Resumo
Muitos estudos clínicos demonstram o impacto do tabagismo sobre o aumento da fragilidade do tecido ósseo, entretanto a maior parte destes estudos se restringe às análises de exames de imagem e sintomas dos pacientes, o que dificulta o avanço no entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos no processo de reparação destes tecidos após a lesão estabelecida.
Assim, para avançarmos no entendimento do papel dos diferentes tipos celulares, quimiocinas e fatores de crescimento envolvidos no processo de remodelamento do tecido ósseo, foram coletadas amostras de tecido em pacientes fumantes submetidos à artroplastia total de quadril no qual avaliaremos os principais tipos celulares, assim como as quimiocinas e fatores de crescimento envolvidos na regulação das atividades destas células para a manutenção do processo de reparação do tecido ósseo e a histoarquitetura do tecido. Os pacientes foram divididos em três grupos experimentais: Fumantes (pacientes tabagistas que não pararam de fumar antes da cirurgia), ex- fumantes (pacientes tabagistas que pararam de fumar pelo menos 6 semanas antes da cirurgia) e não fumantes (pacientes que nunca fumaram). Foi avaliada a histoarquitetura do tecido ósseo da área de trabéculas, presença de Colágeno I através da técnica de imunofluorescência, expressão gênica dos Colágenos I e V e as quimiocinas IL-1, IL-6, TNF-alfa através da técnica de ELISA.
INTRODUÇÃO
Diversos estudos demonstraram os efeitos deletérios do tabagismo sobre o tecido ósseo, com aumento da diferenciação e da atividade dos osteoclastos e inibição da osteoblastogênese acarretando maior fragilidade óssea. Além disto, o tabagismo está entre um dos fatores desencadeantes dos processos inflamatórios envolvidos no desenvolvimento de doenças que acometem o sistema esquelético (1-4).
A remodelação óssea tem uma importante função para manter a homeostase do tecido depende da interação entre os principais tipos celulares presentes neste tecido: osteoclastos, osteoblastos e osteócitos. Os principais mediadores envolvidos na regulação da atividade destes tipos celulares são o RANKL e a OPG. O RANKL é uma molécula de superficie de membrana que pertence a família dos receptores de TNF que tem como função promover a osteoclastogênese e a reabsorção óssea, mas para que isso ocorra é necessario a interação do RANK (o ativador do receptor do fator kappa B nuclear) com o RANKL. A OPG (osteoprotegerina) é uma proteína expressa pelos osteoblastos, pelas células estromais da medula óssea e por outros tipos celulares, que age como antagonista ao RANK e, consequentemente, inibe a formação e a atividade dos osteoclastos (3-5).
OBJETIVOS GERAIS
Temos por objetivo no presente estudo avaliar o efeito do tabagismo sobre os mecanismos envolvidos no processo de reparação do tecido ósseo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar amostras que foram coletadas do tecido ósseo esponjoso retirado da epífise femoral proximal de pacientes fumantes e não fumantes submetidos à cirurgias ortopédicas para avaliação de tipos celulares e quimiocinas específicos ao metabolismo ósseo e da histoarquitetura do tecido.
METODOLOGIA
Este trabalho teve aprovação da Comissão de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP-FMUSP) CAAE 03581418.9.0000.0065 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). Para a realização da retirada do tecido ósseo, os pacientes foram submetidos à cirurgia de artroplastia total do quadril por via anterior (como já descrito no Relatório Parcial). As amostras foram retiradas da cabeça do fêmur (figura 1A), utilizando-se trefina 0,5mm. Logo após, as amostras foram armazenadas em freezer -80°graus para posterior pulverização e elaboração de homogenato para as avaliações de expressão gênica pelo método RT-qPCR em tempo real, ilustrado na figura 1C. Outra parte destas amostras foram mantidas por 24 horas em formol e, posteriormente, tratadas com tampão ácido nítrico para sequentemente serem emblocadas em parafina para confecção de cortes e lâminas histológicas., ilustrado na figura 1D.
A) B)
C) D)
Histoarquitetura do osso e imunofluorescência para marcação de COL1: Foram feitas colorações em hematoxilina e eosina para quantificação de número de trabécula e área de trabécula e imunofluorescência para coloração específica de col 1 ( Anti-colageno tipo I da Novus- Litlleton, CO). As análises morfométricas foram feitas através da utilização de um analisador de imagens e o software Image-Pro Plus versão 4.5 para Windows (Media Cybernetics-Silver Spring MD, EUA). Foram contabilizadas as áreas de trabécula positivas para imunomarcação e posteriormente, realizado o cálculo da área marcada por área total da trabécula.
Elisa: Foram analisadas as citocinas IL-6, IL-1 e fatores de crescimento TNF- α, com o equipamento de leitura Filter Max F5 e com software SoftMax Pro Sodtware (Molecular Devices). Os resultados foram obtidos com base na leitura da densidade i i .
P u C ig E
Anti-TNF-α 785173
Novo-Analítica, SP
Anti-IL1-β 785344
Anti-IL-6 785265
Tabela 1: Anticorpos primários para marcação de tecido ósseo.
RT-PCR:Para a análise da expressão gênica de COL1A1 e COL5A1, primeiramente, os tecidos obtidos foram pulverizados para extração do RNA total. A expressão gênica foi determinada através de uma reação de cadeia de polimerase de transcriptase reversa em tempo real (RT-qPCR) utilizando GAPDH como um g u çã “h u k i g g ” T i u çã transcriptase reversa foram preparadas utilizando o kit Superscript Platinum III One- Step (Invitrogen) e realizadas no termociclador Step One® (Applied Biosystems). As sequências de genes foram adquiridas através do endereço eletrônico:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide. As amostras do grupo controle foram utilizadas como calibradores e a expressão relativa foi calculada através do método 2−ΔΔCT
DESENVOLVIMENTO
Até o presente momento foram coletadas amostras de um total de 71 pacientes, os quais foram enquadrados nos grupos de inclusão e exclusão desta pesquisa. Destes 71 pacientes, 39 são pacientes controles, 16 tabagistas e 16 pacientes foram inseridos no grupo de ex-fumantes (pacientes que abandonaram o tab gi z ≥ 6
RESULTADOS PRELIMINARES
Figura 2: Em relação ao grafico, podemos diferenciar a área de trabéculas dos grupos Controle, Fumo (*p=0,003) e Ex-fumo (*p<0,001). (Controle n=14, Ex-fumo n=7, Fumo n=5). De acordo com a imagem ilustrada, observamos o afilamento das trabéculas do grupo Ex-fumo (figura 2B) e Fumo (figura 2C) em relação ao grupo Controle (figura 2A). Os valores estão expressos como média ± EP.
Figura 3: Expressão gênica COL1A1 e COL5A1. Observamos redução de expressão para COL1A1 no grupo Ex-fumo e Fumo (*p= 0,039), comparados ao grupo Controle. (Controle n=12, Ex- fumo n=5, Fumo n=8) e o aumento de expressão para COL5A1 no grupo Ex-fumo (*p=0,005) e Fumo (*p=0,005) comparados ao grupo Controle (Controle n=19, Ex-fumo n=6, Fumo n=5). Os valores estão expressos como média ± EP.
Figura 4: Expressão colágeno I, técnica de imunofluorescência. Observamos redução da expressão Colágeno I no grupo Ex-fumo (*p<0,001) observamos tendência do grupo Fumo quando comparados ao grupo Controle. (Controle n=12, Ex-fumo n=7, Fumo n=3). De acordo com a imagem ilustrada, é possivel observar a expressão de colágeno I presente em maior quantiddade no grupo Controle (figura 3A) quando comparado as grupos Ex-Fumo (figura 3B) e Fumo (figura 3C). Os valores estão expressos como média ± EP.
Figura 5: Analisando os 3 graficos, observamos a expressão da interleucina IL-6 e IL-1 beta, pela técnica de Elisa, aonde houve um aumento da expressão, desses 3 marcadores, no grupo Ex-fumo (*p<0,001) e no grupo Fumo (*p<0,001) quando comparados ao grupo Controle. (Controle n=14, Ex- fumo n=12, Fumo n=14). Os valores estão expressos como média ± EP.
Fontes consultadas
1. Tanaka Y, Nakayamada S, Okada Y. Osteoblasts and osteoclasts in bone remodeling and inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005; 4:325–8. 10.2174/1568010054022015.
2. Ikeda K, Takeshita S. Factors and mechanisms involved in the coupling from bone resorption to formation: how osteoclasts talk to osteoblasts. J Bone Metab. 2014; A21(3):163–7.
3. Martin TJ, Sims NA. RANKL/OPG; Critical role in bone physiology. Rev Endocr Metab Disord. 2015; 16:131–9.
10.1007/s11154-014-9308-6.
4. Zhao B. TNF and Bone Remodeling. Curr Osteoporos Rep. 2017; 15:126–34. 10.1007/s11914-017-0358-z.
5. PEREIRA, Rosa; LOPES, Jaqueline. Osteoporose. Medicinanet, 2010. Disponível em: https://www.
https://www.medicinanet.com.br/conteudos/revisoes/3749/osteoporose.htm. Acesso em: 16 de setembro de 2021.
