* Primeiros passos
PESQUISA
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR: Gradus Primus*
Cláudia Jorge do NascimentoProfessora do Instituto de Química - UnB Carlos Bloch Jr.
Professor do Instituto de Química - UnB Pesquisador da EMBRAPA Recursos Genéticos e Bioctenologia cbloch@cenargen.embrapa.br
INTRODUÇÃO
Por quase meio século, a determi-nação de estrutura tridimensional (3D) de proteínas vem sendo feita por métodos de cristalografia e difração de raio-X; é inquestionável a impor-tância e a contribuição que aplica-ções dessa técnica têm proporciona-do à Bioquímica. Entretanto, há mais ou menos vinte anos, a Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que já ocupava um local de destaque nos estudos estruturais de pequenas mo-léculas, começou a ser utilizada na determinação da estrutura tridimensi-onal de peptídeos e proteínas em solução, independentemente de da-dos cristalográficos. Para que isso fosse possível, sensíveis avanços na instrumentação e na metodologia dessa técnica tiveram que ocorrer, incluindo-se, entre os mais importan-tes, o uso de campos magnéticos homogêneos de alta intensidade, novas técnicas de pulso e a introdu-ção de métodos computacionais mais avançados para a produção e a inter-pretação dos dados de RMN de ma-cromoléculas.
Atualmente, mais de duas mil es-truturas 3D de proteínas determina-das por RMN têm suas coordenadetermina-das atômicas depositadas no Brookhaven Protein Data Bank (http:// www.rcsb.org/pdb/) e esse número vem crescendo rapidamente. Verifi-caram-se também significativos pro-gressos na determinação estrutural de outros biopolímeros por RMN, como é o caso dos ácidos nucléicos e dos oligossacarídeos, antes obtidos
apenas por difração de raio-X. Com a chegada da era pós-genô-mica, nunca se exigiu tanto dos mé-todos para obtenção de estruturas 3D de biomoléculas. Tradicionalmente, esse trabalho tem sido efetuado com características quase artesanais de-vido à alta complexidade da tarefa, ao tempo necessário para a obtenção de apenas uma estrutura (vários me-ses) e aos elevados custos com infra-estrutura e manutenção. Por essas e por outras razões é que o uso da RMN em Bioquímica ainda se encontra restrito a poucos grupos de excelên-cia espalhados pelo mundo e que seus fundamentos teóricos permane-cem obscuros para a maioria daque-les que têm algum interesse nos mais recentes avanços dessa nova era de descobertas científicas.
O presente artigo tem como obje-tivo primordial oferecer a leitores que não sejam da área de RMN, mas
que possuam noções básicas em física e em química, uma visão global dos fenômenos que fundamentam essa técnica, e da maneira como tais fenô-menos são utilizados no processo de determinação estrutural de substânci-as relativamente simples, permitindo-lhes dar os primeiros passos para uma melhor compreensão das metodolo-gias desenvolvidas na obtenção de estruturas 3D de moleculas bem mais complexas (peptídeos, proteínas e áci-dos nucléicos) disponíveis na literatu-ra.
É importante ressaltar que a abor-dagem escolhida será bastante simpli-ficada, uma vez que para uma verda-deira compreensão do fenômeno que representa a Ressonância Magnética Nuclear seria necessária uma descri-ção em termos de Mecânica Quântica, com a utilização de operadores quân-ticos e matrizes de densidade, 1-4 o que
está fora dos objetivos deste artigo.
PRINCÍPIOS BÁSICOS DA ESPECTROSCOPIA DE
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR A Espectroscopia é o estudo da interação da radiação eletromagnética (REM) com a matéria. Essa radiação pode ser vista como uma onda com duas componentes, uma elétrica e ou-tra magnética, que oscilam perpendi-cularmente entre si, sendo ambas tam-bém perpendiculares à direção de pro-pagação da luz (Figura 1). A interação entre a radiação eletromagnética e a matéria pode ocorrer de duas formas: pela sua componente elétrica ou pela sua componente magnética.
Uma das diferenças fundamentais entre a RMN e as outras formas de espectroscopia reside no fato de que, na RMN, essa interação se dá com o campo magnético da REM e não com o campo elétrico, como é o caso, por exemplo, do infravermelho ou do ul-travioleta.
A REM de interesse em análises químicas vai desde os raios gama (alta energia) até as ondas de rádio (baixa energia). Para cada tipo de espectros-copia é exigido um tipo de excitação e, para cada uma delas, existe uma quan-tidade definida de energia, ou seja, esses fenômenos são quantizados. Isso quer dizer que uma radiação de fre-qüência determinada e característica é absorvida para uma determinada tran-sição.
A RMN encontra-se na região das ondas de rádio (radiofreqüências). Em princípio, pode-se dizer que a RMN é uma outra forma de espectroscopia de absorção. Em um campo magnético, sob determinadas condições, uma amostra pode absorver REM na região da radiofreqüência (rf), absorção essa governada por características da amos-tra. Essa absorção é função de determi-nados núcleos presentes na molécula, que são sensíveis à radiação aplicada e, por isso, esses núcleos são alvo de estudo para a compreensão da RMN.
1- A DEFINIÇÃO DE SPIN NUCLEAR
A grandeza física envolvida em RMN é o spin nuclear. O conceito de spin nuclear provém da Mecânica Qu-ântica, não possuindo conceito equi-valente na Mecânica Clássica. Esse con-ceito é fundamental para a compreen-são do fenômeno e pode ser compre-endido como uma propriedade que determinados núcleos apresentam. Tais núcleos, devido à sua configuração nuclear, assumem um comportamento característico de momento angular, capaz de gerar um momento magnéti-co (Figura 2), pois uma carga em movimento gera um campo magnéti-co. O momento magnético µµµµµgerado pode ser descrito em termos do núme-ro de spin I, cujos valores, calculados pela mecânica quântica5,6, podem ser
0, 1/2, 1, 3/2 etc. Como se sabe, núcleos que apresentam tanto massas atômicas quanto números atômicos
pares não possuem spin, sendo, conse-qüentemente, o número de spin igual a zero. É o caso do 12C, 16O, 32S etc.
(Tabela 1). Esses núcleos não têm momento angular associado e, portan-to, não exibem propriedades magnéti-cas, o que implica a ausência de sinais detectáveis por RMN. Núcleos com spin I ≠ 0 são, em princípio, detectáveis por RMN. A detecção desses núcleos está relacionada a condições experi-mentais especiais, que não serão aqui abordadas.
Dentre os diferentes núcleos detec-táveis por RMN, núcleos com I = ½ são bastante apropriados para uma com-preensão mais simplificada da técnica.
2- APLICAÇÃO DE UM CAMPO MAGNÉTICO: A ENERGIA E A
FREQÜÊNCIA EM RMN Na ausência de um campo magné-tico, os spins nucleares estão orienta-dos randomicamente, não apresentan-do nenhuma orientação definida (Fi-gura 3). Entretanto, quando uma amos-tra é submetida a um campo magnético externo B0, de alta intensidade e ho-mogêneo, os spins nucleares tendem a assumir determinadas orientações. Se-gundo a mecânica quântica, o número de spin I determina o número de orientações que um núcleo pode assu-mir diante de um campo magnético externo pela relação7:
número de orientações possíveis = 2I + 1 No caso de um núcleo com número de spin I = ½, apenas duas orientações são possíveis, quando há aplicação de um campo magnético: uma parcial-mente alinhada com o campo magné-tico aplicado e outra parcialmente contra o campo magnético (Figura
Tabela 1: Mostra a correlação existente entre o número atômico (Z) e o número de massa (A) com o número de spin (I)
I Meio inteiro Inteiro Zero A Ímpar Par Par Z Par ou ímpar Ímpar Par Exemplos * 1H(1/2), 17O (5/2), 15N (1/2) 2H (1), 14N (1), 10B (3) 12C (0), 16O (0), 32S (0)
* O número entre parênteses indica o número de spin I do núcleo exemplificado
Figura 2: Momento magnético
µ gerado a partir do momento angular
4). O ângulo θθθθθque define a orientação do vetor com relação a B0 também é
determinado pela mecânica quântica (seus valores aproximados são 55º e 125º). As duas orientações represen-tam diferentes estados energéticos. Isso acontece porque um núcleo com spin cria seu próprio campo magnético, como já mencionado. Quanto mais paralelo forem esses dois campos (o do núcleo e o campo magnético exter-no), menor será a energia desse esta-do. Assim, o estado de menor energia é aquele que se encontra parcialmen-te alinhado com o campo e é denomi-nado estado ααααα (ou +½), e o estado de maior energia, o parcialmente con-tra, é denominado estado βββββ (ou -½) (Figura 5). As energias desses níveis podem ser descritas como Eα = - µB0e Eβ= µB0, o que equivale a dizer que a diferença de energia entre os dois níveis pode ser expressa por8: ∆E = (E
β
- Eα) = 2µB0, desde que I = ½. A diferença de energia ∆∆∆∆∆E que surge entre os dois níveis está relacio-nada com vários fatores, dentre eles, segundo a equação anterior, a intensi-dade do campo magnético B0aplicado:
quanto maior for o campo magnético aplicado, maior será a diferença de energia entre os dois níveis (Figura 6) e maior a diferença de população asso-ciada a esses níveis. Isso significa que, para uma melhor resolução de spins nucleares em ambientes químicos se-melhantes, são desejáveis espectrôme-tros com campos cada vez mais inten-sos.
É interessante observar que a dife-rença entre níveis de energia inicial-mente inexistente surge devido ao
efeito do campo magnético externo B0 aplicado sobre o sistema de spins em estudo. Essa é mais uma das diferenças básicas entre a RMN e outros tipos de Espectroscopia: em infra-vermelho e ultra-violeta, por exemplo, já existem diferentes níveis energéticos (vibracio-nais e eletrônicos, respectivamente), bastando a aplicação de uma radiação de freqüência apropriada para que uma transição (vibracional ou eletrôni-ca) ocorra. No caso da RMN, os dife-rentes níveis energéticos devem ser primeiramente criados pela aplicação de um campo magnético de alta inten-sidade (B0); só assim é que se pode
proceder à Espectroscopia, aplicando-se, então, a radiação de freqüência apropriada para cada núcleo.
O fenômeno da RMN ocorre na região das radiofreqüências (MHz) e a
interação da radiação eletromagnética com a matéria dá-se com a sua compo-nente magnética. Portanto, para se proceder a RMN, deve ser aplicado um segundo campo magnético (chamado de B1), proveniente de uma fonte de
radiofreqüência aplicada perpendicu-larmente ao campo B0. É esse segundo
campo magnético que permite a obser-vação de absorções em RMN.
3- O CONCEITO DE CONSTANTE GIROMAGNÉTICA - A EQUAÇÃO
FUNDAMENTAL DA RMN Na ausência do campo magnético externo B0, os estados ααααα e βββββsão
dege-nerados, uma vez que não há distinção de energia. Aplicando-se o campo B0,
entretanto, um estado é mais estável que o outro, devido a uma interação entre o campo e o momento magnético associado ao spin nuclear. A absorção em RMN é, portanto, uma conseqüên-cia das transições entre o nível de menor energia e o de maior energia, possíveis pela aplicação de um segun-do campo magnético na região da radiofreqüência.
O momento angular L e o momento magnético µµµµµ podem ser representados por vetores e a proporcionalidade en-tre eles é chamada de constante (ou razão) giromagnética. Essa constante, que determina a freqüência de resso-nância do núcleo, constitui um parâ-metro muito importante em RMN e é representada por γγγγγ, apresentando um valor próprio para cada núcleo, poden-do ser expressa pela relação:
γ= 2πµ / hI
onde h é a constante de Plank (∆E = hν).
Se a constante giromagnética γγγγγfor positiva, como é o caso dos núcleos de
1H e 13C, o estado +½ representa um
nível de menor energia. Caso a cons-tante giromagnética seja negativa, como, por exemplo, para o 15N, ocorre o
oposto.9
Além de ser responsável pela fre-qüência de ressonância de cada nú-cleo, a constante giromagnética influ-encia outros fenômenos importantes da Ressonância Magnética Nuclear,10
como é o caso do acoplamento de spins (que será abordado mais adian-te), da sensibilidade dos núcleos, em processos de polarização cruzada, en-tre outros.
Figura 3: Spins randomica-mente orientados
Figura 4: Direções quantizadas assumidas pelos spins sob ação de um campo magnético B0
Figura 5: Níveis energéticos criados pela ação do campo magnético B0
Substituindo-se as equações an-teriores (∆E = hν e γ= 2πµ / hI) , pode-se chegar a:
ν = γB0 /2π
que é a equação fundamental utilizada em RMN e que define a condição de ressonância para um núcleo com spin I = ½.
4- A MAGNETIZAÇÃO LÍQUIDA Em um campo magnético externo, o momento magnético µapresenta um ângulo θθθθθcom a direção do campo magnético B0 aplicado (Figura 4). Se-gundo a Mecânica Clássica, bastante útil para a visualização de muitos con-ceitos de RMN, a interação entre um núcleo com um momento magnético µµµµµ
e o campo B0 faz com que o momento
magnético precesse em torno daquele eixo (Figura 7). A freqüência desse movimento é chamada freqüência de Larmor, e seu valor é dado pela expres-são anterior ν = γB0 /2π em Hertz.
Os dois estados energéticos corres-pondem, então, à precessão de µ em torno do eixo, alinhado (menor ener-gia, se γγγγγfor positiva) ou oposto ao campo magnético aplicado B0.
Consi-derando que o campo B0 esteja aplica-do na direção z, no equilíbrio, os vetores dos momentos magnéticos es-tarão distribuídos em dois cones, em torno dos eixos +z e z (Figura 8).11
A população dos dois diferentes estados energéticos αe β (respectiva-mente nαe nβ) pode ser obtida a partir
da equação de Boltzmann:7
nα/nβ = e∆E/kT
onde k é a constante de Boltzmann e T, a temperatura expressa em escala Kel-vin.
Pode-se deduzir que, à temperatu-ra ambiente, como a diferença de ener-gia ∆∆∆∆∆E é muito menor que kT (∆E << kT), haverá um pequeno excesso de população de spins no estado menos energético. Assim, para um valor posi-tivo de γγγγγ, haverá um ligeiro excesso de população para o estado α, ou seja, para os núcleos que estão alinhados com o campo magnético. Esse excesso
de população resulta em uma magne-tização líquida na direção +z, uma vez que no plano xy, a resultante é nula (Figuras 9, 10).
5- O EFEITO DA APLICAÇÃO DE B1
SOBRE A MAGNETIZAÇÃO Em RMN, a aplicação do campo B1 é feita perpendicular ao campo B0 aplicado (portanto, na direção x ou y). Assumindo que B1 seja aplicado na
direção x, o campo oscilante nessa direção é equivalente à soma vetorial de dois vetores de igual amplitude, movendo-se em direções opostas no plano xy (Figura 11). A magnitude de cada uma dessas componentes corres-ponde à metade do vetor B1 e somente uma delas tem efeito no vetor magne-tização. A outra pode, portanto, ser negligenciada.12,13
O campo B1 é aplicado na forma de
um pulso, ou seja, a fonte de r.f. permanece ligada por períodos
con-trolados da ordem de microssegundos (µs) a milissegundos (ms). O pulso eletromagnético é criado por manipu-lação da fonte de radiação eletromag-nética, ligando-a ou desligando-a, e a duração do pulso (µs a ms) é o tempo para o qual a fonte de radiação se encontra ligada.
No método pulsado, os núcleos são excitados em uma região de freqüênci-as por um ou mais pulsos. Na resso-nância, o campo B1, aplicado na forma de um pulso, faz com que alguns núcleos que se encontravam em situação de equilíbrio (magnetização líquida em z), apenas sob influência de B0 absorvam energia e seus
momen-tos magnéticos nucleares passem a precessar no plano xy (Figura 12).14
Ou seja, o campo B1 altera a direção de precessão da magnetização, acarretan-do, portanto, uma perturbação do sis-tema, retirando-o do equilíbrio.
A nova componente gerada no pla-no xy pode ser observada com auxílio de um detector no mesmo plano de precessão. Para isso, a fonte de r.f. deve ser desligada. Quando isto ocor-re, o sistema tende a retornar à situação original de equilíbrio. Este retorno é conhecido por processo de relaxação, que faz com que os núcleos percam o excesso de energia e retornem às suas posições originais de equilíbrio.
O decaimento da magnetização xy que dá origem ao sinal de RMN para retornar à sua posição de equilíbrio é exponencial e dá origem ao chamado sinal FID (Free Induction Decay). Os
Figura 6: Efeito do campo B0
na diferença de energia entre os estados α e β
Figura 7: Precessão nuclear
Figura 8: Cone de precessão nuclear
sinais da FID (Figura 13) são detecta-dos como uma função do tempo, en-contrando-se aí todas as informações sobre acoplamento e deslocamento químico (fenômenos que serão vistos a seguir) contidos em um espectro de RMN. Como existem vários núcleos em uma amostra, também são originados vários sinais de FID que se superpõem, de forma que se torna muito difícil a extração das informações desejadas (Figura 14). Para que as informações se tornem acessíveis ao usuário, ou
seja, para que a interpretação do es-pectro seja facilitada, os sinais da FID são convertidos para um domínio de freqüências de ressonância, caracterís-ticas de cada núcleo, através de uma operação matemática chamada trans-formada de Fourier. A transtrans-formada de Fourier dos diferentes sinais de FID dá origem ao espectro de RMN comumen-te analisado15 (Figura 15). Em outras
palavras, um espectro de RMN consiste em uma série de ressonâncias em dife-rentes freqüências, denominadas des-locamentos químicos.
6- O DESLOCAMENTO QUÍMICO Segundo a equação fundamental da RMN já apresentada (ν= γB0 /2π), em um espectro de RMN, todas as absorções devidas a um mesmo tipo de núcleo deveriam ocorrer a uma mesma freqüência, uma vez que, segundo essa equação, a freqüência νννννdepende apenas do campo B0 aplicado e da
constante giromagnética de cada nú-cleo. O espectro obtido experimental-mente, no entanto, mostra que a situ-ação não é exatamente assim,
poden-do ser observadas diferentes absor-ções a diferentes freqüências (Figura 15).
O fator que rege essa diferença de freqüências de absorção é denomina-do blindagem. Esse fenômeno pode ser compreendido levando-se em con-ta a vizinhança (núcleos e elétrons) na qual se encontra o núcleo que está sendo objeto de análise.
Cada uma dessas partículas carre-gadas está sujeita à influência de cam-pos magnéticos. Tomando como exem-plo um átomo de hidrogênio em uma molécula, observa-se que, quando ela é submetida a um campo magnético, o campo induz uma circulação dos elé-trons em torno do hidrogênio, em um plano perpendicular ao campo exter-no. Essa carga circulante gerada é tal que o campo magnético gerado (cha-mado induzido) pode se opor ou não ao campo externo. No primeiro caso, diz-se que os elétrons produzem um efeito de blindagem sobre o hidrogê-nio, no segundo, o efeito é de desblin-dagem desse núcleo (Figura 16). Des-sa forma, o núcleo fica sujeito a um campo magnético efetivo (Befet = B0 -Binduzido), e o grau de blindagem ou desblindagem dependerá da densida-de eletrônica próxima densida-dele, ou seja, do ambiente químico em que ele se en-contra. Isso justifica diferentes absor-ções para núcleos próximos a átomos eletronegativos, onde a desblindagem é maior, uma vez que átomos eletrone-gativos diminuem a densidade eletrô-nica dos átomos de hidrogênio que estejam em suas vizinhanças. Para o etanol (Figura 15), por exemplo, os átomos de hidrogênio do grupo -CH2 encontram-se mais próximos do áto-mo de oxigênio do que os do grupo CH3. Por isso, a densidade eletrônica
na região próxima ao grupo CH2 será
menor que na região próxima ao grupo CH3, o que torna os primeiros mais desblindados com relação a esses últi-mos.
Conclui-se, então, que núcleos em diferentes ambientes químicos apre-sentarão diferentes freqüências de ab-sorção devido a diferentes graus de blindagem ou desblindagem. A dife-rença entre essa freqüência de
absor-Figura 9: Resultante no plano xy
Figura 10: Magnetização líquida
ção com relação a um determinado núcleo-referência (chamado padrão) é denominada deslocamento químico. Assim, núcleos quimicamente equiva-lentes (em semelhantes ambientes ele-trônicos) apresentam o mesmo deslo-camento químico. No etanol, todos os três núcleos de hidrogênio do grupo CH3 apresentam o mesmo
desloca-mento químico, ocorrendo a mesma coisa com os dois núcleos de hidrogê-nio do grupo CH2.
Os valores de deslocamento quími-co em unidades de freqüência são valores muito próximos. Por isso, é muito usual a chamada escala delta (δδδδδ), dada pela relação:
δ = νamostrax 106 / νespectrômetro onde νννννamostra é dada em Hertz e ννννν
espectrô-metro em MHz. A escala δδδδδé, portanto,
adimensional com valores expressos em ppm. Os núcleos mais blindados apresentam valores de δδδδδmenores, en-quanto os mais desblindados apresen-tam valores de δ δ δ δ δ maiores. No espectro de RMN de hidrogênio (RMN-1H) do
etanol (Figura 15), podem ser obser-vados dois valores de deslocamento químico: um primeiro, próximo a 1 ppm, mais blindado em relação ao segundo, próximo a 3,5 ppm. Como os
núcleos de hidrogênio da CH3 são
mais blindados que os do -CH2, os
primeiros absorvem a 1 ppm e esses últimos a 3,5 ppm.
7- ACOPLAMENTO SPIN-SPIN Observando-se um espectro de RMN, pode-se ver que os sinais origi-nados das absorções nem sempre apa-recem como picos únicos ou singletos, mas podem aparecer também como dupletos, tripletos, quartetos etc. (Fi-gura 15), o que está relacionado com o que se chama acoplamento spin-spin. Esse fenômeno é originado quan-do núcleos em diferentes ambientes eletrônicos estão próximos entre si (normalmente o efeito é observado em até três ligações, exceto quando existi-rem duplas ou triplas ligações).
Basicamente, existem dois tipos de acoplamento spin-spin: o acoplamen-to homonuclear, quando o acopla-mento ocorre entre o mesmo tipo de núcleos, como, por exemplo, quando hidrogênios em diferentes ambientes químicos acoplam entre si, e o acopla-mento heteronuclear, que ocorre entre núcleos diferentes, como, por
exem-plo, entre hidrogênio e carbono. Por meio da Mecânica Quântica,7
sabe-se que o desdobramento de um sinal de singleto para dupleto, tripleto, etc. (chamado de multiplicidade) pode ser dado pela relação 2nI+1, onde n é o número de núcleos vizinhos em diferentes ambientes químicos e I é o número de spin do núcleo que está sendo analisado. Para núcleos com spin I = ½ , a multiplicidade será dada simplesmente por (n+1).
Assim, no espectro de hidrogênio do etanol (Figura 15), desprezando-se o hidrogênio do grupo OH, devido ao processo de troca química, (não abordado aqui), serão observados dois sinais devidos a acoplamento homo-nuclear: um relativo aos hidrogênios da metila e outro aos hidrogênios do grupo CH2, uma vez que se encon-tram em diferentes ambientes eletrôni-cos e que, portanto, apresentarão dife-rentes deslocamentos químicos. Esses sinais, entretanto, não aparecem como singletos (Figura 15). A multiplicida-de é dada por (n+1): os três hidrogê-nios da metila têm dois vizinhos (os dois hidrogênios do grupo CH2); logo, o seu sinal aparecerá no espectro como um tripleto (2 + 1 = 3), observado em torno de 1 ppm. Analogamente, os dois hidrogênios do grupo CH2 têm como
vizinhos os três hidrogênios da metila e seu sinal será um quarteto (3 + 1 = 4), cuja absorção é obervada em torno de 3,5 ppm.
A intensidade dos picos de um multipleto não é a mesma. Ela está associada ao número de transições naquela determinada freqüência de cada um dos picos observados. Para núcleos com I = ½, a intensidade dos picos do multipleto pode ser obtida a partir do triângulo de Pascal (Figura 17), dispensando o cálculo dos núme-ros de transições associadas a cada um dos picos. Assim, para um dupleto, por exemplo, a intensidade dos sinais será de 1:1; para um tripleto, de 1:2:1; para um quarteto, de 1:3:3:1; e assim por diante, segundo os valores expressos no triângulo de Pascal.
A distância entre cada um dos picos de um multipleto é chamada de cons-tante de acoplamento J (Figura 18), e
Figura 12: Influência de B1 na magnetização líquida
Figura 13: Decaimento
indica o quanto um acoplamento entre núcleos é efetivo: uma maior constante de acoplamento significa um acopla-mento mais efetivo.
Além disso, a constante de acopla-mento também pode servir para iden-tificar diferentes acoplamentos no es-pectro. Essa identificação é facilitada tendo-se em conta que, se um núcleo A acopla-se a um núcleo B com uma constante de acoplamento JAB, a cons-tante de acoplamento de B com A (JBA) deve ser igual a JAB (JAB = JBA). Tabelas contendo diferentes valores de cons-tantes de acoplamento para diferentes grupos funcionais e moléculas podem ser encontradas na Literatura,7-10 o que
facilita a interpretação dos sinais em um espectro de RMN de uma maneira inequívoca. Os valores das constantes de acoplamento J são dados em unida-des de freqüência (Hz) e são chamadas
1J, 2J, 3J, , nJ, dependendo do número
de ligações existentes entre os núcleos que acoplam (1, 2, 3, , n ligações, respectivamente).
A RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR EM DUAS
DIMENSÕES
Nas últimas quatro décadas, a rea-lização de experimentos de RMN em várias dimensões elevou sobremaneira a capacidade de resolução dessa técni-ca, ampliando, conseqüentemente, os seus horizontes de aplicação. A RMN em duas dimensões (RMN-2D) foi pro-posta em 1971,16 e hoje representa uma
poderosa técnica para a elucidação estrutural de moléculas orgânicas, inor-gânicas e principalmente de biomolé-culas. Essas moléculas apresentavam espectros de difícil interpretação devi-do, principalmente, à superposição de sinais ao longo de toda a faixa espectral e/ou em uma dada região de freqüên-cia17 (Figura 19). A RMN-2D
possibili-tou a interpretação dos espectros des-sas moléculas, antes dificilmente iden-tificadas pelos métodos em uma di-mensão.
Para entender as razões disso e o que é um espectro de RMN em duas dimensões, assim como o seu proces-samento, é necessário compreender conceitos como tempo de preparação,
tempo de evolução e tempo de detec-ção.
Tempo de preparação é o período durante o qual um sistema de spins é preparado para atingir o equilíbrio tér-mico. Esse tempo pode incluir a aplica-ção de um ou mais pulsos ou, simples-mente, ser um período t ≠0; pode até mesmo nem existir, dependendo do experimento que está sendo realizado. O importante é que o sistema de spins se encontre em equilíbrio antes que o experimento seja iniciado.
O tempo de evolução (chamado t1)
constitui o experimento de RMN pro-priamente dito, durante o qual o siste-ma de spins evolui fora da situação de equilíbrio pela aplicação de um ou mais pulsos, dependendo da informa-ção que se deseja obter. O tempo de detecção (ou tempo de aquisição, cha-mado t2) é o período durante o qual se adquire o sinal do FID.
Um experimento unidimensional pode apresentar esses três tempos (Fi-gura 20). O tempo de evolução (t1) é
fixo e o sinal recebido é apenas função do tempo de detecção (t2), que é variável. Em um experimento conven-cional em uma dimensão, o tempo de evolução t1 é zero e a detecção é realizada imediatamente após o pulso de radiofreqüência (Figura 21). Os spins sofrem ação do campo B1 e o
resultado é, então, detectado. O sinal
Figura 15: Espectro de hidrogênio do etanol
detectado no domínio temporal (FID) é transformado para o domínio das freqüências mediante a transformada de Fourier e o espectro resultante é um gráfico de amplitude x freqüência, chamado unidimensional porque ape-nas um dos eixos corresponde a fre-qüências de absorção (Figura 15).
Em um experimento bidimensio-nal, é válido o mesmo diagrama tem-poral (Figura 20). A principal diferen-ça é que existem obrigatoriamente dois períodos variáveis: o tempo de evolu-ção (t1, que em um experimento 1D pode ser zero) e o tempo de aquisição (t2). Fazendo-se uma série de experi-mentos nos quais variem progressiva-mente os valores do tempo de evolu-ção, desde zero até t1, tem-se duas
variações no domínio temporal: uma devida a t1 e outra devida a t2. Se uma
série de FIDs for detectada a partir desses experimentos nos quais se vari-am os valores de t1, a transformada de Fourier ao longo de t2 dessas diferentes FIDs fornecerá uma série de espectros 1D. Se uma outra transformada de Fourier for realizada ao longo de t1,
então poderemos obter um espectro bidimensional, com sinais observados
ao longo de duas dimensões, F1 e F2.18
Dessa forma, informações comple-xas, que antes apareciam em apenas uma dimensão (por exemplo, hidrogê-nios em ambientes químicos seme-lhantes que apresentam deslocamen-tos químicos muito próximos, o que pode levar à superposição de sinais), aparecem agora em duas dimensões, facilitando a interpretação do espectro para determinação da estrutura mole-cular.
O espectro bidimensional resultan-te pode ser representado de duas for-mas: o gráfico superposto (stacked), que mostra o espectro em três dimen-sões (F1, F2 e intensidade); e o gráfico
de contorno, que representa um corte horizontal do gráfico stacked. Esse corte é selecionado pelo próprio usu-ário de acordo com a intensidade que se deseja obter. O corte leva a um gráfico bidimensional F1 x F2 (Figuras 22, 23).
Embora o gráfico stacked seja mais fácil de ser visualizado, é, entretanto, mais difícil de ser analisado, uma vez que interpretação em três dimensões se torna mais complexa. Por isso, um corte transversal que gera um gráfico
Figura 17: Triângulo de Pascal mostrando a intensidade relativa dos picos para diferentes valores de multiplicida-de (n+1): para um tripleto, n=2; para um quarteto, n=3; e assim por diante.
Figura 18: Constante de Acoplamento (J)
de contornos (Figuras 22, 23) é muito mais utilizado, já que com ele se obtém um diagrama bastante cla-ro, constituído por linhas de contor-no que são bem mais convenientes de ser analisadas.
Existem hoje diferentes tipos de experimentos em RMN multidimen-sional (2D e 3D) que utilizam dife-rentes recursos tanto em termos de software como de hardware.13
Experimentos menos recentes também continuam sendo muito uti-lizados para elucidação estrutural. Os experimentos COSY (Correlated SpectroscopY) e HETCOR (HETero-nuclear CORrelation) são exemplos disso. O espectro COSY fornece cor-relações para o mesmo núcleo (por exemplo, 1H com 1H, Figura 22). O
espectro de 1H aparece ao longo da
diagonal. Os pontos fora dessa dia-gonal representam correlações entre hidrogênios não-equivalentes e são denominados cross-peaks.
Os cross-peaks, como mostra a Figura 22, devem, obrigatoriamen-te, formar um triângulo retângulo com relação aos picos correspon-dentes na diagonal, em razão da simetria do espectro, dado de grande importância na interpretação do es-pectro, pois é uma garantia de que os picos realmente estão acoplando. Caso não seja formado um triângulo retângulo, pode-se garantir que os picos em análise não estão acoplan-do. Além disso, o experimento COSY apresenta também a vantagem de obter os valores das contantes de acoplamento J em unidades de fre-qüência Hz, o que representa mais uma garantia do acoplamento entre os picos que estão sendo analisados. No caso do espectro obtido pelo experimento HETCOR (Figura 23), o espectro não aparece na diagonal. Em uma dimensão, aparece o espec-tro do hidrogênio, por exemplo, en-quanto em outra dimensão aparece o espectro do outro núcleo (no caso do espectro da Figura 23, o outro núcleo é o de carbono-13). O espec-tro bidimensional mostra as correla-ções existentes entre os dois núcleos como em um gráfico do tipo xy.
CONCLUSÃO
Apesar de relativamente recente, a Ressonância Magnética Nuclear já é referência mundial para a análise de estruturas moleculares em diversas áreas do conhecimento. Na Bioquímica mo-derna, essa técnica permitiu, de forma inédita, a investigação de estruturas tridimensionais de biomoléculas em condições próximas do estado fisioló-gico (soluções aquosas). Tal fato
pos-sibilitou um considerável avanço nos estudos de dinâmica molecular que, antes da RMN, limitavam-se quase que exclusivamente a dados cristalográfi-cos. Mesmo com todo o avanço tecno-lógico registrado ultimamente nesse campo, a determinação da estrutura tridimensional de uma biomolécula ainda não pode ser considerada uma tarefa trivial. As limitações e peculiari-dades dessa técnica, bem como a gi-gantesca demanda imposta pelos
vári-os projetvári-os genomas concluídvári-os neste começo de século, além daqueles que ainda estão por vir, indicam as dimen-sões do trabalho que se tem pela frente.
De fato, vários grupos de pesquisa têm-se unido em consórcios (The Rese-arch Collaboratory for Structural Bio-informatics, http://www.rcsb.org/ index.html), assim como empresas de biotecnologia (Celera Genomics; http:/ /www.celera.com/), para atacar de
for-Figura 19: Espectro de RMN-2D de uma proteína (Bloch Jr. C., et al. 1998)
Figura 20: Tempos possíveis em um experi-mento de RMN
ma mais eficiente a etapa considerada mais fascinante e desafiadora desses vários projetos, que é a determinação das estruturas tridimensionais de todas as proteínas sintetizadas por um dado ser vivo, ao longo de todas as etapas metabólicas de seu desenvolvimento. É possível que os próximos anos testemunhem iniciativas ousadas, a exemplo do projeto genoma humano, na área de determinação estrutural de proteínas, nos quais, tanto a cristolo-grafia de raio-X quanto a RMN multidi-mensional deverão ocupar papéis
de-cisivos na obtenção de estruturas 3D em larga escala. Espera-se que o pre-sente artigo possa dar uma contribui-ção, por menor que seja, nessa direção a partir da difusão dos fundamentos aqui apresentados e como introdução a uma próxima publicação dedicada exclusimente à RMN de proteínas.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor José Daniel Figueroa Villar pelos espectros do etanol gentil-mente fornecidos e a Rodrigo A.V.
Figura 22: Espectro COSY do etanol
Morales, pelos elaboração e arte de várias figuras apresentadas neste artigo.
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