DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
POTENCIAL DA Monoraphidium sp. PRODUZIDA EM CULTIVOS
OUTDOOR PARA OBTENÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS DE
TERCEIRA GERAÇÃO
Thalita Marreiro Delmiro
Orientador: Prof.ª Dr.ª Renata Martins Braga-UFRN
Natal/RN Junho/2020
Thalita Marreiro Delmiro
POTENCIAL DA Monoraphidium sp. PRODUZIDA EM CULTIVOS OUTDOOR PARA OBTENÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS DE TERCEIRA GERAÇÃO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química - PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em Engenharia Química, sob a orientação da Prof.ª Dr.ª Renata Martins Braga
Natal/RN Junho de 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Delmiro, Thalita Marreiro.
Potencial da Monoraphidium sp. produzida em cultivos outdoor para obtenção de biocombustíveis de terceira geração / Thalita Marreiro Delmiro. - 2020.
86f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Natal, 2020.
Orientadora: Dra. Renata Martins Braga.
1. Microalgas - Dissertação. 2. Lipídeos - Dissertação. 3. Biocombustíveis 3G - Dissertação. 4. Pirólise flash catalítica - Dissertação. 5. HZSM-5 - Dissertação. I. Braga, Renata Martins. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 574
outdoor para obtenção de biocombustíveis de terceira geração. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de Concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa: Engenharia Ambiental. Natal/RN, 2020, Brasil.
Orientadora: Prof ª. Drª Renata Martins Braga
RESUMO: Microalgas são biomassas promissoras para a obtenção de biocombustíveis
de terceira geração (3G), pois a além de acumularem grandes quantidades de lipídeos que podem ser convertidos em biodiesel a partir da transesterificação, a sua biomassa residual pode ser aproveitada em outros processos de conversão. Além disso, possuem crescimento rápido, não compete com fontes de alimentos, podendo ser cultivadas em larga escala em sistemas de cultivos outdoor. Diante disso, o presente trabalho tem como objetivo avaliar o potencial de geração de biocombustíveis 3G a partir de biomassas da microalga Monoraphidium sp., obtidas de cultivos intensivos outdoor, através da caracterização do extrato lipídico e de sua conversão através do processo de pirólise flash. Para isso, as biomassas foram caracterizadas quanto ao teor de matéria seca, cinzas, proteínas, lipídeos (TL) e carboidratos e também através de análise termogravimétrica (TGA/DTG), espectroscopia na região do infravermelho médio IR) e próximo (FT-NIR). A caracterização das cinzas foi realizada através de fluorescência de raio X (FRX) e difração de raios X (DRX). Já o extrato lipídico, obtido pelo método Schmid-Bondzynski-Ratzlaff, foi avaliado quanto ao seu perfil graxo por cromatografia a gás acoplada a um espectrômetro de massa (GC-MS). Os resultados preliminares de caracterização revelam biomassas com alto conteúdo proteico (20,05 - 34,81%), de carboidratos (22,07% -48,44%) e de cinzas (13,02 – 33,29%). Quanto ao TL, os resultados variaram entre 8 – 22% e apresentaram um perfil de ácidos graxos ricos em C16:0, C16:4 ω-3, C18:2 ω-6, C18:3 ω-3 e C18:4 ω-3. Também foi realizada a pirólise flash catalítica (Py-GC/MS) da biomassa antes e após a extração, e do extrato lipídico, utilizando a zeólita HZSM-5 como catalisador, que proporcionou o melhoramento das características dos produtos gerados em relação a pirólise convencional, promovendo o aumento da formação de hidrocarbonetos aromáticos renováveis nos três casos. Para o extrato lipídico foi observada uma maior formação de alcanos na faixa de C8-C12
(16,38%) em comparação ao que foi obtido para a pirólise da biomassa antes e após a extração, indicando assim, a sua capacidade para a geração de hidrocarbonetos renováveis que atendem as faixas de produção do bioquerosene e principalmente da biogasolina.
energético para produção de biocombustíveis 3G, seja através da conversão do óleo em biodiesel ou produção de combustíveis renováveis a partir da pirólise catalítica.
Palavras-chave: Microalgas, Monoraphidium sp., lipídeos, biocombustíveis 3G, pirólise
crops to obtain third generation biofuels. Post-graduation Program of Chemical Engineering, Federal University of Rio Grande do Norte. Area of Concentration: Chemical Engineering. Line of Research:Environmental Engineering.Natal/RN, 2020, Brazil.
Orientadora: Prof ª. Drª Renata Martins Braga
ABSTRACT:
Microalgae are promising biomasses for obtaining third generation (3G) biofuels, because in addition to accumulating large amounts of lipids that can be converted into biodiesel from transesterification, their residual biomass can be used in other conversion processes. In addition, they have rapid growth, do not compete with food sources, and can be grown on a large scale in outdoor cultivation systems. Therefore, the present work aims to evaluate the potential for the generation of 3G biofuels from biomass of the
Monoraphidium sp., obtained from intensive outdoor crops, through the characterization
of the lipid extract and its conversion through the flash pyrolysis process. For this, the biomasses were characterized in terms of dry matter, ash, protein, lipids (TL) and carbohydrates content and also through thermogravimetric analysis (TGA / DTG), spectroscopy in the middle infrared (FT-IR) and near (FT-NIR). The ash characterization was carried out through X-ray fluorescence (FRX) and X-ray diffraction (DRX). The lipid extract, obtained by the Schmid-Bondzynski-Ratzlaff method, was evaluated for its fatty profile by gas chromatography coupled to a mass spectrometer (GC-MS). The preliminary characterization results reveal biomasses with high protein content (20.05 - 34.81%), carbohydrates (22.07% -48.44%) and ash (13.02 - 33.29%). As for TL, the results varied between 8 - 22% and showed a fatty acid profile rich in C16: 0, C16: 4 ω-3, C18: 2 ω-6, C18: 3 ω-3 and C18: 4 ω -3. Catalytic flash pyrolysis (Py-GC / MS) of biomass before and after extraction and lipid extract was also performed, using zeolite HZSM-5 as a catalyst, which provided an improvement in the characteristics of the products generated in relation to conventional pyrolysis. , promoting an increase in the formation of renewable aromatic hydrocarbons in all three cases. For the lipid extract, a higher formation of alkanes in the C8-C12 range (16.38%) was observed in comparison to
what was obtained for the biomass pyrolysis before and after extraction, thus indicating its capacity for generating renewable hydrocarbons that serve as production ranges for
Monoraphidium sp. presents the energy potential for the production of 3G biofuels, either through the conversion of oil into biodiesel or the production of renewable fuels from catalytic pyrolysis.
Keywords: Microalgae, Monoraphidium sp., Lipids, 3G biofuels, Catalytic flash pyrolysis, HZSM-5
Potencial da Monoraphidium sp. produzida em cultivos outdoor para obtenção de biocombustíveis de terceira geração
Aprovada em 22 de Junho de 2020
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________ ________________________________ Prof.ª Dra. Renata Martins Braga Prof. Dr. Marcus Antônio de Freitas Melo
Orientadora – UFRN Membro Interno - UFRN
__________________________________ _______________________________ Prof. Dr. Domingos Fabiano de Santana Souza Prof. Dr. Rodrigo César Santiago Membro Interno - UFRN Membro Externo - UFERSA
A Deus por sua graça infinita em minha vida, por guiar os meus passos e cuidar de mim durante toda essa jornada. Sem Ele nada posso fazer!
A toda a minha família, em especial a meus pais, Valdenor e Leila, pelo amor incondicional, educação, encorajamento e por estarem comigo sempre. Vocês são a minha base de sustentação e muito preciosos para mim!
Ao meu irmão Thales, minha cunhada Lídia e ao meu sobrinho Gustavinho. Vocês são incríveis. Muito obrigada pelo apoio, orações e por mesmo longe, se fazerem tão presentes.
A minha orientadora, Professora Renata Braga, pela oportunidade ter a sua orientação, por sua dedicação, apoio e por me encorajar sempre para a realização deste trabalho. Muito Obrigada!
A professora Dulce Melo e o professor Marcus Melo, por disponibilizarem o espaço e estrutura do LABTAM para que este trabalho fosse realizado. Muito obrigada!
A Rebecca e Guilherme pela amizade e por me ajudarem nos procedimentos experimentais. Gratidão também a toda equipe e amigos do LABTAM por me ajudarem direta ou indiretamente na realização deste trabalho. Muito Obrigada!
Ao professor Domingos Fabiano e Giovani, pela ajuda nas leituras dos espectros NIRs. Muito obrigada!
A Petrobrás, pelo financiamento da bolsa de pesquisa no Projeto de Pesquisa e Desenvolvimento “Produção de biomassa algácea com alto teor de lipídeos destinada à obtenção de biocombustíveis na Planta Piloto de UFRN”. Ao professor Graco Aurélio Câmara de Melo Viana e toda equipe do projeto pelo desenvolvimento da pesquisa. Ao PPGEQ, FUNPEC e UFRN. Muito obrigada!
Lista de Figuras
Lista de Tabela
Capítulo 1: Introdução ... 15
1.1. Objetivo ... 16
1.1.1. Objetivos específicos ... 16
Capítulo 2: Revisão Bibliográfica ... 18
2.1. Microalgas e suas aplicações ... 19
2.2. Microalgas e o seu potencial para a produção de biocombustíveis ... 21
2.3. Cultivo de microalgas ... 22
2.3.1. Sistemas de cultivo ... 23
2.3.1.1. Sistemas abertos ... 23
2.3.1.2. Sistemas fechados ... 25
2.3.2. Estratégia de acúmulo de lipídeos em microalgas ... 25
2.4. Composição bioquímica das microalgas e perfil graxo ... 26
2.5. Monoraphidium sp. ... 27
2.6. Extração e quantificação de lipídeos em microalgas ... 28
2.6.1. Processos de extração de lipídeos ... 28
2.7. Métodos instrumentais para caracterização de microalgas e fração lipídica ... 31
2.7.1. Técnicas térmicas ... 31
2.7.2. Métodos espectroscópicos aplicados a identificação de lipídeos em microalgas ... 32
2.8. Obtenção de biocombustíveis a partir de Microalgas ... 35
2.8.1. Biodiesel ... 35
2.8.1.1. Transesterificação ... 35
2.8.2. Combustíveis a partir da Pirólise ... 36
Capítulo 3: Metodologia ... 39
3.1. Obtenção das biomassas de microalgas ... 40
3.2. Caracterização da biomassa ... 41
3.2.1. Determinação da matéria seca (MS) ... 41
3.2.2. Determinação do teor de cinzas ... 42
3.2.3. Composição química das cinzas ... 43
3.2.4. Difração de raios X das cinzas ... 43
3.2.5. Método de Kjeldahl para a determinação do teor de proteína bruta. ... 43
3.2.6. Teor de lipídeos pelo método Schmid-Bondzynski-Ratzlaff ... 44
3.2.10. Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier
(FT-IR e FT-NIR)... 46
3.2.11. Pirólise analítica (Py- GC/MS) ... 46
Capítulo 4: Resultados e Discussões ... 48
4.1. Caracterização das biomassas ... 49
4.1.1. Teor de lipídeos, proteínas e carboidratos ... 49
4.1.2. Perfil graxo dos extratos lipídicos ... 51
4.1.3. Caracterização das cinzas ... 52
4.2. Análise termogravimétrica ... 55
4.3. Espectroscopia na região do infravermelho médio (MID) e infravermelho próximo (NIR) ... 57
4.4. Pirólise analítica (Py-GC/MS) ... 60
4.4.1. Pirólise Flash convencional da biomassa liofilizada e residual. ... 60
4.4.2. Pirólise Flash convencional do extrato lipídico ... 63
4.4.3. Pirólise Flash Catalítica ... 65
Capítulo 5: Conclusão ... 70
Capítulo 6: Referências ... 73
Figura 2. 1- Conversão da biomassa de microalgas. ... 20
Figura 2. 2- Raceways de cultivo de microalgas com capacidade de 20 m3 localizados na Fazenda SAMISA – UFRN ... 24
Figura 2. 3- Fotobiorreatores - Sistemas Fechados ... 25
Figura 2. 4 – Microalga do gênero Monoraphidium. ... 27
Figura 2. 5 - Ruptura celular para disponibilização dos lipídeos e extração lipídica ... 29
Figura 2. 6 - Reação de transesterificação ... 35
Figura 3. 1- Tanques outdoor para cultivo de microalgas –Fazenda SAMISA-UFRN. ... 40
Figura 3. 2- Diagrama esquemático da metodologia de caracterização das biomassas ... 41
Figura 4. 1- Monoraphidium sp. Liofilizada ... 49
Figura 4. 2- Cinzas das biomassas liofilizadas ... 53
Figura 4. 3-Etapas reacionais de precipitação de carbonatos em meio de cultivo. ... 54
Figura 4. 4-DRX das cinzas das biomassas da microalga Monoraphidium sp. ... 54
Figura 4. 5-Análise termogravimétrica das biomassas da microalga Monoraphidium sp. . 55
Figura 4. 6-Espectros de infravermelho médio para as biomassas da microalga Monoraphidium sp. ... 58
Figura 4. 7- Espectro FT-NIR para as amostras de Monoraphidium sp. ... 59
Figura 4. 8- Ajuste dos dados de TL ao modelo de calibração ... 59
Figura 4. 9-Produtos da pirólise convencional da Monoraphidium sp. liofilizada e após a extração. ... 61
Figura 4. 11 - Pirólise convencional do Extrato lipídico ... 64
Figura 4. 12-Classes de produtos da pirólise da 402.MONO.29.04.19 – Extrato lipídico.. 64
Figura 4. 13-Produtos da pirólise catalítica com HZSM-5 da 402.MONO.29.04.19 – Biomassa antes e após a extração ... 66
Figura 4. 14-Produtos da pirólise catalítica com HZSM-5 da 402.MONO.29.04.19 – Extrato Lipídico ... 67
Figura 4. 15 - Classes de produtos de pirólise catalítica com HZSM-5 para a biomassa 402.MONO.29.04.19 liofilizada, após extração e seu extrato lipídico. ... 68
Figura 4. 16- Rota de formação de aromáticos apartir da pirólise catalítica (HZSM-5) da Monoraphidium sp...69
Tabela 2. 1- Produtividade de biodiesel a partir de biomassas diversas ... 22
Tabela 2. 2- Região espectral do infravermelho ... 33
Tabela 2. 3-Rendimentos dos produtos de pirólise ... 37
Tabela 3. 1- Nomenclatura das amostras de microalgas ... 41
Tabela 4. 1-Parâmetros de luminosidade e pluviosidade dos cultivos e resultados de caracterização das biomassas da microalga Monoraphidium sp. ... 50
Tabela 4. 2- Perfil graxo dos extratos obtidos das biomassas da Monoraphidium sp. ... 51
Tabela 4. 3-Composição das cinzas por FRX ... 53
Tabela 4. 4- Zonas de decomposição térmica da Monoraphidium sp. ... 56
Tabela 4. 5-Resultados para o modelo de calibração obtido no NIR ... 60
Tabela A. 1- Perfil de ácidos graxos – Monoraphidium sp. ... 83
Tabela A. 2-Produtos da pirólise convencional da biomassa 402.MONO.29.04.19 – Liofilizada e após a extração ... 84
Tabela A. 3- Produtos da pirólise convencional da biomassa 402.MONO.29.04.19 –Extrato lipídico ... 85
Tabela A. 4-Produtos da pirólise Catalítica da biomassa 402.MONO.29.04.19 –Liofilizada e após a extração ... 86
Tabela A. 5-Produtos da pirólise catalítica da biomassa 402.MONO.29.04.19 –Extrato lipídico ... 87
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado
1. Introdução
Os biocombustíveis de terceira geração são produzidos a partir de matérias primas renováveis, facilmente cultiváveis, que possuem crescimento rápido e não competem com as fontes de alimento. As culturas destinadas para essa finalidade são previamente planejadas com o objetivo de obter maiores produtividades de uma forma mais rápida. Aliado a isso, intervenções genéticas também são requeridas com o propósito de melhorar as características das biomassas para a produção de biomoléculas de interesse.
As microalgas são as representantes das biomassas de terceira geração e vêm sendo destacadas como promissoras para se obter diversos tipos de biocombustíveis a partir de diferentes rotas de conversão. Os lipídeos acumulados no interior das suas células são os constituintes que vêm ganhando bastante atenção, pois a depender da espécie e do cultivo, possuem grandes quantidades de triglicerídeos (TAGs) e ácidos graxos livres, que podem ser convertidos em biodiesel a partir da transesterificação e esterificação, respectivamente. Rotas bioquímicas são também aplicáveis às microalgas, como o processo de fermentação de seus polissacarídeos para a geração de bioetanol (Kim et al., 2015). Termoquimicamente, as microalgas podem ser convertidas a partir de processos como a gaseificação, para a geração de gás de síntese, e também a partir da liquefação hidrotérmica e pirólise, para a geração de bio-óleo, bio-carvão e gases (Raheem et al., 2015).
As inúmeras vantagens da utilização de microalgas na produção de biocombustíveis são a alta taxa de crescimento desses micro-organismos em um curto período de tempo, não necessitam de terras aráveis (Chen, J. et al., 2018), o rendimento de biomassa/área é alto em comparação à outros tipos de culturas, e o seu cultivo pode ser realizado utilizando efluentes (Menegazzo & Fonseca, 2019). Além disso, por se tratar de micro-organismos de elevada eficiência fotossintética, as culturas de microalgas em larga escala tornam-se fontes intensivas de captura de CO2 (Moreira & Pires, 2016).
O cultivo de microalgas é bastante versátil, podendo ser realizado em culturas indoor ou outdoor, em sistemas abertos ou fechados, os quais podem assumir diversas configurações. Um dos principais desafios atualmente é produzir em larga escala microalgas visando o alto rendimento de lipídeos. Por isso diversas pesquisas vêm sendo realizadas, a fim de encontrar as melhores condições de cultivo e as melhores espécies
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado produtoras de lipídeos. Estratégias como a submissão das microalgas a estresse de nutrientes e a utilização da engenharia genética (Bajhaiya et al., 2017) para o melhoramento das cepas, têm sido aplicados para conseguir uma maior produtividade de óleo e biomassa.
Para que a produção de biocombustíveis a partir de microalgas seja economicamente viável, o acompanhamento do cultivo mediante a caracterização da biomassa constitui uma etapa importante que pode auxiliar na avaliação do seu potencial para aplicação em diferentes processos de conversão. Para a produção de biodiesel, por exemplo, além da caracterização da biomassa como um todo, a avaliação quantitativa e qualitativa do material lipídico extraído torna-se imprescindível, pois a partir desses resultados é possível inferir se a biomassa pode apresentar viabilidade ou não para a produção desse biocombustível. Com isso, este trabalho visa realizar caracterizações em biomassas de microalgas pretendendo avaliar os seus potenciais para a geração de biocombustíveis.
1.1. Objetivo
Caracterizar biomassas da microalga Monoraphidium sp., cultivadas em sistemas intensivos outdoor, avaliando o seu potencial energético para a produção de biocombustíveis de terceira geração.
1.1.1. Objetivos específicos
✓ Avaliar a composição bioquímica de biomassas da Monoraphidium sp. cultivadas em diferentes períodos em tanques outdoor.
✓ Caracterizar fração lipídica obtida pelo método extrativo de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (SBR) e avaliar o seu potencial para biodiesel.
✓ Caracterizar a biomassa da Monoraphidium sp. a partir de técnicas analíticas instrumentais e investigar os seus potenciais na determinação rápida do teor lipídico.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado ✓ Avaliar o potencial de geração de biocombustíveis 3G da biomassa antes e após a extração e de seu extrato lipídico, através da pirólise (PY-GC/MS), convencional e catalítica, utilizando HZSM-5 como catalisador.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado
2. Revisão bibliográfica
2.1. Microalgas e suas aplicações
As microalgas são os seres mais primitivos do planeta terra, em geral são unicelulares, podendo ser procariontes (ausência de membranas envolvendo o núcleo e organelas celulares), ou eucariontes (presença de membrana envolvendo núcleo e organelas celulares). Esses micro-organismos possuem crescimento rápido e fácil adaptação a diversos ambientes (Arenas et al., 2017). Pertencentes ao grupo das Talófitas, as microalgas são caracterizadas por não possuírem raízes, caules e folhas, e por realizarem fotossíntese a partir de pigmentos fotossintetizantes, como a clorofila (Shin et al., 2018). A biodiversidade de microalgas é gigantesca. Estima-se que atualmente existam cerca de 50.000 espécies, sendo que desse total, 30.000 são realmente estudadas e analisadas (Mata et al., 2010).
O atual interesse de estudo das microalgas está vinculado principalmente ao uso potencial desses micro-organismos em aplicações biotecnológicas, visto que, esses seres são capazes de acumular diversas biomoléculas de interesse da indústria alimentícia, farmacêutica/cosmética e de energia. A maioria das espécie de microalgas estudadas produzem bioprodutos como carotenoides, ácidos graxos, enzimas, antioxidantes, polímeros, toxinas e esteróis (Ratha & Prasanna, 2012). Algumas microalgas como a Dunaliela salina, Chlorella e Anthospira (Spirulina) já vêm sendo produzidas em larga escala para obtenção de compostos carotenoides, astaxantina e proteína para suplemento em alimentos ( Koyande et al., 2019)
Nas aplicações ambientais, as microalgas têm demonstrado vantagens ecológicas, que estão vinculadas a obtenção de créditos de carbono, já que elas realizam fotossíntese, utilizando o CO2 como fonte de carbono para o seu crescimento (Kassim & Meng, 2017;
Sepulveda et al., 2019). Além disso podem também ser utilizadas no tratamento de efluentes pois conseguem absorver grandes quantidade de nitrato e fosfato (Delgadillo-Mirquez et al., 2016; Álvarez-Díaz et al., 2017; Amini et al., 2019)
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado As microalgas também têm ganhado atenção especial do setor energético visto que elas possuem grande aplicabilidade como matéria prima eficiente e sustentável para a produção de diversos biocombustíveis (ver Figura 2.1.)
Figura 2. 1- Conversão da biomassa de microalgas. Fonte: Adaptado de Chagas, (2016).
No Brasil o cenário é bastante promissor para o investimento na produção de microalgas. As principais vantagens são a grande área costeira tropical que o país detém, além de receber níveis de insolação entre 8 – 22 MJ/m². Existem, atualmente no Brasil mais de 40 laboratórios onde culturas de algas são mantidas e empresas como a Petrobrás e Embrapa desenvolvem diversas pesquisas afim de se conceber de forma econômica e viável o biodiesel proveniente desses microrganismos (Brasil et al., 2017).
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado
2.2. Microalgas e o seu potencial para a produção de
biocombustíveis
Os biocombustíveis são obtidos a partir de fontes orgânicas renováveis, e podem substituir os combustíveis de origem fóssil, apresentado a vantagem de serem menos poluentes. Atualmente os biocombustíveis estão classificados em quatro gerações. Os de 1° geração são aqueles obtidos através de matérias primas que são fontes de alimento, como por exemplo o milho, a cana- de- açúcar, girassol, soja, dentre outros. Os de 2° geração são os provenientes de recursos que não são destinados a alimentação, como bagaços e resíduos lignocelulósicos, óleos de frituras e outros tipos de gordura. Os de 3° geração são representados por aqueles produzidos a partir de matérias primas de crescimento rápido, como as microalgas, e que recebem intervenções tanto no meio de cultivo como no seu genoma a fim de se obter maiores produtividades e características desejáveis para conceber biomoléculas de interesse. Já os de 4° Geração podem ser considerados um desdobramento dos de 3° geração. A diferença é que os de 4° geração são considerados biocombustíveis carbono negativo, pois utilizam biomassas alteradas geneticamente para capturar de forma mais eficiente o CO2 (Abdullah et al., 2019).
Dentro da temática dos biocombustíveis de 3° geração, a utilização da biomassa de microalgas apresenta diversas vantagens: Conseguem acumular grandes quantidades de lipídeos no interior de suas células. Possuem alta taxa de crescimento em um curto período de tempo, não necessitam de terras aráveis (Chen, J. et al., 2018). O rendimento de biomassa/área é alto em comparação à outros tipos de culturas, o seu cultivo não requer grandes quantidade de água e pode ser realizado utilizando efluentes (Menegazzo & Fonseca, 2019). Além disso, o sequestro de carbono intensivo realizado pelas culturas de microalgas, tornam a sua biomassa extremamente atraente (Chen, J. et al., 2018).
Na Tabela 2.1 tem-se uma estimativa comparativa da capacidade de produtividade de biodiesel a partir de diversas biomassas, onde as microalgas se destacam como sendo as mais promissoras em relação à oleaginosas tradicionalmente usadas para esse fim.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Tabela 2. 1- Produtividade de biodiesel a partir de biomassas diversas
Matéria Prima Galões/ área/ ano
Milho 18 Soja 46 Girassol 98 Cacau 105 Colza 122 Mamona 194 Coco 276 Óleo de palma 610 Microalgas 5000 Fonte: (Elrayies, 2018)
Apesar das diversas vantagens supracitadas, atualmente, para que a produção de biocombustíveis a partir de lipídeos de microalgas se torne mais vantajosa e competitiva economicamente, é necessário escolher as melhores espécies e aperfeiçoar cada vez mais a eficiência de produtividade dos cultivos. A otimização desses parâmetros, segundo Shin et al., (2018), torna mais viável a produção de biocombustíveis como o biodiesel.
2.3.
Cultivo de microalgas
Três formas de cultivos são utilizadas para o crescimento e acúmulo da biomassa de microalgas, o autotrófico, heterotrófico e o mixotrófico, sendo esse último a reunião de características dos dois outros (Menegazzo & Fonseca, 2019). Na modalidade autotrófica as microalgas fazem fotossíntese e, portanto, utilizam a luz como fonte de energia e o CO2 como fonte de carbono. O cultivo heterotrófico por sua vez corresponde
a cultura de microalgas em que se utilizam o carbono orgânico (ex.: glicose) como fonte de carbono e também de energia. O cultivo mixotrófico é aquele em que a microalga utiliza a fotossíntese como fonte de energia principal e também faz o uso de carbono inorgânico e orgânico para o seu crescimento (Brennan & Owende, 2010).
Atualmente tem se falado em um quarto tipo de cultivo, o foto-heterotrófico, que é onde as microalgas requerem luz enquanto usam compostos orgânicos como fonte de carbono. Aparentemente esse tipo de cultivo é parecido com o mixotrófico, porém o que difere é que a luz deve estar presente durante o crescimento foto-heterotrófico para atender as exigências energéticas das células, enquanto que no cultivo mixotrófico as
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado microalgas podem utilizar os compostos orgânicos para atender essa finalidade (Chew et al., 2018).
2.3.1. Sistemas de cultivo
Atualmente existem diversos tipos de sistemas de cultivos de microalgas visando a sua produção em larga escala, que podem ser classificados em sistemas abertos, fechados e híbridos. Cada sistema de cultivo apresenta vantagens e desvantagens, e portanto a sua escolha deve ser feita baseada no tipo de produto final que se deseja obter e a sua aplicação (Narala et al., 2016).
2.3.1.1. Sistemas abertos
Nos sistemas abertos a cultura é desenvolvida principalmente em lagoas naturais, tanques circulares abertos ou do tipo raceway (tanques de forma elíptica, que se assemelha a uma pista de corrida). Os tanques do tipo raceway consistem tipicamente de um tanque oval, geralmente de concreto, apresentando entre 0,2 a 0,5 m de profundidade, com utilização de pás que promovem a homogeneização do sistema e não permitem a sedimentação das microalgas. Além disso pode-se instalar difusores de CO2 submersos
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Figura 2. 2- Raceways de cultivo de microalgas localizados na Fazenda SAMISA –
UFRN
Fonte: Foto por José Anchieta Fernandes Filho, 2019
O sistema de cultivo aberto apresenta como vantagem o baixo custo de implementação e operação, são mais duráveis e possui grande capacidade de produção (Mata et al., 2010). Além disso, esse tipo de sistema tem uma importância ambiental, visto que eles podem ser fontes intensivas de captura de CO2.
Os problemas ou desvantagens desse tipo de cultivo são principalmente os listados abaixo, conforme Magro et al., (2016):
- Risco de contaminação, já que em sua maioria esses sistemas estão em ambientes externos;
- Os fatores ambientais não podem ser controlados, como por exemplo as variações de luz e temperatura que ocorrem durante o dia e as estações do ano;
- A evaporação, causando a diminuição da coluna de água nos tanques de cultivo;
- A adaptação limitada das espécies;
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Por esse sistema ser bastante vulnerável à contaminação, os cultivos abertos são concebidos para se obter produtos com baixo valor agregado, como é o caso do cultivo que visa a obtenção de biomassa para alimentação de organismos da aquicultura ou para a produção de biodiesel.
2.3.1.2. Sistemas fechados
Os sistemas fechados são representados pelos fotobiorreatores que podem assumir diversas formas: cilíndricas, serpentinas verticais ou horizontais (tubulares), espirais ou painéis de forma achatada (Chew et al., 2018). Esse sistema é vantajoso por permitir controlar as condições de cultivo, o que conduz a maiores produtividades e viabiliza a produção comercial de uma série de compostos de valor agregado (Narala et al., 2016).
Figura 2. 3- Fotobiorreatores - Sistemas Fechados Fonte: Greenwell et al. (2010) apud (Palomino, 2017)
2.3.2. Estratégia de acúmulo de lipídeos em microalgas
Para um crescimento adequado das microalgas são requeridos luz, pH, CO2,
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado nutrientes como nitrogênio e fósforo (Mata et al., 2010), além do controle da mistura e de contaminação do sistema de cultivo (Magro et al., 2016).
Atualmente alguns processos biotecnológicos vêm sendo estudados visando a produção de um alto conteúdo de lipídeos em microalgas. As condições de estresse, como controle de certos nutrientes, intensidade luminosa, temperatura, salinidade e pH são as formas mais estudadas para alcançar esse êxito. A limitação de nutrientes nos meios de culturas é com certeza um dos fatores principais que podem influenciar no aumento da fração lipídica de forma significativa e no perfil lipídico.
A estratégia de depleção de nitrogênio no meio de cultivo tem ganhado bastante atenção pois é um dos nutrientes que afetam o crescimento de microalgas e a produção de lipídeos (Chen, B. et al., 2017). Em situações onde a quantidade de nitrogênio no meio de cultivo é alta, o acúmulo de biomassa é favorecido, pois as células das microalgas direcionam o nitrogênio para a síntese de amido, o qual por sua vez é utilizado para auxiliar o crescimento delas. Já quando ocorre a diminuição de nitrogênio no meio de cultivo, a síntese de amido é bloqueada, fazendo com que as células direcionem o carbono, fotossinteticamente fixado, para a formação de ácidos graxos, ocasionando assim um maior acúmulo de lipídeos ( Tandon & Jin, 2017; Sajjadi et al., 2018;). Portanto, pode-se dizer que o conteúdo de nitrogênio presente na célula é inversamente proporcional ao acúmulo de lipídeos e por causa disso a análise do nitrogênio orgânico em meios de cultivo torna-se fundamental pois possibilita intervir na privação de nitrogênio e assim iniciar a indução de lipídeos. Uma quantidade de nitrogênio orgânico por biomassa, menor que 3% já é considerada como um privação desse elemento (Sajjadi et al., 2018)
2.4.
Composição bioquímica das microalgas e perfil graxo
A biomassa de microalgas é constituída principalmente de carboidratos, lipídeos e proteínas (Pereira et al., 2012). Os lipídeos têm ganhado um interesse especial pois constituem matéria prima para a produção de biodiesel. Trata-se de moléculas orgânicas, que podem ser polares ou apolares. Os lipídeos polares têm carácter estrutural, participam da composição da membrana celular funcionando como barreira seletiva para nutrientes. Já os lipídeos apolares (ou neutros) são moléculas de reserva energética produzidas e
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado acumuladas principalmente em condições de estresse. Na categoria dos lipídeos polares encontramos os fosfolipídios e os glicolipídios (Subhash et al., 2017). Já os representantes dos lipídeos neutros são em sua maioria os triacilglicerídeos (TAGs), diacilglicerídeos (DAGs), monoacilglicerídeos (MAGs), ácidos graxos livres (FFAs), hidrocarbonetos e pigmentos (Sajjadi et al., 2018).
Os ácidos graxos são as unidades fundamentais da maioria dos lipídeos. Trata-se de ácidos orgânicos de cadeia longa de 4 a 24 carbonos possuindo um grupo carboxila e uma cauda hidrocarbonada que dá aos lipídeos o caráter oleoso e insolúvel em água. (Ferreira et al., 2013). Em microalgas são encontrados ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), mono-insaturados (MUFAs) e saturados (SAFAs) (Hakalin, 2014). Em relação ao perfil graxo, as microalgas podem apresentar composições diversificadas, que variam conforme a espécie, tipo de meio de cultivo empregado e também fatores ambientais. De uma forma geral, diversas microalgas apresentam um perfil lipídico com ácidos graxos livres C16:00 (ácido palmítico), C18:1ω9 (ácido oleico), C18:2 ω6 (ácido linoleico) e C18:3ω3 (ácido linolênico) (Sajjadi et al., 2018).
2.5. Monoraphidium sp.
Monoraphidium é um gênero de microalgas verdes, dulcícolas, pertencente à família Selenastracea. As algas desta família apresentam-se com formato fusiforme, retas ou curvas, comumente solitárias ou coloniais e que se reproduzem por formação de autoporos (Lin et al., 2019).
Figura 2. 4 – Microalga do gênero Monoraphidium.
FONTE:http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Monoraphidium/sp_1/sp_1 c2.html, (2019).
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado As microalgas Monoraphidium sp. apresentam-se bastante adaptáveis às mudanças que possam ocorrer no meio de cultura, conseguem crescer muito bem em água de temperaturas amenas e em baixa intensidade luminosa. Além disso, por serem capazes de absorver grandes quantidades de nitrato e fosfato, elas podem crescer facilmente em cultivos que utilizem água residuais (Holbrook et al., 2014). Em relação ao conteúdo lipídico, os autores têm encontrado um valor percentual que pode chegar a 50-67% (Holbrook et al., 2014; Jiang et al., 2016; Pikoli et al., 2019). A variação desses valores pode ser justificada pela cepa de microalga e condições de cultivo em que foi empregada. O seu perfil graxo é bastante variado, apresentando ácidos graxos saturados, mono e poli insaturados. Shrivastav et al. (2015), sob diferentes condições de cultivo constatou a presença significativa de C16:0 (ácido palmítico) (17,24 -39,61%); C18:0 (ácido esteárico) (2,09-17,96%); C18:1ω9 (ácido oleico) (5,41 – 14,19%) e C18:2n6 (Ácido Linoleico) (4,63 -27,96%). Jiang et al. (2016) constatou a semelhança do óleo extraído da Monoraphidium sp. com o óleo de palma (presença de C16:0, C18:1ω9, C18:2ω6), que é uma das matérias primas mais utilizadas mundialmente para a produção de biodiesel. Outros autores também relataram perfil graxo rico em alfa - linolênico para esta microalga (Řezanka et al., 2017; Pikoli et al., 2019; Lin et al., 2019; Zhao et al., 2020)
2.6. Extração e quantificação de lipídeos em microalgas
2.6.1. Processos de extração de lipídeos
O processo de extração de lipídeos deve ser bastante seletivo para frações lipídicas, garantindo que substâncias indesejáveis não sejam extraídas. Etapas prévias de tratamento da biomassa algácea são de extrema importância. A principal delas é a ruptura da parede celular a fim de disponibilizar para o meio externo as substâncias de interesse e dessa forma aumentar a eficiência de extração, como é ilustrado na Figura 2.5.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado FONTE: Adaptado de Rivera et al., (2018)
Figura 2. 5 - Ruptura celular para disponibilização dos lipídeos e extração lipídica
De acordo com Onumaegbu et al. (2018) o pré-tratamento da biomassa algácea para ruptura celular, pode ser realizado por técnicas mecânicas, físicas, térmicas e químicas, como também pela combinação destas. Os principais métodos mecânicos envolvem a moagem mecanizada comum, a homogeneização por alta pressão e também a moagem utilizando moinho de esferas. As técnicas físicas englobam os procedimentos de utilização de micro-ondas (Dai et al., 2014; Onumaegbu et al., 2018) e ultrassom (Sivaramakrishnan & Incharoensakdi, 2018). O uso de autoclave (Surendhiran & Vijay, 2014) e explosões a vapor (Lorente et al., 2015) são exemplos de técnicas térmicas. Já os métodos de pré-tratamento químico podem ser realizados por meio de catálises ou por processos enzimáticos (Zhang et al., 2018)
Assim como existem várias formas de pré-tratamento para ruptura da parede celular, também existem diversos métodos de extração que podem ser utilizados para obter os lipídeos. A extração por Fluido supercrítico, por exemplo, é um método recente e é bastante eficiente pois consegue extrair quase em sua totalidade a matéria graxa , utilizando-se um solvente (geralmente o CO2) em condições supercríticas (Santana et al.,
2012).
O conteúdo lipídico é tradicionalmente determinado por métodos gravimétricos através da extração com solventes (Gusso et al., 2012). Os métodos mais citados na literatura que utilizam solventes orgânicos para a extração de lipídeos em microalgas são os de Folch et al. (1957), Bligh & Dyer (1959), Sohxlet e recentemente o de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado O método de Soxhlet consiste na utilização do aparelho criado por Franz von Soxhlet (1879) para a extração de frações lipídicas em materiais graxos. Nele um solvente puro (hexano, éter de petróleo, éter etílico) é colocado em contato com a mostra de forma sucessiva e intermitente (Brum et al., 2009). O principal inconveniente que o método de Soxhlet apresenta é o longo tempo requerido.
O método de Folch, é um método a frio e um dos mais utilizados para a extração de lipídeos. Ele foi concebido para se extrair lipídeos em tecidos animais e faz uso de uma mistura de clorofórmio e metanol como solvente com posterior adição de um sal (KCl) para proporcionar uma melhor separação de fases (Folch et al., 1957).
O método de Bligh & Dyer (1959) baseia-se na metodologia proposta por Folch et al., foi concebido para a extração de gorduras a frio, utilizando–se 3 solventes: clorofórmio, metanol e água. Nesse processo de extração líquido-líquido forma-se uma fase orgânica rica em clorofórmio onde se tem os lipídeos, e uma fase aquosa com metanol contendo os compostos não lipídicos. A separação da fase orgânica é feita em um balão de separação com posterior evaporação do solvente. O método de Bligh & Dyer é o método que mais vem sendo usado para extrair o conteúdo lipídico em microalgas (Mubarak, Shaija e Suchithra, 2015). Entretanto apresenta as desvantagens de utilizar solventes orgânicos tóxicos e também de superestimar o teor lipídico pois substâncias como clorofila podem ser extraídos com os solventes.
O método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (International Dairy Federation, 1986) baseia-se na prévia digestão ácida do material utilizando ácido clorídrico. Para a extração e separação dos lipídeos, são utilizados solventes orgânicos como o álcool etílico, éter etílico e éter de petróleo. A remoção dos solventes ocorre por evaporação e a determinação da quantidade extraída é realizada por gravimetria
As desvantagens dos métodos extrativos/gravimétricos residem no longo tempo de mão de obra, o que inviabiliza a análise de uma grande quantidade de amostras, e a grande quantidade de solvente utilizada no processo, além de necessitar de mão de obra qualificada.
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2.7.
Métodos instrumentais para caracterização de microalgas e
fração lipídica
Os métodos tradicionais para determinação de lipídeos costumam ser muito demorados e exigem bastante trabalho. Muitas vezes torna-se inviável analisar uma grande quantidade de amostras fazendo-se o uso deles. Por isso diversos autores já reportam o uso de técnicas analíticas instrumentais para a determinação do teor lipídico em microalgas, como por exemplo a análise termogravimétrica, a espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectrometria de massa, dentre outros. Essas técnicas podem ser usadas acopladas a quimiometria, que é uma ferramenta estatística que auxilia na interpretação de dados químicos através de formulação de modelos matemáticos.
Essas técnicas, que comumente são utilizadas para a caracterização dos materiais, podem ajudar na determinação de respostas rápidas, o que traz grandes vantagens que vão desde minimizar o tempo de análise, como também permitir o acompanhamento da produtividade lipídica das microalgas e auxiliar nas tomadas de decisões sob o meio de cultivo.
2.7.1. Técnicas térmicas
A análise termogravimétrica (TGA) é uma técnica termo analítica que acompanha a variação de massa da amostra, em função da programação da temperatura, sob uma atmosfera controlada (Denari & Cavalheiro, 2012). Tipicamente os resultados são representados em curvas de TGA (variação de massa no tempo dm/dt) e por uma curva de DTG que representa a primeira derivada da TGA. A DTG é uma ferramenta matemática que contribui na interpretação e na elucidação de eventos térmicos que não são evidentes nas curvas de TGA (Gomes, 2013). As vantagens de se utilizar esse tipo de análise está no fato de que o equipamento apresenta fácil operação, requer quantidade mínima de matéria-prima, e garante um controle preciso de registro de temperatura e perda de peso da amostra (Bach & Chen, 2017).
Através da análise termogravimétrica as propriedades físicas e químicas das amostras em função da temperatura podem ser determinadas. Em microalgas por exemplo, como reportam Bach & Chen (2017), os estudos mais relevantes sobre TGA
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado têm envolvido principalmente a determinação da composição centesimal da biomassa, bem como a investigação do comportamento térmico da mesma para processos de termo conversão (combustão, torrefação, pirólise, gaseificação e cinética química).
Tem sido observado que o perfil termogravimétrico das microalgas estão relacionados aos estágios de decomposição/devolatização de seus componentes majoritários como carboidratos, proteínas e lipídeos (Gomes et al., 2015; Yang et al., 2019). Na análise termogravimétrica da biomassa da microalga Monoraphidium sp., Gomes et al. (2015) verificou a presença de 3 eventos térmicos, o primeiro ocorrendo entre 29 -150°C, ao qual atribuiu como sendo a perda de umidade; o segundo evento térmico entre 190 - 350°C, representando a decomposição de carboidratos e proteínas e o terceiro estágio, entre 352 - 521°C, como sendo a decomposição da fração lipídica.
A pirólise analítica é um procedimento analítico instrumental que vem sendo utilizado para caracterizar microalgas, como é o caso de estudos realizados por Almeida et al.(2017), que utilizou a técnica para caracterizar energeticamente biomassas de Chlorela Vulgaris e Arthrospira Platensis e identificar os principais produtos de pirólise gerados a partir dessas microalgas. A pirólise analítica também foi utilizada por Biller & Ross, (2014) para quantificar a composição bioquímica em microalgas, visto que as espécies de produtos obtidas são provenientes dos componentes presentes na biomassa. Os autores concluíram que a técnica pode auxiliar nos estudos dos níveis de alteração bioquímica em microalgas.
2.7.2. Métodos espectroscópicos aplicados a identificação de lipídeos em microalgas
A espectroscopia é uma técnica que se baseia nas interações das radiações eletromagnéticas com as moléculas ou partículas do material. Recentemente as técnicas espectroscópicas vem sendo estudadas e empregadas no monitoramento das propriedades bioquímicas das microalgas, como por exemplo a espectrometria de fluorescência, ressonância magnética nuclear (RMN), espectroscopia Raman e a espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (Challagulla et al., 2017).
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2.7.2.1. Espectroscopia na região do infravermelho com transformada
de Fourier
A região do infravermelho está situada no espectro eletromagnético entre as regiões do visível e micro-ondas, e pode ser dividida em 3 regiões distintas: infravermelho próximo (NIR, do inglês, Near Infrared), médio (MID, do inglês, Middle Infrared) e distante (FAR, do inglês, Far Infrared) conforme a Tabela 2.2.
Tabela 2. 2- Região espectral do infravermelho
Região Espectral Comprimento de Onda (nm) Número de onda (cm-1) Frequência (HZ) NIR 780 a 2.500 12.800 a 4.000 3,8 x1014 a 1,2 x 1014 MID 2.500 a 50.000 4.000 a 200 1,2 x 1014 a 6,0 x 1012 FAR 50.000 a 1.000.000 200 a 10 6,0x1012 a 3,0 x 1011 Fonte: Adaptado de Skoog et al., (2002)
As técnicas espectroscópicas na região do infravermelho são eficazes na determinação de compostos orgânicos e vêm sendo amplamente utilizadas na caracterização de microalgas, principalmente na região do infravermelho médio (MIR) e próximo (NIR). A espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, é um dos métodos mais utilizados para estimar a composição de biomassas de microalgas, apresentando diversas vantagens. Ela pode ser utilizada também para acompanhar a evolução das principais biomoléculas, como lipídeos, em tempo real (Podevin et al., 2018). Alguns trabalhos utilizam essa técnica acoplada a uma outra, como por exemplo a análise termogravimétrica para estudo da pirólise de microalgas e cinética (Peng et al., 2015;Wang et al., 2018).
Para a identificação de lipídeos, as regiões de absorção de interesse do MIR são principalmente relacionados aos picos de vibração de deformação axial da ligação C-H (deformação axial =C-H a 3010 cm-1; deformação axial C-H em –CH
3 e CH2 em 2855,
2925 e 2954 cm-1, respectivamente), deformação axial C = O de ésteres (1745 cm-1), flexão de CH2 (1460 cm-1), deformação axial C-O-C em ésteres (1070-1250 cm-1) e
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado deformação angular de CH2 (720 cm-1) (Forfang et al., 2017). A quantificação de
biomoléculas por esta técnica se dá através de análises quimiométricas, já que os espectros de FTIR de sistemas biológicos são bastante complexos, necessitando dessa forma fazer uso de uma análise multivariada para filtrar as informações significativas (Ami et al., 2014). O uso do FTIR acoplado à quimiometria tem sido realizada em diversas pesquisas que buscam quantificar de forma rápida e confiável o teor de biomoléculas de interesse, inclusive de lipídeos em microalgas ou em outros tipos de biomassas ( Dean et al. 2010; Cebi et al. 2017 ; Bataller &Capareda, 2018).
A espectroscopia na região do NIR é uma técnica analítica que tem sido empregada na indústria ambiental, alimentícia e agrícola, com aplicações que vão desde análise de constituintes químicos, controle de qualidade até autenticação de produtos (Brown et al., 2014).Oferece a vantagem de quantificação rápida e in situ de compostos ricos em ligações O-H, C-H, N-H e S-H (Challagulla et al., 2014). Os instrumentos atuais de NIR utilizam transformada de Fourier (FT-NIR) e as regiões de interesse do espectro obtido para determinar a concentração de lipídeos são as representadas pelas bandas que indicam principalmente ligações C-H (4167–4545 cm-1, 5600–6150 cm-1, 6900–7300 cm-
1 e 8000–9000 cm-1 (Chmielarz et al., 2019).
Com o uso da técnica do FT- NIR é possível desenvolver curvas de calibração a partir de uma análise multivariada, onde a um conjunto de espectros são atribuídos valores obtidos por métodos analíticos de referência. Para desenvolver a calibração multivariada, geralmente utiliza-se a regressão de mínimos quadrados (PLS), que tem sido eficaz na construção de modelos robustos e preditivos, como é o caso de trabalhos como os de Liu et al. (2015), que construiu modelos para rápida caracterização de ácidos graxos (C16:0;C18:0; C18:1 e C18:3) em microalgas, e obteve coeficientes de correlações (R²) entre 0,989 e 0,998. Também Laurens & Wolfrum, (2011), construíram um modelo com capacidade de prever o conteúdo de lipídeos neutros e polares em microalgas da espécie Nannochloropsis sp., Chlorococcum sp., Spirulina sp. e uma diatomácea desconhecida. Os modelos criados foram desenvolvidos a partir de diferentes métodos: PLS, PLS1 e PLS2. Os resultados experimentais mostraram que os espectros de NIR das quatro espécies de algas poderiam ser utilizados para prever o conteúdo lipídico (R2 0,969 e 0,951).
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2.8.
Obtenção de biocombustíveis a partir de Microalgas
2.8.1. Biodiesel
O biodiesel consiste em uma mistura de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMES)
que podem ser produzidos a partir de uma fonte renovável, como óleos vegetais, gordura animal e até mesmo óleos de frituras (Torres et al., 2017;Chen & Lee, 2018). O biodiesel pode ser produzido a partir da esterificação de ácidos graxos livres e pela transesterificação de triglicerídeos (TAGs), (Salam et al., 2016), sendo este último processo o mais amplamente utilizado.
2.8.1.1. Transesterificação
A transesterificação consiste na reação entre um óleo vegetal com um álcool de cadeia curta, como metanol e etanol para formar monoésteres e glicerol. Esta reação é reversível e um excesso de álcool é usado para deslocar o equilíbrio para o lado dos produtos ( Salam et al., 2016; Chen & Lee, 2018). Na Figura 2.6 está um esquema da reação de transesterificação, que estequiometricamente na transesterificação requer 3 mols de álcool e 1 mol de triglicerídeo para produzir 3 mol de ésteres e 1 mol de glicerol.
C H2 C H C H2 O O O C C C R1 O R2 O R3 O Triglicerídeo + H3C OH Metanol Catalisador C H2 C H C H2 OH OH OH Glicerol + R1 C O O CH3 R2 C O O CH3 R3 C O O CH3
Ésteres Metílicos de ácidos graxos (Biodiesel) Figura 2. 6 - Reação de transesterificação
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Na produção do biodiesel por transesterificação podem ser utilizados catalisadores homogêneos ou heterogêneos, ácidos ou básicos, sendo a rota homogênea a mais comum. A utilização de catalisadores básicos apresenta um grande problema quando o óleo possui uma grande quantidade de ácidos graxos livres (sigla em inglês FFA – Free Fatty Acids), pois favorece a reação de saponificação desses ácidos, o que implica em consumo de catalisador além de dificultar a separação dos produtos devido a formação de sabão (Chen & Lee, 2018). Por causa disso, para formação de biodiesel tem sido preferível utilizar a catálise ácida. Um outro fator importante a ser destacado é a presença de umidade. A água pode causar a hidrólise dos triglicerídeos e formar sabões bem como emulsões. Como aborda Chen et al. (2018), para evitar isto, a etapa de remoção de água é requerida quando o teor de umidade é maior que 0,05% (p/p).
2.8.2. Combustíveis a partir da Pirólise
Pirólise ou craqueamento é um processo que envolve o tratamento térmico da biomassa em uma atmosfera com ausência parcial ou total de oxigênio (Vieira et al., 2014). Tipicamente utiliza-se uma ampla faixa de temperatura que vai geralmente de 300 a 700 °C e nessas condições os diferentes componentes da biomassa são craqueados em uma variedade de compostos que podem ser gasosos (CO2, CO, NH3 e hidrocarbonetos
de baixo peso molecular), líquidos (bio-óleo) e sólidos (carvão) (Fermoso et al., 2017), e os rendimentos desses produtos variam conforme o tempo de residência e a temperatura utilizadas no processo (Tabela 2.3).
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Tabela 2. 3-Rendimentos dos produtos de pirólise
Processo Condições Bio-óleo (%) Carvão (%) Gás (%)
Pirólise lenta Abaixo de 400 °C; Tempo de residência maior que 30 minutos. 30 35 35 Pirólise rápida 500° C; Tempo de residência ~10-30 segundos. 50 20 30 Pirólise Flash 500° C; Tempo de residência ~1 segundo. 75 2 13
Fonte: Adaptado de Marcilla et al., (2013)
Dentre os produtos gerados, o bio-óleo é um dos mais desejados, uma vez que podem chegar a 75% de rendimento de produção. Além disso é uma mistura rica em compostos orgânicos, que pode ser utilizada como biocombustível, ou precursor de outros produtos químicos. Em microalgas, na pirólise flash, é possível obter um rendimento alto de bio-óleo de composição diversificada, com a presença de hidrocarbonetos, ácidos carboxílicos, álcoois, fenóis, açúcares, furanos, poli-aromáticos, compostos nitrogenados (Li et al., 2019). Tem sido demostrado que o bio-óleo produzido a partir de microalgas tem melhores características, como menos oxigenados e maior poder calorífico, se comparado com o bio-óleo gerado a partir de biomassas lignocelulósicas, como a madeira (Adamakis et al., 2018).
A composição do bio-óleo de microalgas é derivada dos principais constituintes de sua biomassa: carboidratos, proteínas e lipídeos. Compostos oxigenados, como os
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado furanos têm sido destacados como produtos de carboidratos (Chen, W. et al., 2017). Já os fenólicos e aromáticos são provenientes principalmente das proteínas ( Almeida et al., 2017; Simão et al., 2018). Em relação aos lipídeos, a sua pirólise pode gerar alguns aldeídos, álcoois e cetonas e a partir do craqueamento de suas cadeias graxas geram também hidrocarbonetos lineares que podem atender a faixa carbônica de biocombustíveis como a biogasolina (C5 – C9), bioquerosene (C9 - C15) e diesel verde (C15
– C21) (Scaldaferri, 2019).
A presença de compostos oxigenados e nitrogenados dificultam o uso direto do bio-óleo como biocombustível, por isso faz-se necessário a retirada desses componentes, que pode ser realizada a partir da pirólise catalítica, promovendo o melhoramento das características do bio-óleo, direcionando a formação dos produtos desejados (Simão et al., 2018).
Dentre os catalisadores mais estudados, tem sido demonstrado que a utilização de zéolitas comerciais ZSM-5 (especialmente o HZSM-5) é um dos mais eficazes para desoxigenação e desnitrogenação dos produtos da pirólise de microalgas. Isto tem sido observado em vários trabalhos envolvendo a pirólise direta de microalgas (Thangalazhy-gopakumar et al. 2012; Conti et al., 2016; Chagas et al., 2016; Simão et al., 2018 e outros). O HZSM-5, forma ácida da zeólita ZSM-5, é um catalisador microporoso que possui grande eficiência de remoção de compostos oxigenados e nitrogenados, como também alta seletividade para formação de compostos aromáticos (Chagas et al., 2016).
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado
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3. Metodologia
3.1.
Obtenção das biomassas de microalgas
Quatro biomassas de microalga Monoraphidium sp., selecionadas para este trabalho, foram disponibilizadas pelo projeto de pesquisa da UFRN/CENPES-PETROBRÁS: “Produção de biomassa algácea com alto teor de lipídeos destinada à obtenção de biocombustíveis na Planta Piloto da UFRN”. Elas foram obtidas de cultivos outdoor apresentados na Figura 3.1, presentes na Planta Piloto da UFRN, que está localizada na Fazenda SAMISA (59575-000/Extremoz/RN - 5.69 °S, 35.24 °W).
Figura 3. 1- Tanques outdoor para cultivo de microalgas –Fazenda SAMISA-UFRN. Fonte: Adaptado de https://earth.google.com, (2019)
Esses cultivos foram realizados em diferentes períodos, utilizando a mesma cepa e as mesmas características de nutrientes do meio (meio BG 11 modificado e pH neutro) e com tempo médio de cultivo de 5 a 6 dias. Ao final de cada cultivo, as amostras foram coletadas e acondicionadas em tubos falcons de 50 mL para serem destinadas ao processo de liofilização durante 72 h, em liofilizador FreeZone 4.5 da LABCONCO, sob vácuo e temperatura de -43 °C. As biomassas foram nomeadas conforme descrito na Tabela 3.1.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado Tabela 3. 1- Nomenclatura das amostras de microalgas
Tanque/ Nome abreviado da espécie / Data de Coleta
402.MONO.05.12.17 02.MONO.03.05.18 404.MONO.07.05.18 402.MONO.29.04.18
Fonte: Autoria própria.
Após liofilizadas, as biomassas foram caracterizadas conforme está disposto na Figura 3.2.
Figura 3. 2- Diagrama esquemático da metodologia de caracterização das biomassas. Fonte: Autoria própria.
3.2.
Caracterização da biomassa
3.2.1. Determinação da matéria seca (MS)
A metodologia utilizada na determinação de matéria seca foi baseada nos procedimentos analíticos do National Renewable Energy Laboratory (NREL),
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado
Determination of Total Solids and Ash in Algal Biomass de 2 de dezembro de 2013, Technical Report NREL/TP-5100-60956. Aproximadamente 1 g de amostra de microalga fresca, foi seca em estufa de circulação de ar a 60 °C ± 1 °C, à pressão atmosférica durante 18 h. Em seguida a amostra foi acondicionada em dessecador de bancada por 10 min, pesada em balança analítica de precisão e retornou a estufa de circulação de ar a 60 °C ± 1 °C por mais 1 h. Os ciclos de resfriamento, pesagem e secagem por 1 h foram repetidos duas vezes para obter massa constante. O percentual de matéria seca foi calculado através da Equação (01). O experimento foi realizado em triplicata.
𝑀𝑆 % = (𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 cad+amostra seca− 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 cad)
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 da amostra umida 𝑥 100
(01)
A Matéria seca da biomassa liofilizada foi determinada seguindo a mesma metodologia
.
O teor de umidade da amostra foi dado por diferença, conforme a equação 02.𝑈𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 100% − 𝑀𝑆% (02)
3.2.2. Determinação do teor de cinzas
A metodologia utilizada na determinação do teor de cinzas foi também baseada nos procedimentos analíticos do National Renewable Energy Laboratory (NREL), Determination of Total Solids and Ash in Algal Biomass de 2 de dezembro de 2013, Technical Report NREL/TP-5100-60956. Para este experimento foi utilizada a amostra seca, após a determinação de sólidos totais e cadinhos previamente secos. Aproximadamente 1 g de cada amostra de microalga foi aquecida em uma mufla EDG 7000 da TECNAL até 575°C. Em seguida o cadinho contendo a amostra de cinza foi pesado em balança analítica de precisão. O percentual de cinzas foi calculado através da Equação (03). O experimento foi realizado em triplicata.
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado % 𝐶𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠 = Massa cad+cinzas – Massa cad
𝑂𝐷𝑊 𝑥 100
(03)
Em que:
𝑂𝐷𝑊 = Massa amostra seca ar x MS % 100
(04)
3.2.3. Composição química das cinzas
A composição química inorgânica das cinzas das microalgas foi determinada através de Fluorescência de raios X (FRX) por energia dispersiva, usando um equipamento Shimadzu EDX-820. Os espectros de fluorescência de raios X foram obtidos utilizando-se cerca de 300 mg de biomassa liofilizada, cujo diâmetro das partículas estava entre 0,104 e 0,074 mm, depositado em um porta amostra de polietileno.
3.2.4. Difração de raios X das cinzas
A difração de raios X foi realizada com o objetivo de identificar as principais fases da estrutura cristalina das cinzas das microalgas selecionadas. A análise foi realizada utilizando o difratômetro de raios X, D-8 Advanced da Bruker com radiação a Cu-Kα voltagem de 30 kV, e corrente de 30 mA a 2Ɵ (Cu-Kα) 1–80◦, passos de 0.02◦ e velocidade de scan de 0.01◦/s.
3.2.5. Método de Kjeldahl para a determinação do teor de proteína bruta.
A determinação do teor de proteínas foi realizada pelo laboratório de Nutrição Animal (LNA) da Escola Agrícola de Jundiaí (EAJ), unidade acadêmica da UFRN. O método utilizado foi o de Kjeldahl (AOAC, 1995) que se baseia na digestão ácida da amostra com transformação do nitrogênio em íon amônio (NH4+), que é separado por
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado destilação e medido através de titulação. O cálculo para a determinação do teor de proteínas (TP) foi realizado pela Equação (05):
𝑇𝑃(%) =𝑉 𝑥 𝐾 𝑥 𝐹𝑐
𝑚𝑎 𝑥100
(05)
Sendo ma , a massa da amostra seca; V, volume da solução de ácido sulfúrico gasto
na titulação ; K =Fca*N* 0,014; onde Fca é o fator de correção da solução de ácido sulfúrico; N, Normalidade da solução de ácido sulfúrico e Fc, o fator de conversão do nitrogênio para proteína, que para este caso foi igual a 5.
3.2.6. Teor de lipídeos pelo método Schmid-Bondzynski-Ratzlaff
A determinação do teor lipídico foi realizada a partir do método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (SBR) (International Dairy Federation, 1986) que foi adaptado para uma fácil realização em tubos falcons de 50 mL, utilizando 0,5g da amostra de microalga liofilizada. Nos tubos com a biomassa, foi promovida uma prévia digestão ácida com 5 mL de HCl 8M e logo em seguida realizou-se a extração com álcool etílico, éter etílico e éter de petróleo, utilizando 5 mL de cada um dos solventes. A separação das fases foi realizada em uma centrífuga a 2000 rpm durante 5 min. A fase superior, que contém os lipídios extraídos foi transferida para um Erlenmeyer. Após isso, mais 3 extrações foram realizadas. O Erlenmeyer foi colocado em banho-maria para evaporação do solvente, restando assim o extrato lipídico que foi seco em estufa a 60 °C até peso constante.
O teor de lipídeos (TL) e teor de lipídeos livre de cinzas (TLa), foram calculados utilizando as equações (06) e (07), respectivamente
𝑇𝐿 = 𝑚3− 𝑚1 𝑚2 × 100 (06) TL𝑎 = 𝑇𝐿 𝐴𝐹𝐷𝑊× 100 (07)
Em que TL é o teor de óleo (%), m1 a massa do Erlenmeyer (g), m2 a massa da
Thalita Marreiro Delmiro, Junho/2020 Dissertação de Mestrado cálculo do TLa foi considerado o peso da amostra seca livre de cinzas (do inglês Ash Free
Dry Weight – AFDW)
3.2.7. Teor de carboidratos
O teor de carboidratos (TC) foi calculado por diferença, conforme a Equação 08. TC (%) =100- %cinzas-%umidade% - %TL- %TP (08)
3.2.8. Caracterização do extrato lipídico
3.2.7.2. Composição dos ácidos graxos
Para a análise do perfil graxo das amostras por cromatografia a gás com espectrometria de massa (GC-MS), os lipídeos extraídos pelo método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff foram metilados a partir de uma reação com NaOH com posterior esterificação dos ácidos graxos, com metanol na presença de HCl. Em tubos de ensaio com tampa rosqueável, foram pesados cerca de 40 - 50 mg do extrato lipídico. Logo em seguida foram adicionados 2,5 mL de NaOH (0,5 N). Finalizado o processo, foram adicionados aos tubos 7,5 mL de uma solução estererificante com posterior aquecimento em banho-maria a 70 °C por 10 min. Após atingir a temperatura ambiente, adicionou-se 2 mL de Hexano e 5 mL de solução saturada de NaCl. A solução resultante foi agitada em vórtex e 1 mL da fase superior foi retirado e colocado em frasco de vidro de cor âmbar. Em seguida, realizou-se novamente a extração com mais 1 mL de Hexano. Os frascos foram etiquetados e mantidos sob refrigeração até a análise de GC-MS. Para isso, utilizou-se um cromatógrafo a gás GC-2010 Plus e espectrômetro de massas QP2020 da Shimadzu, disponibilizado pela central analítica do instituto de Química da UFRN.
3.2.9. Análise termogravimétrica (TGA/DTG)
A análise termogravimétrica foi realizada para as amostras de Monoraphidium sp. liofilizadas, com o objetivo de correlacionar os eventos de perda de massa à decomposição térmica dos principais constituintes bioquímicos presentes nas amostras. A análise foi desenvolvida entre 30 a 800 °C, a uma razão de aquecimento de 5°C/min
