Dopamine ELISA
Manual e automatico imunoensaio enzimático para
a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro,
de dopamina em plasma humano e urina.
RE59161
96
2-8°C
I B L
I N T E R N A T I O N A L
G M B H
Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.IBL-International.com
1. APLICAÇÕES
Imunoensaio enzimático manual e automatico para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de dopamina em plasma humano e urina. Adicionalmente o teste pode ser usado para pesquisa em sobrenadantes de culturas celulares e tissue homogenates.
2. SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
As catecolaminas adrenalina, noradrenalina e dopamina são sintetizadas na medula adrenal, no sistema nervoso simpático e no cérebro. Influenciam praticamente todos os tecidos e estão envolvidas, juntamente com outros sistemas hormonais e neuronais, na regulação de uma grande variedade de processos fisiológicos.
Como as catecolaminas e os seus metabolitos, metanefrina e normetanefrina, são segregadas em quantidades superiores às normais numa série de doenças, podem ser usados para efeitos de diagnóstico. Neste contexto, o diagnóstico assim como o follow-up de doenças tumorais do sistema nervoso revestem-se de especial importância. Isto aplica-revestem-se esrevestem-sencialmente ao feocromocitoma, mas também ao neuroblastoma e ao ganglioneuroma.
Devido ao passo de extracção no início do teste, o utilizador pode utilizar materiais de todas as espécies animais. Funciona com ratazanas, ratos e outros. A estrutura química das catecolaminas é idêntica em todos os animais.
3. PRINCÍPIO DO TESTE
Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay) de fase sólida baseado na técnica de sandwich. Os poços estão revestidos com anticorpos de cabra anti-coelho. O anticorpo líquido adicionado, direccionado contra o epitopo de uma molécula de antigénio liga-se às paredes da placa durante o tempo de incubação. O antigénio da amostra é incubado no poço revestido, juntamente com anticorpo secundário conjugado com enzima (E-Ab) dirigido para uma região diferente da molécula de antigénio. Após a reacção do substrato, a intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de antigénio. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva padrão.
4. AVISOS E PRECAUÇÕES
1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.
2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.
3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.
4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.
5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.
6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente à IBL:
7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.
8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.
9. Evite o contacto com a solução de Paragem. Pode causar irritação na pele e queimaduras.
10. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.
5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas secções correspondentes.
A microplaca é estável até expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8 °C.
6. RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS
A libertação in-vivo de catecolaminas e metanefrinas é influenciada por diversas comidas e medicamentos. Vitamina B, café e bananas, alfa-metildopa, inibidores MAO e COMT assim como medicações relativas à hipertensão não devem ser ingeridas pelo menos durante as 72 h anteriores à recolha de amostras.
Plasma (EDTA)
A amostra de sangue deve ser armazenada a 2-8°C até ser centrifugada para separar o plasma, o que deve ser feito nas 2 h que seguem à recolha do sangue.
Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.
Armazenamento: 2-8°C ≤ -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente. Para envio, as amostras devem ser congeladas. Estabilidade: 6 horas 1 mês
Urina
É possível usar tanto a primeira urina do dia como urina de 24 h. O volume total de urina excretada durante o período de 24 h deve ser recolhido e misturado num único frasco contendo como conservante 10-15 mL de HCl 6 N. Determinar o volume total para cálculo de resultados. Misture e centrifugue as
amostras antes de iniciar o ensaio.
Armazenamento: ≤ -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.
Estabilidade: 6 meses
7. MATERIAIS FORNECIDOS
Os reagentes fornecidos com este kit são suficientes para até 96 determinações simples ou até 48 réplicas em plasma e urina.
A microplaca pode ser utilizada para: Adrenalina, Noradrenalina e Dopamina
Quantidade Símbolo Componente
1 x 12 x 8 MTP Microplaca Tiras separáveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal).
1 x 6 x 2.5 mL CAL A-F
Padrão A-F
Adrenalina: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/mL (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/L)
Noradrenalina: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/mL (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/L)
Dopamina: 0; 60; 180; 585; 2300; 11470 ng/mL (0; 392; 1175; 3819; 15014; 74876 nmol/L)
Pronto a usar. Contêm: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina [-] Dopamina (biologicamente activas), 0.1 M HCl.
1 x 2 x 2.5 mL CONTROL 1+2
Controlo 1+2
Pronto a usar. Contêm: [-] Adrenalina, [-] Noradrenalina [-] Dopamina (biologicamente activas), 0.1 M HCl. Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos.
1 x 400 µL ENZCONJ CONC Conjugado Enzimático Concentrado (50x) Contêm: Estreptavidina fosfatasa alcalina, Tampão Tris, HCl, 0.01 % NaN
3.
4 x EXTRPLATE Placa de Extracção (Macroplaca) 24 poços cada. Revestida com gel de afinidade de borato.
2 x 60 mL EXTRBUF Tampão de Extracção
Cor-de-rosa. Pronto a usar. Contêm: 0.016 % NaN3.
2 x 1.25 mL COMT LYO COMT liofilizado
Contêm: Catecol-O-metiltransferase (fígado de porco), NaN3.
2 x 1.25 mL COENZ Solução de Coenzima Pronto a usar. Contêm: S-Adenosil-L-Metionina, estabilizantes.
1 x 3 mL ENZBUF Tampão Enzimático Pronto a usar. Contêm: Tampão Tris, HCl, estabilizantes.
1 x 100 mL RELEASEBUF Tampão de Libertação Colorido Amarelo. Pronto a usar. Contêm: 0.1 M HCl, Indicador.
2 x 3 mL ACYLREAG Reagente de Acilação Pronto a usar. Contêm: dimetilformamida, Ethanol. Cuidado! Tóxico. Altamente inflamável.
Quantidade Símbolo Componente
1 x 100 mL WASHBUF CONC Tampão de Lavagem Concentrado (10x) Contêm: Tampão Tris, HCl, Tween, 0.2 % NaN
3.
1 x 2 mL COMT ADD COMT Aditivo Contêm: plasma humano, estabilizantes, 0.01 % Timerosal.
1 x 8.0 mL ANTISERUM DO Dopamina Antisoro cor-de-violeta Pronto a usar. Contêm: anticorpos contra Dopamina (coelho), Tampão, estabilizantes.
1 x 25 mL PNPP SUBS Solução de Substrato PNPP Pronto a usar. Contêm: p-nitrofenil fosfato (PNPP).
1 x 15 mL PNPP STOP Solução de Paragem PNPP Pronto a usar. Contêm: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA.
3 x FOIL Película Aderente
8. MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 10; 10-100; 100-1000 µL 2. Agitador orbital (200-900 rpm) (p.ex. EAS 2/4, SLT)
3. Vortex
4. Pipeta de 8 canais com reservatório de reagente
5. Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automático ou semi-automático 6. Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvâncias a 405 nm
(comprimento de onda de referência 600-650 nm) 7. Água bidestilada ou bi-destilada
8. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronómetro 9. Tubos de ensaio descartáveis para diluição de amostras 10. 0.1 M HCl, para diluição de amostras (Urina)
9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO
1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.
2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.
3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.
4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem.
5. Usar um esquema de pipetagem para verificar a distribuição adequada pelos poços da placa. Um esquema de pipetagem tanto para pré-tratamento de amostras como para o ensaio está disponível no site da IBL.
6. O tempo de incubação afecta os resultados. Todos os poços devem ser manuseados na mesma sequência de ordem e tempo. Recomenda-se o uso de uma pipeta de 8 canais para pipetagem das soluções em todos os poços.
7. A lavagem das microplacas é importante. Poços lavados incorrectamente levarão a resultados errados. Recomenda-se o uso de uma pipeta multicanal ou de um sistema de lavagem de microplacas automático. Não permitir que os poços sequem entre incubações. Não arranhar os poços revestidos durante a lavagem e a aspiração. Lavar e adicionar todos os reagentes com cuidado. Ao lavar, verificar que todos os poços contêm o mesmo volume de Tampão de Lavagem e que não existem resíduos nos poços.
8. A humidade afecta os tubos/poços revestidos. Não abra o saco até atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poços não utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.
10. PROCEDIMENTO MANUAL
10.1. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 2 experiências separadas.
Pode ocorrer a separação de quantidades visíveis de gel da superfície da placa de extracção durante a extracção. Este facto não influencia os resultados do teste.
Contaminação aérea por desinfectantes contendo peroxigénio para limpeza de superfícies ou equipamentos utilizados em pó ou em solução, p.e. VIRKON deve ser evitado em qualquer caso.Estes compostos alteram fortemente o desempenho do ensaio.
VIRKON é marca registada da DuPont.
10.1.1. Diluição de Amostras
As amostras que se suspeite conterem concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas como segue:
Amostra diluir com Observações
Plasma > padrão mais elevado agua bidest. antes do passo de extracção
Urina > padrão mais elevado 0.1 N HCl antes do passo de extracção 10.1.2. Extracção de Amostras, Padrões e Controlos (Placa de Extracção) (versão manual)
1. Pipetar 20 µL de cada Padrão, Controlo e amostra de urina e 500 µL de cada amostra de plasma para os respectivos poços da placa de extracção. Adicionar 500 µL de água bidest. A todos
os poços excepto aos com amostras de plasma para corrigir diferenças de volumes.
2. Pipetar 1 mL de Tampão de Extracção para cada poço.
3. Tapar a placa com película adesiva. Extrair 30 min à TA (18-25°C) num agitador (600–900 rpm).
Durante a extracção, a superfície do líquido deve humedecer a película aderente mas o nível de líquido não deve exceder 2/3 do poço. Salpicos não afectam os resultados.
4. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. 5. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
6. Tapar a placa com nova película adesiva.
Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador (600–900 rpm). Salpicos não afectam os resultados. 7. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel.
Remover completamente o líquido.
8. Pipetar 150 µL de Tampão de Extracção para cada poço. Adicionar 50 µL de Reagente de Acilação a cada poço. Misturar imediatamente após pipetagem.
9. Extrair 20 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador (400–600 rpm).
10. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover
completamente o líquido.
11. Pipetar 2 mL de água bidest. para cada poço.
12. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min à TA (18-25°C) num agitador (600–900 rpm).
Salpicos não afectam os resultados.
13. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel.
Remover completamente o líquido.
14. Pipetar 300 µL de Tampão de Libertação para cada poço.
15. Agitar 30 min à TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador (400–600 rpm).
As amostras preparadas devem ser testadas no próprio dia. Caso não seja possível, pode armazenar a placa de extracção coberta com folha adesiva durante a noite a 2-8ºC.
10.1.3. Preparação de componentes concentrados
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 6 tiras (48 determinações).
Diluir /
dissolver Componente com Diluente Relação Observações Armazena-mento Estabilidade
25 mL WASHBUF CONC 225 mL agua bidest. 1:10 Misturar energicamente. 2-8°C 4 semanas 120 µL ENZCONJ CONC 6 mL WASHBUF
(diluído) 1:51
Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez. Misturar
sem fazer espuma. 18-25°C 5 h 10.2. PROCEDIMENTO DO ENSAIO (versão manual)
10.2.1. Preparação da Solução Enzimática COMT
A Solução Enzimática COMT deve ser preparada imediatamente antes da sua utilização.
Dissolva cada componente de COMT liofilizado em 1.25 mL de água bidestilada e misture a COMT* dissolvido. Em seguida pipete 1.25 mL de Solução de Coenzima, depois mais 1.25 mL de Tampão
Enzimático e 0.40 de Aditivo COMT aos frascos de COMT misturado para dar um volume final de 4.5 mL
de Solução Enzimática COMT por frasco. Prepare un (1) frasco para 48 determinações de dopamina. A solução pode aparecer turva. Agite sem provocar espuma. A solução COMT é estável à temperatura ambiente durante 1 hora.
* Se apenas for necessária uma alíquota da solução COMT, a restante solução deverá ser imediatamente congelada em alíquotas a -20ºC. A solução COMT é estável nessas condições durante 1-2 meses.
10.2.2. Derivatização Enzimática de Amostras, Padrões e Controlos (Microplaca)
Se pipetar com deslocamento positivo, devolva o líquido residual da ponta da pipeta para os poços correspondentes da placa de extracção.
É útil segurar a placa de extracção em posição inclinada.
10.2.3. Para utilização na pesquisa de homogeneizados de tecidos e sobrenadantes de culturas celulares recomenda-se o seguinte:
O trabalho com sobrenadantes de culturas celulares depende da matriz bem como das concentrações esperadas.
Segundo o protocolo à urina (extracção de pelo menos 20 µL de sobrenadante), pode esperar-se uma sensibilidade de 5 ng/mL. No caso de uma matriz com adição de soro (FCS), o protocolo para plasma (extracção de 500 µL de sobrenadante) pode ser usado com uma sensibilidade de cerca de 4 pg/mL.
Para homogeneizados de tecidos não deve ser utilizado ácido perclórico para a homogeneização. Para informação adicional contacte a IBL.
10.2.4. Dopamina para urina e plasma
IMPORTANTE: A diluição dos padrões extraídos, controlos extraídos e amostras de urina do doente tem de ser realizado antes de pipetar para os poços da Placa de Microtitulação para extra tubos.
1. Dilua todos Padrões extraídos, Controlo extraído e amostras de urina 1:51 com a Tampão de
Libertação para os tubos descartáveis (p.e. 10 µL de Amostra extraída + 500 µL Tampão de Libertação).
2. Pipete 75 µL de Solução Enzimático COMT acabado de preparar para cada poço da Placa de Microtitulação. Agitar rapidamente.
3. Pipete 100 µL dos Padrões, Controlos e amostras de urina extraídos e prediluidos para os
respectivos poços da placa de microtitulação. Pipete 100 µL das amostras de plasma extraídas diretamente (sem pré-diluição) para os respectivos poços. Durante esta fase segurar as pontas das pipetas diretamente para a Solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar rapidamente.
4. Pipete 50 µL de Antisoro para Dopamina (cor-de-violeta) para cada poço.
5. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min à TA (18-25°C) num agitador orbital
(400–600 rpm).
6. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
7. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático acabado de preparar para cada poço.
8. Tapar a placa com nova película adesiva. Incubar 60 min à TA (18-25°C) num agitador orbital
(400–600 rpm).
9. Retire a folha. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem diluído. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel.
10. Para a adição das Soluções de Substrato e Stop usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser
executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e Stop. Usar a técnica de “positive displacement” e evitar a formação de bolhas de ar.
11. Pipetar 200 µL de Solução deSubstrato a cada poço.
12. Incubar 40 min à TA (18-25°C) (sem pelicula adherente) num agitador orbital (400–600 rpm). 13. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução de Paragem PNPP a cada poço.
Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
14. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (comprimento de onda de referência: 620-650 nm)
nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem. Nãos bolhas de ar devem ser visível.
11. PROCEDIMENTO AUTOMÁTICO
11.1. INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE (versão automático)
Os conteúdos do kit para 96 determinações podem ser divididos em 2 experiências separadas.
Pode ocorrer a separação de quantidades visíveis de gel da superfície da placa de extracção durante a extracção. Este facto não influencia os resultados do teste.
Contaminação aérea por desinfectantes contendo peroxigénio para limpeza de superfícies ou equipamentos utilizados em pó ou em solução, p.e. VIRKON deve ser evitado em qualquer caso.Estes compostos alteram fortemente o desempenho do ensaio.
VIRKON é marca registada da DuPont.
11.1.1. Diluição de Amostras
As amostras que se suspeite conterem concentrações superiores à do padrão mais elevado têm que ser diluídas como segue:
Amostra diluir com Observações
Plasma > padrão mais elevado agua bidest. antes do passo de extracção
Urina > padrão mais elevado 0.1 N HCl antes do passo de extracção 11.1.2. Extracção de Amostras, Padraões e Controlos (Placa de Extracção) (versão automático)
1. Pipete 30 µL de cada Padrão, Controlo e amostra de urina e 750 µL de cada amostra de plasma
para os respectivos poços da placa de extracção. Adicionar 750 µL de agua bidest. a todos os poços excepto aos com amostras de plasma para corrigir diferenças de volumes.
2. Pipete 1 mL de Tampão de Extracção a cada poço.
3. Tapar a placa com película adesiva. Extrair 30 min a TA (18-25°C) num agitador orbital
(600–900 rpm). Durante a extracção, a superfície do líquido deve humedecer a película aderente mas o nível de líquido não deve exceder 2/3 do poço. Salpicos não afectam os resultados.
4. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. 5. Pipetar 2 mL de agua bidest. a cada poço.
6. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min a TA (18-25°C) num agitador orbital
(600–900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
7. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel.
Remover completamente o líquido.
8. Pipetar 150 µL de Tampão de Extracção a cada poço. Adicionar 50 µL de Reagente de Acilação a
cada poço. Misturar imediatamente após pipetagem.
9. Extrair 20 min a TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
10. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel. Remover
completamente o líquido.
12. Tapar a placa com nova película adesiva. Agitar 5 min a TA (18-25°C) num agitador orbital
(600–900 rpm). Salpicos não afectam os resultados.
13. Retire a folha. Esvaziar imediatamente a placa e eliminar líquido residual numa toalha de papel.
Remover completamente o líquido.
14. Pipetar 450 µL de Tampão de Libertação a cada poço.
15. Agitar 30 min a TA (18-25°C) (sem película aderente) num agitador orbital (400–600 rpm).
As amostras preparadas devem ser testadas no próprio dia. Caso não seja possível, pode armazenar a placa de extracção coberta com folha adesiva durante a noite a 2-8ºC.
11.1.3. Preparação de componentes concentrados (versão automático)
Os volumes indicados em baixo são para uma experiência com 6 tiras (48 determinações).
Diluir /
dissolver Componente com Diluente Relação Observações Armazena-mento Estabilidade
50 mL WASHBUF CONC 450 mL agua bidest. 1:10 Misturar energicamente. 2-8°C 4 semanas 190 µL ENZCONJ CONC 9.5 mL WASHBUF
(diluído) 1:51
Preparar mesmo antes de usar e utilizar apenas uma vez. Misturar sem fazer
espuma.
18-25°C 5 h
11.2. PROCEDIMENTO DO ENSAIO (versão automático) 11.2.1. Preparação da Solução Enzimática COMT
A Solução Enzimática COMT deve ser preparada imediatamente antes da sua utilização.
Dissolva cada componente de COMT liofilizado em 1.25 mL de água bidestilada e misture a COMT* dissolvido. Em seguida pipete 1.25 mL de Solução de Coenzima, depois mais 1.25 mL de Tampão
Enzimático e 0.40 de Aditivo COMT aos frascos de COMT misturado para dar um volume final de 4.5 mL
de Solução Enzimática COMT por frasco. Prepare un (1) frasco para 48 determinações de dopamina. A solução pode aparecer turva. Agite sem provocar espuma. A solução COMT é estável à temperatura ambiente durante 1 hora.
* Se apenas for necessária uma alíquota da solução COMT, a restante solução deverá ser imediatamente congelada em alíquotas a -20ºC. A solução COMT é estável nessas condições durante 1-2 meses.
11.2.2. Dopamina para urina e plasma (versão automático)
IMPORTANTE: A diluição dos padrões extraídos, controlos extraídos e amostras de urina do doente tem de ser realizado antes de pipetar para os poços da Placa de Microtitulação para extra tubos.
1. Dilua todos Padrões extraídos, Controlos extraído e amostras de urina 1:51 com a Tampão de
Libertação para os tubos descartáveis (p.e. 10 µL de Amostra extraída + 500 µL Tampão de Libertação).
2. Pipete 75 µL de Solução Enzimático COMT acabado de preparar para cada poço da Placa de Microtitulação. Agitar rapidamente.
3. Pipete 100 µL dos Padrões, Controlos e amostras de urina extraídos e prediluidos para os
respectivos poços da placa de microtitulação. Pipete 100 µL das amostras de plasma extraídas diretamente (sem pré-diluição) para os respectivos poços. Durante esta fase segurar as pontas das pipetas diretamente para a Solução COMT. A cor muda para rosa. Agitar placa 1 min.
4. Pipete 50 µL de Antisoro para Dopamina (cor-de-violeta) para cada poço.
5. Tapar a placa com película adesiva. Incubar 120 min a TA (18-25°C) num agitador orbital
(400–600 rpm).
6. Rejeitar a solução de incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem
diluído.
7. Pipetar 100 µL de Conjugado Enzimático para cada poço.
8. Tapar a placa. Incubar 60 min a TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm).
9. Rejeitar a solução d’incubação. Lavar a placa 6 x com 250-300 µL de Tampão de Lavagem diluído. 10. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Soluções de Substrato e
Dopamin ELISA 0.000 0.750 1.500 2.250 3.000 1 10 100 1000 10000 100000 (ng/L) (OD)
11. Pipete 200 µL de Solução deSubstrato para cada poço.
12. Incubar 40 min a TA (18-25°C) num agitador orbital (400–600 rpm). No caso da temperatura no
automáto excede 25°C, deve abreviar o tempo de incubação à 30 min para evitar transbordamento de sinal (em inglês: signal overflow).
13. Parar a reacção de substrato adicionando 50 µL de Solução de Paragem PNPP a cada poço.
Misturar rapidamente os conteúdos agitando cuidadosamente a placa.
14. Medir a densidade óptica com um fotómetro a 405 nm (comprimento de onda de referência: 620-650 nm)
nos 60 min a seguir à pipetagem da Solução de Paragem.
12. CONTROLO DE QUALIDADE
Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso, o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser repetida.
Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.
Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e métodos de lavagem.
13. CÁLCULO DE RESULTADOS
Constrói-se um gráfico com a DO dos padrões (eixo dos yy, linear) em função da sua concentração (eixo dos xx, logarítmico), quer em papel gráfico semi-logarítmico quer usando um método computorizado. Uma boa curva é fornecida optando por interpolação cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log.
Para o cálculo da curva de calibração, deve usar cada sinal dos padrões.
A concentração em ng/ml dos controlos do kit e das amostras de urina pode ser lida directamente da curva padrão correspondente.
Os resultados para as amostras de plasma em ng/ml têm de ser divididos por 1275. Este factor de correcção responde à diferença no volume exigido durante a fase de extracção e à pré- diluição 1:51 dos padrões. Para converter de ng/ml para pg/ml, por favor multiplique por 1000.
No caso de amostras diluídas, os valores têm de ser multiplicados pelo correspondente factor de diluição. Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado têm que ser diluídas como descrito em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente. Calcular a quantidade excretada em 24h para cada amostra de urina: µg/24h = µg/L x L/24h
Conversão:
Dopamina (µg/L) x 6.528 = nmol/L
Curva de Calibração Típica (Exemplo. Não usar para cálculos!)
Padrão Dopamina
(ng/mL) DOMédia DO/DO(%) max
A 0 0.135 0.0 B 60 0.287 6.4 C 180 0.500 15.3 D 585 1.113 41.0 E 2300 2.105 82.5 F 11470 2.522 100
14. VALORES ESPERADOS
Os resultados por si só não devem ser a única razão para qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.
Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os seguintes valores: (5 % - 95 % percentil) Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu próprio intervalo de normalidade.
Urina Plasma
µg/dias nmol/dias pg/mL nmol/L Dopamina < 600 < 3917 < 100 < 0.65
15. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.
Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.
Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se estiverem em concentrações inferiores às indicadas:
Hemoglobina 2.0 mg/mL Bilirrubina 1.0 mg/mL Triglicéridos 91 mg/mL 16. DESEMPENHO Especificidade Analítica (Reactividade Cruzada) Substância Dopamina
Reactividade cruzada de outras substâncias testadas < 0.5 % Dopamina 100 Adrenalina < 0.05 Noradrenalina < 0.05 Metanefrina < 0.05 Normetanefrina < 0.05 3-MT < 0.05 L-DOPA < 0.05 Sensibilidade Analítica (Limite de Detecção)
Urina 5 ng/mL Média do Sinal (Padrão Zero) + 2SD
Plasma 4 pg/mL
Precisão Intervalo (ng/mL) CV (%)
Intra-Ensaio Urina Plasma 0.046 – 1.402 37 - 1549 11 7 Inter-Ensaio Urina Plasma 0.213 – 1.055 47 - 990 10.8 16.3
Linearidade
Intervalo (ng/mL) Diluição em Série até Intervalo (%)
Urina [ng/mL] 141 – 5732 1:32 87 - 114
Plasma [pg/mL] 0.04 – 1.3 1:16 100 - 135
Sem inibição da formação do complexo anticorpo-antigénio detectada.
Recuperação
Mean (%) Range (%) % Recuperação após adição de “reforço”
Urina [ng/mL] 101.5 89 – 113
Plasma [pg/mL] 91 70 - 113
Comparação Método Usado
versus HPLC Dopamina IBL = 1.06 x HPLC -0.154; r = 0.985; n = 90
17. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO
1. Rust MB, Faulhaber J et. al. Neurogenic Mechanisms Contribute to Hypertension in Mice with Disruption of the K-CL Cotransporter KCC3. Circulation Research, January (2006)
2. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004)
3. Adams, J. M. et al. Effects of 17β-Estradiol on hypoglycemia-induced increases in plasma catecholamines in the rat. Poster Society for Neuroscience, Annual Meeting, New Orleans (2003)
4. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: 61-71 (2002)
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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode –written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance
and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer’s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
