Métodos para Obtenção de Extratos

Os diferentes métodos de obtenção de extratos para pesquisa de alcalóides e flavonóides estão resumidos na Figura 4.

4.3.1 Pesquisa de alcalóides e flavonóides

Extrato de P. alata (A)

Folhas secas (500 g) foram moídas e padronizadas pela passagem em um sistema composto por três tamises com aberturas de 1400 µm, 850 µm e 250 µm respectivamente (SONAGLIO et al., 1999). Na seqüência utilizando a metodologia adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987), 40% do material vegetal que passou através do tamis com abertura 250 µm, foi misturado ao pó que passou pelas aberturas anteriores. A droga foi umedecida com o líquido extrator (álcool de cereais 97°GL: duas partes de álcool para uma parte de água destilada, obtendo-se teor alcoólico de 64,7%), passada através do tamis com abertura 1400 µm e deixada em repouso por duas horas.

Utilizando um funil de separação, o material vegetal foi empacotado,

colocando previamente um pequeno pedaço de algodão no funil com objetivo de

uma pré-filtração e o solvente foi distribuído uniformemente sobre a planta moída

e padronizada deixando um excesso de dois centímetros acima do nível da droga.

Durante 12 horas o solvente ficou em contato com o material vegetal. Após,

iniciou-se a percolação coletando-se 1 mL de extrato por minuto.

O extrato de P. actinia foi obtido do Laboratório de Farmacognosia da

UFPR, produzido por Kely Cristina Santos, segundo metodologia proposta pela

Farmacopéia Brasileira I para o preparo de tintura de P. alata (DA-SILVA, 1926).

Extrato de P. incarnata ©

O extrato fluido de P. incarnata foi obtido comercialmente (“Chemische

Fabrik Dr. Hetterich ”) Fürth, Alemanha.

4.3.2 Obtenção dos extratos fracionados para pesquisa de flavonóides

Extrato de P. alata (A

)

Após elaborado o extrato hidroalcoólico de acordo com a metodologia adaptada da Pharmacopoeia Helvética VII (1987) e armazenado em refrigerador a 8°C, por 3 dias, o precipitado (20 g) foi diluído em 200 mL de metanol:água (2:1) e extraído três vezes em funil de separação, com porções de 100 mL com os solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila. O líquido restante foi denominado fração aquosa que foi concentrado até secura. Em cada uma dessas extrações foi aguardado o tempo suficiente até obter a nítida visualização das linhas de separação das duas fases. As fases orgânicas de cada extração, foram reunidas e também concentradas até a secura em evaporador rotatório.

4.3.3 Obtenção do extrato sob refluxo para pesquisa de flavonóides

Extrato de P. alata e P. actinia (B)

Para obtenção dos extratos das folhas sob refluxo, foram utilizados 0,400 g da planta, seca e padronizada de acordo com o item 3.3.1 para extrato de P. alata. Colocada em balão de fundo redondo de 50 mL, acrescentado 25 mL de etanol 40% e aquecido em banho-maria, sob refluxo por 15 minutos. Após, a mistura foi filtrada por algodão para balão volumétrico de 50 mL. O resíduo da droga e o algodão foram lavados em balão de fundo redondo com 10 mL de etanol 40% e aquecido a fervura sob refluxo por 10 minutos. Filtrado novamente a mistura por algodão, lavado o resíduo e o algodão e mais 10 mL de solvente em balão de 50 mL e aquecido em banho-maria sob

refluxo por mais 10 minutos. Após o resfriamento em temperatura ambiente, o extrato foi filtrado para balão volumétrico completando o volume com etanol 40%.

4.3.4 Obtenção dos extratos para pesquisa de alcalóides

A preparação de extratos para pesquisa de alcalóides foi realizada somente com P. alata.

Extrato I

Pó padronizado das folhas (5 g), umedecidas com hidróxido de amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, adicionado aproximadamente 30 mL de clorofórmio suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 15 minutos. Após, o extrato foi filtrado e concentrado em banho maria, o resíduo foi ressuspendido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).

Extrato II

Utilizando 15 g de pó padronizado das folhas, umedecido com hidróxido de amônio 5%, deixado em repouso por 10 minutos, foi adicionado clorofórmio o suficiente para cobrir a amostra e colocado no ultrassom por 20 minutos. Após, o extrato foi filtrado, concentrado em banho maria, redissolvido o resíduo com 10 mL de acido clorídrico 1% e colocado no ultrassom por 10 minutos. Filtrado novamente, alcalinizado com hidróxido de amônia 10% até pH 9-12, foi procedido a extração em funil de separação com 5 mL de diclorometano. A extração foi repetida por 3 vezes. Após este processo, a fase orgânica foi concentrada em banho maria, e o resíduo redissolvido com 5 mL de metanol (EVANS, 1996).

Extratos III e IV

De modo a reproduzir a metodologia clássica para extração de alcalóides, segundo método descrito por Benatti (1967), uma parte do extrato hidroalcoólico foi concentrado em rota-vapor, sendo feita a extração durante 7 horas com éter sob aquecimento usando o aparelho Soxhlet. Após finalizado este processo foi adicionado o agente secante sulfato de sódio anidro, filtrado e levado em banho-maria até resíduo, em seguida foi redissolvido com ácido clorídrico 1% sob agitação por 1 hora. Após este processo o extrato foi colocado na geladeira por 10 horas, em seguida foi realizada a extração com clorofórmio (fase orgânica descartada), adicionando hidróxido de sódio 10% a fase aquosa e novamente foi submetido a extração com clorofórmio, acrescentando agente secante sulfato de sódio anidro à fase orgânica, concentrando em banho-

maria até 1mL e realizando a CCD com a mesma fase móvel e revelador descritos anteriormente (Extrato Quente III).

Realizou-se o mesmo processo descrito acima, com alteração na extração inicial com éter, a qual foi realizado a frio, em funil de separação (Extrato Frio IV).

Figura 4: Fluxograma dos métodos para obtenção dos extratos

Extrato (A) (Phram. Helvética VII ) Extrato (T)

(Farm. Brasielira II)

Folhas padronizadas

P. actinia Folhas padronizadas P. alata Extrato (C) P. incarnata (obtido comercialmente)

Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV, CCD) Extrato (B) sob refluxo Pesquisa Flavonóides e alcalóides (CLAE, UV, CCD) Extrato (A1) fracionado Pesquisa Flavonóides (CCD) Pesquisa Flavonóides e alcalóides (CLAE, UV, CCD) Pesquisa Flavonóides (CLAE, UV) Extrato (B) Sob refluxo Pesquisa Flavonóides (UV, CLAE)

Extrato I, II, III e IV

Pesquisa alcalóides (CLAE)