VIRULENCIA DO FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO Metarhizium anisopliae CONTRA
FÊMEAS DE Aedes aegypti E COMPORTAMENTO NA PRESENÇA DE PANO PRETO
Adriano Rodrigues de Paula, Anderson Ribeiro, Aline Teixeira Carolino, Ruth de
Souza Braga Dias,
Leila Eid Imad da Silva
,
Richard Ian Samuels
Universidade Estadual do Norte Fluminense/Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias- Laboratório de Entomologia e Fitopatologia, Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes-RJ.
biodepaula@yahoo.com.br; anderson.ribeirorj@yahoo.com.br; teixeira_a@yahoo.com.br; ruthdias.psi@gmail.com; leila-psique@hotmail.com; richard@uenf.br
Resumo - A eficiência da utilização de panos pretos + fungo contra fêmeas de Aedes aegypti em
diferentes estados nutricionais foi recentemente questionada. O presente estudo investigou a redução da sobrevivência de fêmeas alimentadas com sangue ou sacarose expostas a um pano pretos impregnado com fungo e o comportamento de pouso de fêmeas na presença de um pano preto. Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue foram menos suscetíveis ao fungo M. anisopliae impregnado no pano preto comparado com fêmeas alimentadas com sacarose. Observando o comportamento dos mosquitos foi verificado que fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue pousaram menos no pano preto, comparado com fêmeas alimentadas com sacarose. Entretatno 16 horas pós-alimentação sanguínea as fêmeas voltaram a pousar no pano preto comparativamente igual às fêmeas alimentadas com sacarose. Panos pretos impregnados com fungo parecem ser promissores para serem utilizandos contra o mosquito da dengue, reduzindo provavelmente a população desse vetor e a incidencia de dengue.Palavras-chave: Fungos entomopatogênicos, Pano preto, Aedes aegypti, Dengue.
Área do Conhecimento: Ciências biológicas
Introdução
Métodos convencionais para o controle de A.
aegypti não estão conseguindo prevenir as
epidemias de dengue, e novas alternativas são urgentemente necessárias. Um dos problemas mais graves que enfrentam as autoridades é o rápido desenvolvimento de populações de mosquito resistente ao inseticida químico (RANSON et al. 2009). Já foi observada a resistência de A. aegypti para todas as quatro classes de inseticida (carbamatos, organoclorados, organofosforados e piretróides) em muitas regiões do Brasil (RANSON et al. 2010). Estudos recentes têm demonstrado a virulência dos fungos contra adultos, larvas e ovos de A. aegypti (SCHOLTE et al 2007; PAULA et al. 2008; PEREIRA et al. 2009; SANTOS et al. 2009; DARBRO et al. 2011). Um dos principais desafios para o uso de fungos contra vetores é o desenvolvimento de métodos que propicie a infecção dos insetos. Pano preto impregnado com fungo e pendurados nos tetos de casas foram testados na África contra os mosquitos da malária (SCHOLTE et al. 2005). Nosso grupo tem testado pequenos pedaços de panos pretos de algodão impregnados com fungo para infecção de A.
aegypti. Entretanto a eficiência da utilização de
panos pretos contra fêmeas de A. aegypti
alimentadas com sangue foi recentemente questionada. O presente trabalho investigou a redução da sobrevivência de fêmeas alimentadas com sangue ou sacarose expostas a um pano preto impregnado com fungo e depois, pela primeira vez, foi observado o comportamento de pouso de fêmeas alimentadas com sangue ou sacarose na presença de um pano preto.
Metodologia
Os mosquitos adultos A. aegypti foram criados no insetário LEF/UENF. O fungo Metarhizium
anisopliae isolado ESALQ 818 foi utilizado para os
testes de sobrevivência. O fungo foi formulado com 0,05% de Tween 80 (TW). A concentração utilizada foi de 1x109 conidios/mL.
Ensaio 1 - Sobrevivência de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose e expostas a um pano preto impregnado com ESALQ 818
O pano preto de 8 x 6 cm foi esterilizado em autoclave durante 15 min. a 1 atm (121oC) e 1 mL da suspensão do fungo foi pulverizado em cada lado do pano utilizando uma Torre de Potter (BURKART Ltd. UK). O pano ficou secando por 16h numa sala do insetário em temperatura
ambiente. Depois foi colocado no sentido vertical dentro de um pote plástico 12 x 7 cm coberto com organza (Figura 1). Cinco potes foram utilizados em cada repetição. Em cada pote foi colocado 10 mosquitos/totalizando 50 mosquitos por tratamento. Os mosquitos ficaram expostos ao pano + fungo por 48 horas, depois o pano foi retirado e a avaliação de sobrevivência continuou a ser feita. O experimento foi mantido em climatizada (BOD) a 25 °C, 70 ± 10% UR. A quantificação de mosquitos vivos foi feita diariamente durante 7 dias. Os mosquitos mortos foram retirados e descartados. O tratamento controle foi feito da mesma maneira, entretanto o pano preto foi tratado com TW. Os mosquitos foram alimentados com papel filtro impregnado com sacarose 10%.
Figura 1 – (A) Pote plástico com um pano preto impregnado com fungo. (B) Pode plástico coberto com organza branco e com papel filtro impregnado com sacarose 10%.
Ensaio 2 - Comportamento de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose na presença de um pano preto
Nesse experimento um pano de algodão preto (20 x 10 cm), previamente autoclavado, foi fixado dentro de uma câmara de observação (100 x 51 x 61 cm) com fita adesiva transparente (Figura 2). A câmara foi colocada numa sala sob luz natural e temperatura monitorada usando um registrador de dados (temperatura max: 26.90ºC min: 23.80ºC; RH máx: 85% min: 71,6%). Dois alimentadores contendo 30mL de sacarose 10% foram colocados dentro da câmara. Cinqüenta fêmeas foram liberadas na caixa. Os testes foram feitos separadamente: primeiro foi feito ensaio com fêmeas alimentadas com sangue, depois alimentadas com sacarose. Só fêmeas ingurgitadas foram utilizadas para o grupo alimentado com sangue. As fêmeas foram alimentadas com sangue e imediatamente liberadas na câmara de observação. As fêmeas alimentadas com sacarose foram retiradas da criação de mosquitos alimentados diariamente com sacarose 10% dispostos em alimentadores de 30mL.
Figura 2 – Câmara de observação com um pano preto fixado e exposto aos mosquitos alimentados com sangue ou sacarose.
Depois que os mosquitos foram liberados na câmara, em cada período de tempo (0, 2, 4, 8, 16, 24 e 32 horas), um observador rapidamente entrou na sala e observou a quantidade de insetos que estavam sobre o pano. Durante as observações noturnas a luz foi brevemente ligada para permitir a contagem de insetos. Os experimentos de sobrevivência dos insetos ao fungo e os testes de comportamento foram repetidos 3 vezes. Para análise dos resultados o teste de variância (ANOVA) de uma via e o teste post-hoc de Duncan foram utilizados. O tempo médio de sobrevivência (S50) foi calculado pelo método de Kaplan-Meier (BLANFORD et al., 2005). Curvas de sobrevivência foram comparadas usando Log-Rank.
Resultados
Ensaio 1 - Sobrevivência de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose e expostas a um pano preto impregnado com ESALQ 818
A Tabela 1 mostra que as fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue foram menos suscetíveis ao isolado ESALQ 818 comparado com fêmeas alimentadas com sacarose. A taxa de sobrevivência de fêmeas alimentadas com sangue foi significativamente maior (43,3%) do que a porcentagem de sobrevivência de fêmeas alimentadas com sacarose 24,4% [F(3,8) = 110,66 (P<0,01); Figura 3]. O valor de S50 das fêmeas alimentadas com sangue foi maior (6 dias), comparado com o valor de S50 das fêmeas alimentadas com sacarose (3 dias).
Tabela 1 – Sobrevivência (%) ± Desvio Padrão (DP) e Tempo Médio de Sobrevivência (S50) das fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose e expostas ao fungo. O tratamento controle foi feito com TW.
Tratamentos Sobrevivência (%) ± DP
S50 Fêmeas + Sangue + Fungo 43,3 ± 6,87 a 6 Fêmeas + Sacarose + Fungo 24,4 ± 8,84 b 3 Fêmeas + Sangue + TW 80 ± 2,22 c ND Fêmeas + Sacarose + TW 81 ± 2,57 c ND Os valores seguidos de mesma letra indicam que os resultados não foram estatisticamente diferentes quando comparados usando o teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). Dados não determinados (ND). Dias S OBRE V IV Ê NC IA ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 7 0 20 40 60 80 100 Sangue+Fungo Sacarose+Fungo Sangue+TW Sacarose+Tw
Figura 3 – Curvas de sobrevivência diária de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose e expostas ao fungo. As fêmeas no tratamento controle foram expostas ao TW.
Ensaio 2 - Comportamento de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue ou sacarose na presença de um pano preto
A Figura 4 mostra a média de fêmeas alimentadas com sangue ou sacarose que pousaram no pano preto fixado dentro da câmara de observação. Duas horas pós-liberação dos mosquitos na câmara de observação foi observado maior média de mosquito alimentado com sacarose no pano preto, comparado com a média de mosquitos alimentados com sangue. Quatro e oito horas após a liberação dos insetos, a média de mosquitos alimentados com sacarose que estavam em contato com o pano foi significativamente maior (P<0,01) comparado com a média de mosquitos alimentados com sangue. Durante a noite (16 horas após a liberação dos mosquitos na câmara) a média de mosquitos alimentados com sacarose contabilizados no pano foi significativamente igual (P>0,01) a média de
mosquitos alimentados com sangue. Nos demais tempos de observação (24 e 32 horas) não foi verificada diferença estatística (P>0,01) de fêmeas alimentadas com sangue ou sacarose em contato com o pano preto.
Figura 4 – Médias e Desvio Padrão de mosquitos alimentados com sangue ou sacarose em contato com o pano preto fixado dentro de uma câmara de observação. As quantificações foram feitas 0, 2, 4, 8, 16, 24 e 32 horas pós-liberação dos mosquitos. O teste iniciou às 8 horas da manhã e foi avaliado até 16 horas do dia seguinte. *Diferença significativa entre a média de mosquitos com sangue ou sacarose em contato com o pano.
Discussão
Os fungos entomopatogênicos têm sido considerado potenciais candidatos para o controle do mosquito adulto A. aegypti (PAULA et al., 2008; PAULA et al., 2013a aceito). O presente estudo mostrou que fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue foram menos suscetíveis ao fungo M.
anisopliae comparado com fêmeas alimentadas
com sacarose. Esse resultado foi igual a estudos nossos anteriormente publicados (PAULA et al., 2011b). Myone et al., 2011 observaram que fêmeas de Anophele gambiae alimentados com sangue foram menos suscetíveis ao fungo B.
bassiana ou M. anisopliae, comparado com
mosquitos alimentados com sacarose. Entretanto o motivo da menor suscetibilidade de mosquitos alimentados com sangue ao fungo ainda não foi esclarecido. Os estudos observando os efeitos da alimentação sanguínea na longevidade dos mosquitos têm sido contraditórios (MNYONE et al., 2011). Uma das hipóteses é que os mosquitos que se alimentam somente de sangue sobrevivem menos porque ocorre o desvio de nutrientes para a produção dos ovos (OKECH et al., 2003). Outros experimentos registraram que a alimentação
sanguínea aumentou significativamente a sobrevivência dos mosquitos, comparado com alimentação com açúcar (SCOTT et al., 1993; SCOTT et al., 1997; STYER et al., 2007). Sabe-se que a idade, sexo, desenvolvimento e estado nutricional pode afetar a suscetibilidade do inseto a infecção fúngica (DIMBI et al., 2003). Nesse trabalho foi verificada menor suscetibilidade de fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue ao fungo impregnado em panos preto (Figura 3). Consideramos as impossibilidades de pulverizar fungo contra mosquitos no campo. Superfícies atrativas impregnadas com fungo são mais realistas. Vários estudos têm mostrado que cortinas ou panos pretos impregnados com inseticida (GIMNIG et al., 2003; KROEGER et a., 2006) ou fungo entomopatogênico (SCHOLTE et al., 2005; PAULA et al., 2008; LWETOIJERA et al., 2010; MNYONE et al., 2010; PAULA et al., 2013b) resulta em significativa mortalidade de mosquitos. A exposição de panos pretos impregnados com fungo resultou em significativa redução da sobrevivência de fêmeas de A. aegypti
alimentadas com sacarose em condição de semicampo (PAULA et al., 2008) e numa simulação de um cômodo residencial (PAULA et al., 2013a aceito). Panos pretos impregnados com fungo podem ser colocados em residências humanas (testes em andamento). No teste de comportamento foi observado que fêmeas de A.
aegypti alimentadas com sangue pousaram menos
no pano preto, comparado com fêmeas alimentadas com sacarose e isso poderia ser negativo quando se propõe a utilização de pano preto + fungo em residências. Pousar menos sobre o pano possivelmente resultaria em menor aderência dos conídios no tegumento dos mosquitos e menores taxas de infecção. Contudo nesse trabalho foi observado que a partir de 16 horas pós-alimentação sanguínea (Figura 4) a quantidade de fêmeas em contato com o pano preto foi significativamente igual (P>0,01) a quantidade de fêmeas alimentadas com sacarose. Se nesse momento o pano estivesse impregnado com fungo a contaminação poderia ocorrer. Estamos investigando o comportamento de fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue ou sacarose expostas ao pano preto impregnado com fungo (experimento em andamento). Pano preto + fungo não repele o pouso de mosquitos (MNYONE et al., 2011). Observamos que fêmeas alimentadas com sangue voam menos comparadas com fêmeas alimentadas com sacarose, pousando sem restrição em superfícies claras (ARP: observação pessoal). Além disso, notamos que o comportamento de pousar no pano preto só ocorre em condições naturais de iluminação. O sistema de iluminação artificial não
foi adequado para esse tipo de ensaio. É interessante notar que poucos mosquitos pousaram no pano durante a noite (Figura 4). Pousar em superfícies escuras pode ser um comportamento defensivo dos insetos contra predadores. A menor suscetibilidade de fêmeas alimentadas com sangue ao fungo também pode estar relacionada ao sistema imunológico. Os mosquitos A. gambiae depois de alimentados com sangue sofrem uma série de mudanças fisiológicas com expressões de genes
relacionados à formação da
matriz peritrófica, digestão, desenvolvimento do ovo e imunidade (DANNA et al., 2005). Kokoza et al. (2000) observaram altos níveis de defensinas em A. aegypti 24 horas após a alimentação com sangue. Pode ser que alimentação sanguínea aumente a defesa imunológica contra fungos. Fato que deve ser investigado, mas esse não foi o foco do nosso estudo. Os efeitos do fungo combinado com inseticida químico têm sido relatados contra pragas agrícolas (HIROMORI et al., 2001) contra mosquitos vetores da malária e filariose (FARENHORST et al., 2009; HOWARD et al., 2010a; HOWARD et al., 2010b) e dengue (PAULA et al., 2011a). A exposição de pano preto impregnado com fungo + inseticida Imidacloprid resultou em significativa redução da sobrevivência de fêmeas alimentadas com sacarose (PAULA et al., 2011a) ou sangue (PAULA et al., 2013b), comparado com a utilização do fungo sozinho. Sugerimos que panos preto impregnados com fungo sejam urgentemente testados no campo contra o mosquito A. aegypti e inseridos no manejo integrado de vetores.
Conclusão
- Fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue foram menos suscetíveis ao fungo M. anisopliae comparado com fêmeas de A. aegypti alimentadas com sacarose, confirmando nossos dados anteriores.
- Esse estudo mostrou que fêmeas de A. aegypti alimentadas com sangue pousaram menos no pano preto, comparado com fêmeas alimentadas com sacarose. Entretatno foi observado que a partir de 16 horas pós-alimentação sanguínea as fêmeas voltaram a pousar no pano preto comparativamente igual à fêmeas alimentadas com sacarose.
- Panos preto impregandos com fungo parecem ser promissores para ser utilizados no ambiente intra e extradomiciliar de residencias.
Agradecimentos
À UENF e FAPERJ projetos: E-26/111.586 /2008, E-26/110.341/2010 e E-26/102.860/2011.
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