Identificação do cluster indigoidina sintetase de Streptomyces sp B

A indigoidina é um pigmento azul presente quando cultivamos Streptomyces sp. B1 em meios contendo como componente a farinha de soja. Observa-se que quando plaqueadas após um período de 2 meses o meio nutriente contido na placa de Petri também adquiri a coloração azulada (Figura 6).

Figura 6. Streptomyces sp. B1 cultivadas em SFM-ágar durante um período de 2 meses. A coloração azulada é um indicio da presença do pigmento conhecido como indigoidina.

A indigoidina possui sua biossíntese governada por um simples módulo de uma NRPS, conhecida como IndC. Para reproduzir um método eficiente de clonagem no nosso grupo de pesquisa realizamos uma busca genoma guiada (genome mining) procurando algum agrupamento biossíntetico que estivesse envolvido na produção desse metabólito, no genoma total da linhagem.

Dessa forma, o cluster 14 apresentou 43 kbp de extensão, onde 39% da informação total se assemelha com os genes responsáveis pela biossíntese da bottromicina (Figura 7). Apesar disso, para a clonagem do fragmento de interesse foi utilizado a enzima BglII que hidrolisa 15 genes biossínteticos, dentre os quais, 3 genes apresentam alta homologia com indA, indB e indC. Esse trio de genes é presente na maioria dos organismos que produzem indigoidina. IndA e indB são homólogos de uma glicosidase e uma hidrolase respectivamente. Esses genes não estão associados diretamente com a biossíntese de indigoidina. Já indC (Figura 8) corresponde a uma NRPS que é responsável pela inserção da L-glutamina, ciclização intramolecular e a dessaturação desse substrato. Além disso, em particular a sequência em Streptomyces sp. B1 apresenta 3,9 kbp de extensão e homologia com alguns organismos produtores desse metabólito como em Streptomyces albus J1074 (Genbank EFE79871), Streptomyces lavendulae (Genbank AHW58010) e Streptomyces fulvissimus (Genbank WP_015608795.1).

Figura 7. Estrutura química da bottromicina A, produzida por Streptomyces sp. BC16019 (Huo et al., 2012).

Os outros genes apresentam funções desconhecidas, ou não relacionadas a biossíntese da indigoidina, no entanto, foi possível observar a alta homologia que essas sequencias apresentam com outros organismos que produzem a indigoidina, como é o caso da Streptomyces albus, Streptomyces lavendulae e Photorhabdus luminescens. Além disso, foi observado a presença de genes relacionados ao transporte, o orf5 é específico para o transporte de indigoidina em Streptomyces lavendulae.

Tabela 11. Principais Genes contidos no cluster 14 em Streptomyces sp. B1 e suas funções previstas, evidenciando indA, indB e indC que estão presentes em todos organismos produtores de indigoidina. Predito pelo NCBI (National Center for Biotechnology Information)

Gene Comprimento (bp) Função predita Gene homólogo Identidade GenBank

orf1 666 Desconhecido - - -

orf2 630 Desconhecido Streptomyces lavendulae 60% WP_030010205.1

orf3 837 ,β-hidrolase Streptomyces griseus 77% WP_032773801.1

orf4 672 SanR fosforibosiltransferase Streptomyces albus 93% EFE_79874.1

orf5 1032 EamA transportador Streptomyces lavendulae 63% BAW_81996.1

indB 660 indB hidrolase Photorhabdus luminescens 52% WP_049581691.1

indC 3831 indC NRPS

Streptomyces albus 89% EFE_79874.1 Streptomyces lavendulae 52% BAW_81996.1 Streptomyces fulvissimus 83% WP_015608795.1 orf6 252 4-oxalocrotonato tautomerase Photorhabdus luminescens 41% WP_049581693.1

indA 939 indA glicosidase Streptomyces fulvissimus 98% WP_015608795.1

orf7 1446 Proteína de membrana Streptomyces alboviridis 92% WP_032759987.1

orf8 1242 Lisofosfolipase Streptomyces griseus 74% WP_069456048.1

orf9 735 Desconhecido Streptmyces griseus 84% WP_073868179.1

orf10 1023 Transportador Streptomyces albus 91% WP_032774938.1

orf11 891 Transportador Streptomyces griseus 84% WP_069173154.1

orf12 798 Transportador Streptomyces albus 83% WP_032774941.1

Ao inspecionar o indC (Figura 8) foi observado uma organização linear, com 2 domínios de adenilação (A), domínio de oxidação (Ox), domínio de tiolação (T) e tioesterase (TE). A proposta de biossíntese desse metabólito envolve a inserção da L- glutamina no segundo domínio de adenilação seguida da dessaturação da ligação α- carbonila.

Figura 8. A organização estrutural de IndC mostrando as posições dos domínios de Adenilação (A), Oxidação (Ox), Tiolação (T) e Tioesterase (TE).

4.1.2 Construção do vetor contendo o cluster da indigoidina sintetase

Após identificado o cluster responsável pela biossíntese da indigoidina sintetase, foi proposta uma transferência dessa informação para Streptomyces coelicolor geneticamente engenheirada, com o objetivo principal de reproduzir um método eficiente para clonagem de grandes fragmentos de DNA. Para isso, inicialmente buscou-se por uma enzima de restrição que fosse capaz de hidrolisar as regiões que flanqueiam os genes responsáveis por sua biossíntese. Dessa forma, a enzima Bglll que atua sobre o palíndromo AGATCT se mostrou promissor para essa aplicação, hidrolisando um fragmento de 20 kbp que permeia as regiões que contém os genes indA, indB e indC (Figura 9). Essa metodologia de clonagem escolhida é conhecida como SLIC (Sequence Ligation Independent Cloning). Nesse tipo de clonagem a ligação da sequência é realizada in vitro através da metodologia isotérmica de Gibson (Kim et al., 2015; Zhou et al., 2015) e depois é transformada em células química ou eletrocompetentes.

Figura 9. Região de 20 kbp hidrolisado pela enzima BglII. Os genes indA, indB e indC, presentes na sequência em negrito, estão relacionados com a biossíntese da indigoidina.

Dessa forma, para aplicar essa metodologia o DNA genômico de Streptomyces sp. B1 (~23 µg) foi hidrolisado em uma reação com a enzima de restrição Bglll, Como os fragmentos de maior comprimento são mais “raros” em uma digestão enzimática, foi decidido separar os fragmentos menores que 18 kbp do restante através de eletroforese horizontal e purifica-los por gel de agarose. A recuperação dos fragmentos acima de 18 kbp foi realizada utilizando-se o “Gel Recovery Kit” (Zymoclean®) resultando na concentração de 45 ng.µL-1. Obtivemos, portanto, uma mistura de fragmentos (>18 kbp) e para selecionar o fragmento de construção correto, foi construído um par de primers com 45 pares de bases de homologia com a região terminal do cluster 14. Além disso, foram adicionados 25 pares de bases para amplificar o plasmídeo pSET152 que possui todos os elementos necessários para a replicação em E. coli (oriT), resistência a apramicina (Apr) e sítio de integração específica do genoma de Streptomycetos (attp φC31o). Esse sítio viabiliza a transferência e integração de informações genéticas. O fragmento foi então amplificado em uma reação de PCR utilizando como molde o plasmídeo pSET152 e purificado por gel de agarose resultando na concentração de 250 ng.µL-1 conforme representado na Figura 10.

Figura 10. Metodologia empregada para a construção do plasmídeo pBSIND (Zhou et al., 2015).

Para realizar a ligação entre os fragmentos foi utilizada a metodologia isotérmica de assembly de Gibson (Gibson et al., 2009). Neste protocolo 10 µL do mix reacional foram imediatamente, transformados em células quimicamente competentes de E. coli DH10B, plaqueados em LB-ágar e triados por PCR de colônia. O rendimento de recombinantes contendo a informação esperada foi abaixo de 4% uma vez que de 50 colônias que foram triadas apenas 2 apresentaram resultado positivo para amplificação da região central da indigoidina sintetase, essa pequena taxa de transformação se deve principalmente a grande probabilidade que existe do plasmídeo recircularizar sem a inserção do fragmento. Esses dois plasmídeos foram extraídos e analisados por restrição. Observou-se no gel após a digestão com Bglll a presença de 2 bandas, referentes ao plasmídeo pSET152 (5000 bp) e referente ao fragmento contendo indC (20000 bp). Apresentando a construção correta e foram denominados pBSIND (Figura 11).

Figura 11. A) Triagem por PCR de colônia de E. coli DH10B/pBSIND amplificando a região central de indC (F/R_Center_Indigo) B) Ensaio de restrição para confirmar a construção correta do plasmídeo pBSIND. A enzima utilizada foi a Bglll os dois fragmentos esperados estavam na ordem de 5000 bp referente ao pSET152 e 20000 bp referente ao cluster 14.

4.1.3 Transferência do cluster Indigoidina sintetase de E. coli DH10B para