UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA – PPGO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO – DIAGNÓSTICO BUCAL
JUSSARA MARIA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES DROGAS SOBRE NEOPLASIAS MALIGNAS DE BOCA
Ação do GW7647 e Pimozida sobre as funções celulares de uma linhagem de carcinoma epidermóide intrabucal
Florianópolis 2019
JUSSARA MARIA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES DROGAS SOBRE NEOPLASIAS MALIGNAS DE BOCA
Ação do GW7647 e Pimozida sobre as funções celulares de uma linhagem de carcinoma epidermóide intrabucal
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia (PPGO), Centro de Ciências da Saúde (CCS), da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Odontologia - Área de Concentração: Diagnóstico Bucal.
Orientadora: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro
Coorientadora: Elena Riet Correa Rivero Orientador no exterior: Jacques Eduardo Nör
Florianópolis 2019
Jussara Maria Gonçalves
AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES DROGAS SOBRE NEOPLASIAS MALIGNAS DE BOCA
Ação do GW7647 e Pimozida sobre as funções celulares de uma linhagem de carcinoma epidermóide intrabucal
Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutora e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia, área de concentração Diagnóstico Bucal.
Florianópolis, 14 de outubro de 2019
________________________________
Prof. Dr. Elena Riet Correa Rivero
Coordenadora do Curso
________________________________
Prof. Dr. Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro
Orientadora
Banca examinadora
_____________________________
Prof. Dr. Jacques Eduardo Nör
University of Michigan – UofM
______________________________
Prof Dr. Michelle Tillmann Biz
Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC
______________________________
Prof. Dr. Therezinha Maria Novais de Oliveira
Universidade da Região de Joinville – Univille
Documento assinado digitalmente Mabel Mariela Rodriguez Cordeiro Data: 19/11/2019 10:14:17-0300 CPF: 003.895.919-47
Documento assinado digitalmente Elena Riet Correa Rivero Data: 19/11/2019 11:10:39-0300 CPF: 691.083.900-53
Dedico este trabalho àquele que pacientemente se manteve ao meu lado durante essa longa caminhada, Giovani Wolff Sfreddo. És a fonte de onde emana a minha força.
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, ao grande arquiteto do Universo pelo dom da vida, pela minha saúde e pela saúde dos meus.
Aos meus amados pais, Juscelino Gonçalves e Sueli Coelho Gonçalves, pelo amor compartilhado e pela educação que recebi desde criança. Foram os valores aprendidos em casa que me guiaram até aqui. Vocês são os meus maiores exemplos de superação, honestidade e trabalho duro. Essa vitória é de vocês.
À minha segunda família, Vilson Sfreddo e Doris Denise Marin Wolff Sfreddo, pelo apoio diário e encorajamento. É um privilégio poder fazer parte de uma família tão alegre e harmoniosa.
Agradeço ao meu querido companheiro, Giovani Wolff Sfreddo, pelo apoio incondicional, amor e respeito mútuo. Obrigada por todo suporte emocional nos dias difíceis e pela alegria compartilhada após cada pequena vitória. O caminho é muito mais fácil e alegre quando se está bem acompanhado.
Às minhas irmãs Rosiana Gonçalves e Maria Denise Gonçalves Welinski. Obrigada pelo carinho recebido durante os últimos anos. É um privilégio tê-las ao meu lado desde sempre e para sempre. Também agradeço ao Guilherme Júlio Welinski, meu querido sobrinho, luz dos meus dias, e ao meu futuro sobrinho e afilhado Felipe Júlio Welinski, o qual já é ansiosamente aguardado.
À minha orientadora Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro. Agradeço imensamente por ter me escolhido durante aquele processo seletivo ainda em meados de 2013. Foi um privilégio trabalhar com uma pessoa que compartilha valores como caráter, dedicação, humildade e conhecimento. Serei eternamente grata pelas oportunidades proporcionadas e pelo carinho concedido.
À minha coorientadora e coordenadora do Programa de Pós-graduação em Odontologia Elena Riet Correa Rivero. Obrigada pelo esforço despendido durante a minha trajetória na pós-graduação. És um grande exemplo de profissionalismo e empoderamento feminino. Também não poderia deixar de agradecer à Carolina Amália Barcellos Silva, colaboradora desse projeto e doadora de uma das linhagens celulares utilizadas.
Às minhas amigas pessoais e colegas de doutorado: Angélica Reinheimer, Ana Gama Guadalupe Cuellar, Caroline Zimmermann, Emanuely da Silva, Fernanda Scotti, Georgia Martini e Rubia Teodoro Stuepp. Obrigada por terem tornado essa jornada tão leve e prazerosa. Agradeço especialmente à Rubia, minha colega de apartamento, por ter sido a minha família em Florianópolis. Também preciso
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destacar o laço construído com a Emanuely, uma das pessoas mais especiais que já conheci.
À Gilmara, técnica do Laboratório de Patologia Bucal e grande amiga. Obrigada pelo seu apoio, paciência e comprometimento. Você fez diferença no meu dia a dia durante o desenvolvimento dessa pesquisa.
A todos os professores do Departamento de Patologia da UFSC, pelo conhecimento compartilhado durante os últimos anos. Especialmente à professora Maria Inês Meurer, que me ensinou mais do que o saber técnico, bem como aos professores Rogério Gondak e Filipe Modolo que se tornaram as minhas grandes referências em patologia devido ao vasto conhecimento e desejo constante de ensinar.
Aos professores da minha primeira casa, Univille, especialmente ao Luiz Carlos Machado Miguel, Lúcia Fátima de Castro Ávila e Kesly Mary Ribeiro Andrades. Obrigada pelo incentivo e encorajamento a mim concedidos desde a época da graduação. É um privilégio, hoje, chamá-los de colegas.
Ao professor Jacques Eduardo Nör, por me permitir fazer parte da equipe do laboratório de Angiogênese, na Universidade de Michigan, durante seis meses. Foi um privilégio trabalhar ao lado de um profissional tão brilhante e, ao mesmo tempo, um ser humano tão maravilhoso.
Ao professor Paulo Fernando Dias, por ter aberto as portas do seu laboratório de cultura celular para que pudéssemos trabalhar. Uma pessoa doce e que trata a todos com muito respeito. Obrigada por compartilhar a sua estrutura física e o seu tempo. Também gostaria de agradecer a equipe LVA, que sempre se solidarizou com as nossas necessidades, principalmente, à Raissa Borges Curtarelli, Mariane Beatriz Sordi e à professora Ariadne Cristiane Cabral da Cruz.
Aos alunos de graduação que tive o privilégio de coorientar, Igor Santos Araújo, João Vitor Steimbach e Julia Pertschy, obrigada pela confiança e amizade construída.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo que propiciou a realização deste curso de doutorado em forma de dedicação exclusiva.
“A doença é a zona noturna da vida, uma cidadania mais onerosa. Todos que nascem têm dupla cidadania, no reino dos sãos e no reino dos doentes. Apesar de todos preferirmos só usar o passaporte bom, mais cedo ou mais tarde nos vemos obrigados, pelo menos por um período, a nos identificarmos como cidadãos desse outro lugar”
Susan Sontag O imperador de todos os males - Uma biografia do câncer
APRESENTAÇÃO
Baseando-se em uma linha de pesquisa desenvolvida desde o mestrado, este estudo foi realizado no Laboratório LCTBio, localizado na Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). A partir desse projeto, dois trabalhos também foram apresentados em Congressos da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica (SBPqO), sendo um na modalidade pôster e outro na modalidade oral.
Dentro dessa linha de pesquisa, três estudos já foram publicados e um encontra-se submetido:
-Gonçalves, J.M., Silva, C.A.B. Cordeiro M.M.R. , Rivero E.R.C. Inhibition of cancer stem cells promoted by Pimozide. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2019 Feb;46(2):116-125.
doi: 10.1111/1440-1681.13049. Epub 2018 Nov 28.
-Curtarelli R.B., Gonçalves J.M., Dos Santos L.G.P., Savi M.G., Nör J.E., Mezzomo L.A.M., Rodríguez Cordeiro M.M. Expression of Cancer Stem Cell Biomarkers in Human Head and Neck Carcinomas: a Systematic Review. Stem Cell Rev. 2018 Dec;14(6):769-784.
doi: 10.1007/s12015-018-9839-4.
-Gonçalves, J.M., Cordeiro M.M.R., Rivero E.R.C. The Role of the Complex USP1/WDR48 in Differentiation and Proliferation Processes in Cancer Stem Cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2017;12(5):416-422.
doi: 10.2174/1574888X12666170315104013.
-Gonçalves, J.M., Bastos, J.L.D., Rivero, E.R.C., Cordeiro M.M.R. Immunoexpression of p53 and Deubiquitinating Enzymes in Oral Squamous Cell Carcinoma (submetido). Além das publicações, também se destacam as atividades de coorientação exercidas pela aluna por meio deste projeto. Ao total foram:
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-Júlia Pertschy. Avaliação do efeito dose-resposta do inibidor seletivo Pimozida sobre células de carcinoma epidermóide bucal humano. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Odontologia) - Universidade Federal de Santa Catarina. Orientadora: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro. Coorientadora: Jussara Maria Gonçalves.
-Raissa Borges Curtarelli. Expressão de biomarcadores de células-tronco neoplásicas em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço humanos: Uma revisão sistemática. 2016. Trabalho de Conclusão de Curso. (Graduação em Odontologia) - Universidade Federal de Santa Catarina. Orientadora: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro. Coorientadora: Jussara Maria Gonçalves.
Três iniciações científicas (IC).
-Joao Vitor Steimbach. Avaliação do efeito dose-resposta do inibidor seletivo GW7647 sobre células de carcinoma epidermóide bucal humano. 2019. Iniciação Científica. (Graduando em Farmácia) - Universidade Federal de Santa Catarina. Orientadora: Carolina Amália Barcellos Silva. Coorientadora: Jussara Maria Gonçalves.
-Igor Santos Araújo. Avaliação da ação do inibidor seletivo GW7647 sobre a proliferação e migração de células de carcinoma epidermóide bucal humano. 2019. Iniciação Científica. (Graduando em Odontologia) - Universidade Federal de Santa Catarina. Orientadora: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro. Coorientadora: Jussara Maria Gonçalves.
-Julia Pertschy. Avaliação do efeito dose-resposta do inibidor seletivo Pimozida sobre células de carcinoma epidermóide bucal humano. 2018. Iniciação Científica. (Graduando em Odontologia) - Universidade Federal de Santa Catarina. Orientadora: Mabel Mariela Rodríguez Cordeiro. Coorientadora: Jussara Maria Gonçalves.
RESUMO
Introdução: Dentre os vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, o mais prevalente consiste no Carcinoma Epidermóide Intrabucal (CEI). Apesar de haver diferentes modalidades de tratamento disponíveis para essa enfermidade, ainda são observados baixos índices de sobrevida e grave comprometimento funcional desses pacientes. Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégicas de terapia para o manejo dessas neoplasias malignas é extremamente necessário. Objetivo: Avaliar o efeito da exposição às drogas GW7647 (agonista de PPARα) e Pimozida (antipsicótico bloqueador de receptores dopaminérgicos) sobre uma linhagem de CEI humano. Metodologia: A fim de determinar a curva dose-resposta das drogas, as células foram tratadas com concentrações crescentes de GW7647 (Controle negativo, 10µM, 50µM, 100µM, 150µM e 200µM) e Pimozida (Controle negativo, 1µM, 5µM, 10µM, 15µM e 20µM) nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Após, realizou-se o teste de citotoxicidade MTT, avaliação da capacidade de migração, por meio do método Scratch, ensaio de proliferação e verificação do potencial clonogênico. Resultados: GW7647 e o Pimozida reduziram significativamente a viabilidade celular com valores IC50 de 160,26µM e 14,15µM, respectivamente, no tempo de 72 horas. Observou-se o fechamento da ferida no grupo controle negativo. Entretanto, a partir da administração de dosagens mais altas das respectivas drogas (p<0,05) houve gradativa diminuição no fechamento da arranhadura, indicando diminuição da capacidade de migração. Da mesma maneira, também houve uma diminuição significativa do índice proliferativo e da eficiência de formação de colônia da população celular de CEI com diferentes concentrações quando comparado com o controle negativo (p<0,05). Conclusões: As drogas Pimozida e GW7647 são capazes de induzir a redução de funções importantes durante a carcinogênese, as quais estão relacionadas, principalmente, com o processo de metástase do CEI humano. O efeito destas drogas ocorre de maneira dose e tempo dependente, ou seja, conforme se aumenta a dose e o tempo, mais relevante se torna a ação antineoplásica das substâncias.
ABSTRACT
Introduction: Among the various types of head and neck cancer, the most prevalent
is Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC). Although there are different treatment modalities available for this disease, low survival rates and severe morbidity of these patients are still observed. Thus, the development of new therapeutic strategies for the management of OSCC is extremely necessary. Objective: To evaluate the effect of the exposition to drugs GW7647 (PPARα agonist) and Pimozide (antipsychotic dopaminergic receptor blocker) on a human OSCC cell line. Methodology: In order to determine the curve dose-response of the drugs, cells were treated with increasing concentrations of GW7647 (Controle negativo, 10µM, 50µM, 100µM, 150µM e 200µM) and Pimozide (Negative Control, 1µM, 5µM, 10µM, 15µM, and 20µM) at 24, 48 and 72 hours. Afterward, the MTT cytotoxicity test was performed, as well as migration capacity, by Scratch method, rate of proliferation and potential clonogenic assay. Results: GW7647 and Pimozida significantly reduced cell viability with IC50 values of 160.26µM and 14.15µM, respectively, for 72 hours. Wound closure was observed in the negative control group. However, the administration of higher dosages of the respective drugs (p <0.05) provided a significant reduction in the scratch closure, indicating a decrease in the migration capacity. Similarly, the proliferative index and colony formation efficiency were significantly decreased with different concentrations of the OSCC cell population when compared to the negative control (p <0.05).
Conclusions: The drugs Pimozida and GW7647 are capable of inducing the reduction
of important functions during the carcinogenesis process, which are mainly related to the human OSCC metastasis process. The effect of these drugs occurs in a dose and time-dependent manner, that is, as the dose and time increase, the antineoplastic action of the substances becomes more relevant.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fórmula estrutural do fármaco GW7647...……...35
Figura 2: Ilustração da via de sinalização do receptor PPARα... 36
Figura 3: Fórmula estrutural do fármaco Pimozida...40
Figura 4: Atuação da droga Pimozida pela via STAT……….47
Figura 5: Atuação da droga Pimozida pela via USP1/WDR48...53
Figura 6: Linhagem celular CAL27 oriunda de Carcinoma Epidermóide Bucal humano...56
Figura 7: Distribuição em grupos dos tempos e concentrações das drogas GW7647 e Pimozida, os quais foram avaliados para estabelecer a curva dose-resposta ideal....57
Figura 8: Ensaio de migração celular (GW7647)...64
Figura 9: Ensaio de migração celular (Pimozida)...65
Figura 10: Ilustração das colônias coradas com Violeta Cristal 5% após a aplicação de diferentes concentrações da droga GW7647 nos três períodos de tempo (24h, 48h e 72h) (10x)...69
Figura 11: Ilustração das colônias coradas com Violeta Cristal 5% após a aplicação de diferentes concentrações da droga Pimozida nos três períodos de tempo (24h, 48h e 72h) (10x)...70
Figura 12: Fotografia do poço da placa de cultura ilustrando as colônias coradas com Violeta Cristal 5% após a aplicação de diferentes concentrações da droga GW7647 nos três períodos de tempo (24h, 48h e 72h)...71
Figura 13: Fotografia do poço da placa de cultura ilustrando as colônias coradas com Violeta Cristal 5% após a aplicação de diferentes concentrações da droga Pimozida nos três períodos de tempo (24h, 48h e 72h)...72
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Estudos que avaliaram o Pimozida como um possível agente terapêutico contra o câncer...44 Tabela 2: Informações sobre a linhagem de células que será utilizada nesse estudo...55 Tabela 3: Resultado do teste T de amostras independentes para o teste de viabilidade celular em células de Carcinoma Epidermóide Bucal tratadas com GW7647 e Pimozida...62 Tabela 4: Resultado do teste T de amostras independentes para o teste de migração celular de células de Carcinoma Epidermóide Bucal tratadas com GW7647 e Pimozida...63 Tabela 5: Resultados do teste T de amostras independentes nos três períodos avaliados do ensaio de proliferação celular utilizando a droga GW7647...67 Tabela 6: Resultados do teste T de amostras independentes nos três períodos avaliados do ensaio clonogênico utilizando a droga GW7647 e Pimozida...68 Tabela 7: Valores (%) do teste de eficiência de formação de colônia (PE) para o grupo controle e fração de sobrevida (SF) nos três períodos avaliados do ensaio clonogênico utilizando a droga GW7647 e Pimozida...69
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Viabilidade das Células de Carcinoma Epidermóide Bucal (%) tratadas com GW7647 e Pimozida...61 Gráfico 2: Avaliação do fechamento percentual das arranhaduras em diferentes dosagens de GW7647 e Pimozida nos três respectivos períodos...63 Gráfico 3: Avaliação percentual da proliferação celular nos grupos de dosagens de GW7647 e períodos estudados...66 Gráfico 4: Contagem do número de colônias após administração de diferentes dosagens de GW7647 e Pimozida em diferentes períodos estudados...68
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC...Adenilato Ciclase ATP...Trifosfato de adenosina BCL-xL...linfoma de células B2
bHLH... basic-Helix-Loop-Helix CAC...Carcinoma Adenóide Cístico cAMP...monofosfato de adenosina cíclico CAPES...Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CCS...Centro de Ciências da Saúde CDKN... Inibidor de Quinase Dependente de Ciclina CEI...Carcinoma Epidermóide Intrabucal CPNPC...Carcinoma de Pulmão de Não Pequenas Células CEPSH...Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos CFU...Unidade Formadora de Colônia CONEP...Comissão Nacional de Ética em Pesquisa CO2...Dióxido de Carbono
CHC...Carcinoma Hepatocelular CTN...Célula-tronco Neoplásica DNA... Ácido Desoxirribonucleico DMEM...Meio de Eagle Modificado por Dulbecco DMSO...Dimetilsulfóxido DUB... Desubiquitinase EMT...Transição epitélio-mesenquimal EpCAM...Molécula de Adesão Epitelial Celular FDA...Administração de drogas e comidas dos Estados Unidos IC50...Metade da concentração inibitória máxima
ID...Proteína Inibidora da Ligação de DNA IL-6...Interleucina 6 INCA...Instituto Nacional de Câncer LMA...Leucemia Mieloide Aguda MTT...Sal brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil) Tetrazólio NF-KB...Fator nuclear Kappa B OMS...Organização Mundial da Saúde
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PPGO...Programa de Pós-Graduação em Odontologia PPAR...Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma PPRE...Elemento de resposta ao DNA SBPqO...Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica PBS...Tampão Fosfato-Salino PE...Eficiência de formação de colônias PKA...Proteína Kinase A RXR... Receptor Retinóide X SF...Fração de Sobrevida STAT...Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição TNF...Fator de Necrose Tumoral Ub...Ubiquitina UPS...Sistema Ubiquitina-Proteossoma UFSC...Universidade Federal de Santa Catarina USP1...Protease Específica da Ubiquitina 1 WDR48...WD repeat-containing protein 48
LISTA DE SÍMBOLOS cm...Centímetro ºC...Graus Celsius =………..………..Igual a +...Mais ±...mais ou menos ®...Marca registrada <...Menor que h...Horas µL...Microlitro µM...Micro Molar mg...Miligrama nm...Nanômetro %...Por cento
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 31 2. REVISÃO DE LITERATURA...33 2.1 Carcinoma Epidermóide…………..……...33 2.2 GW7647...34 2.2.1 Descrição...34 2.2.2 Apresentação comercial...35 2.2.3 Ação farmacodinâmica ...35 2.2.4 Metabolismo e farmacocinética...37 2.2.5 Indicações clínicas ...37 2.2.6 GW7647 como um potencial alvo anticâncer ...37 2.2.7 Mecanismo de ação do GW7647 sobre o câncer...38 2.3 Pimozida...39 2.3.1 Descrição...39 2.3.2 Apresentação comercial...40 2.3.3 Ação farmacodinâmica ...40 2.3.4 Metabolismo e farmacocinética...40 2.3.5 Indicações clínicas ...41 2.3.6 Pimozida como um potencial alvo anticâncer ...41 2.3.7 Mecanismo de ação do Pimozida sobre o câncer...45 3. JUSTIFICATIVA...53 4. HIPÓTESE DE ESTUDO...54 5. OBJETIVOS...54 5.1 Objetivo geral ...54 5.2 Objetivos específicos...54 6. METODOLOGIA...55 6.1 Delineamento do estudo ...55 6.2 Aspectos Éticos e Legais …...55 6.3 Procedimentos experimentais …...55 6.3.1 Linhagem celular ……...55 6.3.2 Cultivo celular...56 6.3.3 Curva dose-resposta …...57
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6.3.4 Teste de viabilidade celular usando MTT ...58 6.3.5 Ensaio de migração celular...58 6.3.6 Ensaio de proliferação celular...59 6.3.7 Ensaio clonogênico...60 6.4 Análise estatística ……...60 7. RESULTADOS...61 7.1 Teste de viabilidade celular usando MTT...61 7.2 Ensaio de Migração celular... 62 7.3 Ensaio de Proliferação celular...66 7.4 Ensaio clonogênico...67 8. DISCUSSÃO...73 9. CONCLUSÕES...79 REFERÊNCIAS...80
1. INTRODUÇÃO
A incidência anual de câncer de cabeça e pescoço é superior a 550.000 novos casos, sendo que 300.000 pessoas morrem a cada ano em todo o mundo por essa doença. Dentre os vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, o mais prevalente consiste no Carcinoma Epidermóide Intrabucal (CEI) (UICC, 2014), que representa mais de 90% de todos os neoplasmas malignos da cavidade oral e orofaringe (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017). Especificamente no Brasil, no ano de 2017, 14.700 casos novos foram estimados, sendo 11.200 em homens e 3.500 em mulheres (INCA, 2018).
Apesar das modalidades de tratamento disponíveis, como radioterapia, quimioterapia e cirurgia, ainda são observados baixos índices de sobrevida e grave comprometimento funcional em pacientes que apresentam CEI localmente invasivo. Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégicas de terapia para o manejo de pacientes com CEI é extremamente necessário (ZHAO et al., 2013).
Ao longo dos anos observou-se uma menor incidência de câncer em pacientes com esquizofrenia (MORTENSEN, 1989). Sobretudo, verificou-se que o processo de carcinogênese nesses pacientes não está relacionado com exposição aos fatores de risco tradicionais (CATTS et al., 2008). Embora a causa dessa redução na incidência de câncer ainda não esteja esclarecida, o uso de drogas antipsicóticas por esses pacientes pode ser o responsável por mediar esse efeito (MORTENSEN, 1989). Baseando-se nessa informação, elegeu-se o primeiro fármaco abordado nesse estudo, o Pimozida.
Este medicamento consiste em um agente antipsicótico de administração oral, já aprovado pela FDA (Food and Drug Administration), indicado para tratar síndrome de Tourette, psicose crônica e tics motores e fônicos resistentes (PHARMACEUTICALS, 2008). Embora o estudo dessa droga em CEI seja pioneiro, outros autores já investigaram o seu potencial como alvo anticâncer em diversos tipos de neoplasia (CHEN et al., 2011, 2015; FAKO et al., 2016; LEE et al., 2015; MISTRY et al., 2013; NELSON et al., 2012; STROBL; PETERSON, 1992; STROBL et al., 1990; TAUB, ROBERT; BAKER, 1979; ZHOU et al., 2016).
No entanto, é importante destacar que a citoxicidade desse antipsicótico não está relacionada à sua ação sobre os receptores dopaminérgicos e serotoninérgicos, pois
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concentrações muito mais altas seriam necessárias para saturar estes tipos de receptores e induzir a citotoxicidade (STROBL et al., 1998). Portanto, uma explicação alternativa para a citotoxicidade do Pimozida é a interação direta com três vias: STAT3 e STAT5, wnt/β-catenina e USP1 / WDR48 (GONÇALVES et al., 2019).
O segundo fármaco que será abordado neste estudo, tambémde maneira inédita em CEI, é o medicamento GW7647 que, ao contrário do Pimozida, ainda não foi aprovado pela FDA. Apesar de sua indicação clínica consistir no controle da dislipidemia, ao longo dos anos verificou-se ação antineoplásica desse medicamento em linhagens celulares de carcinoma de mama (GOPISETTY VENKATA et al., 2006) (HOQUE; ROBILLARD; BENDAYAN, 2012) (VENKATA et al., 2008), hepatocarcinoma (VAN DER MEER et al., 2010) e carcinoma de pulmão de não pequenas células (CPNPC) (CHEN et al., 2011).
Esse efeito se deve ao fato do GW7647 ser um agonista do Receptor Ativado por Proliferadores de Peroxissoma α (PPARα), o qual está associado a diversas alterações gênicas durante a carcinogênese (BERGER; MOLLER, 2002). PPAR consiste em um grupo de fatores de transcrição de ácido desoxirribonucleico (DNA) com três isoformas distintas: β, α/δ e γ (BERGER; MOLLER, 2002), sendo o PPARα um fator de transcrição ativado por ligante e envolvido na regulação da homeostase lipídica (LATRUFFE; VAMECQ, 1997). Quando ativado pelos seus respectivos ligantes endógenos, que são os ácidos graxos livres e eicosanoides, os PPARs realizam a heterodimerização com o receptor de ácido retinóico 9-cis. Este complexo, então, inicia a transcrição e expressão de seus genes alvo. Como resultado, observa-se a regulação do metabolismo lipídico e, como tal, sua ativação leva a um aumento na absorção e catabolismo de ácidos graxos (BRAVO et al., 2014).
Alguns estudos sugerem que ativar PPARα pode ser útil para a prevenção ou tratamento de diferentes tipos de câncer. A administração oral de diferentes agonistas do PPARα inibiu o crescimento e angiogênese de tumores derivados de melanoma, carcinoma pulmonar de Lewis, glioblastoma e fibrossarcoma (PANIGRAHY et al., 2008). Essa ação antineoplásica pode ocorrer por meio de três vias dependentes do receptor PPARα (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2012), como: Inibição da expressão gênica de mediadores da inflamação através da interação da subunidade p65 do NF-κB (do inglês, factor nuclear kappa B) (VARGA; CZIMMERER; NAGY, 2011); aumento da oxidação mitocondrial de ácidos graxos, inibição da expressão da glutaminase, o que diminui os níveis de glutamina e limita o crescimento de células neoplásicas
(AOYAMA et al., 1998) e, por fim, assim como o Pimozida, a via protease específica da ubiquitina (USP1) / WD repeat-containing protein 48 (WDR48) (CHEN et al., 2011).
Baseando-se nessa perspectiva, o objetivo deste estudo consistiu em avaliar, de maneira pioneira, a ação e o efeito do inibidor seletivo das drogas Pimozida e GW7647, in vitro, sobre células provenientes de uma linhagem celular de CEI.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Carcinoma epidermóide intrabucal (CEI)
O câncer está entre as principais causas de morbidade e mortalidade, com aproximadamente 18 milhões de novos casos e quase 10 milhões de mortes em 2018 (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018). Mais de 50% dos novos casos ocorrem na África e na Ásia. É estimado que a taxa anual de casos passe para 22 milhões (um aumento de aproximadamente 70%) nas próximas duas décadas. O câncer de boca é o décimo sétimo câncer mais comum, sendo o carcinoma epidermóide o tipo mais frequente dentre (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2018; ZHAO et al., 2013).
Segundo o levantamento do Instituto Nacional de Câncer (INCA), estima-se que no Brasil surgiram 11.200 novos casos em homens somente no ano de 2018. No que se refere à mortalidade, foram reportadas 4.923 mortes em 2017 (INSTITUTO NACIONAL DE CâNCER, 2016).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) define o CEI como uma neoplasia epitelial invasiva com alta propensão para metástase, que ocorre, principalmente, em homens com idade entre a quinta e sexta décadas de vida (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017). O processo de carcinogênese ocorre por meio de múltiplas etapas, de uma série de alterações gênicas irreversíveis que controlam o crescimento, morte e diferenciação celular. Além disso, o CEI contém alta heterogeneidade celular devido às mutações que ocorrem em função da instabilidade gênica e fatores ambientais (AGRAWAL et al., 2011; NISHIMINE et al., 2003). O carcinoma epidermóide, quando presente no lábio, possui como principal fator etiológico a exposição solar. Entretanto, quando o mesmo é intrabucal está diretamente relacionado a hábitos nocivos (etilismo e tabagismo) (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017).
Clinicamente, o CEI é precedido por lesões cancerizáveis, como a leucoplasia, eritroplasia e leucoeritroplasia. Estas condições possuem um aspecto clínico que
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muitas vezes é condizente com o início de alterações celulares, com potencial para se transformar em um carcinoma (NEVILLE; DAY, 2002). Após essa transformação, o CEI normalmente se apresenta como uma úlcera exofítica ou endofítica, de superfície irregular, vegetante, papilar ou verruciforme e sua cor poderá variar da coloração normal ao vermelho ou branco. A superfície é frequentemente ulcerada e o tumor é endurecido à palpação (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017). A localização intrabucal mais comum é a língua, geralmente as superfícies ventral e a lateral da região posterior são mais atingidas. Outros locais de predileção são assoalho de boca, palato mole/duro e gengiva (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017).
Histopatologicamente, o CEI caracteriza-se por ilhas ou cordões de epitélio neoplásico invadindo o tecido conjuntivo, podendo conter pérolas de ceratina, aumento do número de mitoses e mitoses aberrantes (ADEL K. EL-NAGGAR et al., 2017).
Apesar dos tratamentos, como cirurgia, radioterapia e quimioterapia terem sido gradualmente aprimorados, o prognóstico dos pacientes em estágios avançados de CEI ainda permanece sombrio, com uma taxa de sobrevida de apenas 50% ao longo de cinco anos. Em função dos baixos índices de sobrevida e do grave comprometimento funcional causado pela cirurgia e pela radiação, é urgente desenvolver novas estratégias terapêuticas para estes pacientes (ZHAO et al., 2013). 2.2 GW7647
2.1.1 Descrição
GW7647 é um ácido monocarboxílico, o qual o grupo fenil é substituído por um grupo 3-aza-7-ciclohexil hept-1-yl, sendo o nitrogênio acilado por um grupo carbonila. Exerce o papel de agonista do PPARα (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (NIH), 2005). Este composto foi identificado, primeiramente, por Brown e colaboradores em 2001 (BROWN et al., 2001) (Figura 1).
Figura 1 – Fórmula estrutural do fármaco GW7647.
Fonte: (BROWN et al., 2001)
2.1.2 Apresentação comercial
O fármaco GW7647 ainda não foi aprovado pela FDA. Por essa razão, essa droga ainda não está comercialmente disponível para uso clínico.
2.1.3 Ação farmacodinâmica
A droga GW7647 consiste em um agonista do receptor PPARα (CREATIVE DIAGNOSTICS, 2019). A ativação desse receptor ocorre da seguinte maneira:
Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são uma grande família de proteínas de membrana integrais que respondem a uma variedade de estímulos extracelulares. Cada GPCR se liga e é ativado por um ligante específico que varia em tamanho de catecolaminas, lipídios ou neurotransmissores de moléculas. Normalmente, esses ligantes são ácidos graxos oriundos da dieta alimentar (SCHUPP; LAZAR, 2010).
Quando um GPCR é ativado por ligante extracelular, uma alteração conformacional no receptor é induzida, a qual é transmitida a um complexo de proteína G heterotrimérico intracelular, a subunidade Gα-S. Após, este complexo ativado se liga e ativa uma enzima chamada Adenilato Ciclase (AC) que, por sua vez, catalisa a conversão de trifosfato de adenosina (ATP) em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (CREATIVE DIAGNOSTICS, 2019).
No entanto, com o aumento na concentração do segundo mensageiro cAMP há, também, a ativação de uma enzima chamada Proteína Kinase A (PKA). Após a ativação de PKA, esta enzima fosforila outras proteínas, incluindo enzimas que
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convertem glicogênio em glucose e fatores de transcrição responsáveis por regular a expressão gênica, como o PPAR (CREATIVE DIAGNOSTICS, 2019).
O PPAR consiste em uma classe de reguladores transcricionais dependentes de ligantes. Esta família inclui três isoformas: PPARα, PPAR β/δ e PPARγ (WILLSON et al., 2000) (BERGER; MOLLER, 2002), as quais foram encontradas em todas as espécies de mamíferos estudadas até o presente momento (SCHUPP; LAZAR, 2010). A isoforma PPARα pode regular a transcrição gênica por meio de vias: heterodimerização com RXR (Receptor Retinóide X) ou com Fator nuclear Kappa B (NF-kB). O dímero PPAR-RXR liga-se a uma sequência específica denominada elemento de resposta ao DNA (PPRE) localizada na região promotora ou intragênica. Ao mesmo tempo, co-ativadores do receptor nuclear entram em sinergia com o PPAR-RXR, complementam e estabilizam o complexo transcricional ativo (WILLSON et al., 2000).
Ao final desse processo, ocorre a transcrição de diversos genes alvo, sendo estes associados ao metabolismo de ácidos graxos e homeostase lipídica, exercendo um papel regulador fundamental da β-oxidação peroxisomal e mitocondrial de ácidos graxos e síntese de corpos cetônicos, os quais garantem homeostase celular durante os períodos de alimentação e inanição (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2012) (SCHUPP; LAZAR, 2010). Além disso, o PPARα não é exclusivamente um regulador metabólico, mas também tem potente atividade anti-inflamatória (VARGA; CZIMMERER; NAGY, 2011), devido à regulação negativa dos ativadores das vias de sinalização do NF-κB (DELERIVE; DE BOSSCHER; BESNARD, 1999), um dos genes associados à inflamação (AUWERX et al., 1996) (Figura 2).
Vale destacar que o receptor PPARα é predominantemente expresso em tecidos que catabolizam quantidades elevadas de ácidos graxos, como o fígado (AUWERX et al., 1996), mas foi também encontrado em miócitos cardíacos, células epiteliais renais, músculo esquelético, epitélio do intestino grosso, células do músculo liso e endotelial, bem como células do sistema imunológico, incluindo macrófagos, linfócitos e granulócitos (AUBOEUF et al., 1997).
Figura 2: Ilustração da via de sinalização do receptor PPARα.
Fonte: do autor
2.2.4 Metabolismo e farmacocinética
Ainda não há relatos na literatura sobre o mecanismo farmacocinético do GW7647 em animais e tampouco em humanos, uma vez que ainda não se iniciaram as fases de pesquisa clínica.
2.2.5 Indicações clínicas
Os agonistas de PPARα foram inicialmente estudados com o intuito de controlar a dislipidemia, ou seja, a elevação de colesterol e triglicerídeos no plasma ou a diminuição dos níveis de HDL, uma vez que este receptor desempenha um efeito hipolipidêmico (SUMANASEKERA et al., 2003). Além disso, essa família de receptores também foi utilizada para controlar o Diabetes tipo 2, uma vez que a PPARα tem um papel direto na regulação da gliconeogênese por meio da estimulação da expressão do piruvato desidrogenase quinase (GROSS; STAELS, 2007).
2.2.6 GW7647 como um potencial alvo anticâncer
Já está comprovado na literatura que a ação dos PPARs impacta diretamente em consequências clínicas relacionadas a distúrbios metabólicos, os quais são
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conhecidos por estarem associados ao aumento do risco de câncer (como diabetes, obesidade, dislipidemias e inflamação crônica). Portanto, modular as atividades dos PPARs representa uma abordagem alternativa para o tratamento e prevenção do câncer (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2012).
Segundo Panigrahy e colaboradores (2008), ativar o PPARα pode ser útil para a prevenção e tratamento de diferentes tipos de câncer. Visto que a administração oral de diferentes agonistas do PPARα inibiu o crescimento de tumores derivados de melanoma, carcinoma pulmonar de Lewis, glioblastoma e fibrossarcoma (PANIGRAHY et al., 2008) e xenoenxertos de células de câncer de pulmão humano (A549) (POZZI et al., 2007). Portanto, múltiplos tipos de tumores poderiam ser prevenidos por essa classe de medicamentos, como o GW7647.
Chen e colaboradores (2011) identificaram o GW7647, por meio de uma triagem de uma coleção de 9.525 moléculas bioativas. Dentre estas, cinco compostos com valores de IC50 variando de 2 a 8mM foram selecionados para o estudo da potência e das propriedades dos respectivos compostos, sendo um destes o GW7647. Esta droga foi capaz de inibir a resistência à cisplatina em CPNPC durante o processo proliferativo. Os autores correlacionaram o resultado satisfatório do GW7647 com diminuição da expressão de complexo proteico chamado USP1/WDR48, o qual também é afetado mediante a administração de Pimozida, a segunda droga estudada neste trabalho (CHEN et al., 2011).
Em contrapartida, o efeito in vitro do GW7647 também foi avaliado por Gupta e colaboradores (2000) em células oriundas de carcinoma de cólon (GUPTA et al., 2000) e por Gopisetty e colaboradores em carcinoma de mama (GOPISETTY VENKATA et al., 2006), porém estes autores não observaram efeitos significativos mediante o uso deste fármaco. Portanto, embora os agonistas do PPARα sejam, em longo prazo, designados como inibidores de crescimento tumoral, a efetividade do GW7647 sobre a carcinogênese ainda permanece controversa na literatura, uma vez que esta ainda é escassa sobre esse assunto (BRAVO et al., 2014).
2.2.7 Mecanismo de ação do GW7647 sobre o câncer
Existem três possíveis mecanismos que podem resultar na ação antineoplásica mediante a ativação do receptor PPARα (PETERS; SHAH; GONZALEZ, 2012):
1) Na primeira, o PPARα inibe a expressão gênica de mediadores da inflamação através de mecanismos repressivos que são mediados pela interação com a subunidade p65 do Fator Nuclear Kappa B (NF-κB) (do inglês, factor nuclear kappa B). Interferir nas vias de sinalização dependentes de NF-κB, como Fator de Necrose Tumoral (TNF) (do inglês, tumor necrosis factor), pode efetivamente inibir o crescimento de múltiplos tipos de tumores (VARGA; CZIMMERER; NAGY, 2011).
2) Na segunda, o PPARα é responsável por modular a expressão de genes que codificam várias enzimas catalizadoras de ácidos graxos mitocondriais. A ativação do PPARα pode aumentar a oxidação mitocondrial de ácidos graxos e inibir a expressão da glutaminase, o que diminui os níveis de glutamina e limita o crescimento de células neoplásicas. Como os ácidos graxos e a glutamina são produzidos enzimaticamente pelo efeito de Warburgm (glicólise aeróbica), e são substratos necessários para a proliferação celular, ativar os receptores de PPARα pode, potencialmente, inibir a proliferação de células tumorais (AOYAMA et al., 1998).
3) Na terceira, os agonistas de PPARα inibem a angiogênese (PANIGRAHY et al., 2008) (POZZI et al., 2007). Este efeito é mediado pela inibição dependente de PPARα sobre a proliferação de células endoteliais e regulação negativa do citocromo P450 CYP2C, uma enzima que catalisa a epoxidação de ácido araquidônico a ácidos epoxieicosatrienóicos (POZZI et al., 2007), os quais promovem a angiogênese (PANIGRAHY et al., 2008).
2.3 Pimozida 2.3.1 Descrição
Pimozida é um agente antipsicótico da série difenil-butilpiperidina, cuja forma de administração é oral. Este composto foi aprovado pela FDA (do inglês, Food and Drug Administration) em setembro de 2011, e tem a fórmula estrutural de 1-[1-[4,4-bis(4-fluorofenil) butil] -4- piperidinil] -1,3- dihidro-2H-benzimidazola -2- one (PHARMACEUTICALS, 2008) (Figura 3).
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Figura 3: Fórmula estrutural do fármaco Pimozida.
Fonte: (GONÇALVES et al., 2019).
2.3.2 Apresentação comercial
Pimozida é apresentado comercialmente em comprimidos, para administração por via oral, que podem conter 1 ou 2mg do medicamento.
2.3.3 Ação farmacodinâmica
Pimozida é um medicamento que atua sobre os neurônios no sistema nervoso central por meio do bloqueio de receptores dopaminérgicos; contudo, como esse bloqueio ocorre ainda permanece incerto. No entanto, é sabido que quando estes receptores são bloqueados há uma série de alterações secundárias na função e no metabolismo central de dopamina, que contribui para os efeitos terapêuticos e indesejáveis do Pimozida. Adicionalmente, assim como outros medicamentos antipsicóticos, Pimozida têm vários efeitos sobre outros receptores nervosos centrais que não são completamente conhecidos (PHARMACEUTICALS, 2008).
2.3.4 Metabolismo e farmacocinética
Durante a administração oral, mais do que 50% da dose de Pimozida é absorvida, com o pico nos níveis de soro de seis a oito horas (sendo que pode-se estender de 4-12 horas) depois da administração. Entretanto, a eliminação ocorre em aproximadamente 55 horas. Pimozida é metabolizado primeiramente no fígado, e produz dois metabólitos: 1-(4-piperidil)-2-benzimidazolinona e ácido butírico 4,4-bis(4- fluorofenil). Contudo, a atividade antipsicótica destes metabólitos é desconhecida. Os rins são a principal via de eliminação do Pimozida e seus metabólitos (PHARMACEUTICALS, 2008).
2.3.5 Indicações clínicas
As principais recomendações para o uso do Pimozida consistem no tratamento de psicoses crônicas e da síndrome de Tourette, a qual consiste em um transtorno neuropsiquiátrico hereditário caracterizado por diversos tiques físicos e pelo menos um tique vocal (PHARMACEUTICALS, 2008). No entanto, inúmeros estudos também têm observado que esta droga exerce potencial antineoplásico, vide tabela 1.
2.3.6 Pimozida como um potencial alvo anticâncer
A primeira descrição usando Pimozida como um medicamento anticâncer foi realizada por Taub e Baker (1979). Os autores trataram um melanoma metastático pulmonar com este medicamento (administração oral: 4mg, uso diário, durante uma semana; 8mg/dia durante a segunda semana e 12mg/dia após esse período) e observaram que as lesões no pulmão diminuíram 1-2mm. Uma semana depois, as lesões regrediram em 50%. Depois de oito semanas de terapia, as lesões pulmonares eram indetectáveis.
Onze anos depois, Strobl e colaboradores (1990) reportaram o primeiro estudo in vitro. Os autores utilizaram uma linhagem celular derivada de carcinoma de mama humano. Os resultados elucidaram alguns mecanismos de ação do Pimozida. Um destes foi a inibição do crescimento celular MCF-7 por antagonistas seletivos de Calmodulin W-13 e W-12. Este resultado levou os autores a concluírem que o Pimozida é uma futura possibilidade de tratamento para o carcinoma de mama. Além disso, dois anos depois, os mesmos autores investigaram o modo de ação deste medicamento em células neoplásicas oriundas de carcinoma de mama que eram resistentes ao Tamoxifen. O estudo revelou resultados favoráveis e indicou que o Pimozida pode ser uma potencial alternativa para o tratamento de carcinomas de mama que são resistentes ao Tamoxifen (STROBL; PETERSON, 1992).
O Pimozida tem sido mais explorado como um agente anti-neoplásico durante os últimos cinco anos. Chen e colaboradores (2011) afirmaram que esta droga consiste em uma pequena molécula inibidora seletiva que atua contra o complexo Desubiquitinase chamado USP1/WDR48. Principalmente, o Pimozida atua sinergicamente com a cisplatina, assim como o GW7647, inibindo a resistência à cisplatina durante a proliferação celular de CPNPC. Estes achados também suportam
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a hipótese de que o complexo USP1/WDR48 é um potencial alvo anticâncer para o tratamento desta doença (CHEN et al., 2011).
Além disso, Nelson e colaboradores (2012) e Mistry e colaboradores (2013) testaram o Pimozida em leucemia. No primeiro estudo (NELSON et al., 2012), os autores avaliaram o potencial do medicamento como um efetivo inibidor da função do Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição 5 (STAT5) (do inglês, signal transducer and activator of transcription 5). A ativação do fator de transcrição STAT5 é indispensável para a patogênese da leucemia mieloide aguda (LMA). De fato, os autores demonstraram que o Pimozida reduz o estado de ativação da STAT5 nos modelos celulares de LMA, bem como recomendaram este medicamento para o tratamento desta enfermidade. No segundo estudo sobre Leucemia (MISTRY et al., 2013), foi verificado que o Pimozida bloqueou a USP1 in vitro, e promoveu a degradação de ID1. Consequentemente, este medicamento inibiu o crescimento celular de maneira dependente da dose. Portanto, mais uma vez, Pimozida foi descrito como um potencial alvo terapêutico para leucemia.
Adicionalmente aos estudos realizados para elucidar os mecanismos de ação do Pimozida, a possível relação entre esta droga e a manutenção das características de uma célula-tronco tem sido estudada. Chen e colaboradores (2015) investigaram, in vitro, o efeito do Pimozida sobre a inibição da manutenção das características das células-tronco e da tumorigenicidade em carcinoma hepatocelular (CHC). Este estudo apresentou resultados extremamente pertinentes, pois o medicamento foi capaz de inibir a migração e proliferação celular, bem como a capacidade de formação de colônias. Além disso, Pimozida inibiu a manutenção e tumorigenicidade de células de CHC com características de células-tronco (marcação positiva para CD133), e, surpreendentemente, Pimozida reverteu os fenótipos tumorigênicos de células-tronco induzidos pelo tratamento com Interleucina 6 (IL-6) (do inglês, interleukin 6) em células de CHC. O efeito antineoplásico do Pimozida foi também testado em um modelo de CHC implantado em camundongos apresentando resultados semelhantes aos encontrados nos experimentos in vitro (CHEN et al., 2015).
Lee e colaboradores (2015) determinaram o efeito desta droga na linhagem celular de glioblastoma. Os autores confirmaram a inibição farmacológica da manutenção das características de células-tronco pelo Pimozida, e apresentaram resultados com diminuição do crescimento clonogênico das células do gioblastoma e
do crescimento neoplásico em modelos tumorais xenoenxertados, porém sem toxicidade às células normais (LEE et al., 2015).
Seguindo a mesma ideia sobre a possível relação entre a manutenção das características de uma célula-tronco e o Pimozida em CHC, Fako e colaboradores (2016) realizaram um estudo onde descreveram a atividade antineoplásica em uma linhagem celular que expressou a molécula de adesão epitelial celular (EpCAM) (do inglês, epithelial cell adhesion molecule), um marcador de célula-tronco hepática que é um alvo funcional da via wnt/β-catenina. Estes dois estudos (CHEN et al., 2015; FAKO et al., 2016) apontaram que o Pimozida é uma nova possibilidade para a terapia antineoplásica.
Finalmente, o último estudo publicado relacionando Pimozida e o câncer foi realizado por Zhou e colaboradores (2016). Os autores relataram que o medicamento inibe o crescimento celular e a ativação da STAT3 em células oriundas de câncer de próstata. Além disso, foi capaz de desregular a formação de esferas e colônias, bem como suprimir a migração celular em ambos os tipos celulares utilizados nesse estudo, DU145 e LNCaP.
Todos os estudos (in vivo e in vitro) que usaram Pimozida como uma forma alternativa de tratamento contra o câncer, até o momento, estão descritos na tabela 1. Todos os autores estão em mútuo acordo, independentemente da localização e origem do tumor pesquisado, que o medicamento Pimozida apresenta resultados positivos e um significante potencial para ser um alvo terapêutico. Contudo, é importante destacar que não há estudos sobre os efeitos do Pimozida em carcinoma de cabeça e pescoço, especificamente em CEI.
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Tabela 1- Estudos que avaliaram o Pimozida como um possível agente terapêutico contra o câncer
Taub and Baker 1979 (TAUB, ROBERT; BAKER, 1979)
Krummel, Neifeld and Taub 1982 (KRUMMEL; NEIFELD; TAUB, 1982)
Neifeld et al., 1983 (NEIFELD et al., 1983) Jia et al., 2018 (JIA et al., 2018)
Melanoma
Strobl et al., 1990 (STROBL et al., 1990) Strobl and Peterson 1992 (STROBL;
PETERSON, 1992)
Strobl et al., 1998 (STROBL et al., 1998) Bertolesi et al., 2002 (BERTOLESI et al., 2002)
Wiklund et al., 2010 (WIKLUND et al., 2010) Mapes et al., 2018 (MAPES et al., 2018)
Carcinoma de mama
Wiklund et al., 2010 (WIKLUND et al., 2010) Chen, Thomas S. Dexheimer, et al., 2011
(CHEN et al., 2011)
Fortney et al., 2015(FORTNEY et al., 2015)
Carcinoma de Pulmão
Zhou et al., 2016 (ZHOU et al., 2016)
Mohanty et al., 2017 (MOHANTY et al., 2017) Carcinoma de próstata Lazo et al., 1986 (LAZO et al., 1986) Carcinoma de ovário
Ren et al., 2018 (REN et al., 2018) Carcinoma Coloretal Jandaghi et al., 2016 (JANDAGHI et al., 2016) Carcinoma Pancreático
Cai et al., 2017 (CAI et al., 2017) Osteosarcoma McGrath et al., 1984 (MCGRATH; NEIFELD,
1984) Neuroblastoma
Lee and Hait 1985 (LEE; HAIT, 1985) Astrocitoma Lee et al., 2015 (LEE et al., 2015) Glioblastoma Kennedy, Hait and Lazo 1986 (KENNEDY;
HAIT; LAZO, 1986)
Nelson et al., 2012 (NELSON et al., 2012) Bar-Natan et al., 2012 (BAR-NATAN et al.,
2012)
Mistry et al., 2013 (MISTRY et al., 2013) Nogami et al., 2015 (NOGAMI et al., 2015)
Leucemia
Simpson et al., 2018 (SIMPSON et al., 2018) Linfoma de células-T Chen et al., 2015 (CHEN et al., 2015)
Fako et al., 2016 (FAKO et al., 2016) Carcinoma Hepatocelular Fonte: Adaptado de (GONÇALVES et al., 2019)
2.3.7 Mecanismo de ação do Pimozida sobre o câncer
O real mecanismo de ação antineoplásica do Pimozida ainda não foi totalmente esclarecido. Contudo, a literatura apresenta três prováveis vias que justificam os resultados positivos reportados: STAT3 e STAT5, wnt/β-catenina e USP1/WDR48. STAT3 e STAT5
Os transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STATs) (do inglês Signal Transducer and Activator of Transcription) são fatores de transcrição frequentemente ativados no câncer (HAURA; TURKSON; JOVE, 2005). Os receptores tirosina quinases e não-tirosina quinases são responsáveis por ativar STATs localizados na membrana citoplasmática via fosforilação de resíduo de tirosina. A ativação de STAT induz a dimerização via interação de fosfotirosina –SH2 entre duas moléculas STAT. Após, os dímeros STAT são translocados para o núcleo onde eles ativam a transcrição de seus genes alvo. Estes genes codificam proteínas requeridas para auto-renovação, sobrevivência e proliferação celular (Figura 4) (NELSON et al., 2012). Por essa razão, frequentemente células-tronco neoplásicas mostram ativação da via STAT e aumento da regulação de STAT3. Estas proteínas são mediadores críticos do comportamento tumoral e, por isso, podem representar possíveis estratégias para o tratamento do câncer (NELSON et al., 2016).
Yu, Kortylewski e Pardoll (2007) determinaram que, uma vez fosforilada, a STAT3 é dimerizada e translocada para o núcleo para induzir a transcrição de genes alvo como o linfoma de células B2 (BCL-xL) (do inglês B-cell lymphoma 2) (YU; KORTYLEWSKI; PARDOLL, 2007). No entanto, Chen e colaboradores (2015) demonstraram que o Pimozida reduziu os níveis de fosforilação de STAT3 e, consequentemente, a transcrição dos genes dependentes desta via, como o BCL-xL, MCL1 e MYC (CHEN et al., 2015).
De modo semelhante, Cai e colaboradores (2017) verificaram que esta droga foi capaz de inibir a transcrição dos genes MYC, BCL-xL e MCL em células oriundas de osteossarcoma mediante inibição da fosforilação da STAT3. (CAI et al., 2017). Corroborando, Zhou e colaboradores (2016) também identificaram redução de STAT3 fosforilada com o uso do Pimozida em uma linha de carcinoma de próstata (ZHOU et al., 2016).
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No entanto, a STAT3 não é o único alvo afetado pela ação do Pimozida dentro das Tirosinas Kinases; a STAT5 também é um importante fator de transcrição para este tipo de terapia. Essa proteína controla a expressão de genes que regulam diretamente o comportamento celular maligno. Mohanty e colaboradores demonstraram que as células de carcinoma de próstata expressam níveis variados de STAT3 e STAT5 e o Pimozida é um inibidor de ambas as vias (MOHANTY et al., 2017). Nogami e colaboradores (2015) e Bar-Natan e colaboradores (2012) reportaram que o Pimozida reduziu a ativação específica da fosforilação de STAT5 em células de leucemia mielóide que expressavam receptores de tirosina Kinase, diminuindo a expressão de STAT5 (NOGAMI et al., 2015) (BAR-NATAN et al., 2012).
Da mesma forma, Nelson e colaboradores (2012) observaram que a inibição desta via pelo Pimozida resultou em morte celular em uma linhagem de leucemia mielóide aguda através da indução de apoptose (NELSON et al., 2012). Corroborando, Simpson e colaboradores (2018) observaram a redução da ativação do STAT5 em linfoma periférico de células T e, consequentemente, redução da viabilidade celular (SIMPSON et al., 2018). Além disso, recentemente alguns estudos realizaram o teste de imuno-histoquímica para avaliar a expressão da STAT5 fosforilada e revelaram a existência de marcação disseminada de pSTAT5 em tumores tratados exclusivamente com veículo, enquanto tumores mamários de camundongos tratados com Pimozida mostraram diminuição da pSTAT5 (MAPES et al., 2018).
Em resumo, esta via tem sido considerada tão relevante que já foram produzidos outros derivados do Pimozida, mas com alta especificidade para redução dos níveis de STAT5 fosforilada, tornado estes compostos ainda mais ativos que o medicamento convencional (RONDANIN et al., 2017).
Figura 4: Atuação da droga Pimozida pela via STAT. Receptores de tirosina quinases ativam o
Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição (STAT) via fosforilação de resíduo de tirosina, localizado na membrana plasmática. A ativação de STAT induz a dimerização via interação fosfotirosina-SH2 entre duas moléculas STAT. Então, os dímeros STAT são translocados para o núcleo onde eles ativam a transcrição de seus genes-alvo. No entanto, o pimozida inibe a fosforilação da STAT e regula negativamente os níveis de transcrição dos BCL-xL, MCL1 e MYC
Fonte: Adaptado de (GONÇALVES et al., 2019) wnt/β-catenina
Esta é a via menos conhecida, uma vez que existe apenas dois estudos na literatura explorando esse mecanismo de ação do Pimozida. A via de sinalização da Wnt/β-catenina tem sido relatada por levar a Transição epitélio-mesenquimal (EMT) em muitos cânceres (PAI et al., 2016). Ren e colaboradores (2018) investigaram a expressão de marcadores de EMT, tais como E-cad, N-cad, Vimentina e Snai-1, após o tratamento com Pimozida em linhagens celulares de carcinoma colorretal. Os resultados da análise de western blot mostraram o aumento da expressão proteica de E-cad, mas redução da expressão de N-cad, Vimentina e Snai-1 em células HCT116 e SW480 de maneira dose-dependente. Portanto, o Pimozida inibiu a EMT dessas células (REN et al., 2018).
Além disso, durante a EMT as células perdem as características epiteliais e adquirem fenótipos mesenquimais, incluindo alterações relacionadas ao EpCAM (KYUNG-A HYUN et al., 2016), um marcador de células-tronco hepáticas e alvo transcricional direto da sinalização wnt/β-catenina. Fako e colaboradores (2016)
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confirmaram a inibição do crescimento e redução da expressão de EpCAM em uma linhagem de carcinoma hepatocelular após aplicação do Pimozida, justamente em decorrência do rompimento da via de sinalização wnt/β-catenina (FAKO et al., 2016).
USP1/WDR48
O mecanismo de ação do medicamento Pimozida mais estudado está relacionado com o complexo USP1/WDR48. O processo de inibição da progressão do câncer por meio desta via ocorre da seguinte maneira (GONÇALVES; CORDEIRO; RIVERO, 2017):
A) 1ª etapa: Regulação do desenvolvimento e diferenciação por meio do fator de transcrição bHLH (basic-Helix-Loop-Helix)
A terceira maior família de fatores de transcrição reconhecida no genoma humano é o bHLH (TUPLER; PERINI; GREEN, 2001). Os fatores de transcrição bHLH têm sido reportados como importantes reguladores de desenvolvimento (MASSARI; MURRE, 2000). O gene HLH regula muitas vias e está associado com a proliferação desregulada durante a tumorigênese (LANGLANDS et al., 2000). A classe I de homodímeros bHLH é amplamente expressa e promove ativação de genes antiproliferativos como inibidor de quinase dependente de ciclina (CDKN1A, CDKN2A e CDKN2B) (YOKOTA; MORI, 2002).
A classe II de proteínas bHLH apresenta uma expressão mais restrita e é capaz de compor heterodímeros com as proteínas da classe I que regulam genes tecido-específicos. Além disso, bHLH contribui também para perpetuação da linhagem celular (WILLIAMS et al., 2011).
B) 2ª etapa: Proteínas Inibidoras da Ligação de DNA (ID) atuam como dominantes negativos de bHLH por meio da formação de heterodímeros
Proteínas ID são dominantes negativos de proteínas HLH por meio da composição de heterodímeros de alta afinidade, evitando assim a ligação entre DNA e HLH e, consequentemente, a transcrição de genes associados à diferenciação é inibida. A formação de complexos transcricionalmente ativos e bloqueados pela proteína ID é,
geralmente, associada à proliferação celular (NORTON et al., 1998). Proteínas ID são altamente relacionadas ao processo de apoptose (HARA et al., 1994) e habilitam a progressão do ciclo celular durante a fase G1/S (NORTON et al., 1998).
Em células normais, a diminuição da proliferação celular está associada com a diferenciação celular. Contudo, o oposto ocorre em células neoplásicas que apresentam um estado proliferativo incontrolável associado com a inibição da diferenciação. A superexpressão ectópica de ID tem sido reportada em linhagens celulares com esta alteração entre diferenciação e proliferação (NORTON et al., 1998). Uma ampla variedade de tumores tem exibido uma alta expressão de genes ID. Estas proteínas, principalmente ID1, são relacionadas com os fenótipos de tumores menos diferenciados, mais invasivos e agressivos e, em casos específicos, isto pode ser usado como um marcador de progressão e diagnóstico (ISRAEL et al., 1999).
Estudos indicam a existência de alterações em proteínas ID nos casos de cânceres mais severos; um dos pontos mais relevantes é a imortalização de queratinócitos primários humanos em expressões ectópicas de ID (ISRAEL et al., 1999). Este evento pode estar relacionado com a interação entre os componentes do ciclo celular ou regulação de uma classe de fator bHLH epiderme-específica. Este desequilíbrio provoca um ambiente tolerante para a maturação dos queratinócitos (LANGLANDS et al., 2000). Além disso, a limitação para a maturação dos queratinócitos está conectada com a diminuição da expressão de proteínas ID e a habilidade de livre diferenciação (LANGLANDS et al., 2000).
Nishimine e colaboradores (2003) avaliaram a expressão de ID em CEI. Durante este estudo detectou-se que a quantidade de ID1 (27,7%) é mais alta do que ID2 (6,0%) e ID3 (7,2%). Sobretudo, ID1 mostrou uma significante correlação com a condição linfonodal. Estes resultados mostraram uma associação entre ID1 e o potencial metastático em tumores primários com envolvimento linfonodal, alegando que a expressão de ID1 pode estar correlacionada com o comportamento metastático tumoral e a progressão maligna (NISHIMINE et al., 2003). Em carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, Lin e colaboradores (2010) investigaram a relevância de ID1 durante a resistência à apoptose. ID1 protegeu os queratinócitos da apoptose e esta proteína foi extremamente super-regulada em amostras clínicas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço. Os autores concluíram que ID1 é um potencial alvo
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para o tratamento desta enfermidade, pois esta proteína favorece a resistência à apoptose (LIN et al., 2010).
Os CEIs pobremente diferenciados exibem os mais altos índices de imunopositividade para ID (LANGLANDS et al., 2000). Considerando que altas expressões de ID têm sido associadas com os tumores pobremente diferenciados, metástase e pobre prognóstico, é possível afirmar que esta proteína pode predizer o estágio de desenvolvimento tumoral (LIN et al., 2000).
C) 3ª etapa: Tentativa de degradação de ID pela ubiquitina
O maior método de degradação de proteína em células eucarióticas é o sistema ubiquitina-proteossoma (UPS). Os UPS consistem em um grande complexo de proteínas composto de aproximadamente 50 subunidades que funcionam como um complexo de degradação, altamente específico, que degrada as proteínas indesejáveis. Além disso, esse sistema é responsável por regular algumas funções celulares como o reparo de DNA, homeostase proteica e regulação do ciclo celular (HERSHKO, 1998) (D’ARCY; LINDER, 2012). O UPS é composto por um proteossoma específico que marca a ordem gerada por uma pequena molécula chamada ubiquitina (Ub) (HERSHKO, 1998).
Ub é uma proteína composta por 76 aminoácidos, e é responsável por remover resíduos em proteínas marcadas por meio de uma ligação covalente (HERSHKO, 1998). A ligação para marcar proteínas é um modo de regular a atividade, localização e meia-vida de muitos polipeptídeos. Ub é capaz de se ligar especificamente a proteínas indesejáveis em um momento e de uma maneira precisa. Este evento é possível pois a cascata contém centenas de Ub ligases (E3s), dezenas de Ub enzimas de conjugação (E2s), e pelo menos duas enzimas ativadoras de Ub (E1s) (HUSSAIN; ZHANG; GALARDY, 2009).
É importante destacar que ID1, ID2 e ID3, mas não ID4, são submetidas a poliubiquitinação e, consequentemente, ocorre sua degradação pelo proteossoma 26S. Portanto, IDs têm vida curta na maioria das células (BOUNPHENG et al., 1999). Em contrapartida, neste contexto, a alteração da Ub preserva a abundância e estabilidade de ID. Por esta razão, a proteína ID permanece estável (LASORELLA et al., 2006).
D) 4ª etapa: Ação da desubiquitinase USP1 sobre a ubiquitina
A Ub pode ser removida de seu alvo de maneira regulada, por meio da atividade de um grupo de enzimas desubiquitinase (DUB) (VARSHAVSKY, 1997), onde a ligação estabelecida entre C-terminal de carboxilato de ubiquitina e as proteínas alvo é quebrada por essas enzimas DUBs. Além disso, esta enzima pode também retirar uma cadeia de Ub ou apenas uma das proteínas marcadas. Em outras palavras, o processo regulado pela ubiquitinação é frequentemente controlado pela reação enzimática oposta, que é a desubiquitinação (AMERIK; HOCHSTRASSER, 2004). A função das DUBs é remover proteínas marcadas da degradação, retornar estas proteínas para o seu local original ou reverter alterações conformacionais geradas pela ligação da Ub (HUSSAIN; ZHANG; GALARDY, 2009).
No total, o genoma humano tem aproximadamente 100 DUBs (NIJMAN et al., 2005), sendo estas distribuídas dentro de cinco famílias. Dentre estas famílias, a maior corresponde às proteases ubiquitina-específicas (USPs) (do inglês, ubiquitin-specific) (58 membros). Em uma condição de normalidade, as USPs preservam o equilíbrio em redes de sinalização de ubiquitina por remover Ub de locais alvos específicos e aumentam a função de supressão tumoral (HOELLER; HECKER; DIKIC, 2006).
Uma das proteínas mais relevantes dentre as DUBs humanas é a protease USP1. Frequentemente, o papel da USP1 está desregulado em células tumorais sugerindo que esta enzima pode ser um potencial alvo para o tratamento
antineoplásico (GARCIA-SANTISTEBAN; ZORROZA; RODRIGUEZ, 2012)
(HOELLER; HECKER; DIKIC, 2006). Durante muitos anos, o foco tem sido a função da Ub no processo de tumorigênese, apenas recentemente começou-se a valorizar o poder das enzimas que revertem este processo (HUSSAIN; ZHANG; GALARDY, 2009).
E) 5ª etapa: Formação do complexo proteico entre USP1 e WDR48
A USP1 sozinha possui baixo nível de atividade desubiquitinase (SOWA et al., 2009). Por esta razão, frequentemente a USP1 atua juntamente com a proteína 80-kDa, chamada também de WDR48, p80 ou UAF1. WDR48 liga e estimula a protease Ub (COHN et al., 2007). Quando ocorre a formação do complexo USP1/WDR48, a ação catalítica do WDR48 é fortemente aumentada. A maior parte das USPs existe e funciona como um complexo in vivo (SOWA et al., 2009). Corroborando com esses
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dados, Gonçalves (2016) verificou que este complexo é superexpresso em CEI quando comparado com epitélio não neoplásico, sendo essa expressão ainda maior em casos graduados como pobremente diferenciados (GONÇALVES, 2016).
F) 6ª etapa: Manutenção do estado celular indiferenciado e proliferativo
Ao final deste processo, IDs permanecem antagonizando os fatores de transcrição bHLH. Consequentemente, esta proteína inibe a diferenciação e mantém as células em um estado indiferenciado. Estas células têm sido caracterizadas como células-tronco neoplásicas (CTNs) (WILLIAMS et al., 2011).
G) 7ª etapa: Ação do Pimozida sobre células proliferativas e indiferenciadas
Chen e colaboradores (2011) demonstraram que o Pimozida foi capaz de inibir o complexo USP1/WDR48. Este medicamento atuou sinergicamente com a cisplatina, inibindo a resistência a esta droga durante a proliferação celular em CPNPC (CHEN et al., 2011). Mistry e colaboradores (2013) reportaram que este medicamento foi capaz de bloquear USP1 in vitro de maneira dose-dependente. O Pimozida promoveu a degradação de ID1 e inibiu o crescimento de células leucêmicas também de maneira dose-dependente (MISTRY et al., 2013). Lee e colaboradores (2015) encontraram uma significante redução do nível de ID1 em três linhagens celulares de glioblastoma de diferentes pacientes em 4-8 horas depois do tratamento com Pimozida (LEE et al., 2015). Estes resultados evidenciam o Pimozida como um potencial medicamento para a terapia antineoplásica, e esclarecem o seu provável mecanismo de ação. O processo de manutenção do estado celular proliferativo e indiferenciado, bem como a ação do medicamento Pimozida é ilustrado na Figura 5.
