MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

MICROBIOLOGIA

AMBIENTAL

AULA 7

- Microbiologia da água PROF. GUSTAVO H. COUTO

Água atmosférica: nuvens. Chuva, neve, granizo Água superficial: lagos, riachos, rios, oceanos Água subterrânea: lençóis freáticos

Hábitats aquáticos

Água doce: lagos, açudes, nascentes, pântanos e rios Marinho: oceanos (maior dos hábitats)

Estuários: extensões de água costeira, semifechadas, que apresentam uma conexão livre com o mar aberto.

Águas Naturais

Uma gota de água pode conter compostos químicos e

microrganismos de muitas espécies.

Microrganismos podem alterar as substâncias químicas e também fornecerem nutrientes para outros organismos aquáticos.

A água utilizada pelo homem vem de fontes naturais de água doce. Essa água deve ser tratada para eliminar microrganismos potencialmente patogênicos.

Qual amostra apresenta maior diversidade de

microrganismos?

Por quê?

 Nutrientes estão diluídos:

 Baixa diversidade microbiana

 Presença de matéria orgânica: aumenta sua atividade

 Os microrganismos podem:

Ambientes Aquáticos

 O que determina a quantidade e tipo de microrganismos no ambiente aquático?

- temperatura, luminosidade, pH, pressão,

salinidade, turvação e nutrientes.

- Mudar a composição química da água, - Fornecer nutrientes para outros organismos, - Representar um grande risco para a saúde.

Temperatura

 Águas superficiais: 0ºC a 40ºC

Sob a superfície: mais de 90% do ambiente marinho está t<5ºC: ideal para PSICRÓFILOS

 Fendas oceânicas: TERMÓFILOS isolados de sedimentos anaeróbios:

- Arqueobactéria Pyrodictium occultum (Ilha de Vulcano-Itália, água a 103ºC): bactéria fluindo no fundo do mar.

- Bactéria autotrófica anaeróbia que cresce formando H2S a partir de H2e do enxofre

elementar (S).

- Estudos de laboratório: P. occultum tem uma temperatura ótima de crescimento 105ºC e não cresce abaixo de 82ºC.

Exemplo: Fontes hidrotermais

- a temperatura da água pode exceder os 100ºC.

- O sulfato quando aquecido reage com a água formando sulfeto de hidrogênio (H2S)

- produção primária é assegurada por bactérias quimiossintéticas, que obtêm a energia necessária para a fixação do CO2 a partir da oxidação dos sulfuretos (e em particular do H2S) presentes nos fumos emergentes

Thermus aquaticus: espécie de bacteria que suporta

temperaturas elevadas que foi isolada de um geiser.

- É fonte da enzima termoresistente Taq polimerase, uma das principais enzimas utilizadas em biologia molecular para a amplificação de fragmentos de DNA

Pressão hidrostática: pressão do fundo de uma coluna vertical

de água

 Aumento de 1 atm a cada 10 m de profundidade.  Fundo de oceanos: pressão elevada

Alterações fisiológicas: velocidade de reações químicas, solubilidade de nutrientes e ponto de ebulição da água. - BARÓFILOS: encontrados a  2.500 m de profundidade. - BARÓFILOS EXTREMOS: em profundidades acima de

Luz

 A vida na água depende, direta ou indiretamente, dos produtos metabólicos de organismos fotossintéticos.

Algas e cianobactérias: principais microrganismos fotossintetizantes encontrados nos ambientes aquáticos.

• Crescimento limitado às regiões superficiais: ZONA FÓTICA.

• Tamanho da zona: depende das condições do local (posição do sol, estação do ano e turbidez da água).

• Em geral: atividade fotossintética restrita a 50-125 m de profundidade.

Salinidade:concentração de NaCl (0% - 32%)

Água doce: 0 %; inibição em concentrações ≥ a 1%.

 Água do mar: 2,75% de NaCl; concentração total (NaCl + outros sais) = 3,3 - 3,7%

Exemplos de Microrganismos tolerantes a altas concentrações de sais:

HALOFÍLICOS: 2,5-4,0 % de NaCl

HALOFÍLICOS EXTREMOS: Lagos salgados (ex.: Salt Lake, EUA): 32% de salinidade, mar morto (lago hipersalino).

Mar morto (34.2% de salinidade em 2011, densidade de 1.240 kg/L)

Turbidez: material suspenso + luz  variações na limpidez

das águas de superfícies.  Material suspenso:

- partículas minerais: erosão das rochas e solo.

- detritos: matéria orgânica particulada  decomposição de materiais vegetais e animais. - microrganismos suspensos.

Quanto maior a turvação da água  menor a penetração da luz e menor a profundidade da zona fótica.

 Material particulado: superfície à qual os microrganismos aderem.

pH

 Maioria dos microrganismos aquáticos: 6,5 - 8,5;  pH dos oceanos: 7,5 - 8,5;

 Organismos marinhos: 7,2 - 7,6;  Lagos e rios: variação ampla.

Exemplos de microrganismos em condições de pH extremos: - Arqueobactérias de lagos salgados da África: pH = 11,5 - Arqueobactérias de geisers: pH= 1,0

Nutrientes: inorgânicos e orgânicos. Influenciam significativamente

o crescimento microbiano. • Nitratos e fosfatos: algas

• Eutrofização: super crescimento de algas: O2

Carga de nutrientes:

• águas próximas à praia: variável - esgotos domésticos (compostos orgânicos e inorgânicos).

• águas de mar aberto: estável e baixa.

• efluentes industriais: presença de substâncias antimicrobianas

Podem inibir o crescimento de alguns microrganismos mas também podem permitir o crescimento de formas mais resistentes.

EUTROFIZAÇÃO

Cianobactérias (ou algas azuis)

Floração de cianobactérias

- Devido principalmente ao acúmulo de nutrientes ricos em fósforo e nitrogênio - Pode produzir metabólitos secundários que

dão gosto e odor desagradáveis à água, além de toxinas

- Off-flavor: gosto de “barro”, “inseticida”, “mofo”, que muitas vezes encontramos nos peixes.

Gesosmina (GEO) e o 2-Metilisoborneol (MIB): compostos orgânicos que conferem o sabor e odor na água, e deve-se pela proliferação de algas nos mananciais com alto índice de nutrientes, e é ampliada por fatores como luz, poluição, temperatura e chuvas. São totalmente prejudiciais a saúde quando em excesso.

Cianobactérias (ou algas azuis)

- Cianotoxinas: podem ser altamente tóxicas para animais aquáticos, terrestes e humanos através da ingestão ou contato com água contaminada.

- Principais toxinas: nodularinas, microcistinas, anatoxinas, saxitoxinas - Toxicidade: hepatóxicas, neurotóxicas, dermatóxicas ou inibidoras da

síntese de proteínas de acordo com seu mecanismo de ação.

Fenômeno da maré-vermela (red bloom)

Dinoflagelados - protistas

- Possuem pigmentos fotossintéticos que varia de cor (de verde à marron ou vermelho).

Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO)

• Quantidade de oxigênio necessária para a oxidação biológica e química das substâncias oxidáveis contidas na amostra

 DBO é o parâmetro fundamental para o controle da poluição das águas por matéria orgânica.

 Degradação microbiológica de matéria orgânica utilizando O2

dissolvido no corpo d’água.

 Permite indiretamente avaliar a quantidade de matéria orgânica presente na água capaz de ser oxidada pelos microrganismos presentes.

- análise de consumo de oxigênio feita pelos microrganismos envolvidos em processos de oxidação do substrato.

- corresponde à diferença entre as concentrações de oxigênio no início e no fim de um período de incubação, em condições específicas do ensaio.

- A temperatura de incubação é padronizada em 20°C e o tempo de incubação em 5 dias

PLÂNCTON:

Coleção de vida microbiana que flutua e se movimenta na região superficial dos pântanos, lagos e oceanos.

População de plâncton pode ser constituída especialmente de algas e cianobactérias (FITOPLÂNCTON) ou por protozoários e outros animais microscópicos (ZOOPLÂNCTON).

Microrganismos no ambiente aquático:

Os microrganismos fototróficos são considerados como plâncton mais importante

São os produtores primários de matéria orgânica por meio da fotossíntese. Condições como: luz solar, ventos, marés, correnteza, nutrientes e

ingestão por formas superiores

Afetam o número e o tipo de organismos na população do plâncton.

Controle

- Responsabilidade das autoridades sanitárias - Deve ser testada em intervalos regulares

- Portaria 518/2004 do MS – Padrão microbiológico de

potabilidade da água para consumo humano

* PORTARIA Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011

Distribuição: bactérias heterotróficas

- até 100 UFC/mL aceitável (padrão internacional) - se exceder 500 UFC/mL: medidas devem ser tomadas Preferencialmente: ausência de coliformes em 100 mL de água

Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde

De acordo com essa portaria, os padrões que determinam se uma água é potável ou não são:

 Livre de microrganismos patogênicos e de substâncias químicas nocivas.

 Águas superficiais (rios, riachos e lagos) e subterrâneas:  esgoto doméstico;

 dejetos agrícolas;  dejetos industriais.

 A água pode ser límpida, inodora e insípida e mesmo assim não ser potável: contaminantes físicos, químicos eBIOLÓGICOS.

 Legislação brasileira:

 Portaria no_{2914/2011, MS}

Resolução CONAMA 357/2005 e 397/2008

A classificação ambiental das infecções relacionadas com a água: 1) de transmissão hídrica ou relacionadas com a higiene, da categoria

feco-oral, onde podemos assinalar as diarréias e disenterias, febres entéricas, poliomielite, hepatite A, leptospirose, ascaridíase e tricuríase;

2) de transmissão relacionada com a higiene propriamente dita, como as infecções dos olhos e pele;

3) aquela baseada na água, quando o organismo patogênico desenvolve parte do seu ciclo vital em um animal aquático, como no caso da

esquistossomose, por exemplo; e

4) a transmissão por um inseto vetor que procria na água ou cuja picada ocorre próximo a ela – nesta categoria, destacam-se a malária, a filariose e as arboviroses (dengue e febre amarela).

Bactérias Vírus Protozoários Helmintos Espiroquetas Riquétsias Algas

Microrganismos Patogênicos na Água

Doenças de veiculação

hídrica

Bactérias

- Salmonella spp.: gastroenterite / S. typhi: febre tifóide - Vibrio cholerae: gastroenterite

- Shigella spp.: disenteria bacilar (shigelose) - Yersinia enterocolitica: gastroenterite aguda - Escherichia coli: linhagens patogênicas (enterites) - Clostridium perfringens: enterite, gangrena gasosa - Vibrio parahaemolyticus: gastroenterites

- Pseudomonas aeruginosa: infecções nos olhos e ouvidos. - Staphylococcus aureus: infecções cutâneas, garganta e

intoxicações alimentares

- Leptospira spp.: hepatite, conjuntivite e insuficiência renal

Doenças de Veiculação Hídrica

Fungos:

- saprófitas e parasitas de peixes

- oriundos do solo: Candida albicans (infecções da pele e mucosas)

- Geotrichum: fungo dermatófito

Protozoários:

- ciliados: Giardia lamblia (esporos resistentes ao cloro) - amebas: Entamoeba histolytica (amebíase intestinal)

Vírus:

- Hepatites A e B

- Rotavírus: gastroenterite infecciosa não bacteriana - Enterovírus: poliomielite

PROBLEMAS:

• Grande variedade de microrganismos patogênicos. • Espécies podem estar em pequeno número para

detecção nas amostras coletadas.

• Isolamento e detecção de alguns patógenos podem levar vários dias, semanas ou meses.

• Ausência de um patógeno em particular não significa ausência de outro.

Detecção de Patógenos em Água

Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

A análise microbiológica para determinação da potabilidade

não deve ser baseada no isolamento e identificação de

microrganismos patogênicos:

• Isso porque os agentes patogênicos têm acesso esporádico ao ambiente hídrico e não demonstram sobrevivência durante um longo período de tempo.

• Por estar em pequeno número, os microrganismos patogênicos podem não ser detectados por procedimentos laboratoriais.

• É necessário um período de pelo menos 24 horas para obtenção de resultados laboratoriais para microrganismos patogênicos.

O monitoramento de todos os microrganismos patogênicos é difícil e inviável economicamente:

 meios de cultura e metodologias diferentes.  dificuldade de analisar os resultados.

O que é um microrganismo indicador? Qual seria o ideal?

O que é um microrganismo indicador? Qual seria o ideal?

Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

Indicador ideal de qualidade sanitária:

- Presente em águas poluídas e ausentes em águas não poluídas. - Presente na água quando os microrganismos patogênicos estão

presentes.

- Número de microrganismos indicadores está correlacionado com o índice de poluição.

- Sobrevive melhor e por mais tempo na água que os microrganismos patogênicos.

- Apresenta propriedades uniformes e estáveis.

- Geralmente é inofensivo ao homem e a outros animais. - Presente em maior número do que os patogênicos.

- Facilmente evidenciado por técnicas laboratoriais padronizadas.

Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

 Tipo de microrganismo cuja presença na água é evidência de que ela está poluída com matéria fecal de origem humana ou de outros animais de sangue quente.

 Indica a ausência/presença de microrganismos patogênicos.

Outros Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

 Escherichia coli  microrganismo mais utilizado, pois satisfaz as exigências de um indicador de poluição.

 Streptococcus faecalis

 Anaeróbios: Clostridium perfringens e Bifidobacteria sp.  Vírus bacteriófagos

 Vírus entéricos → métodos mais elaborados para detecção na água.

→ Embora existam pesquisas em andamento nesta área, nenhum “método padrão” para detecção de vírus na água tem sido adotado.

Microrganismos Indicadores da

Qualidade da Água

 Grupo COLIFORME: Família Enterobacteriaceae → Bacilos gram-negativos;

→ Aeróbios ou anaeróbios facultativos; → Não formadores de esporos;

→ Fermentam a lactose (lac+) gerando ácidos orgânicos e gás em 48 horas a 35°C.

 Principais Gêneros:

- Coliformes totais: coliformes ambientais (fezes, vegetais e solo) - Enterobacter (E. aerogenes), Klebsiella, Citrobacter, etc. - Coliformes fecais: coliformes termotolerantes (crescem a 44,5o_{C) -Escherichia coli}

Análise Bacteriológica da Água

 Métodos apresentados no livro:

→ Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater - publicado pelas associações:

- American Public Health Association - American Water Works Association

- Federation of Sewage and Industrial Wastes Associations

Análise Bacteriológica da Água

 Critérios:

- A amostra deve ser coletada em frasco estéril.

- A amostra deve ser representativa do universo do qual foi colhida.

- A contaminação da amostra deve ser evitada durante e após a coleta.

- A amostra deve ser analisada logo após a sua obtenção. - Havendo a necessidade de uma demora na realização da

análise, a amostra deve ser guardada a uma temperatura de 0 a 100_C.

Análise Bacteriológica da Água

 Contagem padrão em placa

- Quantidades de 1,0 e 0,1 mL → plaqueadas.

- Não há um número particular de bactérias que seja

aceitável → água com poucas bactérias patogênicas é

mais perigosa do que com muitas bactérias saprófitas. - Úteis na determinação da eficiência das operações

destinadas à remoção ou à destruição de organismos (sedimentação, filtração e cloração).

Teste dos tubos múltiplos e cálculo do número mais

provável (NMP/100mL)

• Teste presuntivo • Teste confirmativo • Teste completo ou final Membrana filtrante (UFC/mL) Teste cromogênico/fluorogênico

Diluição seriada: extinção

Inoculação em baterias de tubos múltiplos com meio de cultivo. Incubação

→ 35 ou 44,5o_C

Contagem dos tubos positivos.

Uso da tabela de Número Mais Provável (NMP) para estimar densidade.

Técnica dos Tubos Múltiplos 10 ml por tubo 0,1 ml por tubo 1 ml por tubo Amostra de água

Técnica dos tubos múltiplos: determinação do NMP de coliformes (CT)

Tubos com gás do teste anterior

Tubos com caldo lactosado + bile verde brilhante

Incubação a 35ºC /24-48 h

Teste Confirmativo

Tubos com gás Caldo E.C. do teste confirmativo incubação a 44,5 ºC

Teste Coliformes Fecais

Coliformes fecais fermentam a lactose a 44,5 ºC

→ Porque o dissacarídeo lactose está presente nos meios e métodos de detecção de coliformes totais e fecais ???

- Esses grupos possuem toda a “maquinaria” celular necessária para o TRANSPORTE, QUEBRA ENZIMÁTICA e CONSUMO da lactose. Nem todos microrganismos possuem. Portanto é característico do metabolismo dos coliformes.

Membrana celular

Interior da célula Proteína de membrana

específica para translocação da lactose

Enzima específica para a quebra da lactose em 2 monossacarídeos/açúcares Açúcares que entrarão na via glicolítica para a geração de ATP celular e CO2

Via metabólica de utilização da lactose por E. coli

A via da utilização da galactose é mais longa,

precisa ser antes transformada em glucose 1-P para entrar

na via glucolítica (glicólise) enquanto que a glucose entra direto na

Um disco filtrante é colocado na unidade de filtração (poros de 0,45 μM diâmetro).

Um volume determinado de água passa pelo disco filtrante e as bactérias são retidas na superfície da membrana filtrante.

A membrana é retirada e colocada sobre uma almofada absorvente saturada com meio de cultura apropriado.

Incubação

→ 35o_{C: coliformes totais}

→ 44,5o_{C: coliformes fecais}

Contar as colônias

Técnica da Membrana Filtrante

Colônias: membrana filtrante e meio de cultivo

Colônias típicas: brilho metálico Colônias típicas: azuis

- ONPG pode ser metabolizado pela enzima do coliformeβ-galactosidase e o MUG pela

enzima daE. coliβ-glucuronidase.

- Baseia-se na utilização de substratos análogos à lactose (glicopiranosídeos). - A utilização do substrato (galactose nesse caso) libera compostor de cor específica.

Usado como teste complementar. Coliformes Totais: enzima

• β-D-galactosidase:hidrolisa o

• orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosidio(ONPG) • Amarelo quando hidrolisado

E. coli : enzima

• β-glucuronidase:hidrolisa o

• 4-metilumbeliferil-β-glucuronidio(MUG) • Azul Fluorescente quando hidrolisado

Teste Cromogênico e Fluorogênico:

ONPG e MUG

Amostras com resultados positivos para coliformes totais devem ser analisadas para Escherichia coli e, ou, coliformes

termotolerantes, devendo, neste caso, ser efetuada a verificação e confirmação dos resultados positivos

§ 8º Em amostras individuais procedentes de poços, fontes, nascentes e outras formas de abastecimento sem distribuição canalizada, tolera-se a presença de coliformes totais, na ausência de Escherichia coli e, ou, coliformes termotolerantes, nesta situação devendo ser investigada a origem da ocorrência, tomadas providências imediatas de caráter corretivo e preventivo e realizada nova análise de coliformes.