SIMONY DAVET MÜLLER
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE EDUCAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
SIMONY DAVET MÜLLER
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E
FLAVONÓIDES ATRAVÉS DE CLAE E UV DE
EXTRATOS DE
Passiflora alata
CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.
____________________________________
Maique Weber Biavatti, Dra
Orientadora
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:______________________________________
Maique Weber Biavatti, Dra
Presidente
______________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
______________________________________
Cid Aimbiré de Moraes Santos, Dr.
DEDICATÓRIA
Ao José Luis e ao nosso bebê, pelo amor, incentivo e paciência. A Deus.
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora Dra Maique Weber Biavatti pela dedicação e confiança que depositou em mim ao longo destes anos.
Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho, Dr. Cid A. M. Santos e Dr.
Franco Della Monache pela disponibilidade de alguns padrões.
Ao Prof. MSc Renê Artur Ferreira pela coleta da Passiflora alata no Campus de Ilhota SC. Ao Prof. Dr. Armando Cervi pela identificação e registro da planta.
Agradeço as bolsistas Michelly e Sônia do Programa Integrado de Pós
Graduação e Graduação (PIPG) pelo esforço e dedicação.
Ao LAPAM, em especial Luciana e Roberta, pelo incentivo, compreensão,
amizade e auxílio no desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu marido José Luis pelo amor e compreensão.
A minha mãe, minha irmã Sabrina e meu irmão Odilon pela confiança e
incentivo.
Ao meu querido pai que já cumpriu sua missão aqui na Terra.
Aos meus amigos David, Rita, Bia, Anilson, Maria e Aldry pelo
companheirismo, amizade e carinho.
Aos amigos dos Laboratórios de Farmacognosia e Instrumentação
Analítica/UNIVALI, onde uma parte do trabalho foi conduzida.
À Pró-Reitoria de Pesquisa e Coordenação do Programa de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas pelos auxílios concedidos.
À secretária do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas,
Rosélia, pela eficiência e amizade.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva para
realização deste trabalho.
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas
"DETERMINAÇÃO DE ALCALÓIDES E FLAVONÓIDES
ATRAVÉS DE CLAE E UV DE EXTRATOS DE Passiflora
alata CURTIS, Passifloraceae - MARACUJÁ-DOCE".
Simony Davet Müller
Fev/2006 Orientadora: Maique Weber Biavatti, Dra
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas
Palavras-chave: Passiflora, flavonóides, controle de qualidade, alcalóides, CLAE Número de Páginas: 86.
As folhas de Passiflora alata Curtis, (espécie oficial da Farmacopéia Brasileira) são
utilizadas como medicamento contra ansiedade, como antiespasmódico e sedativo. O desenvolvimento de metodologias analíticas para análise de flavonóides e alcalóides em espécies de Passiflora é de suma importância, para o controle de qualidade da planta e extratos fitomedicinais derivados. O estudo sobre perfil de flavonóides e alcalóides em folhas e extrato fluido de P. alata contendo isovitexina foi realizado através de CLAE, comparando seus perfis cromatográficos com extrato fluido de P. incarnata comercial e tintura de P. actinia. Adicionalmente, a concentração total de flavonóides em extratos e folhas foi realizada através de doseamentos Farmacopéicos. O extrato de P. alata foi produzido de acordo com a Farmacopéia Helvetica (1987), de P. incarnata foi obtido comercialmente e de P. actinia de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1926). Na análise dos flavonóides em CLAE verificou-se presença de isovitexina em P.
alata: no extrato farmacopéico coletado em janeiro e agosto/2001 (0,018 e 0,007% m/m) e no
extrato sob refluxo coletado em janeiro e agosto/2001 (1,137 e 0,018% m/m); em P. actinia: no extrato farmacopeico (0,028% m/m) e no extrato sob refluxo (0,631% m/m) e no extrato comercial de P. incarnata (1,198% m/m) sendo o flavonóide majoritário. A vitexina foi encontrada em P. alata (traços), P. incarnata (0,312% m/m) e ausência dos outros flavonóides marcadores testados: orientina, swertisina, hirerosídeo e rutina. O método desenvolvido em CLAE demonstrou ser adequado e diferenciou as espécies estudadas podendo ser aplicado à amostras comerciais. As análises espectrofotométricas baseadas em metodologias Farmacopéicas para P. incarnata, mostraram resultados diferentes em relação ao flavonóide quantificado isovitexina. Sendo que a metodologia da Farmacopéia Britânica apresentou melhor resultado. Não foi detectada a presença de alcalóides β-carbolínicos clássicos testados (harmana, harmina, harmol, harmalol e harmalina) nos extratos e folhas de P. alata .
Abstract of Dissertation (Thesis) presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Pharmaceutical Sciences
LC AND UV DETERMINATION OF ALCALOID AND
FLAVONOID Passiflora alata CURTIS, Passifloraceae
EXTRACTS
Simony Davet Müller
Fev/2006Advisor: Maique Weber Biavatti, Dra.
Area of Concentration: Natural Products.
Keywords: Passiflora, flavonoids, quality control, alkaloids, HPLC Number of Pages: 86.
Leaves of Passiflora alata Curtis (official species in the Brazilian Pharmacopoeia) are employed for anxiety, as antispasmodic and sedative. The development of new analytical methodologies for the analysis of flavonoids and alkaloids in Passiflora species are needed in order to improve the quality assurance of the plant and derived extract and phytomedicines. A survey on the flavonoids and alkaloids profile and content of isovitexin in leaves and fluid extract of P. alata through LC was made, comparing its chromatographical profiles with a commercial P. incarnata fluidextract and P. actinia tincture. Additionally, the concentration of the total flavonoids of extracts and leaves according to phamarcopoeial photometrical method was determined. The fluidextract of
P. alata was produced in accordance with the Pharmacopoeia Helvetica, tincture of P. actinia as
produced in accordance to the Brazilian Pharmacopoeia method. The presence of isovitexin in the species (which have distinct chromatographic profiles) was evidenced, which is the major flavonoid compound in the P. incarnata comercial extract (1.198% w/w), but not in P. alata (0.018 summer e 0.007 winter % w/w) fluidextract and leaves (1.137 e 0.018% w/w) P. actinia (0.028 extract and leaves 0.631% w/w). Just traces of vitexin could be observed in the P. alata and P. incarnata (0.312% w/w) and absence of the other tested flavonoids orientin, swertisin, hyperoside and rutin. The LC developed method demonstrated to be adjusted for the qualitative and quantitative analyses and to differentiate species, appropriate to be applied to commercial sample analysis. The flavonoids spectrophotometrical results of three different methods described to P. incarnata were not comparable, the most suitable performance was verified to the British Pharmacopoeia method. None of the classical beta-carbolinic alkaloids tested were found in the P. alata leaves and medicinal extracts: harmane, harmine, harmol, harmalol, harmaline.
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO...
1 2 OBJETIVOS... 5 2.1 Objetivo Geral... 5 2.2 Objetivos Especificos... 5 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 6 3.1 Gênero Passiflora... 6 3.1.1 Considerações botânicas... 6 3.1.2 Considerações químicas... 103.2 Controle de Qualidade de Passiflora... 15
3.3 Considerações Farmacológicas... 18
4
MATERIAL E MÉTODOS...
234.1 Material Botânico... 23
4.2 Padrões e Solventes... 23
4.3 Métodos para Obtenção de Extratos... 24
4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides ... 24
4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides... 25
4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides...
26
4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides... 26
4.4. Cromatografia em Camada Delgada (CCD)... 29
4.4.1 Investigação de flavonóides segundo Farmacopéia Brasileira... 29
4.4.2 Investigação de alcalóides segundo Farmacopéia Brasileira... 29
4.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)... 30
4.5.1 Instrumentação... 30
4.5.2
Preparo das amostras para pesquisa de flavonóides C-glicosilados
e alcalóides... 304.5.3 Condições cromatográficas para pesquisa de flavonóides C-glicosilados... 30
4.5.4 Curva de calibração para doseamento de isovitexina em CLAE... 32
4.5.5 Curva de calibração para doseamento de vitexina em CLAE... 33
4.5.6 Condições cromatográficas para pesquisa de alcalóides β-carbolínicos. 33 4.6 Validação Analítica... 34
4.6.1 Linearidade e intervalo... 35
4.6.2 Ensaio de exatidão... 35
4.6.4 Limite de quantificação... 36
4.7 Doseamento do Teor de Flavonóides Totais em UV... 37
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES... 41
5.1 Obtenção dos Extratos Hidroalcoólico e Fracionados para Pesquisa de Flavonóides e Alcalóides... 41
5.2 Cromatografia em Camada Delgada (CCD)... 41
5.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)... 45
5.4 Análise Quantitativa Através de CLAE... 52
5.5 Análise Quantitativa Através de CLAE (Sistema Isocrático)... 62
5.6 Validação Analítica... 64
5.7 Doseamento Espectrofotométrico do Teor de Flavonóides Totais... 66
5.8 Pesquisa de Alcalóides Através de CLAE... 70
6
CONCLUSÕES...
787 REREFÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 80
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da planta... 8
Figura 2: Foto Passiflora incarnata Lineau, mostrando a inflorescência e o fruto da planta... 9
Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker; mostrando a inflorescência da planta... 9
Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos... 28
Figura 5: Fluxograma do método descrito por PETRY et al. (1998)... 38
Figura 6: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA BRITÂNICA, (2000)... 39
Figura 7: Fluxograma do método descrito pela FARMACOPÉIA HELVÉTICA (1987)... 40
Figura 8: CCD do extrato hidroalcoólico total de P. alata... 42
Figura 9: Cromatografias em camada delgada das amostras: A- Extrato hidroalcoólico de
P. alata, B- Tintura Farmacopeica de P. actinia, C- Extrato hidroalcoólico
comercial de P. incarnata e os respectivos padrões 1-vitexina, 2-rutina e
3-quercetina... 43
Figura 10: Cromatogramas, da sobreposição do extrato fluido de P. alata coletadas em Janeiro/2001 com o extrato fluido das folhas coletadas em Agosto/2001... 46
Figura 11: Cromatogramas das três espécies de Passiflora: a) P. alata, b) P. actinia e c)
P. incarnata... 51
Figura 12: Esquema mostrando degradação microbiana de flavonóides... 54
Figura 13: Cromatogramas de: a) Extrato fluido de P. alata (A)... 56
Figura 14: Cromatograma de Extrato fluido de P. alata (A) e espectro de UV de: 1-isovitexina... 57
Figura 15: Cromatograma da co-injeção de padrões 1-isovitexina + 2-vitexina e espectro de 1-isovitexina... 57
Figura 16: Cromatogramas de: b) Tintura de P. actinia
(T)... 58
Figura 17: Cromatograma de P. actinia (T) e espectro de UV de: 1-isovitexina... 59
Figura 18: Cromatograma da co-injeção dos padrões: 1-isovitexina+2-vitexina e espectro
1-isovitexina... 59
Figura 19: Cromatogramas de: b) Extrato fluido de P. incarnata (C) e padrões... 60
Figura 20: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 2- vitexina... 61 Figura 21: Cromatograma de extrato fluido de P. incarnata (C) e espectro de UV de: 1-isovitexina... 61 Figura 22: Cromatogramas de P. incarnata (C), co-injeção dos padrões e espectro de UV de: 2- vitexina... 61
Figura 23: Curva de calibração de isovitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340 nm... 65
Figura 24: Curva de calibração de vitexina (padrão secundário) em MeOH 50% a 340 nm... 65
Figura 25: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos... 71
Figura 26: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos... 72
Figura 27: Cromatograma da mistura dos padrões ß-carbolínicos... 72
Figura 28: Espectros de UV dos padrões de alcalóides... 73
Figura 29: Comparação dos cromatogramas do extrato fluido (A) e dos padrões (B)... 74
Figura 30: Comparação dos cromatogramas do extrato a quente (A), extrato a frio (B) e padrões (C)... 75
Figura 31: Comparação dos cromatogramas do extrato I (A), extrato II (B), padrões (C)... 77
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sistema gradiente (1): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH= 2,88 e B = Metanol, fluxo de 0,5 mL/min... 31 Tabela 2: Sistema gradiente (2): A = Água - ácido acético (100:0,5) pH 2,88, B) =
Metanol e C = Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min... 31 Tabela 3: Sistema gradiente (3): A = Acetonitrila - água (110:660); B = Acetonitrila -
água (120:180), fluxo de 1 mL/min... 32 Tabela 4: Sistema Gradiente (4): A = água - ácido acético 0,5 % (m/v); B = Metanol; C
= Acetonitrila, fluxo de 1 mL/min... 32 Tabela 5: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min... 34 Tabela 6: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min... 34 Tabela 7: Sistema Gradiente: A = acetonitrila, B = metanol e C = tampão fosfato (pH
8,0), fluxo de 0,8 mL/min... 34 Tabela 8: Ensaio de Recuperação do método... 36 Tabela 9: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas de P. alata
...
47
Tabela 10: Tempo de retenção relativo aos flavonóides investigados nos extratos de P.
alata, P. actinia e P. incarnata... 50
Tabela 11: Tempo de retenção referente aos flavonóides investigados nos extratos de P.
alata, P. actinia e P. incarnata... 50 Tabela 12: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide isovitexina e teor de
flavonóides totais em UV das preparações extrativas das três espécies de
Passiflora... 55 Tabela 13: Teor encontrado através de CLAE do flavonóide C-glucosilado
vitexina... 63 Tabela 14: Resultados do Ensaio de Recuperação do método... 66
SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E FÓRMULAS
ºC graus Celsius °GL Gay Lussac % porcentagem µg micrograma µm micrômetro µL microlitro Abs absorbânciaAlCl3 cloreto de alumínio
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BZD benzodiazepínico
CA campo aberto
CCD cromatografia de camada delgada CLAE cromatografia líquida de alta eficiência DL 50 dose letal 50%
g grama
H2O água
HPLC High performance liquid chromatrography i.p. intra peritonial
k fator de retenção
LC Liquid chromatrography
LCE Labirinto em cruz elevado
L. Lineau LQ Limite de Quantificação m massa mL mililitro min minuto nm nanômetro P. A. pureza analítica
PDA Photo Diode Array
PIPG Programa Integrado de Pós-graduação e Graduação
p/v peso/volume
R reagente
v/v volume/volume
USP United States Pharmacopeia
1 INTRODUÇÃO
O uso das espécies vegetais, com fins de tratamento de doenças e
sintomas, remota ao momento em que o homem despertou para consciência, e
começou um longo percurso de manuseio, adaptação e modificação dos recursos
naturais para seu próprio benefício (DI STASI, 1996; MARTINS; CASTRO;
CASTELLANI, 1994). Esta prática milenar, atividade humana por excelência,
ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo evolutivo e chegou
até os dias atuais, sendo amplamente utilizada por grande parte da população
mundial como fonte de recurso terapêutico eficaz (DI STASI, 1996).
As plantas são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas,
muitas das quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número
de medicamentos. Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem
os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função
biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela
derivada dos processos de síntese, que apesar dos avanços tecnológicos atuais,
ainda é restrita. Esse fato possibilita que os compostos químicos presentes nas
plantas possam vir a se tornar fármacos em potencial para as mais diferentes
moléstias (NODARI et al., 2000).
O conhecimento da biodiversidade vegetal, além de ser considerado uma
fonte de modelos químicos para a síntese de novas moléculas, também deve ser
incentivado como um recurso natural com possível atividade na forma de
fitoterápico padronizado, eficiente e seguro. Dentre as várias plantas com
atividade farmacológica conhecida, destacam-se algumas espécies do gênero
Passiflora, conhecido popularmente no Brasil como maracujá, cujas partes aéreas
são tradicionalmente empregadas por suas propriedades sedativas,
antiespasmódica e ansiolítica (NODARI et al., 2000).
Das quatrocentas espécies conhecidas de Passiflora, trinta são descritas
por terem frutos comestíveis. Somente poucas espécies alcançaram
desenvolvimento comercial e dentre estas as mais conhecidas são Passiflora
edulis Sims, de casca roxa e P. edulis f. flavicarpa Degener, com casca amarela
(SCHMIDT et al., 1995). Esta última é conhecida vulgarmente por maracujá
amarelo, e representa a forma mais cultivada em escala comercial no Brasil. São
também difundidas em nosso país, embora não na mesma escala: Passiflora
edulis Sims (maracujá roxo), Passiflora alata Curtis (maracujá doce), Passiflora
quadrangularis L., Passiflora caerulea L. e Passiflora laurifolia L. (FREITAS, 1985;
SOUZA e MELETTI, 1997).
Entre as inúmeras espécies de Passiflora nativas do Brasil, encontra-se no
estado do Paraná Passiflora actinia Hooker, espécie com poucos estudos
químicos e farmacológicos foram realizados até o presente. Reginatto (2000),
comparando por cromatografia em camada delgada, sete extratos de espécies de
Passiflora, identificou manchas com Rf semelhante aos padrões dos flavonóides
de isoorientina e isovitexina em P. actinia. Em 2001, Kurtz demonstrou a presença
de traços do alcalóide harmana na mesma espécie. Santos, (2003) demonstrou
que o extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia administrado em camundongos, em
doses inferiores a 1.800 mg/kg, não resultou em toxicidade aparente e através dos
métodos de labirinto em cruz elevado e campo aberto, foi observado um efeito
sedativo com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato
metanol-água.
A espécie Passiflora incarnata L. é nativa dos Estados Unidos, onde é
muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho”
(SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos
secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997), não tendo grande
difusão no Brasil em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al.,
1997). As partes aéreas da planta têm sido usada tradicionalmente para o
tratamento da ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
O uso de Passilfora decorrente de suas propriedades sedantes iniciou-se
no século XVII na Europa, mas os estudos farmacológicos sobre P. incarnata L.
começaram a aparecer a partir do século XIX (HOEHNE, 1939). Graças às
propriedades sedantes e devido à presença de flavonóides C-glicosilados e de
alcalóides do tipo harmana, a P. incarnata L. consta em monografias das
Farmacopéias Francesas (Pharmacopée Française, 1980), Européia (European
Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética
(Pharmacopoeia Helvetica, 1987) e italiana (Farmacopoea Ufficiale Della
Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do
Brasil e desta forma a Farmacopéia Brasileira (Farmacopéia Brasileira, 1977)
elegeu como oficial a P. alata Curtis, apesar desta ainda ser pouco estudada. As
flores grandes e de cor carmim intensa e os frutos comestíveis, de sabor muito
doce, fizeram com que esta espécie se disseminasse muito e fosse bastante
apreciada para o consumo natural, sendo reconhecida vulgarmente como
maracujá-doce (SOUZA e MELETTI, 1997).
Oga et al. (1984); Pereira e Vilegas, (2000); relatam a escassez de literatura
e informações científicas relacionadas com P. alata, o que desperta o interesse e
a necessidade de estudar esta espécie brasileira mais detalhadamente para no
futuro, estabelecer parâmetros mais sólidos em relação à atividade farmacológica
e à composição química correspondente assim como a descrição dos caracteres
microscópicos das espécies aqui encontradas com facilidade e com abundância.
Moraes, Vilegas e Lanças (1997) estudaram várias espécies de Passiflora
incluindo a P. alata, através da observação dos perfis cromatográficos das
amostras comerciais destas espécies. Foi possível ter uma idéia preliminar
somente de flavonóides da espécie comercializada, através de Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE), mas para sua identificação completa é
necessário possuir dados botânicos e identificação dos alcalóides também.
O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma metodologia
validada por CLAE para a determinação qualitativa e quantitativa de flavonóides e
alcalóides em P. alata comparando com os extratos das espécies P. actinia e P.
incarnata. O desenvolvimento desta metodologia poderá ser útil para aplicação no
controle de qualidade, uma vez que a validação de métodos analíticos aplicados
às drogas vegetais ainda é o ponto chave para se obter extratos padronizados.
Este trabalho pretende contribuir ao conhecimento da espécie medicinal brasileira
que é largamente utilizada para ansiedade, como antiespasmódico e sedativa
(ZUANAZZI, 2001).
2 OBETIVOS GERAIS E ESPECÍFICOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar através de CLAE a presença de flavonóides e alcalóides nas folhas e nas preparações extrativas de Passiflora alata Curtis, Passifloraceae.
2.2 Objetivos Específicos
Desenvolver métodos cromatográficos (CLAE), qualitativos e quantitativos para controle de qualidade de extratos de Passiflora sp;
Avaliar qualitativamente e quantitativamente os extratos medicinais
produzidos no Laboratório de Farmacognosia da UNIVALI, com relação as
folhas coletadas em janeiro e agosto;
Avaliar quantitativamente o teor de flavonóides totais por espectrofotometria de ultravioleta (UV), nas folhas e nas preparações extrativas de P. alata .
Comparar os teores de flavonóides e alcalóides através de UV, CLAE bem como os perfis cromatográficos de P. alata com P. incarnata e P. actinia.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Gênero Passiflora
A família Passifloraceae compreende cerca de vinte gêneros e seissentas
espécies, distribuindo-se principalmente nas Américas e na África (BARROSO,
1978). São plantas escadentes, herbáceas ou lenhosas e possuem gavinhas, as
quais são ramos modificados, podendo ainda ser detectada a presença de
nectários extraflorais (BARROSO, 1978).
O gênero predominante nessa família é Passiflora, representado por aproximadamente quatrocentas espécies, cujo nome é atribuído ao significado místico das características físicas de suas flores, nas quais os escritores do século XVI interpretaram suas diferentes partes como representando os símbolos da Paixão de Cristo. Por esta razão, esses vegetais são conhecidos na Europa e América do Norte como flor-da-paixão (BARROSO, 1978; FREITAS, 1985).
Algumas espécies de Passiflora são cultivadas por seus frutos comestíveis, principalmente na forma de sucos e refrescos. A forma de maracujá comestível, o maracujá amarelo, cultivada em escala comercial é Passiflora edulis Sims forma flavicarpa Deg. Também muito difundida no Brasil em menor escala temos a Passiflora alata (Dryander) Curtis, Passiflora quadrangularis L.,
Passiflora caerulea L. e Passiflora caurifolia L. (FREITAS, 1985).
3.1.1 Considerações botânicas
Passiflora alata Curtis
A Passiflora alata (Figura 1) é uma trepadeira com gavinhas, de caule quadrangular com ângulos levemente alados. Estípulas foliáceas, verdes, com até 2 cm de comprimento. Folhas alternadas, simples, oval ou oblonga, de 10 a 16 cm de comprimento por 8 a 11 cm de largura, membranácea, glabérrima, de cor verde-escura na página superior, mais pálida na inferior, uninérvia e arqueado-venosa, com as nervuras salientes em ambas as faces, principalmente na inferior; suas margens são inteiras e hialino-cartilagíneas. O pecíolo mede geralmente cerca de 3 cm de comprimento e é profundamente caniculado na parte superior, apresenta 2 a 4 glândulas sésseis nas margens, dispostas aos pares e convexo na parte inferior, que é carenada. Flores
vistosas hermafroditas, actinomorfas, pentâmeras, solitárias nas axilas das folhas, perfumadas, tendo em média 10 a 12 cm de diâmetro. Sépalas e pétalas camosas, avermelhadas internamente. Corola bisseriada, a série externa muito mais longa, com filamentos listados de branco e roxo, série interna muito curta, dentiforme. Fruto ovóide a periforme, com até 10 cm de comprimento e 6 cm de largura, amarelo quando maduro (OLIVEIRA; AKISUE, 1998; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1977).
A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas encontra-se largamente distribuída em várias regiões. Conforme a região considerada, recebe os mais diversos nomes populares, tais como guaçú, guasú, de-refresco, maracujá-doce, maracujá-comprido ou, simplesmente, maracujá. Esta espécie é muito semelhante a
Passiflora quadrangularis L. (maracujá-mamão, maracujá-assú, maracuja-uaçú), que pertence ao
mesmo sub-gênero e série respectivamente, Granadilla e Quadrangulares; as vezes é difícil distingui-las a primeira vista, mas ambas apresentam detalhes de organização floral e foliar que as caracterizam. A P. alata pode ser também confundida com Passiflora macrocarpa (maracujá-melão), mas novamente, é possível reconhecê-las pela organização foliar e floral. Para alguns botânicos, P. macrocarpa Mast. é sinonímia de P. quadrangularis L. (FREITAS, 1985; DE OLIVEIRA et al., 1980)
Outros usos farmacêuticos incluem preparações fitoterápicas, como sedativo no tratamento de nevralgias, insônia, histeria, epilepsia e ataques nervosos (CORRÊA, 1984). O extrato de maracujá é usado como componente flavorizante em bebidas alcoólicas e não alcoólicas e em sobremesas frias. Suas sementes são doces e acídulas, muito apreciadas para a fabricação de refrigerantes e sucos (CORRÊA, 1984).
Figura 1: Foto Passiflora alata Curtis, mostrando a inflorescência e o fruto da planta. Fonte:
www.herbmed.org/herbs/passifloraalata.
A espécie P. incarnata L. (Figura 2) é nativa dos Estados Unidos, onde é muito cultivada e conhecida como “wild passion flower” ou “maracujá-vermelho” (SOUZA e MELETTI, 1997). Esta espécie cresce preferencialmente em solos secos e pobres (Rehwald et al., 1995; Soulimani et al., 1997) não tendo grande difusão no Brasil, em parte devido ao amargor da polpa do fruto (MORAES et al., 1997). As partes mais utilizadas são as folhas, sendo estas trilobadas com comprimento de 6 a 15 cm e largura de 5 a 12 cm (Souza e Meletti, 1997). As partes aéreas da planta têm sido usadas tradicionalmente para o tratamento de ansiedade, ataques nervosos e nevralgia (SOULIMANI et al., 1997).
A P. incarnata L. consta em monografias das Farmacopéias Francesas (Pharmacopée Française, 1980), Européia (European Pharmacopoeia, 1996), DAB 10 (Deutsches Arzneibuch, 1992 ), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e italiana (Farmacopoea Officiale Della Republica Italiana, 1998). Porém esta espécie não se adapta bem ao clima do Brasil.
Figura 2: Foto Passiflora incarnata L. mostrando a inflorescência e o fruto da planta. Fonte:
www.exot-nutz-zier.de/images/ prod_images/Pass...
Passiflora actinia Hooker
A P. actinia (Figura 3), embora sendo uma espécie nativa da região Sul do Brasil, encontram-se poucos estudos sobre a mesma. Kurtz et al. (2001) em um estudo morfoanatômico e investigação de constituintes alcaloídicos da espécie através de CLAE, relatou que as folhas apresentam um contorno oval, margem lisa, ápice obtuso, base arredondada e limbo inteiro. Observou também que a face abaxial da epiderme é papilosa, o mesófilo é dorsiventral, os feixes vasculares são colaterais e idioblastos contendo drusas estão distribuídos no parênquima foliar. Na análise de alcalóides encontrou a presença de traços de harmana.
Figura 3: Foto Passiflora actinia Hooker mostrando a inflorescência da planta. Fonte:
www.passionflow.co.uk/ actinia1.htm
3.1.2 Considerações químicas
Os estudos referentes à composição química de diversas espécies de Passiflora evidenciam, principalmente, os alcalóides e flavonóides. Entretanto, outras substâncias como saponinas, glicosídios cianogênicos, esteróides, lignanas, ácidos graxos, maltol, aminoácidos e taninos, também são citados freqüentemente na literatura (ALONSO, 1998; REGINATTO, 2000; REGINATTO et al., 2001).
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural (ZUANAZZI, 2001). São particularmente importantes para o controle de qualidade de fitoterápicos, pois através deles é possível identificar muitas espécies de
Passiflora (QUERCIA et al., 1978).
Diversas funções são atribuídas aos flavonóides nas plantas. Entre elas podemos citar: proteção dos vegetais contra incidência de raios ultravioleta e visível, além de proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias; atraentes de animais com finalidade de polinização; antioxidantes; controle de ação de hormônios vegetais; agentes alelopáticos e inibição de enzimas. Podem também ser usados como marcadores taxonômicos e isto é devido sobretudo a sua abundância relativa em quase todo o reino vegetal, especificidade em algumas espécies, relativa estabilidade e seu acúmulo com menor influência do meio ambiente (ZUANAZZI, 2001).
Os flavonóides de origem natural apresentam-se freqüentemente oxigenados e um grande número ocorre conjugado com açúcares. Essa forma conjugada, também conhecida por glicosídeos, pode ser formada pela ligação de um ou mais açúcares aos grupos hidroxilas por ligação hemiacetal facilmente destruída por hidrólise ácida. Outra forma de conjugação de açúcares ao núcleo flavônico é por meio de ligação açúcar-genina entre carbonos C-1 (anomérico) do açúcar e um ou dois carbonos do anel A do flavonóide (C-glicosídeo). Quando o metabólito encontra-se sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também denominado de forma livre (ZUANAZZI, 2001).
Na Passiflora os flavonóides encontrados são do tipo C-glicosilados, possuem atividade biológica e são de interesse quimiotaxonômico e freqüentemente são utilizados como “marcadores” na análise de medicamentos fitoterápicos. Esses flavonóides C-glicosilados são menos solúveis em acetato de etila do que as agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após hidrólise (PEREIRA; VILEGAS, 2000).
Oga et al. (1984) encontraram os flavonóides orientina (1), isoorientina (2) vitexina (3), isovitexina (4), e rutina (5) em P. alata através de CCD. Freitas (1985) realizou um estudo dos
flavonóides glicosídeos de P. incarnata, P. edulis, P. alata e P. quadrangulares, através de CCD e verificou a presença de quatro flavonóides principais nestas espécies identificados como: vitexina, isovitexina, orientina e isoorientina.
Vários estudos relatam a presença dos seguintes flavonóides em P. incarnata: C-glicosil schaftosídio, isoschaftosídio, isovitexina-2´-O-glucopiranosídeo, orientina, isoorientina, isoorientina-2´-O-glucopiranosídio, swertisina (6), isoscoparin-2”-O-glicosídio quercetina e kaempferol (PROLIAC et al., 1988; LI et al., 1991; RAHMAN et al., 1997).
Em folhas de P. sexflora, McCormick e Mabry (1992) encontraram seis di-C-glicosilflavonas: lucenina-2, carlinosídeo, isoviolantina, schaftosídeo, vicenina-1 e isochaftosídeo e seis mono-C-glicosilflavonas: orientina, isoorientina, isoswertiajaponina e isoswertisina. Em adição,
luteolina-7-O-glucosídeo, luteolina e uma aurona (sufulrentina), também foram identificadas.
Ulubelen et al. (1982) pesquisaram três espécies de Passiflora e relataram a presença dos seguintes compostos: C-glucosídeo isovitexina, 2”-xilosilvitexina, luteolina-7-O-glucosídeo e uma mistura de vicenina-2, schaftosídio e isochaftosídeo em folhas de P. pittieri. A partir de P. alata, os autores obtiveram 2”-xilosilvitexina, vitexina, isovitexina e orientina. Saponarina foi encontrado somente em P. ambigua.
Os estudos em relação aos flavonóides de Passiflora relatam que os mesmos são derivados da luteolina (7) e apigenina (8) (GEIGER et al., 1986). Alguns flavonóides detectados com maior freqüência no gênero Passiflora são os seguintes: orientina, homoorientina, isovitexina, vitexina, schaftosídeo e swertisina (6) (PEREIRA et al., 2000).
Souza, Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando CLAE, fase isocrática, para quantificar flavonóides isolados ou compostos em matrizes biológicas complexas, sendo que o mesmo demonstrou um excelente desempenho em separar os flavonóides quercetina, luteolina e 3-O-metilquercetina em extratos de Achyrocline satureioides.
Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e P. incarnata com base nos flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico destas três espécies permite diferenciá-las através da CLAE.
Dhawan et al. (2001) consideraram os flavonóides como o maior grupo de constituintes já pesquisados no gênero Passiflora.
O
Glu
O
H
OH
O
OH
vitexina
O
O
H
OH
O
OH
Glu
isovitexina
O
OH
O
OH
O
H
OH
Glu
isoorientina
(1)(2)
O
Glu
O
H
OH
O
OH
OH
orientina
Os alcalóides já encontrados no gênero Passiflora são do tipo indólico simples, derivados do sistema ß-carbolina, conhecidos como ß-carbolinas ou alcalóides ß-carbolínicos (CORDELL, 1981; DEWICK, 1997). Vários alcalóides indólicos possuem atividade biológica comprovada, sendo que muitos têm valor na medicina como tranqüilizante e no tratamento da hipertensão (Cordell, 1981; Harbone, Baxter, 1995), geralmente essa ação é mediada pela sua interação com um ou mais receptores específicos.
Muitos dos alcalóides ß-carbolínicos são substituídos em C-1 por um grupo metila, como por exemplo harmana (8) (CORDELL, 1981).
O
O
H
OH
O
OH
OH
O glu-rha
rutina
O
OH
O
OH
Glu
O
C
H
3swertisina
O
OH
O
OH
O
H
apigenina
O
OH
O
OH
O
H
OH
luteolina
(5) (6) (7) (8)Fellows et al. (1938) foram os primeiros autores a pesquisarem alcalóides em P. incarnata, porém o extrato clorofórmico da mesma, frente aos reativos gerais para alcalóides (Mayer e Wagner), não apresentou reação positiva.
Entre 1954-1956, Neu, citado por Souza (1997), isolou o alcalóide harmana a partir de partes aéreas de P. incarnata e posteriormente detectou a mesma substância em P. edulis e P.
quadrangularis.
Estudos realizados com P. incarnata durante a década de 1960 detectaram, através de análises cromatográficas e espectroscópicas, os alcalóides harmana (8), harmol (9), harmalol (10), harmalina (11) e harmina (12) (LUTOMSKI, 1959; LUTOMSKI, 1960; LUTOMSKI, 1967; BENNATI
et al., 1968; LUTOMSKI et al., 1968; BENNATI, 1971).
Rehwald et al. (1985) desenvolveram uma metodologia analítica para a detecção de alcalóides em P. incarnata que consistia na extração, purificação, concentração e posterior análise em CLAE da fração alcaloídica. Essa técnica foi sensível à detecção de harmana, harmina, harmalina, harmol e harmalol, porém em quinze amostras comerciais analisadas, somente uma apresentou traços de harmana.
Segundo Bennati (1967), harmana, harmina e harmalina são alcalóides presentes no extrato fluido de P. incarnata sendo que o isolamento e separação foram possíveis mediante extração etérea. O comportamento cromatográfico com padrões de alcalóide foi característico e permitiu reconhecimento comparando-se com extrato fluido de Passiflora em preparação farmacêutica complexa.
Estudos com P. incarnata detectaram os alcalóides: harmana, harmina,
harmalina, harmol, harmana e harmalol, sendo que foi utilizado o método de
Cromatografia de Camada Delgada (BENNATI, 1971).
Oga et al. (1984) relatam apenas o teor de alcalóides expresso em harmana de P. alata, sendo que encontrou 0,217 mg % de alcalóides, no extrato seco das folhas.
Pereira e Vilegas (2000) relatam que contradições e variações dos valores de teor de alcalóides encontrados na literatura devem-se em parte as diferentes metodologias aplicadas, e também pode-se considerar os órgãos empregados, a época e o local de colheita.
N
N
CH
3H
harmana
N
N
CH
3H
O
H
harmol
N
N
CH
3H
O
H
harmalol
N
N
CH
3H
O
C
H
3harmalina
(8)
(9)
3.2 Controle de Qualidade de Passiflora
O nome vulgar “maracujá”, de origem tupi-guarani, é empregado para designar uma série de espécies vegetais pertencentes ao gênero Passiflora. As diversas empresas que comercializam drogas vegetais obtidas a partir destas espécies freqüentemente enfrentam dificuldade na identificação destes materiais.
Com freqüência, tais empresas adquirem-nas de coletores preocupados única e exclusivamente com a atividade extrativa, sem interesse no cultivo da espécie medicinal, bem como, indiferentes à época da colheita e ao processo de transformação adequada das partes vegetais em droga. Por isso, muitas vezes, a droga comercializada no Brasil é de baixa qualidade e não raro apresenta-se fraudada. Com referência a este último fato é conveniente acrescentar que o problema é bem mais amplo e diz respeito de uma maneira geral á maior parte das drogas aqui comercializadas (FREITAS, 1985).
Recentemente, as Resoluções - RDC n
°
48 e 89 de 16 de março de 2004, da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), incorporaram a P. incarnata L.
na lista de plantas para registro simplificado, para as quais não são necessários
estudos complementares toxicológicos, pré-clínicos e clínicos para a obtenção de
registro de medicamentos, em função do acesso aos estudos sobre esta espécie
(BRASIL ANVISA, 2004), embora até hoje não existam resultados conclusivos que
indiquem qual (is) do(s) constituinte(s) químicos(s) presente(s) nas folhas de
maracujá promovam ação sobre o sistema nervoso central (DHAWAN et al.,
2001b). Entretanto, a referida não preconiza os teores de flavonóides totais
(isovitexina/vitexina).
A diferenciação de P. alata de outras espécies comerciais do gênero Passiflora é relativamente fácil, visto estes materiais apresentarem folhas lobadas, como P. incarnata L. e P.
edulis Sims ou folhas digitadas/palmatilobadas como P. caerulea L. Outra diferenciação
preocupante é aquela que diz respeito a P. incarnata L. e P. edulis Sims: a margem da folha de P.
edulis Sims é mais nitidamente serrilhada do que a de P. incarnata L. a folha de P. edulis Sims é
N
N
CH
3H
O
C
H
3harmina
(12)
também um tanto irregular, não se conseguindo aplainá-la totalmente quando prensada entre folhas de papel absorvente. Por outro lado, a face dorsal da folha de P. incarnata L. é pubescente, o que pode ser observado com auxílio de lupa, fato este não observado em P. edulis Sims (FREITAS, 1985).
Como a droga comercializada na maioria das vezes é representada pelas partes aéreas, a dificuldade de diferenciação macroscópica destas drogas aumenta com o grau de fragmentação. Sendo assim, a diferenciação entre as espécies para propósitos de controle de qualidade deve ser baseada em constituintes químicos como os flavonóides e farmacognósticas. Normalmente os parâmetros de avaliação da qualidade da matéria-prima vegetal são caracterizados por critérios de identidade, pureza e teores descritos nas Farmacopéias (FARIAS, 2001).
A determinação dos flavonóides em plantas medicinais, como proposto pelas Farmacopéias Alemã (Deutsches Arzneibuch, 1992), Helvética (Pharmacopoeia Helvetica, 1987), e Italiana (Farmacopoea Ufficiale Della Republica Italiana, 1998) consiste na análise espectrofotométrica do complexo quelato de alumínio após hidrólise e extração com acetato de etila. Este é um método geral e é preconizado para P. incarnata e outras espécies ricas em flavonóides tais como Camomila recutita, Crataegus spp e Betula alba. Muitos autores (Glasl e Becker, 1984; Schmidt e Ortega, 1993; Pereira, 2002) têm atribuído a metodologia muitas fontes de erro analítico, uma vez que o método foi desenvolvido especificamente para analisar flavonóides O-glicosilados e não para flavonóides C-glicosilados, que resistem à hidrólise ácida. Os
C-glicosilados são menos solúveis em acetato de etila (solvente utilizado para extração) do que as
agliconas de flavonas e podem permanecer na fase aquosa após hidrólise, fase esta que é descartada. Durante a hidrólise ácida, podem sofrer isomerização, denominada rearranjo de Wessely-Moser, formando misturas de 8-C-glicosídeo e 6-C-glicosídeo (MARKHAM, 1982).
Até 1978 haviam sido publicados poucos trabalhos detalhando a análise de
flavonóides por CLAE. Na década de 70, a separação de misturas complexas de
flavonóides glicosídeos ainda era difícil, e eram utilizadas com sucesso fases
estacionárias do tipo C8, C18 e NH
2, e como fase móvel, misturas de água e
metanol, ou misturas acetonitrila-água, fracamente acidificadas com ácido acético.
A utilização da CLAE começou a crescer como ferramenta de análise de
flavonóides em Passiflora principalmente a partir da década de 80.
Num estudo realizado por Quércia et al. (1978) através de CLAE em
amostras de P. incarnata, foi utilizada coluna Zorbax ODS (25 x 2,0 mm I. D.),
temperatura 45
°
C, sistema gradiente composto por metanol-água e fluxo de 0,5
mL/min e foi encontrado um teor de vitexina de 0,226% em extrato pilular e 2,24%
em amostras de extratos pulverizados. Ulubelen e Oksu (1982), analisando teores
de flavonóides através de CLAE utilizaram coluna RP 18 (30 X 0,5 cm I. D.),
sistema isocrático composto por metanol-água-ácido acético (25:70:5) e fluxo 1,5
mL/min em amostras de P. pittieri, P. alata e P. ambigua verificaram que a P. alata
possuía o menor teor de vitexina dentre as três espécies.
Em um outro estudo, Pietta et al. (1986), analisando simultaneamente
flavonóides em amostras que continham extratos de P. incarnata e Crataegus
monogyna
, utilizaram coluna C18 (30 cm x 3,9 mm I. D.), sistema isocrático
composto por 2-propanol-tetrahidrofurano-água (5:15:85) e fluxo 1,5 mL/min
verificando a presença de vitexina-4’-O-ramnoside, isovitevina, vitexina e
hiperosídeo.
Também flavonóides C-glicosilados foram pesquisados em extratos de P.
incarnata
pelos autores Qimin et al. (1991) em CLAE, onde foi utilizada coluna RP
18 (250 X 4 mm I. D.), sistema gradiente composto por metanol-ácido fórmico
5%-água e um fluxo de 1,8 mL/min. Foram identificados nestes extratos os flavonóides
schaftosídeo, isochaftosídeo e isovitexina-2”-O-glucopiranosil e
isoorientina-2”-glucopiranosil.
Grice et al., 2001 desenvolveram um novo método em HPLC para análise
simultânea de alcalóides e flavonóides característicos de P. incarnata,
identificando e quantificando harmane, harmine, harmol, isovitexina e vitexina
onde foi utilizado coluna C18 (150 X 4 mm) e um sistema gradiente composto por
metanol-água-ácido acético e fluxo de 1 mL/min.
Os estudos demonstram que a CLAE vem se tornando um dos procedimentos cromatográficos de análise mais utilizados na área de produtos naturais, visto a alta eficiência de separação e sensibilidade que são alcançadas, além da possibilidade de utilização com vários tipos de detectores (MERKEN et al., 2000).
3.3 Considerações Farmacológicas
O gênero Passiflora é mundialmente conhecido por suas propriedades terapêuticas sobre o Sistema Nervoso Central, fato que vem sendo cientificamente comprovado desde meados do séc. XX (RUGGY et al., 1940; LUTOMSKI et al., 1975; LOGGIA et al., 1981).
Na medicina tradicional, a classe de fármacos mais utilizadas como ansiolíticas e sedativas são os compostos benzodiazepínicos (BZD). Entretanto, além dessas ações, também promovem uma série de efeitos indesejados, como hipnose, relaxamento muscular, amnésia anterógrada, prejuízo no desempenho psicomotor, dependência, incompatibilidade com álcool e tolerância (GRAEFF, 1999). Devido a esses fatores, faz-se necessária pesquisa e o desenvolvimento de novas drogas, capazes de produzir uma ação ansiolítica e/ou sedativa desprovida desses efeitos.
Inúmeras drogas vegetais, como Melissa officinalis L., Tília europaea L., Hypericum
perforatum L., vêm sendo usadas na medicina popular devido a suas propriedades tranqüilizantes
(COLETA et al., 2001). Em 1940, Ruggy et al., trabalhando com um derivado do extrato fluido de P.
incarnata L., observaram a diminuição da pressão sangüínea e da contração da musculatura lisa
do intestino e do útero em mamíferos. Em 2000, Shi et al. observaram um efeito vaso relaxante similar, trabalhando com o alcalóide harmana, isolado de Pegamum harmala L.
Alguns alcalóides β-carbolínicos, como a harmina, possuem acentuada atividade alucinógena, bem como promovem tremores quando aplicados intracerebralmente em ratos (CORDELL, 1981; SCHRIPSEMA et al., 2000). A capacidade de ligação dos alcalóides β -carbolínicos aos receptores BZD em ratos foi apresentada por Rommelspacher et al. (1980), sendo a harmana e a norharmana os mais potentes inibidores destes. Posteriormente em 1996, Pepplinkhuizen et al. demonstraram que, em altas doses, o alcalóide norharmana ligava-se aos receptores BZD, bem como inibia a atividade da enzima monoamonoxidase B (MAO-B). Experimentalmente o mesmo alcalóide induziu sedação e relaxamento da musculatura lisa.
Em 1974, foi relatado que os derivados da pirona (maltol e etil maltol), isolados a partir de P.
incarnata L., causavam efeitos depressores em camundongos como: potencialização do sono
induzido por hexobarbital, ação anticonvulsivante em altas doses e diminuição da atividade locomotora em doses relativamente baixas (1/10 da DL50) (AOYAGI et al., 1974).
Contraditoriamente, Soulimani et al. (1997) demonstraram que o maltol isolado, misturas de maltol e harmana e misturas de compostos flavonoídicos e maltol não apresentavam variação nos parâmetros comportamentais e diminuição da atividade locomotora mesmo em doses elevadas. Porém esses mesmos autores confirmaram a atividade ansiolítica de P. incarnata L. no extrato hidroalcoólico (400 mg/kg, i.p.) e a atividade sedativa da mesma a partir do extrato aquoso (400 e 800 mg/kg, i.p.) em camundongos, caracterizando as atividades observadas dependentes do solvente utilizado na produção do extrato.
Em estudo químico farmacológico, Lutomski et al. (1960) alertaram para a importância da presença do complexo alcalóide-flavonóide em P. incarnata, para a obtenção de um melhor efeito farmacológico. Os mesmos autores ainda observam que este complexo está presente no extrato etanólico.
Trabalhando com extrato fluido e evaporado obtido a partir de folhas de P. alata, contendo princípios flavonoídicos e alcaloídicos, Oga et al. (1984) relataram que o mesmo promoveu
redução da atividade locomotora, prolongamento do tempo de sono induzido por pentobarbital sódico e aumento do tempo de latência das convulsões induzidas por pentilenotetrazol (doses de 75 e 159 mg/kg, via i.p.).
Utilizando o modelo experimental de ansiedade, labirinto em cruz elevado (LCE), Wolfman et
al. (1994) testaram a atividade do flavonóide crisina (1 mg/kg, via i.p.) isolado de P. coerulea e
concluíram que esse composto é um agonista parcial dos receptores BZD, pois apresentou um decréscimo da ansiedade sem manifestações de atividade sedativa.
Ao contrário dessa observação, Zanoli et al. (2000), ao administrar os flavonóides crisina a apigenina obtidos respectivamente a partir de P. incarnata e Matricaria chamomilla, verificaram que ambos produziram uma redução da atividade locomotora espontânea em ratos (sedação) na dose de 25 mg/kg (via i.p.). Na dosagem de 1 mg/kg (via i.p.), somente a crisina produziu atividade ansiolítica no modelo de ansiedade claro-escuro. Entretanto, o efeito observado não foi atribuído aos receptores BZD, visto que estes se encontravam bloqueados por injeção do antagonista benzodiazepínico flumazenil.
Um estudo comparativo sobre atividade ansiolítica no LCE dos extratos hidroalcoólicos das espécies de P. alata e P.edulis foi realizado por Petry et al. (2001). Ambos extratos, pela via intraperitonial em ratos (100 e 150 mg/kg), demonstraram atividade, apesar do extrato de P. edulis ser mais efetivo em doses menores (50 mg/kg). Trabalhando com o extrato aquoso dessas mesmas espécies, De-Paris et al. (2002) recentemente obtiveram resultados semelhantes, além de demonstrar que a composição flavonoídica de P. edulis é mais complexa do que a P. alata.
A partir de 2001, Dhawan et al. começaram a publicar uma série de experimentos em relação ao gênero Passiflora, dentre os quais um estudo comparativo da atividade biológica de extratos metanólicos igualmente obtidos de P. incarnata e P. edulis. A dose de 125 mg/kg (via oral) do extrato metanólico das partes aéreas de P. incarnata apresentou significante atividade ansiolítica em camundongos no modelo LCE, enquanto que P. edulis não apresentou atividade significativa em nenhuma das doses testadas (DHAWAN et al., 2001c). O posterior fracionamento do extrato metanólico de P. incarnata, possibilitou o isolamento de uma substância benzoflavônica (BZF), o qual apresentou uma atividade ansiolítica expressiva (10 mg/kg, p.o.) similar ao efeito exibido pelo diazepam (2 mg/kg, v.o) em camundongos submetidos ao LCE (DHAWAN et al., 2001a).
Esses mesmos autores analisaram extratos obtidos de diferentes órgãos vegetais de P.
incarnata e observaram que o extrato metanólico das raízes dessa espécie não apresenta
significativa atividade ansiolítica em relação aos demais órgãos vegetais (DHAWAN et al., 2001b). O extrato metanólico das folhas de P. incarnata apresentou atividade ansiolítica, propriedades anti-tussígenas (Dhawan et al., 2002b) contra tosse induzida por SO2 e propriedades afrodisíacas na dose de 100 mg/kg em animais de laboratório (DHAWAN et al., 2002c).
Santos (2003) realizou um estudo farmacológico através da administração do extrato bruto hidroalcoólico de P. actinia em camundongos, em doses inferiores a 1.800 mg/kg não resultando em toxicidade aparente. Através dos métodos LCE e campo aberto, observou um efeito sedativo
com o extrato hidroalcoólico bruto, extrato metanólico e sub-extrato metanol-água, sendo que apenas este último apresentou atividade ansiolítica na dose de 30 mg/kg. Ainda no mesmo estudo verificou-se que todos os extratos e frações com atividade sedativa, apresentaram atividade de catalepsia em camundongos.
Apesar dos experimentos laboratoriais desenvolvidos com o intuito de avaliar a atividade farmacológica de Passiflora, ainda não se pode afirmar à qual classe de compostos se deve tal atividade sedativa, se a um composto isolado ou a grupos de compostos químicos (PEREIRA e VILEGAS, 2000).
O extrato fluido de P. alata que foi produzido e analisado quimicamente neste trabalho, foi também investigado por (Salomão, 2003) farmacologicamente quanto aos seus efeitos psicotrópicos. Efeito ansiolítico foi observado em camundongos tratados com o extrato (100 mg/kg) e submetidos ao LCE. Todas as doses utilizadas do extrato (30, 100 e 300 mg/kg) produziram sedação, confirmada pela diminuição do número de cruzamentos e levantamentos realizados pelos animais, no campo aberto. Finalmente, extrato 100 mg/kg aumentou o tempo de sono induzido pelo pentobarbital sódico e induziu catalepsia em camundongos produzindo atividade ansiolítica e sedativa nas doses empregadas neste estudo.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material Botânico
A P. alata foi coletada no horto botânico do Campus da UNIVALI em Ilhota SC, nos meses de janeiro e agosto de 2001 e identificada botanicamente como P. alata Curtis pelo Professor Armando Cervi, Curador do Herbário da UFPR e está sob registro UPCB 43.414 no Herbário do Departamento Botânico da Universidade Federal do Paraná – Curitiba PR.
Após a coleta as folhas foram secas ao ar, trituradas e estocadas em frascos de vidro protegidas de umidade e calor, no Laboratório de Farmacognosia do curso de Farmácia da UNIVALI.
A P. actinia, espécie utilizada para fins de comparação com P. alata, foi coletada na Fazenda Experimental do Canguiri da Universidade Federal do Paraná (UFPR) nos meses de outubro e novembro de 2001. A amostra coletada esta registrada no Herbário do Departamento Botânico da Universidade Federal do Paraná – Curitiba PR, sob número UPCB 30.831.
4.2 Padrões e Solventes
Os solventes utilizados no preparo e extração da amostra, foram: álcool de cereais (Synth), metanol, acetato de etila, ácido fórmico, clorofórmio, diclorometano, hexano, ácido clorídrico e hidróxido de amônio todos grau P.A. (Merck).
Para as análises em CLAE, foram utilizados metanol, acetonitrila, isopropanol (Nuclear) e tetrahidrofurano (Sigma-Aldrich), todos grau HPLC; ácido acético (Dinâmica), ácido ortofosfórico (Merck) reagentes de grau analítico, e água ultrapura, produzida num sistema Compacto Easypure (Barnstead) a 18,2 MΩcm.
Foram utilizados os padrões de flavonóides rutina (Sigma), os padrões vitexina, isovitexina, swertisina, orientina e hiperosídeo cedidos pelos professores Dr. Valdir Cechinel Filho e Dr Franco Delle Monache. Padrões de alcalóides, harmana, harmol, harmina, harmalina e harmalol, (Fluka) foram cedidos pelo professor Dr. Cid ª Santos do Departamento de Farmácia da UFPR.
Padrões e solventes foram filtrados por membrana de celulose regenerada (Schleicher e Schuell) com poros de abertura 0,45 µm.
4.3 Métodos para Obtenção de Extratos
Os diferentes métodos de obtenção de extratos para pesquisa de alcalóides e flavonóides estão resumidos na Figura 4.
4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides
Extrato de P. alata (A)
Folhas secas (500 g) foram moídas e padronizadas pela passagem em um sistema composto por três tamises com aberturas de 1400 µm, 850 µm e 250 µm respectivamente (SONAGLIO et al., 1999). Na seqüência utilizando a metodologia adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987), 40% do material vegetal que passou através do tamis com abertura 250 µm, foi misturado ao pó que passou pelas aberturas anteriores. A droga foi umedecida com o líquido extrator (álcool de cereais 97°GL: duas partes de álcool para uma parte de água destilada, obtendo-se teor alcoólico de 64,7%), passada através do tamis com abertura 1400 µm e deixada em repouso por duas horas.
Utilizando um funil de separação, o material vegetal foi empacotado,
colocando previamente um pequeno pedaço de algodão no funil com objetivo de
uma pré-filtração e o solvente foi distribuído uniformemente sobre a planta moída
e padronizada deixando um excesso de dois centímetros acima do nível da droga.
Durante 12 horas o solvente ficou em contato com o material vegetal. Após,
iniciou-se a percolação coletando-se 1 mL de extrato por minuto.
O extrato de P. actinia foi obtido do Laboratório de Farmacognosia da
UFPR, produzido por Kely Cristina Santos, segundo metodologia proposta pela
Farmacopéia Brasileira I para o preparo de tintura de P. alata (DA-SILVA, 1926).
Extrato de P. incarnata ©
O extrato fluido de P. incarnata foi obtido comercialmente (“Chemische
Fabrik Dr. Hetterich ”) Fürth, Alemanha.
4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides
Extrato de P. alata (A
1)
Após elaborado o extrato hidroalcoólico de acordo com a metodologia adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987) e armazenado em refrigerador a 8°C, por 3 dias, o precipitado (20 g) foi diluído em 200 mL de metanol:água (2:1) e extraído três vezes em funil de separação, com porções de 100 mL com os solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila. O líquido restante foi denominado fração aquosa que foi concentrado até secura. Em cada uma dessas extrações foi aguardado o tempo suficiente até obter a nítida visualização das linhas de separação das duas fases. As fases orgânicas de cada extração, foram reunidas e também concentradas até a secura em evaporador rotatório.
4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides
Extrato de P. alata e P. actinia (B)
Para obtenção dos extratos das folhas sob refluxo, foram utilizados 0,400 g da planta, seca e padronizada de acordo com o item 3.3.1 para extrato de P. alata. Colocada em balão de fundo redondo de 50 mL, acrescentado 25 mL de etanol 40% e aquecido em banho-maria, sob refluxo por 15 minutos. Após, a mistura foi filtrada por algodão para balão volumétrico de 50 mL. O resíduo da droga e o algodão foram lavados em balão de fundo redondo com 10 mL de etanol 40% e aquecido a fervura sob refluxo por 10 minutos. Filtrado novamente a mistura por algodão, lavado o resíduo e o algodão e mais 10 mL de solvente em balão de 50 mL e aquecido em banho-maria sob
refluxo por mais 10 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente, o extrato foi filtrado para balão volumétrico completando o volume com etanol 40%.
4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides
A preparação de extratos para pesquisa de alcalóides foi realizada somente com P. alata.
Extrato I
Pó padronizado das folhas (5 g), umedecidas com hidróxido de amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, adicionado aproximadamente 30 mL de clorofórmio suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 15 minutos. Após, o extrato foi filtrado e concentrado em banho maria, o resíduo foi ressuspendido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extrato II
Utilizando 15 g de pó padronizado das folhas, umedecido com hidróxido de amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, foi adicionado clorofórmio o suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 20 minutos. Após, o extrato foi filtrado, concentrado em banho maria, redissolvido o resíduo com 10 mL de acido clorídrico 1% e colocado no ultrassom por 10 minutos. Filtrado novamente, alcalinizado com hidróxido de amônia 10% até pH 9-12, foi procedido a extração em funil de separação com 5 mL de diclorometano. A extração foi repetida por 3 vezes. Após este processo, a fase orgânica foi concentrada em banho maria, e o resíduo redissolvido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).
Extratos III e IV
De modo a reproduzir a metodologia clássica para extração de alcalóides, segundo método descrito por Benatti (1967), uma parte do extrato hidroalcoólico foi concentrado em rota-vapor, sendo feita a extração durante 7 horas com éter sob aquecimento usando o aparelho Soxhlet. Após finalizado este processo foi adicionado o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrado e levado em banho-maria até resíduo, em seguida foi redissolvido com ácido clorídrico 1% sob agitação por 1 hora. Após este processo o extrato foi colocado na geladeira por 10 horas, em seguida foi realizada a extração com clorofórmio (fase orgânica descartada), adicionando hidróxido de sódio 10% a fase aquosa e novamente foi submetido a extração com clorofórmio, acrescentando agente secante sulfato de sódio anidro à fase orgânica, concentrando em
banho-maria até 1mL e realizando a CCD com a mesma fase móvel e revelador descritos anteriormente (Extrato Quente III).
Realizou-se o mesmo processo descrito acima, com alteração na extração inicial com éter, a qual foi realizado a frio, em funil de separação (Extrato Frio IV).
Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos
Extrato (A) (Phram. Helvética VII ) Extrato (T)
(Farm. Brasielira II)
Folhas padronizadas
P. actinia Folhas padronizadas P. alata Extrato (C) P. incarnata (obtido comercialmente)
Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV, CCD) Extrato (B) sob refluxo Pesquisa Flavonóides e alcalóides (CLAE, UV, CCD) Extrato (A1) fracionado Pesquisa Flavonóides (CCD) Pesquisa Flavonóides e alcalóides (CLAE, UV, CCD) Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV) Extrato (B) Sob refluxo Pesquisa Flavonóides (UV, CLAE)
Extrato I, II, III e IV
Pesquisa alcalóides (CLAE)
