LARISSA CARVALHO COSTA
MAPEAMENTO DE GENES DE RESISTÊNCIA A
DIFERENTES ISOLADOS DE Colletotrichum lindemuthianum E
SELEÇÃO RECORRENTE VISANDO À RESISTÊNCIA A
ANTRACNOSE DO FEIJOEIRO
LAVRAS – MG
2019
LARISSA CARVALHO COSTA
MAPEAMENTO DE GENES DE RESISTÊNCIA A DIFERENTES ISOLADOS DE Colletotrichum lindemuthianum E SELEÇÃO RECORRENTE VISANDO À
RESISTÊNCIA A ANTRACNOSE DO FEIJOEIRO
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética Molecular e de Fitopatógenos, para a obtenção do título de Doutora.
Profa. Dra. Elaine Aparecida de Souza Orentadora
LAVRAS – MG 2019
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Costa, Larissa Carvalho.
Mapeamento de genes de resistência a diferentes isolados de Colletotrichum lindemuthianum e seleção recorrente visando à resistência a antracnose do feijoeiro / Larissa Carvalho Costa. - 2019.
109 p. : il.
Orientadora: Elaine Aparecida de Souza.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Lavras, 2019. Bibliografia.
1. Phaseolus vulgaris. 2. Resistência a doenças. 3. Melhoramento genético. I. de Souza, Elaine Aparecida. II. Título.
LARISSA CARVALHO COSTA
MAPEAMENTO DE GENES DE RESISTÊNCIA A DIFERENTES ISOLADOS DE Colletotrichum lindemuthianum E SELEÇÃO RECORRENTE VISANDO À
RESISTÊNCIA A ANTRACNOSE DO FEIJOEIRO
MAPPING OF RESISTENCE GENES TO DIFFERENT STRAINS OF Colletotrichum lindemuthianum AND RECURRENT SELECTION AIMING
RESISTANCE TO ANTHRACNOSE IN COMMON BEAN
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética Molecular e de Fitopatógenos, para a obtenção do título de Doutora.
APROVADA em 26 de março de 2019.
Dr. Alisson Fernando Chiorato IAC
Dra. Ângela de Fatima Barbosa Abreu Embrapa Arroz e Feijão Dr. Magno Antônio Patto Ramalho UFLA
Dr. Thiago Livio Pessoa Oliveira de Souza Embrapa Arroz e Feijão
Profa. Dra. Elaine Aparecida de Souza Orientadora
LAVRAS -MG 2019
A Deus, pela saúde, sabedoria e por todas as bençãos em minha vida OFEREÇO
À minha mãe, Maria da Penha, por ser o meu maior exemplo de vida, de amor e de força para nunca desistir. Nosso amor vai além da vida. Ao meu pai, Valdir e aos meus irmãos, Ivan e Karina pelo apoio, amor e carinho em todas as etapas da minha vida.
AGRADECIMENTOS
A realização dessa tese contou com o apoio de várias pessoas ao longo desses quatro anos, e é chegado o momento tão feliz de agradecer:
Ao meu querido pai, Valdir, pelo amor sem limites e aos meus amados irmãos, Ivan e Karina, que acompanharam de perto todas as alegrias e desafios que a vida acadêmica me proporcionou. Faltam- me palavras para agradecer por tudo que vocês são e fazem por mim. Meus amores, meu berço, meu lar!
A toda minha família e amigos que sempre estiveram ao meu lado torcendo por mim! Obrigada, pelo apoio, pelo carinho, pelo incentivo e por terem compreendido a importância dos meus vários momentos “vidrada nos livros ou no computador” mesmo quando a vontade era me juntar a vocês!
Meus sinceros agradecimentos ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas da UFLA. Tenho muito orgulho em ter cursado o doutorado (e mestrado) nesta casa, digna de grande reconhecimento e excelência. Foram anos maravilhosos vividos aqui.
À professora Elaine, por ter me orientado desde a graduação. Pelos ensinamentos, confiança, amizade e por se preocupar não só com a realização dessa pesquisa, mas também com toda minha trajetória acadêmica e bem-estar pessoal. Fico feliz por ter feito parte do seu grupo e da sua história!
Aos demais professores do programa, Magno, Cézar, João Bosco, José Airton, João Cândido, Vânia e Flávia, pelos valiosos ensinamentos. Cada um de vocês tiveram um papel fundamental na minha formação. Em especial, gostaria de agradecer ao professor Magno por toda a ajuda durante a condução dos experimentos e por ser um exemplo de profissional para mim. Espero um dia ter pelo menos metade do seu carisma e brilhantismo em sala de aula.
Á doutora Ângela, por todos os ensinamentos, pela disponibilidade e por ser uma pessoa tão singular e amiga que sempre está sorrindo e disposta a ajudar.
Ao Rafael Nalin, por toda ajuda e apoio durante essa jornada e por todos os ensinamentos que foram fundamentais para que eu chegasse até aqui.
Aos amigos do feijão, pela amizade e ajuda na condução dos experimentos de campo, principalmente durante o período em que eu estava nos Estados Unidos. A ajuda de vocês foi essencial para o bom andamento do meu trabalho!
Ao GEN pela oportunidade e a todos os amigos do Programa de Pós-Graduação em genética e melhoramento de Plantas, pelo apoio e amizade.
A todos os colegas do Laboratório de Resistência de Plantas a doenças da UFLA. Aos que passaram pelo lab: Francine, Mariana Fofura, Rafael, Quélen, Samira, Carolina, Margot e Samanta. Aos contemporâneos: Lucas, Mariana Andrade, Paula, Ana Carolina, Alex, Nathália e Fernanda. Cada um de vocês foram, de alguma forma, muito importantes durante essa jornada. Muito obrigada, por toda ajuda, pela harmoniosa convivência e por tornarem nosso ambiente de trabalho mais alegre e divertido. Agradeço, de maneira especial, a minha amiga, Mariana Andrade, cuja ajuda foi fundamental para a realização desse trabalho. Obrigada por todo seu empenho, dedicação e amizade.
Ao pesquisador Qijian Song, por ter me recebido tão bem no Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), durante o período do meu doutorado sanduíche. O seu apoio e troca de ideias foram fundamentais para a realização desse trabalho. A experiência profissional adquirida, decorrente das pesquisas que pude desenvolver junto com o seu grupo de pesquisa, é inestimável para a minha carreira.
À todos os demais colegas e pesquisadores do USDA, especialmente a doutora Susan Araya, uma pessoa de coração gigante, uma amiga e companheira de laboratório que foi um presente em minha vida.
Um agradecimento especial ao Doutor Márcio Elias da EMBRAPA, por toda ajuda com o meu trabalho, pelo acolhimento durante a minha estadia nos Estados Unidos, pela amizade e pela sabedoria com que acalma e aconselha.
Agradeço também ao técnico e amigo Miller Marani, que gostava de pegar no meu pé, mas que sempre me auxiliava com muita boa vontade no laboratório e na condução dos experimentos.
A todos os demais funcionários do Departamento de Biologia da UFLA: Dona Iron, Lillian, Raffaela, Zelia, Lamartine e Gisele, por todo o auxílio, prazerosa convivência e amizade.
Ao conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa concedida durante o curso de doutorado e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de doutorado sanduíche no exterior.
Acima de tudo, agradeço a Deus por ter guiado o meu caminho até aqui. Enorme é a minha gratidão por todas as graças concedidas ao longo dessa caminhada, por todo conhecimento adquirido, por todas as pessoas maravilhosas que Ele colocou no meu caminho e por todas as experiências incríveis que Ele me proporcionou viver!
“Lembre-se de olhar para as estrelas e não para baixo, para os seus pés. Tente achar sentido no que você vê e pergunte o que faz o universo existir. Seja curioso.”
RESUMO
A grande variabilidade do fungo Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro, tem dificultado a obtencão de cultivares com resistência durável a esse patógeno. Além da variabilidade de raças fisiológicas que tem sido identificada, variabilidade dentro de raças também tem sido relatada. Nesse contexto, os objetivos desse estudo foram: i) Identificar regiões genômicas associadas à resistência a diferentes isolados da raça 65 de C.
lindemuthianum, uma das mais importantes raças deste fungo no Brasil. ii) Desenvolver e
avaliar a eficiência de um programa de seleção recorrente como alternativa para a obtenção de resistência durável à antracnose do feijoeiro. Para atingir o primeiro objetivo, foram utilizadas duas abordagens de mapeamento: O mapeamento tradicional por ligação, utilizando uma população F2, derivada do cruzamento entre as cultivares de feijoeiro, BRS Estilo x Ouro
Vermelho, as quais são contrastantes quanto a reação a dois isolados diferentes da raça 65 de
C. lindemuthianum e, também, o mapeamento associativo, utilizando um painel diverso de
189 acessos do banco de germoplasma de feijoeiro da Universidade Federal de Lavras, com variação fenotípica para cinco isolados diferentes dessa mesma raça. As 189 linhagens do banco de germoplasma e 400 indivíduos da população F2 do cruzamento entre BRS Estilo x
Ouro Vermelho, bem como os parentais, foram genotipados, utilizando o BARCBEAN6K_3
Illumina SNP chip com 5398 SNPs. Para o desenvolvimento do programa de seleção
recorrente, uma mistura de sementes de 45 populações F2 (população S0), derivadas do
cruzamento dialélico entre dez linhagens de feijoeiro, foi utilizada para a formação da população base. Essas linhagens possuem variabilidade quanto a reação a diferentes isolados de C. lindemuthianum. Cinco ciclos de avaliação, seleção e recombinação entre as plantas S0
mais resistentes a isolados das raças 65, 73, 81 e 89 foram realizados e cerca de 40 progênies S0:2 foram obtidas em cada ciclo. O resultado do mapeamento, utilizando a população
biparental derivada do cruzamento entre BRS Estilo x Ouro Vermelho e dois isolados diferentes da raça 65 de C. Lindemuthianum, revelou a presença de marcadores completamente ligados a regiões genômicas associadas a resistência cada um dos dois isolados utilizados, distantes 1.8cM um do outro, no cromossomo Pv04. Pelo mapeamento associativo foram identificados Quantitative Trait Loci (QTLs) de grande efeito associados à resistência a esses dois isolados, nessa mesma posição e, também, em outras posições do Pv04. Além disso, foram identificados QTLs associados a resistência a outros três isolados da raça 65 nos cromossomos Pv04, Pv05, Pv10 e Pv11. Este é o primeiro trabalho de mapeamento de genes de resistência em Phaseolus vulgaris, que utiliza isolados diferentes pertencentes a mesma raça de C. lindemuthianum. Os resultados indicam que as regiões genômicas que controlam a resistência à raça 65 de C. lindemuthianum variam de acordo com o isolado utilizado. Algumas cultivares com alelos de resistência à raça 65 de C. lindemuthianum, já identificados, também foram avaliadas quanto à reação aos cinco isolados da raça 65 utilizados no presente trabalho, e, estas, apresentaram reação diferente a cada um desses isolados. Em relação à seleção recorrente, por este método foi possível realizar três ciclos seletivos por ano. Após cinco ciclos seletivos, foi observado progresso genético de 7,4% e 10,7% para dois isolados diferentes da raça 65 e de 9,0%, 9,0% e 8,0% para os isolados das raças 73, 81 e 89, respectivamente. Ademais, houve um aumento no número de progênies resistentes a um maior número de isolados de C.
lindemuthianum no decorrer dos ciclos seletivos, evidenciando a eficiência do método. Se as
progênies oriundas desse programa forem conduzidas pelo método bulk dentro de progênies S0,
sabe-se que ao final do processo as progênies serão compostas por misturas de linhas puras. Se o melhorista optar por utilizar essa mistura de linhas puras como cultivar, esta apresentará alelos de resistência piramidados entre e dentro das linhas puras que a compõe, o que pode propiciar uma maior estabilidade e durabilidade da resistência frente a grande variabilidade entre e dentro de raças de C. lindemuthianum.
ABSTRACT
The large variability of Colletotrichum lindemuthianum fungus, the causal agent of anthracnose in the common bean, has made it difficult to obtain cultivars with durable resistance to this pathogen. Variability within races has been reported in addition to the variability of identified physiological races. In this context, the objectives of this study were to i) identify genomic regions associated with the resistance to different C. lindemuthianum strains, one of the most significant races of this fungus in Brazil; and ii) develop and evaluate the efficiency of a recurrent selection program as an alternative to obtain durable resistance to anthracnose in common bean. To reach the first objective, we employed two mapping approaches: the traditional mapping by linkage analysis, using an F2 population derived from
the cross between BRS Estilo x Ouro Vermelho common bean cultivars, which are contrasting regarding the reaction to two different C. lindemuthianum strains of race 65; and the association mapping, using a panel of 189 accessions of the common bean germplasm bank of the Universidade Federal de Lavras, with phenotypic variation for five different strains of the same race. We genotyped the 189 common bean lines of the germplasm bank and 400 individuals from the F2 population of the cross between BRS Estilo x Ouro
Vermelho, as well as the parental, using the BARCBEAN6K_3 Illumina SNP chip with 5398 SNPs. For the development of the recurrent selection program, we used a mixture of seeds from 45 F2 populations (S0 population) derived from the diallelic cross among ten common
bean lines to form the base population (Cycle 0).. These common bean lines present variability regarding different C. lindemuthianum strains. From cycle 0, we performed five evaluation, selection and recombination cycles among the S0 plants most resistant to strains of
races 65, 73, 81 and 89, obtaining approximately 40 S0:2 progenies in each cycle. The result of
the mapping using the biparental population derived from the cross between BRS Estilo x Ouro Vermelho and two different strains of C. lindemuthianum, race 65, revealed the presence of markers completely linked to genomic regions associated with resistance to each of the two strains used, on the Pv04 chromosome, distant 1.8cM from each other. Through the association mapping, we identified significant Quantitative Trait Loci (QTLs) associated with the resistance to both strains this same position as well as in other positions of the Pv04. Furthermore, we identified QTLs associated with resistance to three other strains of race 65 on chromosomes Pv04, Pv05, Pv10, and Pv11. This is the first study about mapping of resistance genes in Phaseolus vulgaris using different strains belonging to the same race of C.
lindemuthianum. The results indicate that the genomic regions that control resistance to C. lindemuthianum, race 65, vary according to the strain used. Some common bean lines with,
already identified resistance alleles to C. lindemuthianum, race 65, were also evaluated regarding the reaction to the five strains of race 65 used in the present study, presenting a different reaction to each of these strains. Concerning the recurrent selection, we were able to perform three selective cycles per year using this method. After five selective cycles, we observed genetic progress of 7.4% and 10.7% for two different strains of race 65 and 9.0%, 9.0%, and 8.0% for the strains of races 73, 81, and 89, respectively. Moreover, there was an increase in the number of progenies resistant to a higher number of C. lindemuthianum strains during the selective cycles, demonstrating the efficiency of the method. If the progenies derived from this program are conducted by the bulk method within S0 progenies, the
progenies will be composed of mixtures of pure common bean lines at the end of the process. If the breeder chooses to use this mixture of pure lines as a cultivar, it will present pyramided resistance alleles among and within the pure lines that compose the mixture, which can provide higher stability and durability of the resistance against the large variability among and within C. lindemuthianum races.
SUMÁRIO
PRIMEIRA PARTE ... 11
1 INTRODUÇÃO GERAL ... 11
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 14
2.1 A Cultura do feijoeiro no Brasil ... 14
2.2 Aspectos gerais da antracnose do feijoeiro ... 15
2.3 Variabilidade patogênica de Colletotrichum lindemuthianum ... 17
2.4 Controle genético da resistência do feijoeiro à antracnose ... 20
2.5 Mapeamento de genes de resistência à antracnose ... 23
2.6 Estratégias de melhoramento visando resistência à antracnose... 27
2.7 Seleção Recorrente ... 29
REFERÊNCIAS ... 32
SEGUNDA PARTE – ARTIGOS ... 44
ARTIGO 1 - GENETIC RESISTANCE TO DIFFERENT STRAINS OF RACE 65 OF Colletotrichum lindemuthianum IS CONFERRED BY DIFFERENT LOCI IN COMMON BEAN GENOME ... 44
ARTIGO 2 - RECURRENT SELECTION AS AN ALTERNATIVE FOR DURABLE ANTRACNOSE RESISTANCE IN COMMON BEAN ... 81
PRIMEIRA PARTE
1 INTRODUÇÃO GERAL
Um dos principais problemas que acomete a cultura do feijoeiro e causa grande instabilidade de produção é a ocorrência de doenças. A antracnose, causada pelo fungo
Colletotrichum lindemuthianum, destaca-se com uma das doenças mais destrutivas da cultura,
podendo reduzir drasticamente o rendimento dos grãos, quando são utilizadas sementes contaminadas e ou cultivares susceptíveis, sob condições climáticas favoráveis à epidemia. (PADDER et al., 2017; SINGH; SCHWARTZ, 2010). A utilização de cultivares resistentes tem sido a forma mais econômica e eficaz de controle da doença (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; MIKLAS et al., 2006). No entanto, a variabilidade genética e patogênica desse fungo, evidenciada pela grande quantidade de raças fisiológicas já identificadas, dificulta a obtenção de cultivares com resistência durável. Atualmente, quase 200 raças de C.
lindemuthianum já foram identificadas em todo o mundo, utilizando o conjunto internacional
padrão de cultivares diferenciadoras de antracnose do feijoeiro (PADDER et al., 2017). No Brasil, há um predomínio das raças 65, 73, 81 e 89 (CARBONELL et al., 2012; PINTO et al., 2012; RIBEIRO et al., 2016; SILVA; SOUZA; ISHIKAWA, 2007).
A interação altamente específica entre P. Vulgaris e C. lindemuthianum tem feito desse patossistema um modelo de referência em estudos de resistência-raça-específica em plantas. Mais de vinte alelos de resistência, provenientes de diferentes genes, já foram identificados em cultivares de feijoeiro, conferindo resistência qualitativa a diferentes raças de
C. lindemuthianum (COELHO et al., 2013; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013;
GONZÁLEZ et al., 2015). Esses genes têm sido mapeados em vários grupos de ligação do feijoeiro e muitos deles são, na verdade, complexos blocos gênicos (clusters), dentro dos quais, genes individuais conferem resistência a uma raça específica (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; MEZIADI et al., 2016; MURUBE; CAMPA; FERREIRA, 2019). O advento das tecnologias de sequenciamento de nova geração e as recentes publicações do genoma do feijoeiro (SCHMUTZ et al., 2014; VLASOVA et al., 2016), têm oferecido a oportunidade para a realização de mapeamento fino de vários genes relacionados à resistência a C.
lindemuthianum, o que permite o desenvolvimento de marcadores moleculares intimamente
ligados ao gene de interesse e viabiliza a seleção assistida por marcadores moleculares (BURT et al., 2015; MURUBE; CAMPA; FERREIRA, 2019; RICHARD et al., 2014; VALENTINI et al., 2017).
Além do mapeamento tradicional, envolvendo populações segregantes oriundas de cruzamentos biparentais, estudos de associação genômica ampla (Genome Wide Association
Study - GWAS), também têm sido realizados na cultura do feijoeiro para a identificação de
regiões genômicas associadas a várias características de interesse, incluindo resistência a doenças (KAMFWA; CICHY; KELLY, 2015; MOGHADDAM et al., 2016; PERSEGUINI et al., 2016; TOCK et al., 2017; ZUIDERVEEN et al., 2016). Nesse caso, não há necessidade de sintetizar uma população para realizar o mapeamento, esta pode ser, por exemplo, um conjunto diverso de indivíduos, que represente algum germoplasma. Comparado ao mapeamento por ligação, utilizando populações biparentais, GWAS pode oferecer maior resolução de mapeamento para identificação de Quantitative Trait Loci (QTLs) (SCHMUTZ et al., 2014; ZHU et al., 2008). No entanto, enquanto que, em populações segregantes oriundas de cruzamentos biparentais, todo o desequilíbrio de ligação entre o marcador e o QTL acontece, exclusivamente, em razão da ligação física, em GWAS, outros fatores, tais como: seleção, deriva genética, estrutura populacional e parentesco, podem afetar o desequilíbrio de ligação e levar a associações espúrias entre o marcador e o QTL.
Além da variabilidade patogênica entre raças de C. lindemuthianum, variabilidade dentro de raça também tem sido observada. Sob o ponto de vista do melhoramento do feijoeiro, essa questão é muito importante, pois as cultivares podem ser resistentes a alguns isolados e suscetíveis a outros, de mesma raça (DAVIDE; SOUZA, 2009; ISHIKAWA; RAMALHO; SOUZA, 2011; RODRÍGUEZ-SUÁREZ et al., 2005). O controle genético da resistência de cultivares de feijoeiro a seis diferentes isolados pertencentes à raça 65 de C.
lindemuthianum foi recentemente estudado por Costa et al. (2017). O diferente padrão de
reação das cultivares de feijoeiro quando inoculadas com os diferentes isolados da raça 65 e as segregaçõesde 15R:1S, observadas na geração F2 de vários cruzamentos, indicaram que
genes duplicados poderiam estar conferindo resistência específica a cada um dos isolados utilizados. Esse resultado evidencia que a especificidade da interação patógeno-hospedeiro ocorre também em nível de isolado, dentro de raça. Portanto, uma grande quantidade de alelos, provenientes de diferentes genes, estão envolvidos na resistência à antracnose, dificultando a obtenção de cultivares com resistência durável. Ademais, genes de resistência a raças específicas, já identificados em algumas linhagens de feijoeiro (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2012; GONÇALVES-(GONÇALVES-VIDIGAL; LACANALLO; (GONÇALVES-VIDIGAL FILHO, 2008; LACANALLO; GONÇALVES-VIDIGAL, 2015; SOUSA et al., 2015), provavelmente não conferem resistência a todos os isolados pertencentes a essas raças. Consequentemente, os
marcadores moleculares ligados a esses genes podem não ser úteis em todas as regiões onde o feijão é cultivado.
Uma estratégia de melhoramento que tem sido utilizada em muitas culturas, visando a aumentar a frequência de alelos favoráveis de várias características, de herança quantitativa, de forma gradativa, por meio de sucessivos ciclos de avaliação, seleção e recombinação, é a seleção recorrente (NELSON et al., 2018; RAMALHO, 2012). Na cultura do feijoeiro, esse método tem sido utilizado com sucesso visando à resistência à mancha angular (Pseudocercospora griseola) e ao mofo branco (White mold). Linhagens provenientes dos vários ciclos seletivos, com boas características agronômicas e bons níveis de resistência à essas doenças, têm sido obtidas (LEITE et al., 2016; REZENDE et al., 2014). No entanto, não há informações, na literatura, sobre a eficiência da utilização dessa estratégia, para a obtenção de cultivares resistentes à antracnose do feijoeiro. Apesar do caráter reação do feijoeiro a C.
lindemuthinaum tipicamente apresentar herança qualitativa, muitos genes estão envolvidos na
resistência às diferentes raças do patógeno e, além disso, resistência parcial, ou quantitativa, também tem sido relatada em algumas ocasiões (GONZÁLEZ et al., 2015; OBLESSUC et al., 2014).
Diante do exposto, o presente trabalho foi realizado com os seguintes objetivos: i) Identificar regiões genômicas associadas a resistência a diferentes isolados da raça 65 de C.
lindemuthianum, por meio do mapeamento tradicional por ligação e GWAS. ii) Desenvolver e
avaliar a eficiência de um programa de seleção recorrente visando à resistência a diferentes isolados, pertencentes a várias raças de C. lindemuthianum, como alternativa para a obtenção de cultivares com resistência durável a antracnose do feijoeiro.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 A Cultura do feijoeiro no Brasil
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), é uma cultura de grande importância no cenário agropecuário mundial, sobretudo nos países em desenvolvimento da América do Sul, América Central e sudoeste da África. Seus grãos possuem elevado teor de proteína, carboidratos e minerais, tornando o seu consumo altamente vantajoso, principalmente para as populações de baixa renda (BROUGHTON et al., 2003; RON et al., 2016). No Brasil, historicamente, o feijoeiro apresenta uma grande importância social, sendo cultivado por um grande contingente de pequenos produtores, voltados, sobretudo, para a agricultura de subsistência. No entanto, nas últimas décadas, o interesse pela cultura por parte de grandes produtores, com elevado nível tecnológico, tem aumentado, fazendo com que a cultura apresente, cada vez mais, grande importância econômica para o país (CARNEIRO; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2015).
O Brasil destaca-se por ser o maior produtor e consumidor mundial de feijão, com uma produção de cerca de 3,12 milhões de toneladas em uma área de 3,17 milhões de hectares no período de 2017/2018 (COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB, 2019). A maior produção no cenário nacional ocorre no estado do Paraná, seguido por Minas Gerais, Mato Grosso, Bahia e Goiás, os quais respondem por cerca de 64% do total produzido no país (CONAB, 2019). No entanto, mesmo produzindo mais de três milhões de toneladas, anualmente, a produção brasileira de feijão ainda não é suficiente para atender ao mercado interno em sua totalidade. O país importa cerca de 150 mil toneladas por ano, sendo a maioria de feijão tipo preto, cujo principal fornecedor é a Argentina (RUAS, 2017). Na maioria das regiões brasileiras, a preferência é pelo feijão de grãos tipo carioca, já nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, o preferido é o grão tipo preto (COMISSÃO TÉCNICA SUL-BRASILEIRA DE FEIJÃO - CTSBF, 2012).
O cultivo dessa leguminosa no país é realizado durante todo o ano, de tal forma que há produção de feijão em praticamente todos os meses do ano, em alguma região do país. No entanto, de maneira geral, a produção concentra-se em três safras bem definidas: A primeira safra, ou “safra das águas”, semeada entre outubro e novembro, a “safra da seca” ou de segunda época, semeada entre fevereiro e março e a terceira safra, também chamada de „safra de “outono-inverno”, com semeadura entre os meses de junho e julho (BARBOSA; GONZAGA, 2012). Nessa última safra, via de regra, é necessário o uso da irrigação, que,
aliada a tecnologias avançadas, tem permitido a obtenção dos maiores índices de produtividade do país, principalmente nos estados localizados na região do planalto central brasileiro (SOUZA; WANDER, 2014) Os Estados de Goiás e Distrito Federal alcançaram produtividade de cerca de 3.000Kg.ha na terceira safra de 2017/2018, praticamente o triplo da produtividade média nacional que foi de 1.056Kg.ha, nesse mesmo período (CONAB, 2019).
Em decorrência do uso de novas tecnologias e melhorias desde o manejo adequado do solo ao uso de sementes melhoradas, a produtividade do feijoeiro tem aumentado nas últimas décadas. No entanto, a produtividade média nacional ainda está muito aquém do potencial produtivo da cultura. Isso ocorre, porque o feijão é cultivado ao longo de todo o ano em uma ampla diversidade de ecossistemas, sob diferentes sistemas de produção, estando exposto a diversos fatores que causam instabilidade à sua produção. Entre esses fatores, a ocorrência de doenças, especialmente as de etiologia fúngica, são responsáveis por perdas significativas de produção (CARNEIRO; PAULA JÚNIOR; BORÉM, 2015; PAULA JÚNIOR; WENDLAND, 2012). A alternativa mais econômica e ecologicamente correta para o controle dessas doenças é o emprego de cultivares resistentes (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; MIKLAS et al., 2006). Dessa forma, pesquisas relacionadas à resistência de cultivares de feijão aos principais fitopatógenos presentes no território nacional são fundamentais para dar sustentabilidade e suporte aos programas de melhoramento do feijoeiro no país.
2.2 Aspectos gerais da antracnose do feijoeiro
A antracnose do feijoeiro, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum, é uma das doenças mais agressivas e de maior importância para a cultura, podendo provocar perda total de produção quando são utilizadas sementes contaminadas e/ou cultivares suscetíveis, sob condições climáticas favoráveis para o desenvolvimento da doença durante o ciclo da cultura (BARBOSA; GONZAGA, 2012; KIMATI et al., 1997). Além disso, em ataques mais severos, a doença pode ocasionar manchas nos grãos, depreciando a qualidade do produto final e tornando-os indesejáveis ao consumo (PAULA JÚNIOR; ZAMBOLIM, 2006). Trata-se de uma doença cosmopolita, Trata-sendo encontrada em todas as regiões onde o feijoeiro é cultivado, principalmente em regiões tropicais e subtropicais da América Latina e África Central e Oriental, onde as condições climáticas favorecem o desenvolvimento da doença (MIKLAS et al., 2006).
No Brasil, há uma alta incidência dessa doença nas lavouras de feijão da maioria dos estados produtores, sendo mais frequente em Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina
e Rio Grande do Sul. Na primeira safra, ou safra das águas, normalmente ocorre uma maior incidência do patógeno. Isso porque a doença é favorecida por temperaturas moderadas, entre 15 e 25°C, associadas à alta umidade relativa do ar, acima de 91% e precipitação frequente (CARBONELL et al., 2012; PINTO et al., 2001).
O agente etiológico da antracnose, C. lindemuthianum, é um fungo filamentoso, de comportamento hemibiotrófico, ou seja, apresenta uma fase inicial biotrófica, em que extrai nutrientes das células vivas do hospedeiro e uma segunda fase, necrotrófica, em que se nutre do tecido morto (PERFECT; GREEN; O‟CONNELL, 2001). Em sua fase assexual ou anamórfica, o fungo produz micélio septado e ramificado, de coloração hialina a quase negra à medida que envelhece. Os conídios são hialinos, unicelulares, de formato cilíndrico, com as pontas arredondadas. Estes são produzidos em corpos de frutificação denominados acérvulos e germinam após um período de 6 a 9 horas sob condições favoráveis, formando um tubo germinativo curto, com um apressório em sua extremidade (PERFECT et al., 1999). A penetração ocorre mecanicamente pela cutícula e epiderme do hospedeiro, por meio da formação da hifa de infecção, que se desenvolve a partir do apressório (O‟CONNELL; BAILEY; RICHMOND, 1985).
À medida que as hifas do patógeno se ramificam intra e extracelularmente nos tecidos do hospedeiro, ocorre o rompimento das células do vegetal e os sintomas macroscópicos da doença começam a ser visualizados (PERFECT; GREEN; O‟CONNELL, 2001). Tais sintomas são de fácil reconhecimento e dependendo da intensidade da doença, podem se manifestar em toda parte aérea da planta, a partir do sétimo dia da infecção. Os sintomas típicos da doença são lesões necróticas de coloração marrom escura nas nervuras da parte abaxial das folhas. Em infestações mais severas, as lesões estendem-se ao limbo foliar, resultando em necrose de parte do tecido vegetal. As lesões produzidas no caule e nos pecíolos são alongadas, escuras e deprimidas, podendo apresentar cancros. Já nas vagens, as lesões são circulares, de coloração marrom, com os bordos escuros e salientes, circundados por um anel pardo avermelhado. Em condições favoráveis ao desenvolvimento do patógeno, uma massa rósea de esporos pode ser observada no centro das lesões. As sementes infectadas podem apresentar desde uma leve descoloração até lesões escuras e deprimidas, as quais são mais facilmente visualizadas em sementes de tegumentos claros (BARBOSA; GONZAGA, 2012; CARBONELL et al., 2012; PADDER et al., 2017).
A curtas distâncias, o patógeno dissemina-se por meio de respingos de chuva, por insetos, animais e pela ação do homem, que transporta sementes e restos culturais infectados entre as lavouras, principalmente quando opera máquinas agrícolas. No entanto, a fonte
primária de inóculo, do ponto de vista epidemiológico, são as sementes infectadas, as quais são responsáveis pela disseminação a longas distâncias, tanto dentro quanto entre países (CARBONELL et al., 2012; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013). No Brasil, muitos produtores utilizam os grãos colhidos como sementes para a próxima semeadura, o que aumenta o risco de contaminação de uma safra para outra.
O uso de sementes de alta qualidade sanitária é de fundamental importância para o controle da antracnose, pois, quanto mais tardio for o aparecimento da doença na lavoura, menor será a perda de rendimento de grãos. A eliminação de restos de cultura e, quando possível, a rotação de culturas com plantas não hospedeiras, também são medidas preventivas recomendadas para evitar a transmissão de inóculo entre safras (CARBONELL et al., 2012; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; REIS; CASA; BIANCHIN, 2011). O sistema de plantio direto, comumente utilizado no Brasil, caso não seja utilizado em um esquema racional de rotação de culturas, pode favorecer o desenvolvimento de algumas doenças, entre elas, a antracnose. Embora vários fungicidas tenham sido recomendados para o controle da antracnose (LIMA et al., 2010; SARTORATO, 2006), este onera os custos de produção. Dessa forma, a resistência genética tem sido uma das estratégias mais eficientes, econômicas e ecologicamente viável para o controle da antracnose (MIKLAS et al., 2006; SINGH; SCHWARTZ, 2010).
O fungo possui ainda uma fase sexual ou telomórfica, denominada Glomerella
lindemuthiana. Nessa fase, o fungo produz peritécios, dentro destes se encontram os ascos, os
quais possuem oito ascósporos (conídios) (KIMATI; GALLI, 1970; SHEAR; WOOD, 1913). Recentemente, tem sido observado que um complexo de diferentes espécies pode estar co-habitando lesões de antracnose (BARCELOS et al., 2014; MOTA et al., 2016).
2.3 Variabilidade patogênica de Colletotrichum lindemuthianum
Apesar do uso de cultivares resistentes ser o método mais eficiente no controle da antracnose, a grande variabilidade genética e patogênica de C. lindemuthianum, evidenciada pela grande quantidade de raças fisiológicas que têm sido identificadas, dificulta a obtenção de cultivares com resistência durável (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; PADDER et al., 2017; PEREIRA et al., 2010; PINTO et al., 2012). A primeira evidência da variabilidade patogênica entre isolados de C. lindemuthianum foi relatada por Barrus (1911) que, utilizando algumas cultivares de feijão, observou que estas apresentavam reação diferente quando inoculadas com dois isolados diferentes de C. lindemuthianum, os quais foram denominados
como Alfa e Beta. A partir de então, várias raças patogênicas começaram a ser relatadas em todo mundo. No Brasil, o estudo pioneiro de identificação de raças de C. lindemuthianum foi realizado por Kimati em 1966. Neste trabalho, a partir de isolados coletados no estado de São Paulo, foram identificadas duas raças do patógeno, as quais pertenciam aos grupos, Alfa mexicano II e Delta.
Nos primeiros estudos de identificação de raças de C. lindemuthianum, cada pesquisador utilizava um conjunto particular de linhagens de feijoeiro, a fim de se averiguar a reação destas a diferentes isolados do patógeno. Nessa época, não havia consenso quanto à nomenclatura das raças identificadas e estas eram, normalmente, designadas por códigos específicos locais, tais como: Alfa, Beta, Gama, Lambda, Epsilon, Mexicano I e II, Brasileiro I e II, entre outras (CARBONELL et al., 1999). Com o objetivo de facilitar o intercâmbio de informações e permitir a comparação dos resultados dos estudos realizados por diferentes pesquisadores, na Primeira Reunião Latino Americana da Antracnose do Feijoeiro, realizada no CIAT (Cali, Colômbia), Pastor-Corrales (1991) sugeriu uma metodologia padronizada para classificar as raças do patógeno, a qual é utilizada até os dias atuais. Por essa metodologia, os isolados são inoculados em um conjunto internacional de doze cultivares diferenciadoras, sendo quatro de origem andina (Michigan Dark Red Kidney, Perry Marrow, Widusa e Kaboon) e oito de origem mesoamericana (Michelite, Cornell 49-242, México 222, PI 207.262, TO, TU, AB 136 e G2333). Um valor binário (HABGOOD, 1970) é atribuído a cada uma dessas cultivares e a raça é determinada numericamente, de acordo com a soma dos valores binários de todas as cultivares para as quais o isolado inoculado é virulento. Como exemplo, a raça 65 é virulenta às cultivares Michelite (20) e México 222 (26), 20 + 26 = 65.
Vários estudos de levantamento de raças vêm sendo realizados desde então. Atualmente, mais de 180 raças já foram identificadas entre isolados de C. lindemuthianum, coletados em todo o mundo, utilizando o conjunto internacional de cultivares diferenciadoras e o método binário para nomear as raças, comprovando a eficiência do método (PADDER et al., 2017). Dessa forma, o monitoramento das raças patogênicas, prevalecentes em cada região produtora de feijão, deve ser um processo rotineiro, assim como a avaliação de germoplasma de feijoeiro com as raças de C. lindemuthianum mais frequentes (BARCELOS et al., 2013; SALA; ITO; CARBONELL, 2006).
Balardin, Jarosz e Kelly (1997) observaram que algumas raças do patógeno, a exemplo das raças 65 e 73, ocorrem em várias regiões geográficas, enquanto outras raças são encontradas apenas em países ou regiões específicas. Estudos de levantamento de raças em regiões produtoras de feijoeiro do Brasil têm sido realizados e as raças 65, 73, 81 e 89 tem
sido as mais frequentes (FERREIRA et al., 2008; ISHIKAWA et al., 2005; MAHUKU; RIASCOS, 2004; PINTO et al., 2012; RIBEIRO et al., 2016; SILVA; SOUZA; ISHIKAWA, 2007). Entre estas, a raça 65, tem sido relatada como uma raça estável e amplamente distribuída na maioria das regiões produtoras.
Ainda que o sistema atual de determinação de raças tenha facilitado a comparação e troca de informações entre diferentes pesquisadores, além de permitir um maior entendimento sobre a dinâmica populacional do patógeno, ele não discrimina toda a variabilidade do patógeno. Isso ocorre porque o conjunto de cultivares diferenciadoras não representa todos os alelos de resistência à antracnose do hospedeiro, o que impossibilita a identificação da real variabilidade patogênica entre isolados de C. lindemuthianum (DAVIDE; SOUZA, 2009; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; RODRÍGUEZ-SUÁREZ et al., 2005). Mahuku e Riascos (2004), utilizando 200 isolados coletados em vários países, verificaram que todas as cultivares diferenciadoras já tiveram sua resistência quebrada por isolados de C.
lindemuthianum. Por outro lado, a raça 0 não é virulenta a nenhuma das doze cultivares
diferenciadoras, no entanto, outras cultivares de feijoeiro já foram descritas como suscetíveis a essa raça (GONZÁLEZ-CHAVIRA et al., 2004; SHARMA et al., 2007).
Carbonell et al. (1999), ao inocularem dois isolados das raças 31 e 65 e três isolados da raça 81, em cultivares recomendadas para o plantio no estado de São Paulo, observaram diferenças dentro de raças para o caráter patogenicidade. Rodríguez-Suárez et al. (2005) verificaram que isolados da raça 65 coletados no Brasil eram mais virulentos quando inoculados nas linhagens AB321 e A493 quando comparados com isolados da mesma raça, pertencentes à micoteca da Michigan State University, EUA. Davide e Souza (2009) inoculando seis diferentes isolados da raça 65 em sete cultivares comerciais de feijão, observaram que houve diferença significativa na agressividade dos isolados utilizados. Recentemente, Costa et al. (2017), verificaram que a cultivar Ouro Negro, descrita em muitos trabalhos, como suscetível à raça 65 (ALZATE-MARIN et al., 2003; GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2011), mostrou-se resistente a cinco de seis isolados da raça 65 de C.
lindemuthianum utilizados. Neste mesmo trabalho, a cultivar Talismã, descrita como
resistente à raça 65 (ABREU et al., 2004), foi completamente suscetível a todos os isolados utilizados.
Quando uma cultivar de feijão é descrita como resistente a uma determinada raça de
C. lindemuthianum, pressupõe-se que ela seja resistente a todos os isolados pertencentes a
essa raça. Caso contrário, isso poderá comprometer a credibilidade dos programas de melhoramento, além de gerar prejuízos econômicos (ISHIKAWA; RAMALHO; SOUZA,
2011). Em razão da alta frequência de ocorrência e a grande variabilidade encontrada dentro de isolados da raça 65 de C. lindemuthianum, Ishikawa, Ramalho e Souza (2011), sugeriram a utilização de um conjunto de cultivares diferenciadoras, adicional, para discriminar a variabilidade dentro de isolados pertencentes a essa raça. As cultivares recomendadas foram: BRS Estilo, BRSMG Majestoso, BRS Supremo, BRSMG União, BRS Valente, Ouro Vermelho, BRSMG Madrepérola e BRSMG Talismã, as quais são comercialmente disponíveis e adaptadas às condições brasileiras de cultivo, o que facilita a sua utilização. Posteriormente, Ishikawa et al. (2012) verificaram que esse conjunto de cultivares também apresentavam capacidade para discriminar a variabilidade dentro de isolados da raça 81 de C.
lindemuthianum.
Variação dentro de raças também tem sido relatada nas raças 73, 81 e 89 (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; ISHIKAWA et al., 2012; SANTOS et al., 2008), sendo importante a identificação de fontes de resistência que discriminem melhor a variação existente dentro dessas raças, assim como tem sido realizado para as raças 65 e 81 de C. lindemuthianum (ISHIKAWA, et al., 2012; ISHIKAWA; RAMALHO; SOUZA, 2011).
A ampla variabilidade patogênica encontrada na população de C. lindemuthianum pode ser atribuída a vários mecanismos de ampliação de variabilidade, comumente encontrados em fungos. Além da recombinação sexual, por meio da meiose, o patógeno também apresenta outros mecanismos de recombinação assexual, como tubos anastomoses entre conídios (CATs) (ISHIKAWA et al., 2012) e anastomose de hifas e formação do heterocário, que leva a ocorrência ciclo parassexual (CASTRO-PRADO et al., 2007; ISHIKAWA et al., 2013) e, consequentemente, ao polimorfismo cromossômico, relatado em linhagens de C. lindemuthianum (GONÇALVES, 2016; O`SULIVAN et al., 1998).
2.4 Controle genético da resistência do feijoeiro à antracnose
Em razão da especificidade dos alelos de resistência, já idenficados em diferentes cultivares de feijoeiro, às diferentes raças de C. lindemuthianum, a resistência do feijoeiro a esse patógeno, geralmente segue um modelo de herança qualitativo, em que os fenótipos, resistente e suscetível, são claramente diferenciados (CAMPA et al., 2014; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013). Esse tipo de resistência, também conhecida como resistência vertical é governada por poucos genes, de grande efeito (ROBINSON, 1971; VANDERPLANK, 1963) e está de acordo com a teoria gene-a-gene proposta por Flor (1956), pela especificidade dos genes de resistência do hospedeiro às raças do patógeno.
Bulkholder (1918), foi quem primeiro estudou a herança da resistência do feijoeiro à
C. lindemuthianum por meio de análises genéticas clássicas, baseadas na interpretação de
resultados obtidos a partir de uma população segregante F2 derivada do cruzamento entre as
cultivares White Marrow (resistente à raça Alpha) e Wells‟ Red Kidney (suscetível à raça Alpha). Neste trabalho foram observadas 362 plantas resistentes e 111 plantas suscetíveis na geração F2, sugerindo que um gene com alelo dominante, mais tarde denominado Co-1, estava
envolvido na resistência à essa raça. A partir de então, até os dias atuais, o controle genético da resistência de cultivares de feijoeiro às mais diversas raças de C. lindemuthianum tem sido estudado e vários alelos de resistência, provenientes de diferentes genes têm sido identificados. (COSTA et al., 2017; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; LACANALLO; GONÇALVES-VIDIGAL, 2015; SOUSA et al., 2015). Além de populações segregantes F2,
Famílias F2:3 e linhagens endogâmicas recombinantes (Recombinant Imbreed Lines - RILs)
também têm sido sugeridas para esse tipo de estudo, sobretudo por possibilitar a repetibilidade dos experimentos e confiabilidade dos resultados obtidos (CAMPA et al., 2014; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013).
Em 1996, Kelly e Young propuseram o uso do símbolo “Co” seguido por um número ou letra para se referir aos alelos de resistência às raças de C. lindemuthianum identificados em cultivares de feijoeiro. Até o momento, já foram identificados 23 alelos Co‟s (Tabela 1), provenientes de diferentes genes. Alguns desses alelos, como por exemplo o Co-42, têm sido utilizados com frequência em programas de melhoramento de feijoeiro visando à resistência à antracnose. Alelismo múltiplo também tem sido relatado nos locos Co-1, Co-3, Co-4 e Co-5 (Tabela 1). Com exceção do alelo co-8, identificado na cultivar AB136 (ALZATE-MARIN et al., 1997), no qual a resistência é relatada como sendo conferida por um alelo recessivo, nos demais casos, o alelo dominante é descrito como o responsável pela resistência. Diferentes tipos de marcadores ligados a esses genes de resistência à antracnose do feijoeiro, têm sido identificados, viabilizando a seleção assistida por marcadores (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2011, 2015; KELLY; VALLEJO, 2004; MEZIADI et al., 2016).
Tabela 1 - Alelos de resistência a C. lindemuthianum, cultivar em que o alelo foi identificado e seu respectivo cromossomo.
Loco Cultivar Cromossomo Referência
Co-1 MDRK Pv01 (MCROSTIE, 1919)
Co-12 Kaboon Pv01 (MELOTTO; KELLY, 2000) Co-13 Perry Marrow Pv01 (MELOTTO; KELLY, 2000)
Co-14 Widusa Pv01 (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2011) Co-15 Widusa Pv01 (GONÇALVES-VIDIGAL; KELLY, 2006)
Co-2 Cornel 49-242 Pv11 (MASTENBROEK, 1960)
Co-3 México 222 Pv04 (BANNEROT, 1965)
Co-32 México 226 Pv04 (FOUILLOUX, 1976, 1979) Co-33 (Co-9) BAT 93 Pv04 (GEFFROY et al. 2008) Co-34 Co-10 Ouro Negro Pv04 (VALENTINI et al., 2017)
Co-4 TO Pv08 (FOUILLOUX, 1976, 1979)
Co-42 G2333 Pv08 (YOUNG et al., 1998)
Co-43 PI 207.262 Pv08 (ALZATE-MARIN et al., 2007)
Co-5 TU Pv07 (ALZATE-MARIN et al., 2007)
Co-52 G2333 Pv07 (VALLEJO; KELLY, 2009)
Co-6 AB 136 Pv07 (KELLY, J.D.; YOUNG, 1996)
co-8 AB 136 - (ALZATE-MARIN et al., 1997)
Co-11 Michelite - (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2007)
Co-12 Jalo Vermelho - (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2008)
Co-13 Jalo Listras
Pretas Pv03
(LACANALLO; GONÇALVES-VIDIGAL, 2015)
Co-14 Pitanga - (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2012)
Co-15 Corinthiano Pv04 (SOUSA et al., 2015)
Co-16 Crioulo 159 Pv04 (COIMBRA-GONÇALVES et al., 2016)
Co- 17 Paloma Pv01 (CASTRO et al., 2017)
Co-u BAT 93 Pv02 (GEFFROY et al., 2008)
Co-v BAT 93 Pv07 GEFFROY, 1997)
Co-x Jalo EEP 558 Pv01 (RICHARD et al., 2014)
Co-w Jalo EEP 558 Pv01 (GEFFROY et al., 2008)
Co-y Jalo EEP 558 Pv04 (GEFFROY et al., 1999)
Co-z Jalo EEP 558 Pv04 (GEFFROY et al., 1999)
Fonte: Dados da autora (2019).
O controle genético da resistência de cultivares de feijoeiro a seis diferentes isolados pertencentes à raça 65 de C. lindemuthianum foi recentemente estudado por Costa et al. (2017). O diferente padrão da reação de cultivares de feijoeiro, quando inoculadas com os diferentes isolados da raça 65 e as segregaçãoes de 15R:1S observadas na geração F2 de vários
estar conferindo resistência específica a cada um dos isolados utilizados. Esse resultado evidencia que a especificidade da interação patógeno-hospedeiro ocorre também à nível de isolado, dentro de raça. Portanto, uma grande quantidade de alelos, provenientes de diferentes genes, estão envolvidos na resistência à antracnose, dificultando a obtenção de cultivares com resistência durável. Ademais, os alelos de resistência, já identificados em algumas linhagens de feijoeiro, conferindo resistência a essa raça, tais como Co-12, na linhagem Jalo Vermelho (GONÇALVES-VIDIGAL; LACANALLO; VIDIGAL FILHO, 2008), Co-13, na linhagem Jalo Listras Pretas (LACANALLO; GONÇALVES-VIDIGAL, 2015), Co-14 na linhagem Pitanga (GONÇALVES-VIDIGAL et al., 2012), Co-15 na linhagem Corinthiano (SOUSA et al., 2015) e Co-17 na linhagem Paloma (CASTRO et al., 2017) provavelmente não conferem resistência a todos os isolados pertencentes a essa raça. Consequentemente, os marcadores moleculares ligados a esses genes podem não ser úteis em todas as regiões onde o feijão é cultivado.
O fato de uma cultivar apresentar resistência qualitativa, não exclui a possibilidade da resistência quantitativa estar presente. Ao contrário da resistência qualitativa, a resistência quantitativa ou resistência horizontal, é governada por muitos genes de pequeno efeito, não específicos a raças do patógeno, podendo, portanto, propiciar uma resistência mais duradoura (POLAND et al., 2008). Por gerar uma distribuíção contínua de classes fenotípicas, que vai desde máxima resistência a máxima susceptibilidade, esse tipo de resistência, é também conhecida como resistência parcial. Na última década, quantitative trait loci (QTLs) conferindo resistência parcial também tem sido identificados no patossistema P. vulgaris – C.
lindemuthianum. Nesses estudos, dois ou mais QTLs envolvidos na resistência a um único
isolado de C. lindemuthianum têm sido identificados (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; GEFFROY et al., 2000; OBLESSUC et al., 2014; PERSEGUINI et al., 2016; ZUIDERVEEN et al., 2016). Interações epistáticas entre QTLs envolvidos na resistência do feijoeiro a C.
lindemuthianum, também têm sido relatadas (GONZÁLEZ et al., 2015), o que evidencia que a
resistência a antracnose no feijoeiro também envolve relações gênicas mais complexas.
2.5 Mapeamento de genes de resistência à antracnose
Para melhor caracterização dos genes de resistência, assim como de todos os outros genes de uma espécie, é muito importante saber a sua posição no genoma da espécie, assim como a sua relação com outros genes. A determinação da posição relativa dos genes nos cromossomos e a distância entre eles é realizada por meio da contrução de mapas genéticos
moleculares (CARNEIRO; VIEIRA, 2002). Para isso, é requerida uma população de mapeamento, que, no caso de plantas autógamas, como o feijoeiro, podem ser utilizadas: Populações F2, Retrocruzamentos, ou, preferencialmente, Linhagens Endogâmicas
Recombinantes (Recombinant Imbreed Lines – RILs). Em todos esses casos, as populações devem ser oriundas do cruzamento entre linhagens contrastantes para uma ou mais características de interesse. Uma vez que as populações RILs são derivadas de várias gerações de autofecundação, o que favorece a quebra dos blocos de ligação, estas propiciam uma melhor resolução de mapeamento e são, portanto, as mais adequadas para esse tipo de estudo. No entanto, são necessários vários anos para a obtenção dessas populações, o que pode dificultar a utilização das mesmas (SEMAGN; BJORNSTAD; NDJIONDJOP, 2007).
Os marcadores moleculares disponíveis para a culura do feijoeiro, especialmente os microssatélites (Simple Sequence Repeats - SSRs) (BLAIR et al., 2009, 2012) e Single
Nucleotide Polymorphism (SNPs) (GALEANO et al., 2009) têm sido largamente utilizados na
construção de mapas moleculares para a identificação de genes, controlando diversas características, incluindo resistência a doenças. Os SNPs são as formas mais abundantes de polimorfismo de DNA em genomas de eucariotos (BROOKES, 1999). Com o advento das tecnologias de sequenciamento de nova geração, o número de SNPs identificados tem aumentado substancialmente (BLAIR et al., 2013), oferecendo a oportunidade para saturar regiões genômicas específicas e aumentar a resolução de mapeamento dos genes de interesse.
Atualmente, vários genes de resistência à antracnose, identificados em várias cultivares, conferindo resistência raça-específica, já foram mapeados em diferentes grupos de ligação do feijoeiro (TABELA 1), sendo frequentemente localizados nas extremidades dos cromossomos. Evidências moleculares têm revelado que, na verdade, esses genes de resistência são organizados em complexos blocos gênicos (clusters), dentro dos quais, genes individuais conferem resistência a um isolado/raça específica (CAMPA et al., 2014; CAMPA; TRABANCO; FERREIRA, 2017; FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; MEZIADI et al., 2016; MURUBE; CAMPA; FERREIRA, 2019; OBLESSUC; FRANCISCO; MELOTTO, 2015).
Em 2014, o primeiro genoma de P. Vulgaris foi publicado, o qual pertence a linhagem andina G19833, com um genoma relativamente pequeno, de cerca de 587Mb (SCHMUTZ et al., 2014), comparado, por exemplo, com o tamanho do genoma da soja de 1.1Gb (SHULTZ et al., 2006). Em 2016, a linhagem mesoamericana BAT93 também teve o seu genoma sequenciado englobando 549.6Mb (VLASOVA et al., 2016). Com o sequenciamento do genoma, informações a respeito da posição física dos marcadores no genoma, bem como
informações sobre as sequências flanqueadoras desses marcadores, podem ser obtidas, levando ao desenvolvimento de marcadores moleculares estreitamente ligados aos genes de interesse. Utilizando o genoma de referência G19833, o mapeamento do alelo Co-x foi refinado para uma região de apenas 58Kb no cromossomo Pv01 (RICHARD et al., 2014). Mapeamento fino também tem sido realizado para os alelos Co-4 (BURT et al., 2015), Co-34 (VALENTINI et al., 2017) e, mais recentemente, para dois novos alelos mapeados no cluster
Co-3 no cromossomo Pv04 (MURUBE; CAMPA; FERREIRA, 2019). Além disso, a grande
disponibilidade de SNPs, aliada à sequência do genoma de referência do feijoeiro, tem permitido o desenvolvimento de chips de genotipagem de alto rendimento, para a construção de mapas de ligação (SONG et al., 2015). A anotação do genoma do feijeoiro também tem permitido a busca por genes candidatos dos alelos mapeados.
A maioria dos alelos de resistência caracterizados em várias espécies de plantas codificam proteínas conhecidas como NBS-LRR (Nucleotide-Binding Site- Leucine-rich
repeat) (NELSON et al., 2018). Essas proteínas estão envolvidas no reconhecimento de
diversos patógenos e pragas, incluindo fungos, bactérias, vírus e nematoides e os genes codificadores de tais proteínas encontram-se, frequentemente, agrupados em clusters (SCHMUTZ et al., 2014). Em particular, dois grandes clusters foram identificados nos grupos de ligação Pv04 e Pv11, contendo vários genes para proteínas NBS-LRR que se colocalizam com alguns alelos de resistência à antracnose, previamente mapeados nesses respectivos grupos de ligação (MEZIADI et al., 2016).
A resistência quantitativa também tem sido relatada no patossistema P.vulgaris – C.
lindemuthianum. QTL‟s de grande e pequeno efeito conferindo resistência a diferentes raças
de C. lindemuthianum têm sido mapeados nos 11 cromossomos de feijoeiro (GONZÁLEZ et al., 2015; OBLESSUC et al., 2014; PERSEGUINI et al., 2016). Nesses estudos, além do mapeamento tradicional de QTL, utilizando populações segregantes biparentais, estudos de associação genômica ampla (Genome-Wide Association Studies - GWAS), também conhecido por mapeamento associativo ou mapeamento por desequilíbrio de ligação, também têm sido utilizados no mapeamento de genes de resistência a antracnose do feijoeiro (ZUIDERVEEN et al., 2016). Por essa abordagem de mapeamento, a população de mapeamento não precisa ser sintetizada, de forma que pode ser utilizado um painel composto por um conjunto diverso de indivíduos, que representem algum germoplasma interessante, que esteja sofrendo eventos de recombinações históricas há muitas gerações. Dessa forma, espera-se que a resolução do mapeamento para identificação de QTLs seja maior em GWAS do que a obtida utilizando populações segregantes biparentais, as quais acumulam um número limitado de eventos de
recombinação, principalmente quando são utilizadas populações em gerações iniciais de endogamia (MOGHADDAM et al., 2016; ZHU et al., 2008).
A resolução com a qual um QTL pode ser mapeado é uma função do decaimento do desequilíbrio de ligação, o qual geralmente pode se estender por mais de 100kb em espécies autógamas, a exemplo do arroz e feijão (GARRIS et al., 2005; PERSEGUINI et al., 2016). Dessa forma, para que se tenha uma alta resolução de mapeamento em GWAS, também é necessário que se tenha uma grande saturação de marcas, cobrindo todo o genoma. Após o sequenciamento do genoma do feijoeiro (SCHMUTZ et al., 2014) e também o desenvolvimento de sistemas de genotipagem de alto rendimento (SONG et al., 2015), vários estudos de mapeamento associativo têm sido realizados para várias características em feijoeiro (HOYOS-VILLEGAS; SONG; KELLY, 2017; KAMFWA; CICHY; KELLY, 2015; MOGHADDAM et al., 2016; TOCK et al., 2017). Perseguini et al. (2016) utilizaram essa abordagem de mapeamento para identificar QTLs associados à resistência a raça 4 de C.
lindemuthianum e a raça 39 de Pseudocercospora griseola. Neste trabalho, foi utilizado um
conjunto diverso de 180 acessos de feijoeiro pertencentes ao banco de germoplasma do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), dos quais 24 eram de origem andina e 156 de origem mesoamericana. Utilizando 384 SNPs e 103 SSRs, 38 e 28 QTLs foram associados a
C. lindemuthianum e P. griseola, respectivamente, sendo a maioria de pequeno efeito,
distribuídos em todo o genoma do feijão, o que indica um padrão de herança quantitativa e complexa para a resistência a ambas as doenças. Zuiderveen et al. (2016) utilizaram um painel de 230 linhagens pertencentes ao pool gênico andino de feijoeiro, as quais foram genotipadas com Illumina BARCBean6K_3 BeadChip (SONG et al., 2015) com 5398 SNPs para idenficar QTLs relacionados à resistência a diferentes raças de C. lindemuthianum. Foram identificados QTLs de grande efeito explicando até 31%, 36%, 37%, 28%, 33% e 36% da variação fenotípica, considerando as raças 7, 39, 65, 73, 109, 3481, respectivamente, em diferentes cromossomos do feijoeiro.
Comparado ao mapeamento tradicional de QTL, um painel de GWAS possui maior variação genética para mapeamento de várias características de interesse, além de maior resolução de mapeamento e não há necessidade de se construir uma população de mapeamento. Com esse painel, também é possível explorar um maior número de alelos, quando são utilizados marcadores multialélicos, como os SSRs. No entanto, é importante ressaltar que em populações biparentais, todo o desequilíbrio de ligação entre a marca e o QTL é atribuído a ligação física, originado pelo desequilíbrio gamético. Já em GWAS, outros fatores, que não a ligação física entre a marca e o QTL podem contribuir para o desequilíbrio
de ligação, tais como: migração, seleção, deriva genética, estrutura populacional e parentesco, podendo causar associações espúrias entre a marca e o QTL. A abordagem de modelos mistos que leva em consideração a estrutura populacional e parentesco podem minimizar a ocorrência de falsos-positivos, mas não os elimina completamente (ZHANG et al., 2010). Dessa forma, o mapeamento tradicional utilizando populações biparentais e GWAS são dois métodos frequentemente utilizados para complementar um ao outro (LI et al., 2016; NELSON et al., 2018; TOCK et al., 2017).
2.6 Estratégias de melhoramento visando resistência à antracnose
Como o fungo C. lindemuthianum é um patógeno que apresenta grande capacidade de recombinação, a resistência baseada em um único gene é, na maioria das vezes, facilmente superada pela evolução da população do patógeno. Uma alternativa para aumentar a vida útil de resistência a doenças, em várias espécies, tem sido introgredir dois, três ou mais alelos de resistência a diferentes raças do patógeno em uma mesma cultivar, ou seja, construir uma pirâmide de diferentes alelos de resistência (CONSORTIUM, 2016; MIKLAS et al., 2006; MUNDT, 2014; NELSON et al., 2018). Essas pirâmides são obtidas, por meio de cruzamentos entre linhagens portadoras de diferentes alelos de resistência com alguma linhagem suscetível, mas bem adaptada e com características agronômicas e comerciais desejáveis. Como as cultivares portadoras de alelos de resistência são, em geral, linhagens ou cultivares mal adaptadas e com vários fenótipos indesejáveis, são necessárias várias gerações de retrocruzamento com o genitor recorrente, a linhagem adaptada, de forma que, ao final do processo, se tenha uma linhagem com todas as características favoráveis (BOTELHO et al., 2011).
Na construção de uma pirâmide, a escolha de um genitor recorrente que apresente perspectiva de longa vida útil, ou seja, que apresente ampla adaptabilidade e estabilidade genotípica, é importante. Isso ocorre porque todos os esforços são concentrados em uma única cultivar e, muitas vezes, ao final de todo o processo, o qual é demorado, já existem outras linhagens superiores para outras características desejáveis e a linhagem com os alelos piramidados já se encontra em desuso (BOTELHO et al., 2011). Essa estratégia tem sido comumente empregada para introduzir diferentes alelos de resistência a várias raças de C.
lindemuthianum em cultivares de feijoeiro. Em muitas ocasiões, o uso de marcadores
moleculares tem facilitado a identificação de indivíduos que apresentem os alelos de resistência piramidados e também grande proporção do genoma do genitor recorrente em
gerações precoces de retrocruzamentos (FERREIRA; CAMPA; KELLY, 2013; GARZÓN; LIGARRETO; BLAIR, 2008; HEGAY et al., 2014; MARCONDES; PEREIRA; SANTOS, 2010; PEREIRA; SANTOS, 2004). No entanto, com o uso extensivo de uma cultivar resistente, ocorre uma forte pressão de seleção na população do patógeno. Como consequência, novas raças patogênicas, capazes de superar os alelos de resistência da linhagem com os alelos piramidados, surgem e são selecionadas, o que faz com que a pirâmide seja menos efetiva (McDONALD; LINDE, 2002; MUNDT, 2014).
A existência de coevolução entre a origem geográfica de C. lindemuthianum e a de seu hospedeiro tem sido verificada (CHIORATO et al., 2006). Cultivares de origem andina são mais resistentes às raças mesoamericanas de C. lindemuthianume, da mesma maneira, cultivares mesoamericanas são mais resistentes às raças andinas. Esse fato, sugere que a transferência de alelos de resistência entre conjuntos gênicos, andinos e mesoamericanos, pode proporcionar resistência mais durável à antracnose (MIKLAS et al., 2006; SINGH; SCHWARTZ, 2010).
Uma outra alternativa que tem sido sugerida para o controle da antracnose, por meio da utilização da resistência genética das cultivares, é o emprego de multilinhas. Esse método consiste na utilização de mistura, em proporções previamente estabelecidas, de linhagens fenotipicamente semelhantes, porém, que apresentem alelos de resistência diferentes às diferentes raças do patógeno. Essa estratégia tem sido recomendada para o manejo de muitas doenças em várias culturas (McDONALD, 2014). Espera-se que, com o uso de multilinhas, ocorra redução na densidade de plantas suscetíveis, diante da redução de inóculo efetivo do patógeno no campo, o que resulta em uma maior estabilidade de produção e aumento da durabilidade da resistência em relação a uma única linhagem com vários alelos piramidados (MUNDT, 2014).
Botelho et al. (2011) avaliaram o potencial da utilização de multilinhas, compostas por sete linhagens de feijão tipo carioca, com características fenotípicas semelhantes, mas com diferentes reações às várias raças de C. lindemuthianum. Foi observado que a mistura das linhagens proporcionou a redução do progresso da doença no campo, sendo que a nota média de severidade da antracnose foi similar àquelas obtidas pelas linhagens resistentes, mesmo que na
constituição da mistura também houvesse linhagens suscetíveis. Além disso, a multilinha apresentou produção similar a das linhagens mais produtivas. Resultados semelhantes foram obtidos, recentemente, por Carvalho (2018). Sendo assim, a mistura de linhagens controla o avanço de antracnose e, assim, diminui a perda de produção quando comparada ao uso de linhas puras.
