sob ambientes diversificados, muitas vezes exclusivos, são geralmente portadores de um amplo espectro de informações genéticas que codificam para enzimas relacionadas ao metabolismo secundário, razão pela qual esses microrganismos são devidamente explorados na pesquisa para uso médico, como inseticidas e para aproveitamento industrial (Strobel et al., 2003).
Atualmente existe um crescente interesse nos produtos naturais produzidos por microrganismos endofíticos, pois apresentam um nicho ecológico imenso, por exemplo, existem cerca de 300.000 espécies de plantas superiores, as quais, abrigam organismos endofíticos e essas espécies crescem nos mais diversificados ambientes. Esses fatores podem influenciar o arsenal enzimático responsável por gerar estruturas químicas com diferentes modificações, cujas atividades biológicas possam ser interessantes à indústria farmacêutica (G. Strobel & Daisy, 2003).
1.3 Metabolitos isolados de actinobactérias endofíticas
Os microrganismos endofíticos que colonizam os tecidos internos das plantas se beneficiam da nutrição e proteção que as plantas superiores oferecem, em troca eles conferem a produção de determinados metabolitos que desempenham importantes funções nas plantas (Tan et al., 2001). Entre esses endofíticos estão as bactérias reconhecidas por produzirem moléculas com atividades biológicas interessantes. Streptomyces aureofaciens CMUAc130, por exemplo, é um endofítico da raiz de Zingiber officinale (Zingiberaceae) que levou ao isolamento e identificação de duas arilcumarinas (8) e (9), com atividade antifúngica (Taechowisan et al., 2005).
Outro endofítico denominado Streptomyces NRRL 3052 isolado de Kennedia nigricans, uma planta nativa do norte australiano, produz as mununbicinas A, B, C e D e possuem um amplo espectro de atividade antibiótica frente a Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis e Staphylococcus aureus (MRSA) (Castillo et al., 2002). A
kakadumicina A, um peptídeo quinoxalínico isolado de Streptomyces sp A35-1, presente em Grevillea pteridifolia, exibiu atividade antifúngica frente a fitopatógenos como Alternaria sp., Botrytis sp., Helminthosporium sp. e Pythium ultimum além de exibir atividade frente a cepas multirresistente de Plasmodium falciparum (Castillo et al., 2003). Streptomyces albiduflavus isolado de plantas do mangue Chinês produzem antimicina A18(10) um potente antibiótico frente a microrganismos patogênicos, (Yan et al., 2010). Antibióticos peptídicos como as coranomicinas também são relatados em endofíticos como Streptomyces sp. MSU-2110 que foi isolado de Monstera sp. (Ezra et al., 2004). Algumas lactonas como a pterocidina (11) isolada de Streptomyces hygroscopius também são relatadas por possuírem atividade antitumoral. Esse microrganismo foi encontrado no caule de Pteridium aquilinum (Igarashi et al., 2006). As antraquinonas lupinicidina A e B (12, 13) também foram encontradas em Micromonospora lupini endofítico de Lupinus angustifolius e apresentaram importante atividade antitumoral (Igarashi et al., 2007). As bafilomicinas (14 – 18) foram isoladas de Streptomyces CS, endofítico de Maytemus hokeri, e apresentaram atividade antitumoral e antimicrobiana (Li et al., 2010) (Figura 3).
Figura 3. Estruturas químicas dos metabólitos produzidos por diversas espécies de actinobactérias endofíticas.
1.4 Estratégias para acessar produtos naturais de microrganismos através do genome mining
Embora os produtos naturais microbianos representem uma excelente fonte para obtenção de estruturas bioativas, o re-isolamento de estruturas previamente conhecidas e o alto custo envolvido na prospecção desses metabolitos tem desestimulado a busca por
novos candidatos a fármacos de origem natural (De Oliveira et al., 2013; Zotchev et al., 2012).
Após a era genômica, no entanto, com o aumento da rapidez e barateamento no sequenciamento de genomas completos, as actinobactérias voltaram a chamar atenção quanto ao seu potencial em biossintetizar moléculas que antes não eram encontradas em condições normais de cultivo ou que eram produzidas em pequenas quantidades. Em 2003 foi publicado o primeiro trabalho guiado por genoma em Streptomyces macromyceticus (M480-M1, NRRL, B5335) no qual foi relatado a manipulação do meio de cultivo e condições de crescimento bacteriano levando ao isolamento de novos enedienos (Zazopoulos et al., 2003).
A partir desse potencial ainda desconhecido, novas plataformas de prospecção do metabolismo secundário tem surgido. A partir do genoma total ou parcial a ferramenta antiSmash consegue decodificar clusters genéticos envolvidos na biossíntese de diversos produtos naturais, além de ser capaz de predizer o tipo de metabólito a ser biossintetizado. Esse tipo de abordagem levou a concepção de um novo termo conhecido como “genome mining” que seria a mineração do genoma em busca de novos candidatos a fármacos, ou a atribuição genética dos metabólitos previamente encontrados.
Nos anos mais recentes, o uso das sequencias genômicas tornou-se uma ferramenta rotineira em inúmeros laboratórios de produtos naturais permitindo a identificação de um grande número de clusters de genes relacionados ao metabolismo secundário com o potencial de direcionar a prospecção para novas estruturas químicas e aprofundar os estudos em biossíntese. Isso tem possibilitado o uso de técnicas para a introdução de uma determinada rota biossintética em organismos geneticamente modificados, com o potencial de reproduzir importantes blocos construtores de metabólitos com grande interesse farmacológico e comercial. Um exemplo bastante significativo é o caso da artemisinina onde os seus principais precursores amorfa-4,11-dieno e ácido di-hidroartemisinico podem ser clonados e produzidos em E. coli e S. cerevisiae respectivamente, levando a um menor custo de produção e em quantidade maior da que é encontrada no organismo vegetal (Ram et al., 2013).
Outras abordagens somadas ao genome mining como a expressão heteróloga, deleção de genes envolvidos na biossíntese de um metabólito, reconstituição in vitro e abordagens genomisotópicas permitiram a descoberta de novos produtos naturais policetidicos, terpenóides e de peptídeos não-ribossomais (De Oliveira et al., 2013; Gross et al., 2007; Hayashi et al., 2014; Tohyama et al., 2006).
1.5 Biossíntese da Indigoidina
A indigoidina (5,5’-diamino-4,4’-dihidroxi-3,3’-diazodifenilquinona) é um pigmento azul produzido por uma série de actinobactérias, bactérias fitopatogênicas como Clavibacter michiganensis, Erwinia chrysanthemi (Starr et al., 1966) e também encontrada em bactérias sapróticas como Arthrobacter atrocyaneus e Vogesella indigofera (Kuhn et al., 1965). Existem relatos que o pigmento azul é gerado em resposta a um fator de virulência ocasionado pelas bactérias fitopatogênicas que iniciam a produção de pectina liase regulada pela proteína PecS que controla inclusive a produção de indigoidina (Reverchon et al., 2002). Sua função devido a estrutura amplamente conjugada é atuar capturando radicais livres e superóxidos que surgem pela resposta do vegetal. Recentemente também foi relatada sua atividade antibiótica.
A biossíntese da indigoidina (Figura 4) é iniciada pela ativação da L-glutamina por uma enzima que transfere uma unidade panteteína (PPTase) e a insere na holo forma do primeiro módulo da NRPS (IndC ou BpsA) que é responsável por sua dessaturação utilizando como co-fator o FAD na presença de ATP, sendo ciclizada e liberada posteriormente por um domínio tioesterase (TE) (Brachmann et al., 2012; Reverchon et al., 2002; Takahashi et al., 2010; Walsh, 2012; Yu, Xu, Valiente, Wang, & Zhan, 2013). A dimerização é uma etapa radicalar e ocorre em presença do ar.
Figura 4. Rota biossíntetica proposta para a formação da indigoidina sendo A: domínio de adenilação; T: domínio de tiolação*; Ox: domínio de oxidação; TE: domínio de Tioesterase; adaptado de Walsh e colaboradores, 2012.
1.6 Biossíntese de Tiopeptídeos
Os tiopeptídeos são uma classe de produtos naturais contendo anéis sulfurados do tipo tiazol/tiazolina e possuem um amplo espectro de atividade biológica como antibiótica, anticancerígena, antimalárica e antiviral (Zhang & Liu, 2013).
Esses metabólitos possuem um núcleo macrocíclico característico, formado pelos aminoácidos que compõem o peptídeo linear e também heterociclos de 5 e 6 membros contendo o nitrogênio. Existem variados tipos de anéis formados como o piperidínico (tioestreptona), deidropiperidina (siomicina A), hidroxipiridínico (nosiepeptídeo) e di-hidroimidazopiperidínico (Sch40832). Também podem variar quanto ao grau de substituição di-, tri- ou tetra- (Arnison et al., 2013).
Para melhor compreensão da biossíntese desses compostos deleções genéticas, expressão em organismos heterólogos, reconstituição in vitro e experimentos de mutassíntese têm auxiliado nos estudos de reconstrução das etapas metabólicas (Bierman et al., 1992; Donk, et al., 2015; Flinspach, et al., 2014; Hayashi et al., 2014; Korenromp, et al., 2005).
A biossíntese desses metabólitos se inicia nos ribossomos que convertem a informação genética no peptídeo linear e posteriormente sofre modificações pós traducionais (RiPPS) para levar ao metabólito final, esse peptídeo é formado por uma cadeia inicial denominada peptídeo líder (LP) que é removido nos estágios finais de síntese. A segunda parte dessa cadeia que compreende os 10-20 últimos aminoácidos é chamado de peptídeo estrutural que será então convertido no tiopeptídeo.
O LP carrega importantes elementos de reconhecimento que são chave para ativar as outras enzimas envolvidas na biossíntese. No entanto, as sequencias presentes nos últimos aminoácidos é que despertam interesse pela possibilidade de realizar pequenas mutações sem que isso afete sua produção. Dessa forma, essa via biossintética pode ser altamente explorada substituindo as informações contidas nos códons do gene responsável pela biossíntese do peptídeo precursor, levando a produção de tiopeptídeos análogos ao original.
Para ilustrar essa via biossintética iremos explorar a produção de tioestreptona (Figura 5) em Streptomyces laurentii, onde existem no total de 21 genes (tsrA ~ tsrU) responsáveis pela sua biossíntese. O peptídeo precurssor desse metabólito possui 58 aminoácidos (aa) na cadeia peptídica, sendo 41 aa compondo o LP e 17 aa o peptídeo estrutural (IASASCTTCICTCSCSS). Uma vez que o precurssor é traduzido pelo
ribossomo, a ciclodesidratase tsrO e a desidrogenase tsrM catalisam o ataque nucleofílico de cada resíduo de cisteína ao grupo carbonílico com posterior eliminação de água, já a ação da desidrogenase é seletiva levando a formação dos anéis tiazol ou tiazolina de todos os resíduos de Cys presentes na cadeia peptídica. Após a formação desses anéis as desidratases codificadas por tsrJ, K e S convertem alguns resíduos de serina e treonina em desidroserinas e desidrotreoninas. Então uma ciclização hetero Diels-Alder [4+2] catalisada por TsrN e L é realizada levando a formação do anel de 6 membros desidropiperidínico. A formação do ácido quinaldico é catalisada por nove enzimas codificadas pelos genes (tsrFAEBDUPQI) utilizando como material de partida o aminoácido L-triptofano. E então esse ácido é adicionado ao peptídeo a partir de uma transesterificação com um resíduo de serina, eliminando a coenzima A (SCoA) e uma adição estereoseletiva ao epóxido presente na estrutura com a eliminação do LP. Finalmente, tsrR catalisa a oxidação do resíduo de isoleucina levando a tioestreptona (Liao et al., 2009).
Figura 5. Biossíntese da tioestreptona por Streptomyces laurentii adaptado de (Liao et al., 2009).
2.0 Objetivos Gerais
O objetivo principal desse trabalho é caracterizar a funcionalidade do cluster indigoidina sintetase e de uma tiopeptídeo sintase, alvos encontrados nas plataformas de bioinformática a partir do sequenciamento realizado da linhagem endofítica Streptomyces sp. B1. Nesse contexto exploramos:
Metodologias para a expressão heteróloga da indigoidina sintetase e da sintase de tiopeptídeos com a finalidade de produzir os metabólitos em questão;
Deleção de genes envolvidos na biossíntese de tiopeptídeos em Streptomyces sp. B1;
Identificação dos metabólitos provenientes desses clusters codificados no genoma de Streptomyces sp. B1;
2.1 Objetivos Específicos
Prospecção dos genes baseados nas plataformas de bioinformática como antiSmash, Phyre2 e o Blastp (NCBI);
Emprego de uma metodologia de clonagem rápida de fragmentos genéticos em organismo heterólogo como Streptomyces coelicolor cepas M1152, M1154 e M1146;
Deleção de genes para avaliar a funcionalidade de uma via metabólica específica;
Avaliação do perfil metabólico a partir de técnicas como a espectrometria de massas (HRESIMS);
3.0 Parte Experimental
Nesta seção serão apresentados os principais métodos empregados para obter o resultado proposto e também a origem dos materiais envolvidos.
3.1 Materiais
3.1.1 Reagentes químicos e biológicos
Todos os reagentes químicos de grau analítico foram adquiridos da Sigma Aldrich, os solventes utilizados de grau HPLC são da empresa J.T Baker, os meios de cultivo diversos são da marca Oxoid. Os kits de extração de plasmídeos e recuperação de DNA foram comprados da empresa QIAGEN e Zymoclean.
3.1.2 Microrganismos utilizados
A linhagem Streptomyces sp. B1 foi obtida das raízes de Citrus spp. e o gênero foi confirmado por análise de amplificação da região 16S em comparação com diversas actinobactérias. As etapas de isolamento e caracterização da linhagem foi realizada pelo Prof. Dr. Wellington Araújo, Prof Dr. João Lúcio de Azevedo e Msc. Joelma Marcon (Marcon, 2002).
As linhagens geneticamente engenheiradas de Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154) foram cedidas pelo Prof. Dr. Peter Leadley (Cambridge, UK) e correspondem as cepas originalmente construídas (Gomez-Escribano et al., 2011).
3.1.3 Meios de Cultivo
Meio LB (Luria-Bertani) Meio 2TY
Extrato de levedura 20 g Triptona 16 g
NaCl 20 g Extrato de Levedura 10 g
Triptona 20 g NaCl 5 g
Ágar (para LB sólido) 20 g Água Milli-Q q.s.p. 1 L Água Milli-Q q.s.p. 1 L
Meio A Vegetativo N
Peptona 4 g Peptona 5 g
Extrato de levedura 2 g Amido 20 g
Extrato de carne 4 g Extrato de carne 2 g
Extrato de soja 2 g Extrato de levedura q.s.p. 1 L
Maltose 20 g Extrato de soja 2 g
Dextrina 10 g CaCO3 1 g
Água Milli-Q q.s.p. 1 L Água Milli-Q q.s.p. 1 L
Meio TSBY Meio GYM
TSB 30 g Extrato de malte 10 g
Sacarose 103 g Extrato de levedura 4 g
Extrato de levedura 5 g Dextrose 4 g
Água Milli-Q q.s.p. 1 L Água Milli-Q q.s.p. 1 L
Meio SFM GPMY
Extrato de soja 20 g Amido de batata 20 g
Manitol 20 g Extrato de levedura 5 g
Agar 20 g Extrato de malte 5 g
MgCl2 1M Conc. Final 10 mM Glicerol 20 mL
Água Milli-Q q.s.p. 1 L Água Milli-Q q.s.p. 1 L
3.1.4 Vetores
Os vetores utilizados para expressão em heterólogo (pESAC13A e pSET152) e para os experimentos de deleção estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Vetores utilizados e suas respectivas aplicações
Vetor Marcadores Aplicação Referência
pYH7
tsr, bla, aac(3)IV, cos, oriT, T3, T7,
rep(pIJ101), ori(ColEI) Deleção de genes
(Sun et al., 2006)
pESAC13A bla, aac(3)IV, tsr, parA, parB, sacB, oriT Biblioteca genômica
(Sosio et al., 2000)
pSET152
attP(ϕC31), int(ϕC31), lacZ, oriT(RP4),
ori(pUC18), aac(3)IV Clonagem
(Sioud et al., 2009)
3.1.5 Plasmídeos
Os plasmídeos produzidos nesse trabalho foram derivados dos vetores pYH7, pESAC13A e pSET152. Suas funções estão descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Plasmídeos desenvolvidos com sua função e vetor derivado
Plasmídeo Função Vetor derivado
pBSΔcal Possui região de homologia a direita e esquerda com o orfE localizado no cluster 36 pYH7 PAC-9D
PAC-20J
PACs construídos a partir da biblioteca genômica (>120 kb)
contendo a região completa do cluster 36 pESAC13A pBSIND
Possui o cluster da Indigoidina sintetase, utilizados para a
clonagem em Streptomyces coelicolor (M1146, M1152 e M1154) pSET152
3.1.6 Antibióticos
Os antibióticos utilizados para cultivo das linhagens foram adquiridos da empresa Sigma Aldrich, preparados conforme Tabela 3, esterilizados em filtros de 0,2 µm e armazenados a -20 °C.
Tabela 3. Antibióticos utilizados para seleção de colônias recombinantes Antibiótico Concentração
estoque (mg.mL-1)
Concentração
final (µg.mL-1) Solvente Ácido Nalidíxico (Nal) 25 25 NaOH (0.15M)
Ampicilina (Amp) 100 100 H2O
Apramicina (Apr) 50 50 H2O
Canamicina (Kan) 50 50 H2O
Cloranfenicol (Chl) 25 25 EtOH
3.1.7 Primers
Os primers descritos nas tabelas 4, 5 e 6 foram desenhados com auxílio do programa Geneious Pro (versão 5.6.7) e produzidos pela Exxtend Biotecnologia Ltda. Os primers foram estocados com concentração de 100 µM em água Milli-Q, sendo a concentração de uso (10 µM) preparada a partir deste estoque.
Tabela 4. Oligonucleotídeos utilizados na clonagem e triagem do cluster indigoidina sintetase
Nome da Sequência Sequência (5' - 3') F1-pSET152-IND CATCGCGATCAAACTCAACCGCGAGCAGAGCAAGGACCAAGATCTATTCCAC ACAACATACGAGC R1-pSET152-IND GGTGAGGGTGGTGCGGGTCACGCCGTTGGCGGTCTCGGAAGATCTTCGACA GACGTAGATCAGGC F1-Right-Indigo GCTCGTCGCTCATGTCGGTGCGGG R1-Right-Indigo TCCAGACGTACGCCAGCGCCTGGG F1-Center-Indigo GCCACGCCGTCGATCTCCAGGTAC R1-Center-Indigo GGTGAAGGCCCAACTGGCAGACCC F1-Left-Indigo GCACCGGGTCGACGGACAGGAACC R1-Left-Indigo GGACGACCGAGACCCAGATCGACGG
Tabela 5. Oligonucleotídeos utilizados na triagem do cluster tiopeptideo sintase
Nome da Sequência Sequência (5' - 3') Thio-Left-F GCCACGTACAGATCGCTCGTCCCG Thio-Left-R GGGACCGCTTCGAGCATGTGACGC Thio-Center-F GGTTGGCGATGCGCTGTCCGCTGC Thio-Center-R GACGGCGTCGCTCTGCTTCGACGC Thio-Right-F GCTCAGCACCAGCACACCGCCACC Thio-Right-R CGCCATGCTCCTGCCACGCGAGAC
Tabela 6. Oligonucleotídeos utilizados na deleção e triagem do cluster tiopeptídeo sintase
Nome da Sequência Sequência (5' - 3')
pΔCAL-F1 TGATCAAGGCGAATACTTCATATGCGCGTGGGCGAGCGAGCGCAGCTC pΔCAL-R1 GGCCCGGTGTTGCGGGAGCCCTTCGCCGGTGCTCCG pΔCAL-F2 GCCGATCACCGCCGGAGCACCGGCGAAGGGCTCCCG pΔCAL-R2 CCGCGCGGTCGATCCCCGCATATGATGGACGGGTACGAGGAGGATGTC scre-pΔCAL-F CAGGAGCCACAGGAAACGCGGCAG Scre-pΔCAL-R CTGACCGTCACGCTGCGCGAACTCC
3.2 Métodos em microbiologia 3.2.1 Condições de Cultivo
Todas Streptomyces foram fermentadas em agitador orbital a 30 ºC em meio TSBY (3% TSB, 10,3% sucrose e 0,5% extrato de soja), a 200 rpm durante 48 h para a produção de micélio para a extração de DNA genômico. Para a extração de metabólitos provenientes das Streptomyces coelicolor M1152, M1154 e M1146 o meio vegetativo N foi utilizado durante 2 dias e então transferido (1:9) para 100 mL de meios diversos onde permaneceram por mais 7 dias.
As linhagens de Escherichia coli (DH10B, ET12567 e TOPO10) foram cultivadas em meio LB suplementadas com antibióticos necessários para cada etapa e foram mantidas em agitador orbital a 37 ºC, 200 rpm durante 16 h e então manipuladas de acordo com cada etapa específica.
3.2.2 Armazenamento das linhagens
Todas as células desse trabalho foram estocadas em soluções contendo glicerol e armazenados em biofreezer na temperatura de −80 ºC. Para isso foi feito um inóculo a partir de uma colônia de Streptomyces ou E. coli segundo as condições:
Streptomycetos: Cultivos em 10 mL de meio TSBY suplementado com 25 µM de ácido nalidixico durante 48 h a 30 ºC e 200 rpm.
E. coli: Cultivos em 5 mL de meio LB suplementadas com antibióticos quando necessário durante 16h a 37 ºC e 200 rpm.
Os inóculos foram então centrifugados a 3500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram resuspensas em 1 mL de solução de glicerol 20% e estocadas em −80 ºC.
3.2.3 Preparo e transformação de células químicamente competentes
A partir de uma colônia de E. coli DH10B, foi feito um inóculo em 5 mL de meio 2TY a 37 ºC durante 16 h e agitação de 200 rpm. Transferiu-se 1 mL desse inóculo para 50 mL de meio 2TY a 37 ºC, 200 rpm até atingir a OD600 0.3 – 0.5. O cultivo foi então resfriado em
banho de gelo e centrifugado a 3500 rpm, 10 minutos, 4 ºC. O sobrenadante foi então descartado e o micélio foi ressuspenso em 50 mL de solução A gelada e mantido nessa condição durante 60 minutos. Novamente as células foram centrifugadas a 3500 rpm, 10 min e 4 ºC e o sobrenadante descartado. De forma sútil o micélio foi resuspenso em 5 mL uma solução gelada B. Desta solução resultante 100 µL foram transferidos para tubos do tipo eppendorf e armazenados em −80 ºC.
Para a transformação de células quimicamente competentes, 100 µL de células foram gentilmente misturadas com aproximadamente com 0,5 µL de plasmídeo ou com 10 µL do mix de ligação, as células foram resfriadas por 30 minutos em banho de gelo e então transferidas para o thermomixer (eppendorf ®) a 42 ºC durante 55 segundos, imediatamente os tubos foram colocados no gelo por 1 – 2 minutos para o choque térmico. Após isso, foram adicionados 500 µL de meio 2TY para revigorar as células, as quais, foram encubadas por 1 h a 37 ºC e 200 rpm. Para selecionar as colônias recombinantes, 150 µL desse meio foram transferidos para placas de LB-ágar com antibióticos apropriados e encubados por 16 h a 37 ºC
Solução A: 50 mM CaCl2, 10 mM CH3CO2K, pH 6,2
Solução B: 50 mM CaCl2, 10 mM CH3CO2K, 20 % glicerol, pH 6,2
3.2.4 Preparo e transformação de células eletrocompetentes
Inoculou-se 500 mL de meio LB com 1% do volume de um pré-inoculo em crescimento a 16 h, essas células permaneceram sob agitação a 37 ºC, 200 rpm até atingir a OD600 0,3-0,5. O cultivo foi então resfriado em banho de gelo e centrifugados a 3500 rpm, 10 min a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 250 mL de glicerol (10%) gelado, centrifugadas, e o sobrenadante descartado. Novamente as células foram ressuspensas em 20 mL de glicerol (10%) gelado, centrifugadas e o sobrenadante descartado. Deste micélio resultante foi adicionado 1-2 mL de glicerol (10%) gelado e então da solução resultante 40 µL foram transferidos para tubos do tipo eppendorf e armazenados em −80 ºC.
Para a transformação de células eletrocompetentes, 40 µL de células foram misturados com 1 µL de plasmídeo ou 10 µL do mix de ligação, esse volume foi então transferido para cubetas de eletroporação previamente esterilizadas e resfriadas em gelo. Foi aplicado um tensão de 1800 V e adicionou-se 1 mL de meio LB para recuperar às células. As células transformadas foram transferidas para tubos estéreis onde
permaneceram a 37 ºC, 200 rpm durante 1 h. Após isso, foram plaqueados 150 µL da suspensão microbiana em meio LB-ágar com o antibiótico apropriado.
3.2.5 Metodologia de clonagem rápida in vitro - SLIC
O DNA genômico de Streptomyces sp. B1 foi fragmentado utilizando a enzima de restrição BglII (New England Biolabs) a 37 ºC durante 9 horas. O DNA fragmentado foi então submetido a eletroforese horizontal usando 0,8% de agarose, a tensão de 40 V, durante 15 horas. A região do gel que continha fragmentos maiores que 18 kbp foi excisadas e o DNA fragmentado recuperado utilizando o kit “Gel DNA Recovery Kit” (Zymoclean®), a concentração final de DNA foi de 89 ng.µL-1.
O vetor linear derivado do plasmídeo pSET152 (Sioud et al., 2009) foi obtido por amplificação por PCR, sendo que os oligonucleotídeos utilizados foram F1-pSET152-IND que contém 45 bp em ambos os lados (sublinhado) de sobreposição com as regiões terminais do fragmento obtido por restrição (20 kbp) que deverá ser pareado. O produto de PCR foi concentrado e extraído de um gel de agarose 0,8% resultando na concentração de 251 ng.µL-1.
Para a montagem final do plasmídeo, 1,1 µL de vetor e 5,0 µL de DNA fragmentado foram adicionados em 10,0 µL do mix Gibson Assembly (Gibson, 2009) em uma reação isotérmica a 50 ºC durante 1 h e então imediatamente 10 µL do produto foi utilizado para a transformação de células quimicamente competentes de E. coli DH10B que foram cultivadas em meio LB-ágar suplementada com apramicina 25 µg.mL-1 durante 16 h a 37 ºC.
Por volta de 50 transformantes foram observados em placas, entre eles, 2 apresentaram positivo para a presença da região central do cluster da Indigoidina sintetase.
Essas colônias foram então cultivadas por 16 h em meio LB suplementado com apramicina 25 µg.mL-1 e seus DNAs foram extraídos e confirmadas as regiões laterais e centrais do cluster clonado.
Para uma segunda confirmação os plasmídeos foram submetidos a um ensaio de restrição seletivo utilizando a enzima BglII e o padrão de digestão foi confirmado novamente, o plasmídeo foi designado “pBSIND”.
3.2.6 Expressão heteróloga do cluster da Indigoidina Sintetase
O plasmídeo pBSDIND em E. coli DH10B foi transferido para E. coli ET12567 através de um experimento de conjugação triparental que envolve duas etapas que serão descritas:
Etapa 1 Transferência do plasmídeo pBSIND em E. coli DH10B para E. coli ET12567.
Células de E. coli ET12567 (CloranfenicolR), TOPO10/pR9604 (AmpicilinaR) e DH10B/pBSIND (ApramicinaR) foram inoculados em 5 mL de meio LB suplementado com os devidos antibióticos a 37 ºC, 200 rpm durante 16 h. Desta cultura 500 µL foram transferidos em 10 mL de meio LB contendo a metade da concentração inicial de antibiótico e então foram incubados a 37 ºC, 200 rpm até atingir OD600 entre 0,4-0,6. As células foram então separadas por centrifugação a 2200 x g por 5 minutos e lavadas duas vezes com 20 mL de meio LB. O sobrenadante foi descartado e o precipitado resuspenso em 500 µL de meio LB. 20 µL de cada cepa foram inoculadas na mesma região da placa em LB-ágar na ausência de antibióticos. Após aevaporação do líquido a placa foi incubada a 37 ºC durante 16 h para favorecer a conjugação tri-parental. No dia seguinte para a seleção das células de E.coli ET12567 contendo os plasmídeos pBSIND e pR9604 uma pequena parte do local de inoculação foi transferida para uma segunda placa LB-ágar suplementada com cloranfenicol 25 µg.mL-1, ampicilina 25 µg.mL-1 e apramicina 25 µg.mL -1
. A placa foi incubada a 37 ºC durante 16 h. Após isso as colônias que cresceram nessas placas foram triadas por PCR.
Etapa 2 Transferência do plasmídeo pBSIND em E. coli ET12567 para Streptomyces coelicolor M1152, M1154 e M1146 via conjugação.
O protocolo de transferência utilizado está descrito no manual de laboratório “Pratical Streptomyces genetics” (Kieser et al., 2000). O protocolo foi seguido e as cepas de Streptomyces coelicolor (M1152, M1154 e M1146) foram selecionadas a partir da resistência a apramicina (Apr) e ácido nalidíxico (NaI).
Os transformantes foram cultivados em meio TSBY, 30 ºC, 200 rpm por 48 horas e então seu genoma foi extraído para a confirmação por PCR da inserção do cluster da indigoidina sintetase.
Para a produção da indigoidina um cultivo de 2 dias em meio vegetativo N foi transferido para o meio SFM (1:100) 30 ºC, 200 rpm onde permaneceu por mais 7 dias, após esse período, o meio foi separado das células por centrifugação (4000 x g, 10 min) e analisados separadamente por LC-MS/MS.
3.2.7 Experimento de deleção genética do domínio de adeniliação do cluster tiopeptídeo sintase
Os experimentos de deleção genética foram realizados de acordo com o protocolo descrito em “Pratical Streptomyces Genetics” (Kieser et al., 2000) e consiste no método de inserção denominado desativação usando uma deleção local. Para isso foi necessário amplificar por PCR (Phusion Flash Master Mix) dois pares de oligonucleotídeos carregando a deleção no fragmento de junção entre eles, os fragmentos possuíam 1,5 kbp de homologia com o fragmento original e foram extraídos utilizando o kit “Gel Recovery Kit” (Zymoclean®) resultando em uma concentração de 40 ng.µL-1.
O plasmídeo pYH7 (Sun et al., 2002) (assimilador ao genoma de Streptomycetos) foi transformado em células quimicamente competentes de E. coli DH10B extraídos com o kit “Miniprep Plasmid Kit” (QIAGEN®
) e então hidrolisados e fosforilados em reação com a endonuclease de restrição NdeI.
Para a montagem do DNA uma reação isotérmica (50 ºC) durante 1 h foi realizada utilizando 3 µL de cada oligonucleotideo amplificado, 1 µL do vetor linear pYH7 e 10 µL Gibson assembly master mix (Gibson et al., 2009).
Imediatamente 10 µL do produto foi transformado em células de E. coli DH10B quimicamente competentes e então incubados por 16 h em meio LB-ágar (37 ºC) suplementados com apramicina 25 µg.mL-1. Após isso, os plasmídeos foram extraídos das células recombinantes e então triados por análise de restrição utilizando as enzimas NdeI e EcoRI de acordo com o protocolo do fornecedor (Thermo Scientific®). O plasmídeo contendo a correta construção foi denominado pBSΔcal.
O plasmídeo pBSΔcal foi transferido para Streptomyces sp. B1 (transferência homóloga) por conjugação, usando E. coli ET12567/pUZ8002 como doador da informação genética. Para isso, uma colônia de Streptomyces sp. B1 foi incubada em 25 mL de meio TSBY suplementada com ácido nalidíxico 25 µg.mL-1 por 48 h (30 ºC e 200 rpm). As células foram então separadas por centrifugação (2200 x g, 10 min, 15 ºC) e lavadas com
20 mL de meio 2TY (1,6% triptona, 1,0% extrato de soja e 0,5% cloreto de sódio). O sobrenadante foi descartado. As células de E. coli ET12567/pUZ8002 previamente transformadas com o pBSΔcal foram inoculadas em 5 mL de meio 2TY suplementadas com ampicilina (25 µg.mL-1), apramicina (25 µg.mL-1), kanamicina (25 µg.mL-1) e incubadas durante 20 h (37 ºC e 200 rpm). Após esse período, 500 µL foi inoculado em 10 mL de meio 2TY contendo a metade da concentração de antibiótico inicialmente adicionado, o meio foi mantido a 37 ºC e 250 rpm até atingir OD600 0.4-0.6. As células foram então centrifugadas (2200 x g, 10 min) e lavadas duas vezes com 20 mL de meio 2TY, o sobrenadante foi descartado e o precipitado resuspenso em 200 µL de meio 2TY.
Os micélios de Streptomyces sp. B1 e E. coli ET12567/pUZ8002 foram combinados (1:9) e plaqueados em meio SFM-ágar (2% farinha de soja, 2% D-mannitol, 2% agar) a 30 ºC sem adição de antibióticos.
Um volume de 1 mL de uma solução 100 µg.mL-1 de apramicina e 500 µg.mL-1 de ácido nalidíxico foram sobrepostos as placas após 16 h para selecionar os transformantes.
Quando as células cresceram nesse meio elas foram transferidas para novas placas de SFM-ágar contendo apramicina (25 µg.ml-1) e ácido nalidíxico (25 µg.mL-1) para confirmar as cepas resistentes ao antibióticos.
Novamente as colônias resultantes foram transferidas para placas SFM-ágar sem antibióticos para permitir a perda do plasmídeo via recombinação homologa. Entre as colônias observadas foram realizados experimentos de PCR para confirmar o padrão de deleção esperado.
3.3 Métodos em biologia molecular 3.3.1 Isolamento de DNA
A metodologia de extração de DNA de actinobactérias utilizada nesse trabalho foi adaptada do trabalho descrito por Sharma e Singh e se mostrou satisfatório para nossa aplicação, o procedimento detalhado será descrito abaixo:
Inicialmente, foi realizado um inóculo em meio TSBY de Streptomyces durante 48 h a 30 ºC e 200 rpm, e então foram transferidos 4 mL desse meio para tubos do tipo eppendorf® e centrifugados a 12000 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o micélio foi ressuspendido em 200 µL de buffer TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) e 50 ng de RNase]. Após isso, foram adicionados 400 µL de solução I [(1%, m/v) Sarkosil, 0.5 M NaCl, (1%, m/v) SDS]. Os tubos foram aquecidos em Thermomixer
(eppendorf®) durante 10 minutos a 37 ºC com agitações esporádicas a cada 3 minutos. Imediatamente foram adicionados 600 µL de uma solução PCI (fenol, clorofórmio e álcool isoamílico; 25:24:1) e cuidadosamente foram misturados por inversão. Após isso a solução foi centrifugada a 12000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de eppendorf®. Nesse novo tubo de eppendorf® foram adicionados 0,1 do volume em acetato de sódio (3 M, pH 5.2) e 0,6 do volume em isopropanol, misturados de 4 a 6 vezes e para precipitar o DNA, os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 12000 rpm e 10 ºC. o precipitado foi ressuspenso em 1 mL de álcool 70% e centrifugados novamente durante 5 minutos e 12000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 40 µL de água milli-Q autoclavada. A concentração de DNA resultante foi checada em uma análise espectrofotométrica a 260 e 280 nm e estocadas em -20 ºC.
3.3.2 Manipulações do DNA
Enzimas de restrição e o mix de montagem de DNA (Gibson Assembly Master Mix) foram adquiridos da New England Biolabs®. Para a Extração e purificação dos plasmídeos uma cultura microbiana foi inoculada durante 18 h e então utilizado “Plasmid Miniprep kit” (QIAprep® Spin QIAGEN) seguindo as orientações do protocolo.
Para as reações de PCR foram utilizados mix contendo os componentes listados na Tabela 7. As enzimas utilizadas foram “Phusion Flash High Fidelity” (Thermo Scientific®
) para realizar amplificações dos plasmídeos e a enzima My Taq Red Mix (Bioline®) para a triagem das colônias.
Tabela 7. Componentes e concentrações das reações de PCR
Componente Concentração Enzima (Phusion Flash, Taq polimerase) 1x
dNTPs 10 nM 0,2 mM Primer F1 0,4 µM Primer R1 0,4 µM DNA Genômico Mg(II) 1mM Dimetil Sulfóxido 1 µL
Os ciclos de PCR foram realizados de acordo com o tempo de catalise de cada enzima sugerido pelo protocolo que acompanha as enzimas e pode ser observado na Tabela 8.
Tabela 8. Ciclos das reações de PCR
Etapa Temperatura Tempo Ciclos desnaturação inicial 95 °C 1 min 1
Desnaturação 95 °C 15s 30
Anelamento 70 °C
5s (Phusion) 15s (taq) 30
Extensão 72 °C 10s 30
Para a excisão do DNA em gel de agarose foi utilizado um estilete e o DNA foi recuperado utilizando o kit “Gel DNA Recovery” (Zymoclean®
)
O DNA genômico foi extraído segundo o método proposto por Sharma e Singh (Sharma et al., 2005).
3.3.3 PCR de colônia
As colônias de E. coli (DH10B e ET12567) recombinantes foram avaliadas com relação a presença de insertos fazendo-se um PCR de colônia. Para isso, foram utilizados tubos de PCR estéreis com 5 µL de água milli Q também esterilizada. As colônias de cada placa de petri foram transferidas para uma nova placa de LB-ágar com antibiótico apropriado e enumerado, imediatamente a mesma ponteira foi imersa no tubo de PCR contendo a água. Após isso, os tubos foram devidamente fechados e mantidos em freezer −20 ºC durante 20 minutos para romper as células das colônias. Durante a reação de PCR duas modificações foram necessárias: o tempo de desnaturação inicial (98 ºC) que passou para 5 minutos ao invés de 1 minuto e a quantidade de primers que passou para 100 µM.
3.3.4 Análise de DNA por eletroforese horizontal
As análises de DNA foram realizadas em cubas de eletroforese horizontal (Apelex® MidiGel 2). Para isso, as amostras de DNA foram misturadas em 6X loading buffer (New England Biolabs) para visualização e realizadas em géis de agarose (Invitrogen) 0,8% contendo buffer TAE 1X suplementado com SYBR safe® (Invitrogen, 5 µL em 50 mL de buffer). Como padrão de peso molecular de DNA foi utilizado 1 kb ladder plus (Invitrogen)
seguindo as recomendações do fabricante. O gel de agarose foi então visualizado em transiluminador UV (254 nm, DNR Bio-Imaging Systems) e fotografados utilizando uma câmera UVP.
3.3.5 Hidrólise com enzima de restrição
As hidrólises com enzimas de restrição foram realizadas de acordo com o manual fornecido pelo fabricante. Uma reação convencional contém a quantidade de DNA necessária para a aplicação (~5 µg), 5 µL de um buffer apropriado para a enzima, 1 µL da enzima de restrição e água milli-Q até completar 50 µL em alguns casos para melhorar a eficiência foi adicionado 1 µL de uma solução 10X BSA (bovine sérum albumin) ou 1 µL de uma solução 10X de espermidina. A reação foi mantida em thermomixer (eppendorf®) durante 1 h, a 37 ºC. Para clonagem foi adicionado 1 µL da enzima CIP (New England Biolabs®) para desfosforilar as regiões 5’ terminais e evitar o re-alinhamento das sequências.
3.3.6 Triagem e construção da biblioteca genômica de Streptomyces sp. B1
Uma biblioteca genômica de Streptomyces sp. B1 foi encomendada da empresa canadense Bio S&T especializada nesse tipo de construção. O vetor utilizado foi o pESAC13A desenvolvido por Sosio e colaboradores, 2000.
Para a triagem do cluster 36, colônias de E. coli DH10B transformadas com o vetor foram cultivadas em 96 placas de poços profundos a 37 ºC, 300 rpm por 16 h. Para cada linha (8 poços), as culturas (800 µL) foram transferidas para tubos plásticos de 15 mL (Greiner) e centrifugados (4500 x g, 10 min e 4 ºC) o sobrenadante foi descartado e o DNA do micélio foi extraído por lise alcalina. Após isso, reações de PCR foram realizadas utilizando a região central do cluster 36 (Thio_Center_F/R), as amostras que amplificaram no tamanho correto de fragmento foram submetidas a uma segunda reação de PCR agora buscando as regiões laterais da tiopeptídeo sintase. Os clones positivos foram identificados, cultivados novamente e re-analisados por PCR e por análise de restrição utilizando a enzima Notl confirmou-se presença de fragmentos entre 100 kb, esses clones foram denominados PAC-9D e PAC-20J e foram enviados ao Brasil.
