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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Fábio César Sousa Nogueira
Análise Proteômica da Deposição de Proteínas em Sementes em
Desenvolvimento e Suspensões Celulares Embriogênicas de
Feijão-de-Corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.]
Fortaleza - CE
FÁBIO CÉSAR SOUSA NOGUEIRA
Análise Proteômica da Deposição de Proteínas em Sementes em Desenvolvimento e
Suspensões Celulares Embriogênicas de Feijão-de-Corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.].
Esta dissertação foi apresentada como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Bioquímica, outorgado pela Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca de Ciências e Tecnologia da referida Universidade.
Orientador: Prof. Francisco de A. P. Campos
_______________________________
FÁBIO CÉSAR SOUSA NOGUEIRA
Análise Proteômica da Deposição de Proteínas em Sementes em Desenvolvimento e
Suspensões Celulares Embriogênicas de Feijão-de-Corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.].
Aprovada em: 22/06/2007
BANCA EXAMINADORA
Prof. Francisco A. P. Campos
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular Universidade Federal do Ceará
Prof. Gilberto Barbosa Domont Instituto de Química
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Dr. Márcio José da Silva
“Ser algum pode em nada desfazer-se! Em todos eles se agita sempre o eterno. Confia, alegre e feliz, sempre no Ser.
Que o ser é eterno; pois existem leis para conservar os tesouros da vida, às quais o Universo recorre para tirar beleza.”
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Francisco de Assis Paiva Campos, a quem devo grande parte do meu conhecimento intelectual. Agradeço a confiança depositada em mim e a orientação desse
trabalho.
Ao Prof. Gilberto Barbosa Domont, por ceder gentilmente o espaço de seu laboratório, pelo apoio intelectual e pela amizade.
Ao Dr. Márcio José da Silva, por aceitar participar da banca examinadora dessa dissertação.
Ao Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará e aos professores desse departamento.
À Marise, que ajudou nas análises dos resultados de espectrometria de massa
realizados nesse trabalho.
Ao Magno, pelo auxílio durante a realização desse trabalho. Por me receber de braços abertos em sua casa no período em que fiquei em Dresden (Alemanha).
Aos amigos, Érico Augusto e Petrônio Augusto, pelas trocas de experiência. Ao Abdul, companheiro de grandes momentos durante o período do mestrado e
pelos simples momentos, como cafezinho pela manhã.
Ao Thiago, que aceitou a tarefa árdua e prazerosa de encarar a química de proteínas.
Aos mais antigos amigos do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas: Juliana Brasil, Emmanuel, Camila e Eduardo. E aos novos integrantes do laboratório
Emanuela,JulianaVaez,Irlaine,Nicodemos,Rafael,Nicolas eFelipe.
Aos amigos do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. Ao Cleverson
e àJanne, pela amizade e apoio.
Aos meus pais, Maria de Fátima e Sousa e Plínio Nogueira Maciel, pelo carinho e pela dedicação em minha criação, obrigado por me propiciarem a vida. Mãe, obrigado
por levantar minha cabeça sempre que ela estava com “sono”.
Aos meus irmãos, Plínio Nogueira Maciel, Luís Carlos Sousa Nogueira e
Ricardo Sérgio Sousa Nogueira, pelo companheirismo.
À minha tia, Rita Liduína, por conceder um lugar no seu lar, onde eu fiquei hospedado durante as temporadas no Rio de Janeiro.
Aos novos membros da família, Amarildo, Seu Carlos (Tito), Dona Tereza,
Débora, Alexandre, André,Aline, Sáfia (minha querida e única afilhada) e Vanderléia
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes Instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de Pós-Graduação ao autor deste trabalho.
Banco do Nordeste (BNB), por concessão de auxílio à pesquisa através do Projeto de Pesquisa “Genômica Funcional, Estrutural e Comparativa do Feijão-Caupi (Vigna unguiculata)” (MCT/BNB, Programa RENORBIO – Rede Nordeste de Biotecnologia).
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, em cujos laboratórios esta pesquisa foi realizada.
RESUMO
ABSTRACT
SUMÁRIO
RESUMO………... viii
ABSTRACT………... ix
SUMÁRIO………... x
LISTA DE FIGURAS... xii
LISTA DE TABELAS………... xiv
ABREVIATURAS... xv
1. INTRODUÇÃO...……….... 16
1.1. O feijão-de-corda…...………... 18
1.2. Embriogênese vegetal………...…………... 20
1.2.1. Proteínas relacionadas com a embriogênese e desenvolvimento da semente... 22
1.2.1.1. Proteínas de reserva... 23
1.2.1.2. Proteínas LEA... 23
1.2.1.3. Proteínas relacionadas à patogênese... 24
1.3. A “era pós-genômica” e as técnicas de análise proteômica... 25
1.3.1. A eletroforese bidimensional...………... 26
1.3.2. A espectrometria de massa... 26
1.3.3. Identificação de proteínas por espectrometria de massa... 28
1.3.4. Proteômica de plantas... 30
2. OBJETIVOS... 32
2.1. Objetivo Geral... 33
2.2. Objetivos específicos...………... 33
3. MATERIAIS E MÉTODOS………... 34
3.1. Coleta do material biológico e estabelecimento da curva de peso fresco das sementes em desenvolvimento de feijão-de-corda (V. unguiculata)... 35
3.2. Estabelecimento dos calos embriogênicos e das suspensões celulares embriogênicas de feijão-de-corda (V. unguiculata)………... 35
3.3. Extração de proteínas.…………...…………...…...……….... 37
3.3.2. Extração de proteínas totais com tampão piridina... 37
3.3.3. Extração com tampão fosfato de potássio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0 e fracionamento em albuminas e globulinas.………...….. 38
3.4. Dosagem de proteínas.…...………... 38
3.5. Eletroforese bidimensional, revelação e análise da imagem...…... 38
3.6. Seleção e processamento dos spots para espectrometria de massa.…... 39
3.7. Espectrometria de massa………...……..……….………..……... 40
3.8. Pesquisa no banco de dados...……….………...… 40
3.9. Síntese de um peptídeo, preparação do antisoro e análise por western blot.………...…... 41
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 43
4.1. Análise proteômica das suspensões celulares embriogênicas (SCE) do fejão-de-corda (Vigna unguiculata)... 44
4.1.1. Estabelecimento dos mapas de referência bidimensionais... 44
4.1.2. Identificação das proteínas presentes em SCE... 44
4.1.3. Classificação funcional das proteínas de SCE... 51
4.2. Análise proteômica da deposição de proteínas em sementes do feijão-de-corda (V. unguiculata)...……...…….. 59
4.2.1. Estabelecimento dos mapas proteômicos de sementes com 10 DAA e sementes maduras... 61
4.2.2. Identificação de proteínas presentes em sementes com 10 DAA e sementes maduras... 65
4.2.3. Classificação funcional das proteínas de sementes...…..……... 89
4.2.3.1. Proteínas dos grupos metabolismo e energia... 91
4.2.3.2. Proteínas do grupo destinação de proteínas/proteínas de reserva... 93
4.2.3.3. Proteínas do grupo doença/defesa... 95
5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS... 98
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……...……… 100
LISTA DE FIGURAS
FIGURA Página
1 - Desenvolvimento de sementes do feijão-de-corda (Vigna unguiculata).
36
2 - Mapas de referência de suspensões celulares embriogênicas (SCE)
de feijão-de-corda (V. unguiculata).
46
3 - Mapas de referência de suspensões celulares embriogênicas (SCE)
de feijão-de-corda (V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
47
4 - Distribuição funcional relativa das proteínas identificadas em
suspensão celular embriogênica de feijão-de-corda (V. unguiculata).
52
5 - Análise por espectrometria de massa dos peptídeos trípticos eluídos
do “spot” 94.
56
6 - Detecção no feijão-de-corda (V. unguiculata) de proteínas que reagem com anticorpos produzidos contra o peptídeo
HSKGDAPPNEDELK, correspondente a uma sequência próxima ao
C-terminal da proteína PR-10.
57
7 - Análise por western blot da expressão da proteína PR-10 em
suspensão celular embriogênica de feijão-de-corda (V. unguiculata).
58
8 - Desenvolvimento das sementes de feijão-de-corda (V. unguiculata). 60 9 - Mapas de referência de sementes com 10 DAA e sementes maduras
de feijão-de-corda (V. unguiculata).
62
10 - Mapas de referência das frações ricas em albuminas de sementes
com 10 DAA e sementes maduras de feijão-de-corda (V. unguiculata).
63
11 - Mapas de referência das frações ricas em globulinas de sementes
com 10 DAA e sementes maduras de feijão-de-corda (V. unguiculata).
12 - Análise por espectrometria de massa dos peptídeos trípticos eluídos
do “spot” A54.
68
13 - Mapas de referência de sementes com 10 DAA de feijão-de-corda
(V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
69
14 - Mapas de referência da fração rica em albumina (FA) de sementes
em desenvolvimento (10 DAA) do feijão-de-corda (V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
70
15 - Mapas de referência da fração rica em globulina (FG) de sementes
com 10 DAA e sementes maduras do feijão-de-corda (V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
71
16 - Mapas de referência de sementes maduras de feijão-de-corda (V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
72
17 - Mapas de referência da fração rica em albumina (FA) de sementes
maduras do feijão-de-corda (V. unguiculata) com os “spots” selecionados para análise no espectrômetro de massa.
73
18 - Distribuição funcional relativa das proteínas identificadas em
sementes com 10 DAA e sementes maduras de feijão-de-corda (V. unguiculata).
90
19 - Padrão de deposição de glubulinas 7S/8S em sementes com 10
LISTA DE TABELAS
TABELA Página
1 - Lista das proteínas de suspensões celulares embriogênicas de
feijão-de-corda (V. unguiculata) identificadas por MS e MS/MS.
48
2 - Lista das proteínas de sementes com 10 DAA de feijão-de-corda (V. unguiculata) identificadas por MS e MS/MS.
74
3 - Lista das proteínas de sementes com 18 DAA de feijão-de-corda (V. unguiculata) identificadas por MS e MS/MS.
ABREVIATURAS
CEF... Calos embriogênicos friáveis
2,4-D... 2,4 ácido diclorofenoxiacético
ABA... Ácido Abscísico
2D... Eletroforese bidimensional
SCE... Suspensão celular embriogênica
DAA... Dia após antese
DTT... Ditiotreitol
IAA... Iodoacetamida
IPG... Gradiente de pH imobilizado
EST... Expressed sequence tag
LEA... Late embryogenesis abundant
PRP... Proteínas relacionadas com a patogênese
m/z... Relação massa/carga
MALDI-TOF... Matrix assisted laser disorption ionization – Time of flight
FA... Fração rica em albuminas
FG... Fração rica em globulinas
MS………... Mass spectrometry
PMF... Peptide mass fingerprint – “Impressão digital da massa do peptídio”
PSA... Persulfato de amônio
PVPP... Polivinilpolipirrolidona
SDS... Sodium doldecyl sulfate
SDS-PAGE... SDS-Poliacrilamida gel eletroforese
TCA... Ácido tricloroacético
TFA... Ácido trifluoroacético
NCBI... National Center for Biotechnology Information
O feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp.) é uma das mais importantes leguminosas cultivadas em regiões semi-áridas. Por ser tolerante a escassez de água,
temperaturas elevadas, prosperar em solos pobres, ele está bem adaptado às regiões
semi-áridas dos trópicos, onde outros legumes não se desenvolvem bem (Singh et al., 2003). Essa cultura também é uma importante fonte de carboidratos, lipídios, minerais, vitaminas,
incluindo folato, tiamina e riboflavina e, principalmente, proteínas para a população de
baixa renda (Phillips et al., 2003).
Essa espécie tem sido alvo de programas de melhoramento genético, tanto para
melhorar características nutricionais de suas sementes, quanto para torná-lo resistente às
pragas, à seca e à salinidade do solo (Ehlers e Hall, 1997;Babaoglu et al., 2000;Somers et al., 2003; Wang et al., 2003; Popelka et al., 2004; Aragão e Campos, 2007). A utilização de modernas ferramentas biotecnológicas é dificultada pela falta de técnicas de cultura de
tecidos que produzam células capazes de regenerar-se em uma planta completa e de
protocolos para a inserção de transgenes em células competentes.
Tentativas de regenerar o feijão-de-corda via embriogênese somática estão sendo adotadas, pois tecidos ou células embriogênicas são excelentes alvos para a transformação
genética (Arnold et al., 2002;Gomes et al., 2006; Aragão e Campos, 2007). Alguns tecidos foram usados como explantes para a indução de calos embriogênicos friáveis (CEF), como
folhas primárias (Muthukumar et al., 1995; Ramakrishnan et al., 2005a, b), cotilédones e eixo embrionário de embriões zigóticos maduros (Gonçalves, 2004). Embora os CEF
sejam capazes de diferenciar-se em embriões maduros (Ramakrishnan et al., 2005a, b), a freqüência de recuperação é baixa, o que limita a utilização desses CEF como alvos para a
transformação genética.
Os estudos relacionados com a fisiologia e bioquímica da embriogênese zigótica e
embriogênese somática, assim como da formação das sementes são de suma importância
quando se pretende abordar as técnicas de melhoramento genético, como, por exemplo, na
utilização de tecidos ou células embriogênicas e na identificação de genes específicos
relacionados à totipotência. Há muito interesse em identificar e entender o padrão de
expressão de proteínas nos diferentes estágios da embriogênese e do desenvolvimento da
semente. Métodos de identificação de proteínas em larga escala têm sido utilizados
recentemente neste sentido e trabalhos com uma abordagem proteômica foram realizados
2003; Gallardo et al., 2003; Imin et al., 2004; Imin et al., 2005; Lei et al., 2005) e soja (Glycine max) (Mooney et al., 2004; Hajduch et al., 2005; Natarajan et al., 2005).
Neste trabalho, dados sobre o desenvolvimento da semente do feijão-de-corda e a
identificação de muitas proteínas por espectrometria de massa são reportados. Este estudo
não somente catalogou as proteínas identificadas, mas também descreveu seu padrão de
acumulação em específicos estágios do desenvolvimento da semente, antes e depois do
período de dessecação. Estes dados são uma contribuição importante para o nosso
entendimento de como as redes metabólicas são reguladas durante a deposição de reservas
e obtenção da tolerância a dessecação. Este trabalho também mostra a identificação de
proteínas presentes em suspensões celulares embriogênicas (SCE) preparadas a partir de
CEF e o papel delas na embriogênese. Este conhecimento ajudará a esclarecer questões
fundamentais da embriogênese somática, como melhorar a freqüência de obtenção de
plantas completas através desse método e como as células adquirem competência de
entrarem numa rota metabólica embriogênica.
1.1. O feijão-de-corda
O feijão-de-corda, Vigna unguiculata (L.) Walp., é uma angiosperma dicotiledônea pertencente a Divisão Magnophyta, Classe Magnoliopsida, Subclasse
Rosidae, Ordem Rosales, Família Fabaceae, Subfamília Papilionoideae, Tribo Phaseoleae,
Subtribo Phaseolinae. Embora tenha pertencido a outros gêneros, Phaseolus e Dolichos, sua classificação atual como Vigna é mundialmente aceita. Esta espécie apresenta uma ampla distribuição geográfica e é especialmente adaptada às condições do semi-árido
(Freire-Filho, 1988). A subespécie unguiculata reúne todas as formas cultivadas de feijão-de-corda e engloba os cultigrupos: unguiculata, a forma mais comum; biflora ou catjang, caracterizado pelas pequenas vagens eretas, encontrado mais freqüentemente na Ásia;
sesquipedalis, também achado na Ásia, é caracterizado pela sua grande vagem; e textilis, achado na África Ocidental (Freire-Filho, 1988; Ehlers e Hall, 1997).
O feijão-de-corda é uma das mais importantes leguminosas cultivadas em regiões
semi-áridas, porque é tolerante a escassez de água, temperaturas elevadas, relativa
capacidade de fixar nitrogênio atmosférico e prosperar em solos com mais de 85% de
areia, menos de 0,2% de matéria orgânica e baixos níveis de fósforo (Singh et al., 2003). Vários são os países produtores de feijão-de-corda no mundo. Eles se concentram
registradas na Índia, no Brasil, na Nigéria e em outros países africanos (Singh et al., 2003). No Brasil, onde se encontram boas condições de clima e solo, o feijão-de-corda é
cultivado, predominantemente, nas regiões Norte e Nordeste do país (Araújo e Watt,
1988). Essa espécie tem uma importância muito grande para a sociedade brasileira, para a
agricultura nordestina e, em especial, para o Estado do Ceará, onde ocupa uma área de
579.221 hectares, distribuída sem exceções, por todos os municípios. O feijão-de-corda é a
principal fonte de proteínas, minerais e vitaminas para a população de baixa renda, que
possui sérias carências protéicas e alimentares, não só das regiões Norte e Nordeste do
Brasil, mas também, para as demais regiões do país (Araújo e Watt, 1988).
Apesar de ser disponibilizada uma grande área para a plantação do feijão-de-corda
a produção obtida é baixa. Há um rendimento inferior aos obtidos experimentalmente e
uma instabilidade na produção de ano a ano. Além dos fatores climáticos, no que concerne
às secas, comuns no Nordeste brasileiro, fatores de origem abiótica (baixa fertilidade,
salinidade e pH do solo, temperaturas elevadas, excesso de umidade, etc) e fatores de
origem biótica (pragas e doenças) também são responsáveis pela instabilidade da produção
de feijão-de-corda. Também podem-se constatar outros fatores, como: a utilização de áreas
menos favoráveis à exploração da cultura; o caráter de subsistência onde são adotados o
mínimo de tecnologias, já disponíveis; a ocupação das áreas exploradas pela cultura com
outras espécies vegetais, consideradas de maior importância econômica e; a falta de uma
política agrícola que garanta financiamento e aquisição do produto (Azevedo e Biserra,
1991; Singh et al., 2003).
Com o objetivo de superar as adversidades encontradas no cultivo do
feijão-de-corda, numerosos programas de melhoramento estão sendo desenvolvidos em vários
países, eles visam um aumento da produtividade, uma maior qualidade dos grãos, um
aumento na qualidade nutricional das sementes, uma maior resistência às secas e
temperaturas severas e a resistência às pragas e doenças. Os métodos de melhoramento
tradicionais principalmente utilizados são aqueles que exploram a variabilidade genética
disponível nas populações originais e as que exploram a variabilidade criada pela
hibridação. As novas tecnologias de melhoramento aplicam a biotecnologia como
ferramenta para o melhoramento do feijão-de-corda, fornecendo, assim, novas
possibilidades no aumento da produtividade dessa espécie (Aragão e Campos, 2007). O
dessa espécie. Alguns trabalhos citam a utilização da biotecnologia no melhoramento do
feijão-de-corda e de outros legumes (Ehlers e Hall, 1997; Babaoglu et al., 2000; Somers et al., 2003; Wang et al., 2003; Popelka et al., 2004; Popelka et al., 2006).
1.2. Embriogênese vegetal
O desenvolvimento da semente é um processo importante no ciclo de vida de uma
angiosperma. Ele se inicia com o processo da dupla fertilização, que conduz ao
desenvolvimento do embrião zigótico e do endosperma. Em plantas diplóides, o
desenvolvimento do embrião inicia com a fertilização de um ovo haplóide por um dos
núcleos espermáticos, originando assim, um zigoto diplóide. Já o desenvolvimento do
endosperma triplóide é iniciado quando a célula homodiplóide central é fertilizada por um
segundo núcleo espermático (Chaudhury et al., 2001). O desenvolvimento combinado do embrião e dos tecidos do endosperma, cada qual com diferentes ploidias, ocorre dentro dos
tecidos do óvulo materno circundado por camadas esporofíticas diplóides dos
integumentos internos e externos. Assim, a interação das diferentes combinações dos
genomas define o desenvolvimento da semente. O entendimento da atividade dos genes em
tecidos de diferentes ploidias e de diferentes origens é importante para conhecer
detalhadamente o desenvolvimento das sementes (Chaudhury et al., 2001).
Segundo Dodeman et al. (1997), o desenvolvimento da semente pode ser dividido em dois principais passos, o primeiro é a embriogênese sensu stricto iniciando com o zigoto e terminando com o estágio cotiledonar e o segundo passo é a maturação da semente
sucedida pela germinação. Com relação à embriogênese sensu stricto, estudos com a
Arabdopsis thaliana tem realçado que no desenvolvimento do embrião, ele passa através dos estágios globular, alongado, coração, torpedo, e cotiledonar e eventualmente para o
embrião maduro desidratado. Estes estágios podem ser subdivididos dentro de uma
seqüência de 20 diferentes estágios representados por três principais eventos: i) a primeira
divisão assimétrica do zigoto, formado por uma pequena célula apical que gera o embrião e
uma grande célula basal que formará o suspensor, ii) um padrão específico de formação
que origina um embrião globular e, iii) a transição do estágio cotiledonar que coincide com
a iniciação das raízes rudimentares seguida, em dicotiledôneas, pelas partes aéreas
rudimentares. Neste estágio a embriogênese sensu stricto pode ser considerada completa. A partir desse momento, em nível morfogenético, inicia-se a atividade meristemática e em
Mudanças fisiológicas como dissecação e, em muitos casos, quiescência, completam o
processo de formação da semente. O fortalecimento e lignificação dos integumentos do
óvulo resultam na formação de uma pele necessária para a conservação da semente
(Dodeman et al., 1997).
Algumas sementes podem ser produzidas sem que haja fertilização, através de
diferentes vias, todas conjuntamente conhecidas como apomixia (Dodeman et al., 1997). Este termo descreve a formação de um embrião no óvulo a partir de células somáticas (não
sexuais). A embriogênese pode também surgir a partir de células somáticas isoladas ou
mesmo células gaméticas. Observa-se naturalmente em alguns vegetais a formação
espontânea de embriões somáticos no corte de folhas ou in vitro depois de uma indução experimental (Dodeman et al., 1997). Nota-se, então, que a embriogênese somática é um processo que ocorre normalmente na natureza e que pode ser mimetizado in vitro.
A embriogênese somática é o processo pelo qual células ou tecidos somáticos
desenvolvem-se até a formação completa de uma planta através de uma série de estágios,
característicos do desenvolvimento de embriões zigóticos. Grupos de genes que são ativos
nas células dos cotilédones de embriões zigóticos são também ativos em células análogas
durante a embriogênese somática (Goldberg et al., 1989). Este desenvolvimento envolve expressões diferenciais dos genes conferindo às células somáticas a habilidade para
manifestar um potencial embriogênico (Chugh e Khurana, 2002). Imin et al. (2004) afirmam que a embriogênese somática é especialmente utilizada para a obtenção de plantas
transgênicas. Apesar de uma eficiente indução da embriogênese somática, a recuperação de
plantas do grupo das Leguminosae é limitada a poucas espécies (Lakshmanan e Taji,
2000). No caso do feijão-de-corda, a obtenção de embriões somáticos com a finalidade de
transformação dessa espécie pode ser desenvolvida utilizando-se diferentes tecidos. Alguns
trabalhos reportam a indução e formação de embriões somáticos a partir de suspensões
celulares provenientes de calos embriogênicos friáveis (Gonçalves, 2004; Ramakrishnan et al., 2005a; Ramakrishnan et al., 2005b), calos derivados de folhas primárias (Muthukumar
et al., 1995), cotilédones e eixo embrionário de embriões zigóticos maduros (Gonçalves, 2004) e cotilédones imaturos (Anand et al., 2001).
A embriogênese zigótica e somática são fenômenos complexos que são amplamente
descritos na literatura (Goldberg et al., 1989; Dodeman et al., 1997; Lakshmanan e Taji, 2000; Chaudhury et al., 2001; Chugh e Khurana, 2002). Ambos os tipos de embriogênese
moleculares relacionados a estágios específicos do desenvolvimento. O foco deste trabalho
estará na identificação de proteínas expressas nos diferentes estágios do desenvolvimento
das sementes e em suspensões celulares embriogênicas.
1.2.1. Proteínas relacionadas com a embriogênese e desenvolvimento da semente
Embriões vegetais expressam um grande número de genes, que diferem
espacialmente, no eixo embrionário e no cotilédone (Borisjuk et al., 1995). Embora, alguns dos genes importantes para a embriogênese sejam também expressos em tecidos
vegetativos. O estudo com embriões mutantes está possibilitando um maior conhecimento
das funções desempenhadas pelos genes no desenvolvimento embrionário (Dodeman et al., 1997). O gene STM tem um importante papel na função do meristema apical e representa o
primeiro gene envolvido na função de regulação específica durante a embriogênese
vegetal. Os genes CLAVATA 1 (CLV 1) e CLV 3 controlam a diferenciação celular. Os
genes CLV e STM apresentam papéis opostos ou competitivos na regulação da atividade
meristemática (Dodeman et al., 1997). O gene SERK é altamente expresso em células jovens que se desenvolvem em embriões e pode aumentar a competência embriogênica de
células cultivadas in vitro. O fator de transcrição WUSCHEL (WUS) promove embriogênese e é um gene chave que regula a manutenção de células indiferenciadas no
meristema apical e floral. O LEC 1 (Leafy Cotyledon 1), uma subunidade do fator de
transcrição HAP 3, está envolvido na maturação do embrião. O LEC 1 é reprimido por
WUS que por sua vez é reprimido por CLV 3 (Imin et al., 2004). A expressão de genes em embriões vegetais sugere uma complexidade a nível molecular que não é aparente numa
perspectiva anatômica. Ressalta-se a importância entre reguladores positivos e negativos
da manutenção e diferenciação do embrião.
Os estágios de desenvolvimento das sementes são caracterizados pela acumulação
de distintos grupos de proteínas no embrião e endosperma. Essas proteínas são altamente
reguladas durante esse processo. Embora não se entenda bem o papel de todas as proteínas
acumuladas durante a embriogênese e armazenadas na semente seca, as proteínas de
reserva servem, principalmente, como fonte de carbono e nitrogênio para germinação das
sementes. A acumulação de proteínas de reserva, marcador da fase de maturação, é seguida
1.2.1.1. Proteínas de Reserva
As proteínas de reservas são classificadas com base na sua extração e solubilidade
em água (albuminas), solução salina diluída (globulinas), solução alcoólica (prolaminas) e
solução ácida ou básica diluída (glutelinas) (Shewry et al., 1995).
A maioria das proteínas em sementes de legumes consiste de proteínas de reserva
de caráter globulínico, que são sintetizadas durante o desenvolvimento das sementes,
estocadas em corpos protéicos e hidrolisadas durante a germinação com a finalidade de
fornecer aminoácidos ou esqueletos de nitrogênio e carbono para o desenvolvimento das
plântulas. As demais proteínas são, principalmente, albuminas que incluem proteínas de
reserva, de manutenção, lectinas, lipoxigenases, entre outras (Shewry et al., 1995; Dodeman et al., 1997; Maruyama et al., 2003; Wang et al., 2003).
As globulinas são geralmente classificadas como proteínas 11S/12S (leguminas) e
7S/8S (vicilinas) de acordo com seu coeficiente de sedimentação. Essas proteínas são
oligoméricas, e quando submetidas à dissociação, originam polipeptídeos heterogêneos.
Essa heterogeneidade é evidente pelo tamanho e pela carga dos polipeptídeos, e resulta de
uma combinação de dois fatores, origem multigênica de cada globulina e modificações
pós-traducionais. As principais proteínas de reserva do feijão-de-corda são as globulinas
7S ou vicilinas, que são responsáveis pelo valor nutricional da semente (Pedalino et al., 1992; Shewry, et al., 1995; Duranti e Gius, 1997). Recentemente a composição das proteínas de cotilédones do feijão-de-corda foi analisada por Freitas et al. (2004), neste trabalho as globulinas totais foram fracionadas e as principais globulinas foram nomeadas
de ]-, ^- e_-vignina.
1.2.1.2. Proteínas LEA
Um importante grupo de proteínas envolvido com o desenvolvimento da semente
são as proteínas LEA. Proteínas LEA são classificadas em pelo menos cinco grupos, de
acordo com suas seqüência de aminoácidos (Wise, 2003). Geralmente, a presença de
proteínas LEA está correlacionada com a tolerância à dessecação. Elas acumulam-se em
altos níveis durante o desenvolvimento das sementes no final da fase de maturação, onde a
semente começa a perder água. Nessa fase, as proteínas LEA têm um papel no
estabelecimento da tolerância à dessecação, atuando como osmoprotetores ou chaperonas.
Outra função mais específica desempenhada por essas proteínas é de seqüestrar íons ou
abscísico) tem um papel chave no controle dos processos fisiológicos e moleculares
envolvidos no desenvolvimento da tolerância à dessecação em sementes, desta forma, a
expressão dos genes LEA são altamente regulados pelas concentrações desse hormônio
(Campalans et al., 2000; Delseny et al., 2001).
As dehydrins são imunologicamente uma distinta família de proteínas, também conhecida como família LEA D11, que tipicamente acumulam-se durante os últimos
estágios da embriogênese ou em resposta a aplicação de ABA, baixa temperatura, seca,
congelamento e salinidade (Close, 1996; Campbell e Close, 1997). A expressão dos genes
que codificam dehydrins também esta associada às concentrações do hormônio vegetal ABA, que tem sua concentração aumentada em condições de desidratação. A característica
que define as dehydrins é a presença de um domínio ]-hélice anfipático em sua molécula, o segmento K, que é conservado nas plantas. A presença da dehydrin em feijão-de-corda foi reportada por Ismail et al. (1999). Os autores demonstraram que o acúmulo de uma
dehydrin de 35 kDa coincide com o início da fase de desidratação da semente do feijão-de-corda.
1.2.1.3. Proteínas relacionadas à patogênese
A indução de proteínas relacionadas à patogênese foi descrita em muitas espécies
vegetais sob infecção de fungos, bactérias, vírus ou pelo ataque de insetos. Essas proteínas
são classificadas dentro de 17 famílias de proteínas relacionadas à patogênese (PRPs) (van
Loon et al., 2006). Elas ocorrem através de elicitores produzidos pelo patógeno no momento do estabelecimento do contato com a planta. Originalmente, as PRPs foram
classificadas com base nas suas características de proteínas vegetais induzidas ou
relacionadas com situações patológicas. No entanto, observações posteriores indicaram a
presença de PRPs em plantas na ausência de patógenos. Dessa forma, o termo “proteínas
relacionadas à patogênese” tornou-se mais abrangente, incluindo as proteínas induzidas por
micróbios ou pelo ataque de insetos e seus homólogos presentes nos processos de
desenvolvimento de tecidos e órgãos ou em situações de estresse (van Loon e van Strien,
1999; Przymusinski et al., 2004; van Loon et al., 2006).
Muitas PRPs estão presentes em específicos estágios de desenvolvimento. Dentre
elas as proteínas das PR-3 e 4, quitinases que ocorrem em tecidos embriogênicos. As das
PR-10 (ribonucleases) atuam na regulação dos hormônios vegetais, auxinas e citocininas, e
induzir as PRPs, como o efeito da toxicidade do excesso de manganês no apoplasto de
folhas de feijão-de-corda mostrado por Fecht-Christoffers et al. (2003).
1.3. A “era pós-genômica” e as técnicas de análise proteômica
A automatização do seqüênciamento do DNA mudou consideravelmente o
entendimento da biologia. Antes os genes eram caracterizados individualmente, mas nos
últimos anos, tornou-se possível identificar completamente a informação contida em um
organismo (genoma). O termo genômica foi introduzido para caracterizar a completa
informação genética de um organismo (Williams, 1999). O começo da genômica logo
provocou a necessidade de se entender a enorme quantidade de dados obtidos pelos
programas genômicos, surgindo, assim, a “era pós-genômica”. Sozinha, a seqüência de
DNA é incapaz de predizer: se e quando os produtos gênicos são transcritos e traduzidos;
as concentrações relativas desses produtos; a extensão das modificações pós-traducionais;
os efeitos de genes “knock-out” ou superexpressos e; o fenótipo de fenômenos de origem
multigênicas, incluindo a administração de drogas, o ciclo celular, a ontogenia, o
envelhecimento, o estresse e a doença (Humphery-Smith et al., 1997). Para solucionar esses problemas um novo campo tem ganhado destaque na ciência das proteínas, a
proteômica, ou o estudo das proteínas expressas por um genoma (proteoma). Agora é
possível perceber a descrição completa, a nível protéico, de um organismo ou tecido sob
determinadas condições. Diferentemente do genoma de um organismo, o proteoma é
variável, sujeito a mudanças como em estágios desenvolvimento, doenças ou condições
ambientais (Pandey e Mann, 2000; Sperling, 2001; Westermeier e Naven, 2002).
O avanço da proteômica foi substancialmente facilitado pelo desenvolvimento de
técnicas que ocorreram paralelamente, como: (1) a melhoria na técnica de eletroforese
bidimensional possibilitou uma alta resolução e reprodutibilidade dos géis obtidos, a
inovação chave foi o desenvolvimento de géis com gradiente de pH imobilizado aplicados
à focalização isoelétrica (Görg et al., 1988; Görg et al., 1999; Görg et al., 2000; Görg et al., 2004); (2) um software que analisa as imagens geradas pelos géis, permitindo arquivar as imagens e compará-las com outras; (3) a invenção de novas técnicas de ionização e
detecção para os espectrômetros de massas, que possibilitaram a análise de proteínas e
peptídeos com alta sensibilidade, acurácia e rapidez, permitindo também a análise de
projetos genomas, pois a seqüência de DNA de organismos é muito importante para a
identificação e caracterização de proteínas com o espectrômetro de massa; e (5) o
desenvolvimento no campo da bioinformática tem fornecido ferramentas para combinar e
armazenar a grande quantidade de dados produzidos por esses novos métodos de análise
(Westermeier e Naven, 2002).
1.3.1. A eletroforese bidimensional
Em meados da década de 70, uma nova técnica de separação de proteínas foi
introduzida por O’Farrel e Klose, independentemente. A eletroforese bidimensional utiliza
duas características físico-químicas das proteínas como meio de separação de amostras
complexas obtidas de células, tecidos ou outras fontes biológicas. Desse modo, essa
técnica ocorre em dois passos: o primeiro passo (primeira dimensão), a focalização
isoelétrica (IEF), que separa as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos (pI); o
segundo passo (segunda dimensão), eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
(SDS-PAGE), que separa as proteínas de acordo com seu peso molecular (MW). Os spots
gerados, de modo geral, correspondem a uma única espécie de cadeia polipeptídica da
amostra, e a qualidade e quantidade de cada espécie podem ser determinadas através da
revelação do gel com corantes e posterior analise de densitometria. Numa eletroforese
bidimensional milhares de proteínas podem ser separadas simultaneamente, também é
possível obter informações sobre o pI, a massa molecular e a abundância relativa, assim
como modificações pós-traducionais, já que, geralmente, elas provocam mobilidade
eletroforética alterada, dessas proteínas (Westermeier e Naven, 2002).
O poder da eletroforese bidimensional como uma técnica de separação bioquímica
foi reconhecido desde sua introdução. Sua aplicação, contudo, tornou-se significante
somente nas últimas décadas, pois a aplicação de gradientes de pH imobilizados para a
primeira dimensão mostrou que a técnica é reprodutível o bastante para uma análise
proteômica (Görg et al., 1988; Görg et al., 1999; Görg et al., 2000; Görg et al., 2004). Um fator determinante nessa técnica é permitir análises posteriores ao fracionamento, como,
por exemplo, por espectrometria de massa (Lambert et al., 2005).
1.3.2. A espectrometria de massa
A espectrometria da massa esta emergindo como uma importante ferramenta na
pequenas. Esta técnica baseia-se na determinação precisa da relação massa-carga (m/z) de
íons em fase gasosa. Os íons são gerados pelo ganho ou perca de uma carga (elétron
ejeção, protonação ou desprotonação). Uma vez que os íons são formados eles podem ser
separados de acordo com a relação m/z e posteriormente detectados. O resultado da
ionização, separação dos íons e detecção forma um espectro de massa que pode fornecer a
determinação precisa da massa molecular, quantificação de cisteínas, localização de pontes
dissulfeto, determinação de modificações pós-traducionais tais como glicosilações e
fosforilações, determinação da seqüência de aminoácidos e principalmente a identificação
de proteínas (Siuzdak, 1996).
O espectrômetro de massa é constituído de três partes: uma fonte de íons,
responsável pela introdução de cargas e vaporização da amostra; o analisador de massas,
que determina a relação massa carga (m/z); e o detector, que registra o número de íons de
cada valor m/z. As fontes de ionização mais comumente usadas para volatilizar e ionizar
proteínas ou peptídeos são, a ionização por eletrospray (ESI) e a ionização por dessorção a
laser auxiliado por matriz (MALDI). O ESI ioniza um analito que esta em solução,
enquanto o MALDI ioniza o analito numa seca e cristalina matriz via pulsos de laser. O
MALDI-MS é normalmente usado para analisar misturas peptídicas relativamente simples,
já o ESI-MS, quando integrado com um cromatógrafo líquido (LC-MS), é preferido para
analisar amostras mais complexas. O analisador de massas é central no contexto da
proteômica, seus parâmetros chave são a sensitividade, resolução, acurácia e capacidade de
gerar espectros de íons fragmentados. Há quatro tipos fundamentais de analisadores usados
na pesquisa proteômica, são eles: íon trap, tempo de vôo (TOF), quadrupolo (Q) e “Fourier
transform ion cyclotron” (FT-MS) (Yates III, 2004).
As fontes de ionização podem ser combinadas com os analisadores permitindo,
também, a construção de equipamentos híbridos de alto desempenho. Uma combinação
que tem se mostrado muito eficiente é a MALDI-TOF, onde a ionização e dessorção da
amostra ocorrem pela diluição desta em uma matriz orgânica, geralmente ácido
-ciano-4-hidroxicinâmico, que contem um grupo cromóforo que absorve luz no comprimento de
onda do ultravioleta ou infravermelho. À medida que os solventes da matriz e da amostra
evaporam ocorre uma co-cristalização de ambos em uma placa de aço inoxidável contendo
micro-fissuras para aplicação da mistura. Este cristal, submetido a pulsos de laser na faixa
de absorção do cromóforo, provoca uma fotoionização dos analitos pela transferência de
gasosa. Após entrarem em fase gasosa os analitos são encaminhados ao analisador do tipo
TOF, onde os íons são acelerados por uma diferença de potencial aplicada entre a fonte e o
detector e, portanto percorrem um espaço livre (tubo de vôo), sob vácuo, até serem
detectados. Como a voltagem de aceleração é a mesma, os íons de m/z diferentes
separam-se no espaço livre e chegam a tempos diferentes proporcionais à raiz quadrada da relação
massa/carga (m/z) dos íons. Assim, os componentes individuais em uma mistura de íons
são separados de acordo com suas relações m/z, tornando possível a determinação da
massa de cada proteína ou peptídeo, submetido à análise, através da geração dos espectros
de massa (Mann et al., 2001; Ashcroft, 2003). Depois de determinar os valores m/z e a intensidade de todos os picos do espectro, podem-se obter informações sobre a estrutura
primária (seqüência) dos peptídeos trípticos. Esta estratégia é chamada MS em tandem,
MS/MS ou MS², já que acopla dois estágios de MS e utiliza equipamentos do tipo MS/MS.
Nesta técnica um íon-pai (ou precursor) é selecionado no primeiro MS e, no segundo, sofre
uma fragmentação, geralmente com um gás inerte, denominada de dissociação induzida
por colisão (“Collision-Induced Dissociation, CID”). Os novos picos produzidos pelos
produtos gerados (íons-filhos) têm suas relações massa/carga determinadas em um segundo
analisador. De modo geral, cerca de seis séries de íons que aparecem nos espectros de
MS/MS sob baixa energia de colisão. Ocorrem as séries a, b, c, quando a carga permanece
na porção N-terminal da molécula e as séries x, y, z quando a carga permanece na porção
C-terminal. Em altas energias de colisão ocorrem às séries d, v, w, que correspondem às
fragmentações de cadeias laterais dos aminoácidos. Os íons mais comuns e informativos
são os íons b e y, gerados pela fragmentação, em baixa energia, da ligação peptídica
existente entre os aminoácidos. Em analisadores do tipo quadrupolo, quadrupolo-TOF e
TOF-TOF os íons-y são mais freqüentemente observados, já nos tipos “ion-trap”, ambas as
series são observadas mais ou menos na mesma intensidade. Num dado espectro originado
da fragmentação de um íon escolhido (precursor) a diferença entre dois picos subseqüentes
de uma mesma série tem como resultado a massa de um resíduo de aminoácido. Então,
desta maneira, pode-se determinar a seqüência de aminoácidos considerando a diferença de
massa entre picos vizinhos (Steen e Mann, 2004).
1.3.3. Identificação de proteínas por espectrometria de massa
Existem algumas estratégias usadas na identificação de proteínas por espectometria
das massas dos peptídeos (peptide mass fingerprinting - PMF) e a busca através de dados de MS/MS não interpretados.
O princípio do PMF é baseado no conceito que, se uma proteína é digerida com
uma enzima que apresenta uma dada especificidade de seqüência, tal como a tripsina, por
exemplo, ela gera fragmentos únicos e previsíveis. Neste procedimento a proteína de
interesse, em muitos casos fracionada por eletroforese bidimensional, é enzimaticamente
clivada e a mistura de peptídeos obtida é analisada por espectrometria de massa. Esse perfil
de clivagem gerado funciona como uma impressão digital desta proteína. O mapa peptídico
obtido por espectrometria de massa é processado, e subseqüentemente, seus dados
submetidos a programas que permitem compará-lo com os peptídeos gerados “in silico”
para todas as seqüências presentes nos bancos de dados (Yates III, et al., 1993; Henzel e Watanabe, 2003; Thiede et al., 2005).
Apesar de o PMF ser bastante utilizado, há muitos problemas associados a esse
método, principalmente na confiança das identificações obtidas. Uma outra estratégia
adotada para a identificação de proteínas por MS é a utilização dos dados de MS/MS não
processados em programas de busca disponíveis. O problema de seqüênciamento de
peptídeos, utilizando-se dados de MS/MS, poderia ser convertido em um simples problema
de combinação com os bancos de dados, sem precisar interpretar os espectros. O espectro
de fragmentação de peptídeos pode não conter informações suficientes para derivar a
seqüência completa de aminoácidos sem ambigüidades, mas pode ter informação suficiente
para combiná-la de maneira única com uma seqüência peptídica no banco de dados usando
somente os fragmentos de íons observados e esperados. Existem vários algoritmos que são
usados para a busca de seqüências em bancos de dados com espectros provenientes de
análises de MS/MS não processados, como por exemplo, “PeptideSearch”, “Sequest”,
“Mascot”, “Sonar MS/MS” e “ProteinProspector”. Na maioria destes programas é ainda
possível submeter os dados de MS junto com os dados de MS/MS, gerando um único valor
de significância na identificação (“score”). Uma limitação da busca em banco de dados
usando somente os dados de MS e MS/MS sem processamento é a necessidade de termos a
seqüência da proteína no banco de dados ou a seqüência de proteínas bem próximas para
uma identificação cruzada por homologia (Mann et al., 2001).
Outras estratégias podem ser usadas a fim de obter a identidade de proteínas. Se a
proteína de interesse não está presente no banco de dados, as seqüências dos peptídeos
seqüências podem ser empregadas em buscas de similaridades de seqüência em programas
específicos (MS-BLAST). Essa estratégia é bastante interessante quando o organismo
estudado possui poucas informações genômicas (Shevchenko et al., 2001; Habermann et al., 2004).
1.3.4. Proteômica de Plantas
Nos últimos anos podemos constatar uma maturidade nos dados obtidos a partir dos
trabalhos publicados sobre proteômica vegetal (Glinski e Weekwerth, 2006; Rossignol et al., 2006).
Os passos mais críticos no emprego da proteômica em plantas são a extração e
preparação da amostra. Sabe-se que nos vegetais, grande parte do volume celular é
constituída de proteínas, embora que, em relação às células animais e microorganismos, os
tecidos vegetais possuam um teor menor de proteínas, pois nestes organismos parte
significativa do espaço celular é ocupada pelo vacúolo, e uma série de compostos que
dificultam a análise protéica como: proteases, compostos fenólicos e metabólitos
secundários que têm efeito deletério durante o processo de extração de proteínas (Michaud
e Asselin, 1995; Newton et al., 2004). Atualmente, há uma grande preocupação no estabelecimento de um protocolo de extração que possa ser aplicado a uma vasta gama de
tecidos vegetais (Giavalisco et al., 2003; Saravanan e Rose, 2004; Vasconcelos et al., 2005; Carpentier et al., 2005; Isaacson et al., 2006).
Recentemente foi publicada uma revisão sobre a aplicação da proteômica nos
vários processos do desenvolvimento vegetal (Hochholdinger et al., 2006). Vários trabalhos utilizam essa abordagem na embriogênese e no desenvolvimento das sementes.
Em Arabdopsis, Gallardo et al. (2001) adotaram uma abordagem proteômica para estudar a germinação das sementes; Higashi et al. (2006) compararam o proteoma de sementes maduras de plantas selvagens e o proteoma de sementes de plantas mutantes (mto1-1) que crescem na deficiência de enxofre e; Chibani et al. (2006) investigaram a dormência em sementes com a finalidade de inferir os mecanismos moleculares e bioquímicos do papel
protoplastos; Imin et al. (2005) investigaram o perfil protéico e suas alterações durante a indução e formação de embriões somáticos; Lei et al. (2005) utilizaram uma abordagem proteômica em culturas de células em suspensão obtidas de calos de raízes; e Boudet et al. (2006) investigaram o papel das proteínas LEA na tolerância a dessecação em radículas de
sementes durante a germinação. Em soja (Glycine max), Mooney e Thelen (2004) identificaram as proteínas de sementes, principalmente proteínas de reserva; Natarajan et al. (2005) compararam diferentes métodos de extração de proteínas de soja que seja compatível com a eletroforese bidimensional; e Hajduch et al. (2005) investigam o padrão de deposição de proteínas em sementes em desenvolvimento. Em feijão-de-corda (Vigna unguiculata), Vasconcelos (2005) e Vasconcelos et al. (2005), investigaram métodos de extração de proteínas compatíveis com uma análise proteômica tanto de sementes em
desenvolvimento, quanto em suspensões celulares embriogênicas.
A avaliação de métodos de extração compatíveis com uma análise proteômica, a
elaboração de mapas proteômicos de alta qualidade e a identificação e classificação
funcional das proteínas presentes em sementes e suspensões celulares embriogênicas de
feijão-de-corda (V. unguiculata) reportados neste trabalho são de extrema valia para elucidar mecanismos moleculares relativos à embriogênese e ao desenvolvimento da
semente. Mecanismos estes, que auxiliarão os modelos de regeneração e transformação
genética de plantas. Tais conhecimentos levarão a caracterização de proteínas associadas
com os diversos estágios da embriogênese, permitindo, assim, o estabelecimento de um
2.1. Objetivo Geral
Analisar a deposição de proteínas durante o desenvolvimento de sementes e
suspensões celulares embriogênicas de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.].
2.2. Objetivos específicos
- Elaborar mapas proteômicos reprodutíveis e de alta qualidade para sementes em
desenvolvimento e suspensões celulares embriogênicas.
- Identificar as proteínas presentes em sementes em desenvolvimento e suspensões
celulares embriogênicas.
- Classificar funcionalmente as proteínas identificadas e analisar a importância dessas
3.1. Coleta do material biológico e estabelecimento da curva de peso fresco das sementes em desenvolvimento de feijão-de-corda (V. unguiculata)
Sementes de feijão-de-corda, cultivar Pitiúba, foram semeadas em um campo no
Jardim Botânico do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, no
Campus do Pici, em Fortaleza (Figura 1A). Imediatamente após a abertura das flores, estas
receberam uma etiqueta na qual constava o dia de sua abertura (antese) (Figura 1B).
Vagens (Figura 1C e D), com 2, 4, 6, 8 10, 12, 14, 16 dias após a antese (DAA) e com
sementes maduras (> 18 DAA), foram coletadas e destas foram retiradas as sementes, no
caso das vagens mais jovens (2, 4 e 6 dias), com auxílio de lupa, pinça e bisturi.
Para obter a média dos pesos frescos, 10 sementes de cada dia após a antese (DAA)
foram pesadas, sendo realizadas cinco repetições de cada pesagem.
3.2. Estabelecimento dos calos embriogênicos e das suspensões celulares embriogênicas de feijão-de-corda (V. unguiculata)
O estabelecimento da cultura de calos embriogênicos foi feito como descrito por
Gonçalves (2004). Os explantes utilizados para o início de uma cultura de calos de
feijão-de-corda foram folhas de plântulas com três dias após a germinação. As sementes
utilizadas passaram por uma assepsia que consistia no mergulho destas em álcool 70% por
1 minuto, seguido de hipoclorito de sódio por 10 minutos, após o que eram lavadas
exaustivamente com água destilada estéril. A germinação ocorreu em frascos, contendo
algodão umedecido e previamente autoclavados.
Três dias após a germinação as folhas das plântulas foram excisadas e explantes
foliares com cerca de 0,5 cm2, desprovidos da nervura central, foram incubados em placas
de Pettri contendo meio MS suplementado com sacarose 3%, agar 0,7%, glutamina e
caseína 100 mg/l e 2,4-D 0,5 mg/l. O subcultivo da cultura de calos é feito a cada 15 dias.
As placas foram mantidas sob fotoperíodo de 16 horas em claro e temperatura de 25 + 2ºC.
Após três subcultivos, houve uma rápida formação de calos embriogênicos friáveis
(CEF) que foram utilizados para iniciar as suspensões celulares embriogênicas (SCE). Os
calos foram transferidos para frascos erlemeyers de 150 ml contendo 30 ml de meio MS
suplementado com sacarose 3%, ágar 0,7%, glutamina e caseína 100 mg/l e 2,4-D 1 mg/l, e
mantidos em um agitador orbital a 100 rpm, sob fotoperíodo de 16 horas em claro e
temperatura de 25ºC, sendo o meio de cultura renovado a cada 4 dias. Todo o
3.3. Extração de proteínas
3.3.1. Processamento do material biológico
As sementes com 2 e 4 DAA foram utilizadas integralmente para a extração de
proteínas, enquanto as demais (6, 8, 10, 12, 14, 16 e > 18 DAA) tiveram o embrião isolado,
sendo a casca e os demais tecidos não embriônicos descartados. Em seguida, todos os
materiais foram congelados em nitrogênio líquido e liofilizados até peso constante. O
material liofilizado foi macerado até adquirir o aspecto de farinha fina, a qual foi utilizada
para a extração de proteínas.
Para a extração de proteínas das suspensões celulares embriogênicas, os erlemeyers
contendo a SCE eram deixados em repouso por 30 minutos para que as células
sedimentassem por gravidade. O sobrenadante era descartado e às células foram
adicionados 50 ml de água destilada. Seguia-se leve agito e novo repouso por 30 minutos.
Este procedimento foi realizado cinco vezes para a completa subtração do meio de cultura.
Após o descarte do último sobrenadante as células eram congeladas e liofilizadas até peso
constante. O material liofilizado foi macerado até adquirir o aspecto de farinha fina, a qual
foi utilizada para a extração de proteínas.
3.3.2. Extração de proteínas totais com tampão piridina
Utilizando o método descrito por Vasconcelos et al. (2005) para a extração de proteínas totais, a farinha do tecido de interesse foi misturada com tampão contendo
piridina 50 mM, tiouréia 10 mM, SDS 1%, pH 5,0 na proporção de 1:40 (p/v), à mesma
adicionou-se polivinilpolipirrolidona (PVPP), em quantidade igual a duas vezes a massa da
amostra. A mistura ficou sob forte agitação a 4ºC, passadas duas horas o material foi
centrifugado a 10.000 g por 40 min. Ao sobrenadante foram adicionados quatro volumes
(1:5, volume do sobrenadante/volume total) de acetona gelada contendo 10% de ácido
tricloroacético (TCA) para permitir a precipitação, foi armazenado por duas horas (ou
durante a noite) a – 20ºC. Seguiu-se centrifugação a 10.000 g por 20 min com subseqüente
descarte do sobrenadante. O precipitado contendo as proteínas totais foi lavado com
acetona. Para tanto, o precipitado foi ressuspenso em acetona gelada (100 µl/mg do
material de partida) e agitado até adquirir o aspecto de suspensão, sendo em seguida
realizada no mínimo duas vezes para livrar a amostra de qualquer traço de TCA. O
precipitado final foi seco a vácuo no dessecador, dessa forma um pó branco foi obtido.
3.3.3. Extração com tampão fosfato de potássio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0 e
fracionamento em albuminas e globulinas
Ao tecido de interesse foi adicionado, na proporção de 1:10, tampão fosfato de
potássio 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 8,0, contendo um “mix” de inibidores de protease (PMSF
0,1 mM, leupeptina 50 gM, E-64 5 gM e EDTA 1 mM), e PVPP na proporção de 1:1. A
mistura foi agitada durante 2 horas a 4ºC e submetida a uma centrifugação (30 min, 10.000
g e a 4ºC). O sobrenadante foi centrifugado (20 min, 10.000 g e a 4ºC), o novo
sobrenadante foi filtrado em papel de filtro (fração solúvel – FS) e, posteriormente,
dialisado a 4ºC contra água destilada gelada, no mínimo três trocas. Após a diálise, ocorreu
uma centrifugação (30 min, 10.000 g e a 4ºC), onde o sobrenadante (fração rica em
albuminas – FA) foi separado do resíduo. O resíduo foi lavado com água destilada e
centrifugado (20 min, 10.000 g e a 4 ºC). Esse passo foi repetido três vezes. O resíduo final
foi chamado de fração rica em globulinas (FG). As frações ricas em albuminas e globulinas
foram congeladas a – 20ºC, liofilizadas e armazenadas a – 20ºC para posterior análise.
3.4. Dosagem de proteínas
O método de Bradford (1976) foi empregado para avaliar a quantidade de proteínas
obtidas em cada processo de extração e estipular a quantidade de proteínas a ser utilizada
nos subseqüentes experimentos.
3.5. Eletroforese bidimensional, revelação e análise da imagem
As amostras foram dissolvidas em 50-100 µl de uréia 7 M, tiouréia 2 M. Uma
alíquota de cada amostra dissolvida foi utilizada para dosagem de proteínas pelo Bradford.
A partir dos resultados das dosagens foi possível encontrar o volume de amostra contendo
a massa de proteínas desejada a ser diluída em solução de reidratação (uréia 7 M, tiouréia 2
M, DTT 65 mM, CHAPS 1% p/v, pharmalyte 0,5% v/v e azul de Bromofenol 0,002% p/v)
para um volume final de 200 µl. Utilizou-se o sistema de reidratação passiva, visto que os
200 µl da solução de reidratação com a quantidade de amostra desejada foram aplicados no
Reswelliing Tray (Pharmacia Biotech) e posteriormente os géis com gradiente de pH
com essa solução durante a noite. As tiras de IPG tinham 11 cm de comprimento e as
faixas de pH variavam de 3 a 10 e de 4 a 7. A focalização isoelétrica foi realizada no
equipamento EttanTM IPGPhor IITM (GE-Healthcare) utilizando o seguinte programa: 1o
passo, 500 V por 0:30 h; 2opasso, 4000 V por 2:30h e; 3opasso, 8000 V até atingir 18.000
Vh totais.
Após a focalização as tiras de IPG foram equilibradas sob agitação em solução (tris
50 mM, glicerol 30 %, uréia 6M, SDS 2% e azul de bromofenol) com DTT (1% p/v) por
15 minutos para a redução das proteínas e, em seguida, alquiladas com IAA (3% p/v)
também em solução de equilíbrio por 15 minutos. Terminado o equilíbrio as tiras foram
mergulhadas em tampão de corrida (Anexo I.I.) por 10 segundos para livrá-los do excesso
de solução de equilíbrio. Logo após foram postos no topo do gel da segunda dimensão e
fixados com tampão de corrida contendo ágar 0,5%. O SDS-PAGE da segunda dimensão
foi realizado em sistema vertical em géis 15% de 14X14 cm contendo 30 ml do Main Gel
(Anexo I.III.). O sistema foi alimentado por uma fonte Power-Pac 3000 (Bio-Rad). A
corrida transcorreu em duas etapas, na primeira utilizamos 10 mA/gel durante 15 min e na
segunda 20 mA/gel até que o indicador (azul de bromofenol) saísse do gel
(aproximadamente 4:30h).
Terminada a corrida, o gel foi colocado em solução de fixação, etanol:ácido
acético:água (4:1:5 v/v/v), durante duas horas, corado com solução de Coomassie R 350
(PhastGel Blue R) (Anexo I.IV.) durante quatro horas, descorado com solução de ácido
acético: metanol: água (1:3:6) em duas lavagens de uma hora e armazenados em solução de
ácido acético 5%.
Os géis foram escaneados utilizando-se o programa LabScan v. 5.0
(GE-Healthcare) no ImageScanner (Amersham Biosciences) com sistema integrado de
transparência. As imagens foram analisadas no programa ImageMaster 2D Platinum 6.0
(GE-Healthcare) por uma combinação de detecção automática dos “spots”, feita pelo
programa, e detecção manual. Pelo programa foram estimados os pontos isoelétricos e as
massas moleculares de cada “spot”.
3.6. Seleção e processamento dos spots para espectrometria de massa
As proteínas de interesse foram excisadas dos géis bidimensionais com o auxílio de
um bisturi e transferidas para tubos eppendorfs, onde foi realizada a digestão com tripsina,
foram selecionados, cortados em pedaços de 1 mm3, totalmente descorados em solução de
bicarbonato de amônio 25 mM / acetonitrila (1:1) em pelo menos 3 lavagens de 30 min, e
desidratados, duas vezes, com acetonitrila 100% por 5 minutos. O solvente remanescente
foi removido dos pedaços de gel em concentrador de amostra Speed Vac (Savant). Os géis
foram reidratados no gelo por 1 hora, em 15 µl de solução de bicarbonato de amônio 50
mM contendo 0,2 µg de tripsina grau seqüenciamento modificada (Promega). Pedaços do
gel foram cobertos com 20µL do tampão e a digestão realizada a 37°C em banho por 16
horas. Em seguida os peptídeos foram extraídos do gel com solução acetonitrila 50%, TFA
5% em água e concentrados, até um volume de aproximadamente 5 µL no Speed Vac
(Junqueira, 2005).
3.7. Espectrometria de massa
A mistura de peptídeos da digestão tríptica foi misturada 1:1,5 com uma solução
saturada de ácido -ciano-4-hidroxicinâmico em acetonitrila 50% / ácido trifluoroacético
0,3% em água. Um µL da mistura foi aplicada na placa de MALDI e seco a temperatura
ambiente antes da análise no espectrômetro de massa.
Os espectros de massa foram obtidos usando-se o equipamento ABI 4700
TOF/TOF (Applied Biosystems). O ABI 4700 foi usado o modo interativo onde todas as
amostras eram analisadas, automaticamente, no modo refletor MS sendo, posteriormente,
os seis picos mais intensos submetidos a uma análise posterior por MS/MS. A intensidade
do laser utilizada foi 4800 para o modo MS e 5200 para o modo MS/MS e a célula de
colisão configurada para 1 kV em pressão de 1x 10-6 torr em presença de gás atmosférico.
3.8. Pesquisa no banco de dados
Nos dados obtidos no TOF-TOF foi utilizado o programa GPS Explorer™(Applied
Biosystems) onde os dados de MS e MS/MS eram processados e submetidos
conjuntamente ao programa MASCOT (Matrix Science Ltd. – www.matrixscience.com).
Os dados obtidos nos espectros eram filtrados pela relação sinal/ruído dos picos que foi de
20 para os dados de MS e 10 para MS/MS; a busca foi feita utilizando-se como banco de
dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) restringido para Viridiplantae (Green Plants). Os critérios de busca foram todas as massas moleculares e
pontos isoelétricos, cisteínas modificadas por carboxamidometilação e as possíveis
acrilamida. Foi tolerada no máximo uma clivagem para peptídeos semi-trípticos e uma
variação de massa dos peptídeos de 100 ppm. Eram consideradas positivas as
identificações onde pelo menos cinco peptídeos eram encontrados e na maioria das vezes
as identificações eram confirmadas com dados de MS/MS para pelo menos um peptídeo
por proteína; nestes casos um espectro de MS/MS era escolhido e analisado visualmente
para confirmar a seqüência. Em ambos os casos os valores de ion score (mínimo de 30) e
protein score (mínimo de 70) eram levados em consideração como valores estatísticos para identificação. As identificações também levaram em conta a relação entre o organismo, no
qual as proteínas foram identificadas, e o organismo estudado.
3.9. Síntese de um peptídeo, preparação do antisoro e análise por western blot
O peptídeo HSKGDAPPNEDELK de seqüência correspondente a uma região
(121-134) próxima à porção C-terminal de uma proteína relacionada à patogênese (PR-10)
identificada nesse trabalho, foi sintetizado pela Biosciences AG, Gottingen, Germany.
Anticorpos policlonais foram produzidos a partir desse peptídeo em coelhas brancas da
Nova Zelândia com quatro meses de idade, como descrito em Aragão et al. (2000). A IgG foi purificada do soro por cromatografia de afinidade (protein-A Sepharose column,
GE-Healthcare) de acordo com Harlow and Lane (1988). A análise de western blot ocorreu de
acordo com Towbin et al. (1979).
Outros dois anticorpos policlonais foram adquiridos para análise de western blot.
Um anticorpo, específico para uma vicilina de aproximadamente 60 KDa, foi doado
gentilmente pelo Dr. José Xavier Filho, da Universidade Estadual Norte Fluminense e; o
outro, específico para uma PR-10 de aproximadamente 16 KDa de Vigna unguiculata, foi fornecido pelo Dr. Edward A. Gwózdz, da Faculdade de Biologia da Adam Mickiewicz
University - Poznan, Poland.
Amostras de proteínas extraídas (extração com o método do tampão piridina) de
embriões em diferentes dias após a antese e de células cultivadas em suspensão
embriogênica foram solubilizadas em tampão de amostra (Tris 62,5 mM, SDS 2%,
Glicerol 10%, pH 6,8) e aplicadas nos géis de eletroforese. A transferência eletroforética
de proteínas em gel de poliacrilamida para a membrana de nitrocelulose foi feita de acordo
com o método originalmente descrito por Towbin et al. (1979). Foi utilizado um sistema de eletroforese preparativo de 8 X 6 cm, em SDS-PAGE descontínuo, 5% Stacking Gel / 15%
para a visualização por coramento com Coomassie R 350 (PhastGel Blue R), outra para a
eletrotransferência. Para a eletrotransferência foi utilizada membrana Hybond-C
(Amersham LifeScience) e o tampão de tranferência (Anexo I.V.), o procedimento foi
realizado em uma unidade de transferência Transphor (TE 42 – Hoefer Scientific
Instruments), de 5 litros, em câmara fria a 4 ºC e sob agitação. Terminada a
eletrotransferência as membranas foram coradas com Ponceau S (Anexo I.VI.) para
confirmação da transferência, lavadas e incubadas com solução bloqueadora, composta de
tampão PBS (NaCl 0,13 M, KCl 2,6 mM, NaHPO4 5,3 mM, KH2PO4 1,7 mM, pH 7,4)
contendo 5% de leite em pó desnatado, sob agitação por 45 min. Decorrido este tempo, a
solução bloqueadora foi descartada e as membranas incubadas com o anticorpo
(anti-vicilina, anti-PR10 ou anti-peptídeoPR10) específico contra a proteína de interesse. Os
anticorpos vicilina e PR10 foram utilizados na diluição 1:2000, enquanto o
anti-peptídeoPR10 foi utilizado na diluição 1:400. Todos foram diluídos em solução
bloqueadora e a incubação foi feita à temperatura ambiente sob agitação lenta por 45 min.
Após cinco lavagens com tampão PBS, cada uma com cinco minutos de duração e sob
agitação lenta, as membranas foram incubadas com o segundo anticorpo conjugado a
enzima fosfatase alcalina na diluição de 1:5000 na solução bloqueadora. Finalmente, após
cinco lavagens sucessivas idênticas as anteriores, reação de coramento foi desenvolvida
utilizando o substrato 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate Nitro Blue Tetrazolium
(BCIP/NBT) (Sigma). Uma pastilha do substrato foi dissolvida em 10 ml de água
destilada. As membranas foram cobertas com a solução do substrato, deixadas sob agitação
lenta e monitoradas até que o coramento atingisse a intensidade desejada, quando então a
membrana foi transferida para uma placa de petri com água destilada para parar a reação.
Géis obtidos de eletroforeses bidimensionais de sementes maduras e de suspensão
celular embriogênica também foram transferidos para membranas de nitrocelulose. Essas
membranas foram incubadas com os anticorpos vicilina, PR10 ou
