Hemoglobinúria Paroxística Noturna.» Dra. Nydia Strachman Bacal» Hematologista e Patologista Clínica» MBA em Economia e Gestão na Saúde

Hemoglobinúria Paroxística Noturna

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t

Diagnóstico e Tratamento

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Dra. Nydia Strachman Bacal

Hematologista e Patologista Clínica Hematologista e Patologista Clínica

Hemoglobinúria Paroxística Noturna

g

Diagnóstico por Citometria de Fluxo

• Doença HPN

• HAM x Citometria de Fluxo

• Antígenos envolvidos

• Tamanhos de clones HPN na HPN

• Clones HPN em falência medular (Anemia Aplástica)

Clones HPN em Desordens medulares:

MDS

(Anemia Refratária),

Mielopatias

(Mielofibrose/ LMC)

• Experiência do HIAE e Conclusão

A Doença: Hemoglobinúria

P

í i

N

Paroxística Noturna

• Expansão clonal adquirida não maligna de

• Expansão clonal adquirida, não maligna de

células-tronco hematopoéticas

• Hemoglobinúria noturna icterícia hemosiderinúria

• Hemoglobinúria noturna, icterícia, hemosiderinúria

• Mutação somática adquirida do gene PIG-A

• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de

• Defeito na síntese da âncora (GPI) com perda de

proteínas de superfície

• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:

• Para diagnóstico os antígenos mais estudados são:

CD55

e

CD59

, ambas proteínas inibidoras do

complemento e, associadas à patogênese da

p

,

p

g

doença clínica.

A Doença: Hemoglobinúria

Paroxística Noturna

Paroxística Noturna

• Anemia Hemolítica / Trombose e Pancitopenia p • Prevalência: < 1/100.000 (rara)

• Sobrevida: 10 a 15 anos

• Morte: trombose ou citopenias progressivas • Morte: trombose ou citopenias progressivas

raramente transformação leucêmica (<5%)

• Muitos pacientes apresentam hemólise intermitente e alguns evoluem para remissão espontânea

alguns evoluem para remissão espontânea.

• Hemólise intravascular crônica com exacerbações.

• Necessidade transfusional e muitas vezes, deficiência de fferro.

• A trombose apresenta predileção pelas veias hepáticas (S.Budd Chiari).

• Pacientes com AA e evidencias laboratoriais de HPN tem menor probabilidade de trombose.

Quadro laboratorial

• Sangue Periférico

– Anemia, Reticulocitose

e

a,

e cu oc ose

– Leucopenia e granulocitopenia

– Deficiência de ferro

Deficiência de ferro

• Medula óssea

hiperplasia eritróide

– hiperplasia eritróide

– aplasia

U i

• Urina

– Hemoglobinúria

– Hemossiderinúria

Teste de HAM

GV com HPN são susceptíveis à lise com complemento

37°C / HCL / pH p

Medida colorimétrica da Hb livre

HPN: lise de 5% a 80% dos G.V.

Scottish Charles - 1794 (cirurgião)

Strübing Paul - 1882 (urina escura matutina, hemólise intravascular, trombose.

Defeito no G.V.) Defeito no G.V.)

Marchiafava, 1911 / Michelli, 1931 (anemia hemolítica com esplenomegalia

e hemoglobinúria e hemosiderinúria)

Ham TH, Dingle JH. Studies on the destruction of red

blood cells II. Chronic haemolytic anaemia with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Certain immunological aspects

f f

of the haemolytic mechanism with special reference to serum complement.

Teste de HAM

• Não existe Falso (-)

Teste de HAM

Não existe Falso ( )

• Existe Falso (+)

Diseritropoese congênita tipo II mas não se

Diseritropoese congênita tipo II , mas não se

o soro do paciente for utilizado ou se os

globulos vermelhos do paciente já foram

globulos vermelhos do paciente já foram

lisados com anticorpo à frio. Portanto o

Teste de Coombs deve ser realizado em

paralelo e se (+) invalida o teste de Ham.

AHAI > HPN

Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol

GPI

GPI

Âncora Glicosil Fosfatidil Inositol

Normal camada bilipídica HPN

Mutação de

A deficiência da âncora GPI resulta na perda de várias proteínas da superfície da célula.

Mutação de gene PIG-A defeito na acetilglucosa minil transferase

Proteínas que se ligam a membrana

celular através da âncora GPI

celular através da âncora GPI

Enzimas

Acetilcolinesterase Acetilcolinesterase

Fosfatase Alcalina Leucocitária ADP-ribosil transferase

Moléculas de adesão

Antígeno associado a função linfocitária - LFA-3 ou CD58 CD66b

CD66b

Proteínas de superfície reguladoras de complemento

D l ti f t DAF CD55 Decay accelerating factor - DAF - ou CD55 Homologous Restriction Factor HRF

Proteínas que se ligam a membrana

celular através da âncora GPI

celular através da âncora GPI

Fc γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16)

Fc-γ Receptor III (Fc γ Rlll or CD16)

Antígeno de diferenciação monocitária (CD14)

Antígenos eritrocitários Antígenos eritrocitários

Yt antigens (AchE) Holley Gregory antigen

Antígenos neutrofílicos

NB1/NB2

Outras proteínas de superfície de função desconhecida

CAMPATH-1 antigen (CDw52) CD24 GP500

CD55 - DAF

Decay Accelerating Factor

Decay Accelerating Factor

P ti i

d

t l d

ti

ã d

Participa do controle da ativação do

Complemento na superfície da célula

Reduz a ação do complexo C4bC2a impedindo

ç

p

p

a ativação de C3

Sua deficiência isoladamente

não

justifica o

quadro clínico

CD59- MIRL Membrane

Inhibitor of Reactive Lysis

Inhibitor of Reactive Lysis

I ib

f

ã d C9

j

l

lt

Inibe a formação de C9 cujo complexo resulta

na lise da célula

Inibe a interação com C8 e C9

Sua inibição resulta em hemólise

Sua reintrodução restaura a resistência ao

Sua reintrodução restaura a resistência ao

Complemento

CD14 - Receptor da proteina que

li

à

d

i

se liga à endotoxina

O LPS (lipopolissacaride da parede

bacteriana) ligada à uma proteina sérica

específica se liga à superfície de

monócitos e macrófagos através deste

receptor.

Este complexo resulta na liberação de

citoquinas TNF-

α IL-4 e IL-6

MOLÉCULAS LIGADAS AO GPI NA CÉLULA HEMATOPOÉTICA HUMANA G.V. PMN Monocitos Plts Linfocitos HSC Reguladoras Complemento CD 55 (DAF) (+) (+) (+) (+) (+) CD 59 (MIRL) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Moléculas de Adesão CD 48 (+) (+) (+) CD 58 (LFA-3) (+) CD66b e CD66c (+) Enzimas Acetilcolinesterase (+) Fosfatase Alc.Leucocitária (+) CD 157 (+) (+) Receptores CD 14 (+) CD 16 (FcγRIII)( γ ) (+)( ) (+) - linf B( ) CD 87 (u-PAR) (+) (+) (+) - linf T Outros CD 52 (+)( ) (+)( ) CD 90 (+) - linf T (+) Proteina Prion (+) (+) (+) (+) (+)

Citometria de Fluxo

Modos de Apresentação

Citometria de Fluxo

Citometria de Fluxo de células HPN

com anti CD59

em eritrócitos

com anti CD59 em eritrócitos

Nú d Número de

Eventos

Tipo I : Normal Células HPN Tipo II

Células HPN Tipo III

anti-CD59 Eritrócitos

(d) Discreta população de Células (d) Discreta população de Células HPN I e HPN II (transição

indistinta)

(e) Células HPN III

Controle isotipo

( )

(f) Células HPN II indistintas das

Células HPN I e HPN III

CD55 e CD59 em Granulócitos

Amostra Controle

CD55 e CD59 em Eritrócitos

Amostra Controle

CD14 em Monócitos

Amostra Controle Atenção !

C t l

Interessante

Interessante

• Pode ocorrer diminuição do percentual de eritrócitos CD55/CD59 negativos devido à hemólise.

• Eritrócitos com CD59 positivos apresentam vida média maior do que os eritrócitos com CD 59 negativos.

A id d d i h óli hi l i ã • A severidade da anemia por hemólise e hipoplasia não

está correlacionada com o percentual de CD59 positivos

Diagnóstico por Citometria de

g

p

Fluxo

G ld S

d

Gold Standart

Praticidade

Praticidade

Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)

Permite trabalhar com leucócitos (meia vida normal)

Eritrócitos: interferentes na avaliação do clone

meia-vida diminuída transfusões

Células HPN na HPN

Expressão variável de antígenos ligados através do GPI em 3 linhagens celulares

CD59

eritrócitos CD59granulócitos CD14monócitos

p g g g Controle normal Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3 Sharon 1996

Interessante

Pacientes com menos de 20% de células anormais

Pacientes com menos de 20% de células anormais

raramente apresentam hemoglobinúria mas podem

ter hemólise e hemossiderinúria.

Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas <5% de

Qualquer ponto de corte é arbitrário, mas 5% de

glóbulos vermelhos tipo HPN não se observa anemia

hemolítica.

Clone de células

HPN III maior que 60%, apresentam

hemoglobinúria, mas às vezes, isto não ocorre por

Indicação de Pesquisa de células

HPN

Pancitopenias

sem causa definida,principalmente

se apresentar reticulocitose

se apresentar reticulocitose

T

b

d

ti ã

d fi id

Tromboses

de repetição sem causa definida

Clone de células HPN em síndromes de

falência medular

Anemia Aplastica HPN Mielodisplasia

11/29 pacientes com Anemia Aplástica (38%) com presença de células HPN.p p ( ) p ç

Schubert J, 1994

Aumento de células HPN em 21 dos 119 pacientes com Anemia Refratária (17,6%)

AR HPN (+) AR HPN (-) P Anormalidades cariotípicas (%) p ( ) 1 / 21 (4.8)( ) 21 / 64 (32.8)( ) .01 Contagem de plaquetas (x 103/μL) _{31 (4-121) 91 (9-126) .01}

Resposta terapêutica a ciclosporina (%) 7 / 9 (77.8) 0 / 8 (0) .002

Progressão para SMD avançada ou

LMA (%) 0 / 21 (0) 4 / 65 (6.2) .57

P i él l HPN t d i t f lê i d d l ó

Wang H, 2002 Blood

Pesquisar células HPN em todos os pacientes com falência de medula óssea antes do tratamento, para auxílio na escolha terapêutica.

Clone de células HPN em

Relação entre HPN e AAA

sindromes de falência medular

• Relação entre HPN e AAA

• Paciente menos hemolítico e mais pancitopenico pode evoluir para AA

• AAA-Doença auto imune orgão específica mediada por linfócitos T citotóxico ativado (CD8) que inibe HSC

• HPN-Expansão de clone de célula T anormalHPN Expansão de clone de célula T anormal

• Tratamento de imunosupressão melhora AAA e HPN • HPN é uma forma de AAA, HPN dano auto imune ao

t ll t ã áti d PIG A stem cell e mutação somática do gene PIG-A

• Mutação do PIG-A pode ser demonstrada em população normal em 10/1.000.000

Pesquisa de HPN

• Exames realizados desde 19/01/2004;

• Até 29/03/2007: 107 solicitações; • 5 casos positivos (4,7%).

• Técnica

• CD 55 – PE / CD59 – FITC (Immunotech) • CD 14 (clone My4) – PE (Coulter)

• CD 64 – FITC (Immunotech) • CD13 PE (B D )

• CD13 – PE (B.D.)

• Glicoforina A (CD235) – PE (Dako)

Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223 233 Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42: 223-233

42: 234-238 – Aug 15, 2000 Pratical Haematology – Dacie JV., Lewis SM

Controle de Qualidade

Controle de Qualidade

• Proficiência através dos interlaboratoriais

• CAP

desde Abril/2006;

-média de 51 laboratórios participantes.

CD55/CD59

• UKNEQAS

UKNEQAS

- desde Novembro/2004;

desde Novembro/2004;

média de 65 laboratórios participantes

CD55/CD59/CD14

CD55/CD59/CD14

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 -

Hemácias

LEFS, 56 anos 08/03/2006

Hemácias

Ausência de expressão antigênica

d CD55 46 5%

Ausência de expressão antigênica

d CD59 34 9% d él l do CD55 em 46,5% do CD59 em 34,9% das células

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 -

Neutrófilos

LEFS, 56 anos 08/03/2006

Neutrófilos

Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 -

Neutrófilos

LEFS, 56 anos 08/03/2006

Neutrófilos

Controle normal: CD59 (+) =

100 0% Ausência de expressão antigênica de 100,0% _{CD59 em 82,7% das células} g

LEFS, 56 anos – 08/03/2006 -

Monócitos

LEFS, 56 anos 08/03/2006

Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99 8% Ausência de expressão do CD14 em

Controle normal: CD14(+) = 99,8% p

RTS, 16 anos – 16/05/2006

Hemácias não realizado pois recebeu

Hemácias -não realizado, pois recebeu

transfusão.

Neutrófilos:

Controle normal: CD55(+) = Ausência de expressão de CD55

Controle normal: CD55(+) =

99,0%

Ausência de expressão de CD55 em 5,7% dos neutrófilos

RTS, 16 anos – 16/05/2006 -

Neutrófilos

RTS, 16 anos 16/05/2006

Neutrófilos

RTS, 16 anos – 16/05/2006 –

Monócitos

RTS, 16 anos 16/05/2006

Monócitos

Controle normal: CD14(+) = 99 0% Ausência de expressão do CD14 em

Controle normal: CD14(+) = 99,0% Ausência de expressão do CD14 em 14,3% das células CD64+.

HPN – Acompanhamento e

T

ê i

Terapêutica

• Tratamento de suporte: p

Ácido fólico, ferro suplementar se necessário Transfusão

C ti óid t

Corticóide – controverso

profilaxia com anticoagulante em caso de trombose

trombose

terapia trombolítica (tPA)

• Transplante e terapia imunosupressora - ATG e ciclosporina • Eculizumab – inibe a ativação do complemento (C5)

reduz hemólise intravascular, diminui hemoglobinuria e diminui a necessidade de transfusão

Raiola AM, Van Lint MT, Lamparelli T. Haematologica 85 (1): 59-62 -2000.

Conclusões

Conclusões

O estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de O estudo de proteínas dependentes de GPI pela técnica de citometria de fluxo é o método de escolha para o diagnóstico de HPN devido à maior sensibilidade.

As proteínas mais estudadas são o CD55 e CD59 em granulócitos e eritrócitos e CD14 em monócitos.

A CMF permite a detecção de quantidades pequenas de células com deficiência parcial ou total das proteínas

células com deficiência parcial ou total das proteínas dependentes de GPI,

M ó i h líti d li

Mesmo após crises hemolíticas severas, pode-se analisar a ausência de expressão na população de leucócitos.

•

EQUIPE

•

Ana Claudia M Brito

•

Ana Claudia M. Brito

João Carlos C Guerra

•

Nydia Strachman Bacal

y

•

Alexandra M.Cavalcante

•

Ruth Hissae Kanayama

•

Sonia Tsukasa Nozawa

• Obrigada !

•

nsbacal@einstein.br

Gene PIG-A