Analise Preliminar do efeito do extrato aquoso do própolis misto de Apis mellífera, do Município do Ibaiti região norte do Estado do Paraná, sobre as bactérias gram positivas
e gram negativas.
Camila Virgínia Dândalo1, Shigehiro Funayama2.
1 Acadêmico do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR);
2 .Farmacêutico Profº Dr. Universidade Tuiuti do Paraná; (Curitiba, PR).
Endereço para correspondência: Camila Virgínia Dândalo, cami_fele@hotmail.com
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RESUMO: A própolis é uma resina natural coletada e modificada por abelhas, que tem sido
usada como agente quimioterápico desde a antigüidade. A ação antibacteriana desse composto foi avaliada através da inoculação do meio reacional contendo diferentes concentrações do extrato aquoso de própolis misto (10 uL, 20 uL, 40 uL, 80 uL e 100 uL) e 10 uL de cada bactéria escolhida em placas de ágar Mueller-Hinton. Foram testadas as seguintes espécies de bactérias: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella typhimurirum,
Enterobacter aerogenes e Pseudomonas aeruginosa. Essas bactérias foram consideradas
sensíveis ao extrato aquoso de própolis misto que foi capaz de inibir o crescimento bacteriano nas placas após 24 horas de incubação a 37ºC.
Palavras-chave: Própolis; Atividade antimicrobiana; bactérias patogênicas.
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ABSTRACT: Propolis is a natural resin collected by bees and modified, which has been used
as a chemotherapeutic agent since antiquity. The reaction media mixtures containing different concentrations of aqueous extract of mixed propolis (10 uL, 20 uL, 40 uL, 80 uL and 100 uL) and 10 uL of each bacterium chosen were inoculated in Mueller-Hinton agar plates and its antibacterial action determined. We tested the following species of bacteria: Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes and Pseudomonas aeruginosa. These bacteria were sensitive to the aqueous extract of mixed
propolis which was capable of to inhibit bacterial bacterial growth on the plates after 24 hours of incubation at 37 C.
INTRODUÇÃO
A Própolis é conhecida e utilizada pelo homem desde os tempos mais remotos. É um material resinoso e balsâmico coletado e processado pelas abelhas a partir de várias fontes vegetais, especialmente dos gomos florais e foliares. Sua composição é complexa e ocorrem variações em função de fatores como a flora da região, estações do ano, mudanças que ocorrem devido ao meio ambiente em que as abelhas o coletam. Mas de forma geral, pode-se afirmar sua riqueza em flavonóides e substâncias minerais. Sua coloração pode variar do amarelo claro, marrom esverdeado ao negro (VIEIRA, M.I. 1983; MARCUCCI et al, 2001).
Na medicina tradicional tem sido utilizada, devido ao seu largo espectro de atividade como antioxidante, antiinflamatório, antibacteriano, antiviral, antifúngico (SFORCIN et al., 2000; MARCUCCI et al., 1996). A composição da própolis varia de acordo com o local de coleta e da espécie vegetal utilizada pelas abelhas na sua confecção. Alguns componentes estão presentes em todas as amostras, enquanto outros ocorrem somente em própolis colhidas de espécies particulares de plantas. Pelo menos 200 componentes diferentes já foram identificados em amostras de própolis de origens diversas, dentre esses, ácidos graxos e fenólicos, ésteres, ésteres fenólicos, flavonóides (flavonas, flavanonas, flavonóis, di-hidroflavonóis, etc.), terpenos, esteróides, aldeídos e álcoois aromáticos, sesquiterpenos e naftaleno (GREENAWAY et al., 1991; AGA et al., 1994; BANKOVA et al., 1995; MARCUCCI et al., 1996, 2001; LEVY JR. NC et. al. 1997).
Vários estudos têm comprovado a atividade antimicrobiana de extrato etanólico (SAHINLER & KAFTANOGLU, 2005). Contudo, os diversos tratamentos químicos e físicos que a própolis sofre durante a extração, tais como solventes utilizados e variação de temperatura, podem alterar suas propriedades farmacológicas e os componentes extraídos (MATSUNO, T 1997).
Pesquisas têm sugerido que a própolis é uma nova alternativa como antimicrobiano propondo que sua atividade possa se associar ao alto conteúdo de flavonóides e compostos fenólicos. Fatores ligados à extração, metodologia de condução de ensaios, influenciam o grau de inibição do extrato em relação às diferentes espécies bacterianas (PARK, Y.K 1998).
Trabalhos tratam da avaliação da atividade antimicrobiana da própolis tanto para bactérias quanto para fungos. Apesar da existência de muitos trabalhos com a própolis, a comparação com outros resultados é prejudicada pela grande diferença entre suas
composições. Há intensa variação de uma região para outra, pois é evidenciada grande variabilidade devido a diversidade climática, da flora e entre outros fatores. Sua ação terapêutica é atribuída aos flavonóides e ao ácido ferúlico, que apresentam, principalmente, poder antibacteriano. Estudos comparativos entre a própolis brasileira e a européia têm demonstrado grande variabilidade na constituição (BANKOVA 1998; BANKOVA, 2005), e intensa atividade farmacológica da brasileira. O interesse demonstrado por vários investigadores, a fim de obter preparações de própolis com composição química definida tem aumentado devido à ampla possibilidade de aplicações médicas. Além de alguns raros extratos aquosos (MATSUNO et al. 1997, PARK & IKEGAKI 1998), a grande maioria das preparações de própolis é relatada como etanólica, metanólica ou extratos de clorofórmio e todas tem demonstrado discreta atividade antibacteriana, tais como aquelas contra os
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus mirabilis (BANKOVA et al. 1983, 1985 KONIG, GRUNBERGER et al. 1988, AGA et al.
1993, FERNANDES et al. 1997, KOO & PARK 1997, MATSUNO et al. 1997, BANKOVA et al. 1998, BURDOCK 1998, PARK et al. 1998, MACIEJEWICZ et al. 2001).
Este trabalho teve por objetivo análise preliminar da concentração mínima inibitória do extrato aquoso de própolis misto sobre a proliferação de Salmonella typhimurium,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes e Streptococcus pyogenes em meio Mueller & Hinton.
Doenças causadas nos indivíduos portadores:
Salmonella typhimuriu: Enterite, sintomas típicos de enterocolite (enjoo, vómitos e
diarreia), Bacteremia e septicemia.
Pseudomonas aeruginosa: Normalmente infeta o aparelho pulmonar, aparelho
urinário, queimaduras, e também causa outras infecções sanguíneas. Em raras circunstâncias pode causar pneumonia por contágio entre humanos. Se a infecção ocorrer em áreas vitais ela pode ser fatal.
Staphylococcus aureus: Síndrome de choque tóxico, Gastroenterite estafilocócica,
Síndrome de pele escaldada estafilocócica, Impetigo, Foliculite, Endocardite, Osteomielite, Pneumonia.
Enterobacter aerogenes: Causa doenças associadas a bacteremia e síndrome séptica em
vários locais, principalmente nos tratos urinários e respiratórios, é geralmente encontrado em humanos o trato gastrintestinal e geralmente não causam doença em indivíduos saudáveis.
Streptococcus pyogenes: Faringite, Escarlatina (complicação da faringite), Erisipelas,
MATERIAL E MÉTODOS
Própolis: As amostras da própolis foram coletadas de colméias de diferentes apiários do
município de Ibaiti, região norte do estado do Paraná, ficando assim classificado como própolis mista.
Extrato aquoso de própolis: O extrato aquoso de própolis misto foi preparado segundo a
técnica proposta por Funayama et al (2006).
Microorganismos: Os microorganismos Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Staphylococcus pyogenes (ATCC 19615), Enterobacter aerogenes (ATCC13048), Salmonella typhimurium (ATCC14028) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC35032), foram adquiridos da
Difco.
Meio Reacional e Plaqueamento: Foi considerado meio reacional a solução preparada com o
extrato aquoso da própolis mista, as bactérias e soro fisiológico. Primeiramente, foi selecionado cepas inativas das bactérias em forma de disco, estas foram inoculadas em meio BHI por 24h em estufa a 37ºC. Após ativar as bactérias, misturou-se uma alíquota de 10 uL de cada cultura bacteriana a diferentes concentrações de própolis, começando por 10 uL, posteriormente 20 uL, 40 uL, 80 uL até 100 uL, completando o volume total para 100 uL com soro fisiológico, ou seja, o recepiente com 10 uL de própolis recebeu 80 uL de soro e assim sucessivamente. Foram preparados seis meios diferentes, devido as diferentes cepas de bactérias adicionadas, sendo um dos meios considerado como controle, pois não houve a adição da própolis. Ambos foram acondicionados em estufa à 37ºC durante 24horas.
Todo o experimento foi realizado em condições assépticas, manipulado em capela de fluxo laminar. O meio de Cultura, a água destilada e os instrumentos utilizados foram esterilizados em autoclave a 121ºC, durante 15 minutos.
Determinação da concentração mínima inibitória: A concentração mínima inibitória foi
definida como a quantidade de extrato aquoso de própolis misto que inibe 100% da proliferação bacteriana. As misturas reacionais testes e controles foram incubadas em estufa a 37ºC por 24 horas e em seguida plaqueadas placas de Mueller & Hinton. A análise dos resultados foi feita após o período de 24 horas de incubação em estufa a 37ºC.
O meio reacional foi preparado com o objetivo de expor as bactérias em contato com o extrato aquoso de própolis para avaliação a ação bactericida.
Posteriormente foi plaqueado o meio reacional, com as diferentes concentrações a fim de determinar a concentração mínima inibitória da própolis diante dos diferentes microorganismos utilizados.
Tabela 1: Resultado do plaqueamento em meio Mueller & Hinton
Extrato do própolis misto 10 uL 20 uL 40 uL 80 uL 100 uL Staphylococcus aureus N 100% N 100% N 100% N 100% N 100% Staphylococcus pyogenes N 100% N 100% N 100% N 100% N 100% Enterobacter aerogenes N 100% N 100% N 100% N 100% N 100% Salmonella typhimurium N 100% N 100% N 100% N 100% N 100% Pseudomonas aeruginosa N 100% N 100% N 100% N 100% N 100% N = Não houve crescimento
% = Eficácia do extrato
Contudo conforme demonstra a tabela 1, não foi estabelecido tal fator, pois todas as concentrações do extrato utilizado no presente experimento apresentaram ação antibacteriana. Os resultados obtidos demonstram que não houve crescimento microbiano nas placas testadas, sendo observado o desenvolvimento microbiano apenas nas placas de referência, nas quais não foram adicionadas alíquotas do extrato aquoso da própolis misto, comprovando a eficácia antibacteriana do extrato de própolis. Os resultados obtidos podem ser verificados nas figuras que seguem.
a
Figura 1. Staphylococcus pyogenes 10 ul extrato Figura 2. Staphylococcus pyogenes - Controle
Figura 3. Staphylococcus aureus 10 ul extrato Figura 4. Staphylococcus aureus - Controle
Figura 5. Salmonella typhimurium 10 ul extrato Figura 6. Salmonella typhimurium - Controle
Figura 7. Pseudomonas aeruginosa 10 ul extrato Figura 8. Pseudomonas aeruginosa - Controle
Figura 9. Enterobacter aerogenes 10 ul extrato Figura 10. Enterobacter aerogene - Controle
CONCLUSÃO
Embora a determinação dos MICs não seja conclusiva pode se verificar que o extrato aquoso da própolis mista de Apis mellífera, apresenta atividade bactericida sobre as bactérias gram positivas como Staphylococcus aureus e Staphylococcus pyogenes, e de gram negativas como Enterobacter aerogenes, Salmonela typhimurium e Pseudomonas aeruginosa.
Serão necessários outros experimentos para determinação dos MICs expressos tanto em volume de extrato.
No entanto, mais estudos são necessários revelando a composição química e a
respectiva concentração do extrato utilizado, além de diferentes espécies de bactérias a fim de comprovar essas atividades.
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