ISSN 21774780
RESUMO
Na presente revisão, descreve-se o “estado da arte” relacionado ao tema membrana amniótica nas cirurgias reconstrutivas de superfície ocular. Em levantamento bibliográfico, realizado nas bases de dados Web of Sciences, Scopus, MEDLINE/Pubmed e SciELO, foram encontradas 1250 publicações sobre o emprego de membrana amniótica em oftalmologia. Destas, 861 referiam-se às aplicações em reparação corneal e em cirurgias reconstrutivas da superfície ocular. Na atualidade, há 213 artigos sobre a transplantação de membrana amniótica para a córnea de animais domésticos ou de experimentação. Em seres humanos, 648 estudos foram conduzidos, dos quais 7% correspondem a estudos clínicos randomizados.
Palavras-chave: células tronco, córnea, deficiência límbica, enxerto corneal
PhD. Marcela Aldrovani¹ PhD. José Luiz Laus1*
MEMBRANAS AMNIÓTICAS NAS
CIRURGIAS RECONSTRUTIVAS DA
SUPERFÍCIE OCULAR
Amniotic membranes for ocular surface
reconstruction surgeries
ABSTRACT
In this review, we describe the state of the art related to the theme “amniotic membrane in reconstructive surgery of ocular surface”. In literature search conducted in the databases Web of Sciences, Scopus, MEDLINE/Pubmed and SciELO, we have found 1250 publications on the use of amniotic membrane in ophthalmology. Of these, 861 were related to the applications in corneal repair and reconstructive surgery of the ocular surface. Currently, there are 213 articles on transplantation of amniotic membrane for corneas of domestic or experimentation animals. About the use of amniotic membrane in human corneal surgeries, 648 studies were realized, of which 7% correspond to randomized clinical trials.
Keywords: cornea, corneal graft, limbal deficiency, stem cell 1. Serviço de Oftalmologia, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV - UNESP), Câmpus de Jaboticabal, SP, Brasil. *E-mail: jllaus@fcav.unesp.br
REVISÃO DE LITERATURA |
CIRURGIA DEPEQUENOS ANIMAIS
INTRODUÇÃO
A superfície ocular corresponde à interface entre o olho funcional e o meio ambiente. Afecções acometendo essa estrutura podem ensejar opacificação corneal e perda da visão. O transplante de membrana amniótica, associado ou não ao emprego de células tronco, constitui opção terapêutica vigente.
DESENVOLVIMENTO
Superfície ocular
O termo “superfície ocular” foi introduzido por Thoft, em 1977, ao publicar uma série de cinco casos de queimaduras químicas unilaterais, tratados com transplante autógeno de conjuntiva bulbar. A superfície ocular compreende, portanto, os epitélios da conjuntiva, da córnea e do limbo (AHMAD et al., 2006; LI et al., 2007).
Os epitélios da superfície ocular são constantemente renovados. O atrito causado pelas pálpebras, o filme lacrimal e a exposição ao ar, além dos danos impostos pela luz, constituem estímulos externos que suscitam a apoptose e a renovação de células epiteliais (LI et al., 2007). Há também, de se considerar que as células guardam, em seu DNA, instruções sobre o número de mitoses que devem realizar. O tamanho dos telômeros cromossômicos é um dos fatores intrínsecos que restringe o potencial mitótico das células epiteliais. A cada ciclo de divisão, encurtam-se os telômeros, decorrendo falhas no cumprimento de suas funções. Células são levadas à senescência e ativam vias programadas de morte celular (ROBERTSON et al., 2005).
Havia a convicção, em décadas passadas, que o epitélio conjuntival, por transdiferenciação, poderia adquirir características corneais e renovar toda a superfície ocular (DAVANGER & EVENSEN, 1971). Admite-se, na atualidade, que
o epitélio límbico é quem desempenha a maior função na renovação e na manutenção da superfície ocular. A remoção cirúrgica do limbo corneoescleral resulta em crescimento de epitélio com fenótipo atípico e em opacificação corneal (CHEN & TSENG, 1990).
A anatomia do limbo foi descrita por Vogt (1921) e revisada por Van Buskirsk (1989). Em 2005, ela foi estudada in vivo por Kobayashi & Sugiyama, empregando-se biomicroscopia com lâmpada em fenda e microscopia confocal. Trata-se de região altamente vascularizada, cujo epitélio abriga células tronco, células de Langerhans, melanócitos e pigmentos de melanina. Células tronco representam, aproximadamente, 10% da população celular encontrada no epitélio límbico, e asseguram que células corneais apoptóticas sejam continuamente substituídas por células viáveis (SCHERMER et al., 1986; DANIELS et al., 2001; LI et al., 2007; MARIAPPAN et al., 2014). Devido à ausência de marcador molecular específico para células tronco, a discriminação de seu fenótipo é conseguida empregando-se marcadores positivos e negativos (Tabela 1) (AHMAD et al., 2006).
Em superfícies oculares saudáveis, os índices de diferenciação e de proliferação das células epiteliais límbicas são proporcionais aos de descamação das células epiteliais apoptóticas corneais. Thoft & Friend (1983) estabeleceram, através da teoria XYZ (Fig. 1), os mecanismos cinéticos pelo qual o evento acontece.
As paliçadas de Vogt constituem o nicho primário das células tronco epiteliais límbicas corneais (DUA et al., 2000; MIRI et al., 2012; OVADIA & NIE, 2013). Estruturas secundárias, possivelmente relacionadas ao nicho das células tronco, têm sido
identificadas, incluindo-se as criptas epiteliais límbicas (DUA et al., 2005) e as projeções focais estromais (SHORTT et al., 2007; OVADIA & NIE, 2013). As características intrínsecas das células tronco, bem como o seu recrutamento para a via terminal de diferenciação, são moduladas pelo microambiente do estroma, por vias de sinalização bioquímica e biofísica (DANIELS et al., 2001). Admite-se que há um loop cibernético entre as células epiteliais límbicas corneais e a matriz extracelular estromal do nicho biológico. As primeiras evidências foram reportadas por Hay (1991), cujo trabalho inspirou, no final da década de 1990, o desenvolvimento da primeira “córnea humana de bioengenharia” (GRIFFITH et al., 1999). Em 2003, Espana et al. observaram que células tronco epiteliais expostas à matriz extracelular estromal corneal tendiam à diferenciação e à apoptose, enquanto que, sob influência da matriz extracelular estromal límbica, preservavam características de indiferenciação.
Limbo Córnea Epitélio
Basal suprabasalEpitélio EpitélioBasal suprabasalEpitélio Marcador ABCG-2 + + + + - -p63 + + + + - -Integrina alfa 9 + + + + - -Integrina beta 1 + + + + - -Integrina alfa 6 + + + + ++ + Nestina - +++ + +++ Alfa enolase + + + + ++ + E-caderina - +++ + +++ Conexina 43 + +++ + +++ Citoqueratina 3 - +++ + +++ Citoqueratina 19 + + + + +++ +++
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Tabela 1 - Distribuição dos marcadores de células tronco e de células epiteliais diferenciadas do limbo e da córnea Figura 1 - Representação esquemática da Teoria XYZ, proposta por Thoft & Friend (1983). Segundo os autores, a renovação corneal se dá a partir da migração centrípeta de células situadas na camada basal do epitélio límbico (X), que ao atingirem o centro da córnea alteram seu eixo de migração e deslocam-se em direção à superfície da córnea (Y), até completarem seu ciclo vital e serem eliminadas por descamação (Z).
Afecções da superfície ocular
As afecções de superfície ocular caracterizam-se por alterações morfofuncionais heterogêneas, de fisiopatogenia variável (HOLLAND et al., 2015). Fatores hereditários, idiopáticos ou adquiridos têm sido apontados como causas ensejantes. Elas se manifestam, especialmente, como condições alérgicas, tóxicas ou inflamatórias. Medicamentos de uso sistêmico ou local, como a mitomicina C, podem contribuir para o estabelecimento das lesões (BRIGHTBILL et al., 2008). Em seres humanos, as afecções de superfície ocular, geralmente, surgem acompanhadas de blefarite, de disfunção das glândulas meibomianas, do glaucoma
ou de hipoplasia da fóvea ou do nervo óptico (HOLLAND et al., 2015). Os sinais clínicos mais evidentes, em animais e em seres humanos, são o blefarospasmo, a fotofobia, o edema, a secreção ocular e a neovascularização corneal (GOMES et al., 1999; LAUS & ORIÁ, 1999).
As lesões de maior repercussão clínica são as que se estendem para o limbo, induzindo a alterações no microambiente do estroma e a perda de células tronco. Dependendo do quantitativo de células tronco perdidas, o epitélio corneal perde a estabilidade físico-química e se torna vulnerável à invasão por células epiteliais globulares, produtoras de mucina, provenientes da conjuntiva (KIM & TSENG, 1995; PUANGSRICHAREN & TSENG, 1995; DANIELS et al., 2001; DUA et al., 2003; DUA et al., 2009). A conjuntivalização secundária à depleção de células tronco límbicas corneais está acompanhada por graus variáveis de reparação estromal e de opacidade corneal, que proporcionam diminuição ou perda da visão em casos mais graves (DUA et al., 2009; BAYLIS et al., 2011). Estima-se que 65% dos casos de conjuntivalização, em seres humanos, se apresentem como lesões difusas associadas à perda total de células tronco límbicas (BAYLIS et al., 2011). Em animais domésticos, todavia, não há estatísticas quanto à incidência ou à prevalência da doença.
Prabhasawat et al. (1997) propuseram classificar a deficiência límbica em duas categorias: I - aplasia ou perda total de células tronco, por destruição abrupta; e II- perda gradual de células tronco, por suporte estromal insuficiente. Incluem-se, na primeira categoria, pacientes (seres humanos ou animais) com história clínica de destruição do limbo, como nas queimaduras químicas, no penfigóide ocular cicatricial e nas ceratites infecciosas graves. Na segunda categoria, incluem-se os pacientes sem história prévia de destruição do limbo, mas com evidências de exaustão funcional das células tronco, como
na aniridia, nas ceratites associada com deficiências endócrinas múltiplas e nas limbites crônicas.
Condutas nas afecções de superfície ocular, notadamente quando há deficiência límbica, apoiam-se na restauração funcional do estroma e na reposição das células tronco epiteliais perdidas. Em 1983, Thoft & Friend realizaram a primeira tentativa de transplante de limbo alógeno. Durante o procedimento, denominado ceratoepitelioplastia, lentículas de estroma corneal coberto por epitélio eram implantadas no estroma límbico. Em 1989, o transplante de limbo córneo-conjuntival emergiu como opção promissora, porém, para a obtenção de tecido viável, realizavam-se biópsias demasiadamente extensas e de risco para o olho doador, inviabilizando, em alguns casos, o sucesso dos procedimentos autógenos ou dos alógenos entre indivíduos vivos (KENYON & TSENG, 1989; TSAI et al., 1990). Fragmentos do limbo e da conjuntiva de doador cadáver ou o anel corneoescleral podem ser empregados no tratamento da deficiência límbica, porém, obrigam que se associe imunossupressão sistêmica prolongada. Ademais, estima-se que 24% dos casos tratados com tecidos de cadáver evoluem para falência e recidiva da deficiência límbica, no interregno de cinco anos (SOLOMON et al., 2002).
A reconstrução da superfície ocular, pela transplantação de membranas que mimetizam o microambiente do nicho das células tronco, notadamente a membrana amniótica, é o método de eleição para se tratar a deficiência límbica. Para casos de deficiência límbica total, recomenda-se que o procedimento seja associado ao transplante de limbo ou de células tronco cultivadas ex vivo (TSENG et al., 1998; SCHWAB, 1999; HOLLAND et al., 2015). Para se tratar a deficiência límbica parcial, o
transplante isolado de membrana amniótica representa, por vezes, estratégia efetiva (SILVA RICARDO et al., 2010).
Membrana amniótica em cirurgias reconstrutivas da superfície ocular
A membrana amniótica é resiliente, visco-elástica e avascular. Trata-se de tecido especializado, cuja avaliação, à microscopia, revela três camadas: epitélio, membrana basal e matriz extracelular estromal (DUA & AZUARA-BLANCO, 1999).
A utilização da membrana amniótica, em oftalmologia, iniciou-se com De Roth (1940), no tratamento de defeitos conjuntivais. Na ocasião, os resultados foram insatisfatórios, pois o autor não separou o âmnion do córion, cujas células são imunogênicas (LI et al., 2014). Os primeiros resultados favoráveis foram reportados por Sorsby & Symons (1946), ao empregaram a membrana amniótica no tratamento de superfícies oculares com queimadura química aguda. As indicações para o emprego de membrana amniótica, na cirurgia reconstrutiva, se expandiram entre as décadas de 1950 e 1990, na União Soviética. Entretanto, os relatos, à época, sobre sua utilização, em oftalmologia, desapareceram da literatura em língua inglesa. No final da década de 1980, oftalmologistas russos mostraram, ao pesquisador venezuelano Horacio Serrano, resultados encorajadores relacionados ao emprego de um material, sem revelar que se tratava da membrana amniótica. O pesquisador, de retorno ao seu país, levando consigo amostras do material repassaram-nas ao Dr. Juan Batlle, para que este fizesse a identificação (apud DUA et al., 2004).
Aplicações oftálmicas de membrana amniótica foram reintroduzidas por Batlle & Perdomo (1993), porém, só adquiriram notoriedade mundial após a publicação de estudo realizado no
Bascom Palmer Institute (Miami, USA), sob a liderança do Dr. Scheffer Tseng (KIM & TSENG, 1995)
Kim & Tseng (1995) separaram a membrana amniótica humana do córion e a empregaram em coelhos com deficiência límbica total, relatando bons resultados em 77% dos casos, com melhora na transparência corneal e redução da neovascularização. Desde então, ela tornou-se importante adjunto nas cirurgias reconstrutivas de superfície ocular. Em oftalmologia médica, a membrana amniótica também é empregada em casos de olho seco, em bolhas filtrantes com vazamentos e em disfunções palpebrais (AZUARA-BLANCO et al., 1999; PRABHASAWAT et al., 2001; HIGA et al., 2007). Em veterinária, ela é utilizada na ceratoplastia (BARROS et al., 1998), no simbléfaro, em casos de alguns tumores esclerais e corneais (BARROS et al., 2005), no tratamento de úlceras corneais (PONTES et al., 2008), na deficiência límbica (CREMONINI et al., 2007), nas queimaduras químicas e no sequestro corneal felino (PONTES et al., 2010). A partir de 1999, após estudo publicado por Schwab, a membrana amniótica tornou-se substrato padrão ouro para se cultivarem células tronco destinadas à reconstrução da superfície ocular.
Em levantamento bibliográfico, realizado nas bases de dados Web of Sciences, Scopus, MEDLINE/Pubmed e SciELO, em julho de 2015 (acesso em 27/07), foram encontradas 1250 publicações sobre o emprego de membrana amniótica em oftalmologia. Destas, 861 referiam-se às aplicações em reparação corneal e em cirurgias reconstrutivas da superfície ocular. Até o presente, há 213 artigos sobre a transplantação de membrana amniótica para a córnea de animais domésticos ou de experimentação. Em seres humanos, 648 estudos foram conduzidos, dos quais 7% correspondem a estudos clínicos randomizados. Os descritores adotados foram amnion, amniotic membrane, cornea, eyes,
ocular surface, ophthalmology.
Seleção e processamento da membrana amniótica
As membranas amnióticas destinadas à reconstrução da superfície ocular devem ser colhidas no curso de operações cesarianas eletivas, sob condições assépticas. Material proveniente de parto vaginal não deve ser considerado, pois há riscos de contaminação por bactérias que comprometem a viabilidade dos enxertos e do próprio olho receptor (LEE & TSENG, 1997). Membranas amnióticas humanas devem ser colhidas apenas de gestantes com sorologia negativa para HIV-1, HIV-2, papiloma vírus (HPV), vírus linfotrópico T humano (HTLV), hepatites B e C, sífilis, citomegalovírus e toxoplasmose, após assinatura espontânea de Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (JOHN, 2003). Todos os princípios éticos enunciados na Declaração de Helsinki devem ser atendidos. No Brasil, deve-se, também, obedecer aos preceitos da resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
Em medicina veterinária, frequentemente, membranas amnióticas canina e equina são empregadas no tratamento de certas afecções corneais e conjuntivais (BARROS et al., 1998, BARROS et al., 2005).
Após a colheita, a membrana amniótica deve ser lavada em tampão fosfato, pH 7,4, contendo 1000 UI/mL de penicilina G, 20 mcg/mL de estreptomicina e 2,5 mcg/mL de anfotericina B (KIM & TSENG, 1995). A manipulação deve, preferencialmente, seguir as diretrizes recomendadas pela United States Food and Drug
Administration e a The American Association of Tissue Bank.
Há relatos sobre o emprego bem sucedido de membrana amniótica fresca, em cirurgias reconstrutivas da superfície ocular (ADDS et al., 2001). Entretanto, tal prática está sendo descontinuada, por obrigar a um pequeno intervalo entre a colheita e a transplantação (MALHOTRA & JAIN, 2014).
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Diferentes protocolos, para preservação de membrana amniótica, são conhecidos. Ela pode ser estocada em glicerina 98%, liofilizada, secada ao ar, irradiada com raios gama, congelada, ou criopreservada a -80C em frascos contendo glicerina 50% e meio de Eagle modificado por Dulbecco, na proporção de 1:1, v/v (KIM & TSENG, 1995). A criopreservação é o método preferido entre pesquisadores e oftalmologistas, incluindo-se os autores desta revisão. Os agentes empregados no processo reduzem a biodisponibilidade de moléculas solúveis e o quantitativo de células viáveis (em 50%). Não obstante, preservam os componentes estruturais da matriz estromal (AKLE et al., 1981). Uma placenta humana fornece, aproximadamente, 30 fragmentos de membrana amniótica, na medida de 2 x 2 cm, que podem ser criopreservados por período máximo de três meses (MALHOTRA & JAIN, 2014).
Os protocolos de preparação da membrana amniótica podem envolver agentes químicos, físicos ou enzimáticos, visando à remoção de seu epitélio. Dentre os químicos, melhores resultados foram percebidos com o ácido etileno-diamino-tetra-acético (EDTA) (GRUETERICH et al, 2002). O EDTA é capaz de remover as células epiteliais, sem comprometer a integridade do estroma amniótico (GRUETERICH et al., 2002). Por se ligar a cátions divalentes das adesões focais, ele permite a remoção das células sem danificar o microambiente. Koizumi et al. (2007), ao compararem as características de células epiteliais crescidas sobre membranas amnióticas íntegras ou desepitelizadas em EDTA, observaram que culturas provenientes de material desepitelizado apresentavam-se mais diferenciadas, estratificadas e ricas em estruturas de adesão.
Bases científicas da aplicação clínico-cirúrgica de membrana amniótica
A membrana amniótica apresenta características mecânicas peculiares, que tornam factíveis a sua aplicação em cirurgias
reconstrutivas. Ela é capaz de suportar a carga de pressão do líquido amniótico e as contrações de Braxton-Hicks, durante a gestação (RIAU et al., 2010). Os biomateriais de membrana amniótica retêm parte das propriedades físico-químicas do tecido fresco, e suportam cargas tensionais e compressivas próximas aos níveis fisiológicos “in natura”. O módulo de Young da membrana amniótica humana, nas gestações a termo e de baixo risco, foi estimado em 3,6 Mpa (BENSON-MARTIN et al., 2006), esse valor é maior do que o obtido para córneas de cães (1,5 Mpa), de coelhos (1,9 Mpa), de porcos (2,2 Mpa) e de seres humanos (2,9 Mpa) (TANG et al., 2011; KLING et al., 2012; LOMBARDO et al., 2014).
A espessura e as propriedades ópticas da membrana amniotica congregam condições favoráveis, notadamente para o tratamento de afecções da superfície ocular. Connon et al. (2010) estabeleceram que a espessura, o índice de refração e a transparência da membrana amniótica variam de acordo com sua localização topográfica na placenta. Por essa razão, pesquisadores e oftalmologistas do Nottinghan Centre of Eye
Research recomendam que apenas fragmentos provenientes
da região placentária proximal ao cordão umbilical sejam transplantados para a superfície ocular. A membrana amniótica da placenta central é mais espessa e tem excelentes propriedades refrativas (CONNON et al., 2010).
Propriedades antimicrobianas e imunogênicas têm sido atribuídas à membrana amniótica, o que possibilita transplantação, com percentis baixos de infecção e de rejeição. A membrana amniótica é parcialmente imunogênica (WANG et al., 2006). Apesar de não expressar antígenos da classe maior de histocompatibilidade (HLA-A, HLA-B, HLA-C), antígenos DR ou beta-2-microglobulinas, ela sintetiza anticorpos W6/32 e antígenos HLA-G (KUBO et al., 2001).
McIntyre & Faulk, em 1979, encontraram uma glicoproteína, até então desconhecida, na matriz extracelular da membrana amniótica, que entenderam tratar-se de um colágeno especial, capaz de impedir a atividade leucocitária e de inibir a resposta inflamatória. Todavia, o achado não foi confirmado por outros pesquisadores. Há evidências de que as células epiteliais amnióticas humanas, sob condições in vitro, secretam fatores imunossupressivos capazes de inibir reações imunes e a ação dos macrófagos (LI et al., 2005).
Condição adjunta, que favorece o uso da membrana amniotica, reside na assertiva de que ela promove a migração de células epiteliais. A membrana basal e o estroma do âmnion possuem características macromoleculares e químicas que facilitam a migração e o crescimento de células epiteliais corneais (ENDO et al., 2004). A membrana basal amniótica, à similitude da corneal e da conjuntival, possui colágenos dos tipos IV e VI, laminina-1, laminina-5 e fibronectina. O estroma amniótico apresenta colágenos fibrilares, proteoglicanos e glicoproteínas adesivas, que emitem sinais biofísicos, reposicionam junções comunicantes e estimulam células epiteliais a migrarem (COOPER et al., 2005; MEI et al., 2012, CHEN et al., 2015). O ácido hialurônico, componente do estroma amniótico, reduz a expressão do fator de transformação do crescimento beta-1 (TGF beta-1), do TGF beta-2 e do TFG beta-3, inibindo a proliferação e a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos. Na prática, a inibição de tais eventos impede a formação de cicatrizes estromais (LEE et al., 2000).
Relativamente aos mecanismos moleculares de ação da membrana amniótica, bem como aos seus efeitos sobre a reparação corneal, estudos têm sido conduzidos. Moléculas inibidoras de inflamação e de angiogênese já foram detectadas
nas células epiteliais, nas células mesenquimais e no estroma do âmnion fresco (MALHOTRA & JAIN, 2014).
As células epiteliais e as mesenquimais amnióticas transcrevem RNAm para mediadores inflamatórios, tais como interleucina 2, interleucina 8, interleucina 10, interferon gama, fator de necrose tumoral alfa, fator de crescimento fibroblástico básico e fator de crescimento derivado de plaquetas (HAO et al., 2000). KIM et al. (2000) propuseram que a membrana amniótica é capaz de diminuir a infiltração por polimorfonucleares e a intensidade dos graus de opacificação, em córneas com lesões. Não há, na literatura compulsada, estudos “in vivo” que contrariem a afirmativa. Paradoxalmente, estudos “in vitro” mostraram que os procedimentos adotados pelos bancos de tecido, visando-se a preservação da membrana amniótica, reduzem a expressão de mediadores anti-inflamatórios para níveis tão baixos, que poderiam ser insuficientes para modular respostas ou processos biológicos (HOPKINSON et al., 2006). Notificou-se que 17, entre 48 moléculas solúveis amnióticas, perdem a função ou deixam de ser expressas, após criopreservação.
Os benefícios relacionados às propriedades anti-angiogênicas da membrana amniótica também têm sido alvo de debates. A membrana amniótica expressa algumas moléculas anti-angiogênicas, como o colágeno do tipo XVIII, o fator derivado do epitélio pigmentado (PEDF), a trombospondina-1, a endostatina e os inibidores de metaloproteinases teciduais, notadamente TIMP-1, 2, 3 e 4 (ROWE et al., 1997, DUA et al., 2004). Estudos observacionais, principalmente os publicados na década de 1990, expandiram o conceito de que as propriedades anti-angiogênicas da membrana amniótica constituem aspecto favorável à reparação corneal. Entretanto, Malhotra & Jain (2014) ponderaram que tais propriedades podem suscitar
efeitos antagônicos, impedindo que superfícies oculares com isquemia límbica grave recuperem suas características funcionais. A isquemia do limbo, com frequência, está associada às queimaduras oculares químicas. Interessantemente, a membrana amniótica não oferece vantagens, quando transplantada para olhos humanos com 360 de isquemia límbica ou com queimadura química de grau IV, na classificação de Roper-Hall (1965) (Tabela 2). Joseph et al. (2001) publicaram uma série de quatro casos de queimadura química grau IV, que foram tratados com transplante de membrana amniótica. Todos evoluíram para falência terapêutica. Dois olhos sofreram evisceração espontânea, um desenvolveu dor crônica e o outro evoluiu para phthisis bulbi. Em estudo multicêntrico, descreveram-se os resultados do transplante de membrana amniótica em 13 olhos humanos com queimaduras agudas, dos quais sete eram de graus II-III e seis eram de grau IV (MELLER et al., 2000). Os autores observaram que 85% dos casos com queimadura de graus II e III apresentaram epitelização completa e melhora da acuidade visual. Os olhos com queimadura grau IV desenvolveram deficiência límbica total.
Grau Prognóstico Características da córnea Envolvimento do limbo
I Bom Defeito epitelial persistente Sem isquemia
II Bom Opacificação corneal, com detalhes visíveis
da íris <1/3 de isquemia
III Reservado
Perda total do epitélio e opacificação corneal, com perda dos detalhes
da íris
Entre 1/3 e ½ de isquemia
IV Ruim Córnea opaca, íris e pupila obscurecidas > ½ de isquemia
Tabela 2 - Classificação das queimaduras químicas de superfície ocular, segundo a escala de Roper-Hall (1965)
Transplantação de membrana amniótica para a superfície ocular
Há semelhanças entre as técnicas para orientação e implantação da membrana amniótica na superfície ocular (HOLLAND et al., 2015). A escolha se baseia nos objetivos terapêuticos buscados e no destino final do enxerto (incorporação à córnea ou deiscência espontânea). Membranas amnióticas podem ser usadas como enxertos temporários ou permanentes.
Relativamente aos enxertos temporários, as membranas amnióticas atuam como curativos biológicos, que revestem e protegem a superfície ocular. A reparação corneal ocorre acompanhada por graus menores de inflamação, pois a membrana amniótica limita a extensão dos danos provocados por polimorfonucleares recrutados para as áreas de lesão. O enxerto deve ser implantado posicionando-se sua face epitelial em contato com o leito receptor; nesta condição, não haverá incorporação da membrana, que poderá ser naturalmente eliminada (deiscência) ou removida ambulatorialmente (MALHOTRA & JAIN, 2014, HOLLAND et al., 2015).
As principais indicações corneais para utilização de enxertos temporários encontram-se listadas na Tabela 3.
Defeitos epiteliais persistentes, sem ulceração Queimaduras químicas agudas
Transplante de córnea de alto risco (*) Síndrome de Stevens Johnson aguda (*)
Pós-ceratectomia superficial
(*) restrita aos pacientes humanos
Tabela 3 - Indicações corneais para emprego de enxertos temporários de membrana amniótica, segundo Holland et al., 2015
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e a proliferação de células epiteliais da córnea ou da conjuntiva, tornando-se parte do susbtrato subepitelial. Ela deve ser implantada colocando-se o estroma amniótico em contato com o leito receptor. As bordas da membrana amniótica devem ser introduzidas por baixo da conjuntiva vizinha, para prevenir o deslocamento do enxerto e facilitar a migração epitelial sobre ele. Para se tratarem defeitos epiteliais corneais persistentes, com ulceração, recomenda-se que múltiplas camadas de membrana amniotica sejam transplantadas (“transplante sanduíche”) e fixadas entre si, empregando-se suturas ou cola de fibrina (MALHOTRA & JAIN, 2014, HOLLAND et al., 2015).
Para proteção do enxerto permanente, impõe-se que a área tratada seja revestida por patch de membrana amniótica (pacientes veterinários) ou por Prokera® (pacientes humanos) (HOLLAND et al., 2015). A Prokera® é uma lente corneoescleral, comercialmente disponível, contendo membrana amniótica em seu lúmen termoplástico.
As principais indicações corneais para utilização de enxerto permanente encontram-se listadas na Tabela 4.
Defeitos epiteliais persistentes, com ulceração Ceratopatia bolhosa
Ceratopatia em faixa Remoção de cicatrizes
Exérese de tumores Deficiência límbica
Tabela 4 - Indicações corneais para emprego de enxertos permanentes de membrana amniótica, segundo Holland et al., 2015
Membrana amniótica como substrato para expansão ex vivo de células tronco
Pellegrini et al. (1997) foram os pioneiros a mostraram que a transplantação de células tronco epiteliais límbicas corneais
expandidas ex vivo constitui opção viável para se reconstruir a superfície ocular com deficiência límbica total. Balizada em princípios de bioengenharia, a técnica consiste no cultivo de população total de células epiteliais límbicas corneais sobre membrana amniótica ou substrato sintético.
As aplicações clínicas de constructos formados por membrana amniótica e células tronco epiteliais límbicas corneais iniciaram-se em 1999, após publicação de Schwab. A membrana e as células tronco podem advir da mesma espécie ou de espécies diferentes; neste caso, originando xenoenxertos, cuja viabilidade já foi comprovada (RENDAL-VÁZQUEZ et al., 2012, ALDROVANI et al., 2015, KOBASHIGAWA et al., 2015).
A primeira etapa do procedimento consiste em realizar uma biópsia límbica (muito menor do que a requerida no transplante de limbo), para obtenção de células tronco viáveis, cuja expansão se consegue em sistema de cultivo em suspensão ou em explante (Fig. 2) (SILVA RICARDO et al., 2010, ALDROVANI et al., 2015). No sistema de cultivo em suspensão, utilizam-se as enzimas dispautilizam-se e tripsina na digestão dos colágenos da membrana basal e na liberação das células epiteliais. A suspensão celular é, posteriormente, colocada sobre a face epitelial da membrana amniótica. No sistema de cultivo em explante, o fragmento de tecido límbico é acomodado no centro da membrana amniótica, para que as células epiteliais possam migrar centripetamente sobre o substrato. O intento está recomendado para o estabelecimento de culturas primárias, quando se dispõe de pouca quantidade de tecido, e visando-se a minimizar o risco de perdas celulares por desagregação enzimática. Recomenda-se que, antes de receber a suspensão celular ou o explante límbico, a membrana seja fixada em um insert para cultivo celular (Fig. 3).
Nakamura et al. (2006) não observaram diferenças em índices de adesão e de proliferação, entre células provenientes de cultivos em suspensão ou em explante. Em estudo conduzido por Shimazaki et al. (2007), o índice de sucesso clínico associado à transplantação de células cultivadas em sistema de explante foi menor (50%), quando comparado ao obtido empregando-se sistema de cultivo em suspensão (73%). Entretanto, a amostragem não foi suficiente para demonstrar superioridade de qualquer dos protocolos.
A viabilidade dos sistemas de cultivo, bem como a presença de células tronco, devem ser avaliadas por ensaios de clonogenicidade e empregando-se marcadores de expressão do fator de proliferação PCNA, do fator de transcrição nuclear p63, do par de citoqueratinas 3/12 e da citoqueratina 19 (AHMAD et al., 2006). O percentual de células positivas para a expressão do fator de transcrição p63 parece representar fator decisivo para o sucesso da terapia límbica. Segundo Rama et al. (2010), 78% dos transplantes bem sucedidos, ou seja, que evoluem sem intercorrências, contêm, no mínimo, 3% de células positivas para p63.
Figura 2 - Fluxograma das etapas envolvidas no cultivo de células tronco epiteliais límbicas corneais. Após biópsia, o fragmento límbico pode ser cultivado empregando-se técnica de cultivo em suspensão ou em explante. Na primeira, o explante límbico é submetido à digestão enzimática para disrupção da membrana basal e liberação de células. A suspensão celular é colhida e, então, cultivada sobre membrana amniótica. Na segunda, o explante límbico é acomodado sobre a membrana basal da amniótica. O procedimento de air-lifting pode ou não ser em-pregado. Alternativamente, as células podem ser co-cultivadas com feed layer de fibroblastos 3T3
Figura 3 - Imagem fotográfica de insert contendo fragmento de membrana amniótica. O insert impede que a membrana amniótica suba à superfície da placa de cultivo, após adição de meio de cultura. Laboratório de Pes-quisa do Serviço de Oftalmologia, FCAV-UNESP, Câmpus de Jaboticabal, Brasil.
A composição do meio de cultura constitui fator importante para a viabilidade do cultivo celular. Os meios contêm nutrientes e mitógenos que estimulam as células tronco a proliferarem do explante para a superfície da membrana amniótica (SILVA RICARDO et al., 2010). Os mais empregados são o SHEM (supplemental hormonal epithelial medium), o KSFM (keratinocyte serum-free medium) e o Epilife® (LOUREIRO et al., 2013).
As células tronco epiteliais do limbo podem ser cultivadas sobre membranas amnióticas intactas ou previamente desepitelizadas. Aparentemente, os dois protocolos oferecem resultados satisfatórios, porém, nenhuma metanálise foi conduzida, até o presente, para integrar os efeitos biológicos e
terapêuticos. Pesquisadores e clínicos mais cautelosos temem que estudos futuros possam revelar discrepâncias entre o potencial de expansão e a viabilidade tardia das células expandidas sobre membrana amniótica intacta ou desepitelizada; dentre outras razões, porque esses substratos diferem quanto ao microambiente molecular. Após desepitelização, a membrana amniótica deixa de expressar alguns neurotransmissores, neuropeptídios e fatores de crescimento que poderiam estar envolvidos na modulação funcional das células epiteliais corneais. Aparentemente, a ressíntese ex vivo dos colágenos e dos proteoglicanos da lâmina basal que apoia as células epiteliais límbicas ocorre mais rapidamente na membrana intacta do que na desepitelizada (CHEN et al., 2010).
Culturas de células progenitoras límbicas corneais expandidas sobre membrana amniótica, com e sem epitélio, exibem os mesmos imunofenótipos, porém, em diferentes proporções. A membrana intacta retém grande parte das células cultivadas em um estágio menos diferenciado do desenvolvimento, com expressão de p63. Em oposição, a membrana desepitelizada favorece a formação de um epitélio corneal mais confluente, contendo um número elevado de células ricas em estuturas de adesão e com expressão do par de citoqueratinas 3/12 (GRUTHERICH et al., 2002, ALDROVANI et al., 2015).
A membrana amniótica desepitelizada atua como nicho biológico substituto, que modula o comportamento das células tronco epiteliais límbicas corneais, em cultura (LI et al., 2007, OVADIA; NIE, 2013). O recrutamento e a proliferação das células parecem ser modulados pelo microambiente da membrana basal e do estroma amniótico (DANIELS et al., 2001, LI et al., 2007, OVADIA; NIE, 2013). Células epiteliais corneais humanas
migram lentamente quando cultivadas sobre a superfície de membranas amnióticas desprovidas de membrana basal (DUA et al., 2004). O crescimento celular, neste caso, envolve a formação de filopódios que que se projetam sobre o colágeno do estroma. Em contrapartida, quando cultivadas sobre membranas amnióticas desepitelizadas e com membrana basal íntegra, as células epiteliais corneais migram rapidamente sobre o substrato, se ancorando a ele através de hemidesmossomos (DUA et al., 2004).
Estratégias desenvolvidas para outras linhagens de células epiteliais têm sido incorporadas na manutenção dos sistemas de expansão formados pela associação ex vivo das células epiteliais do limbo com a membrana amniótica, procurando-se a aumentar a viabilidade das células cultivadas, garantir a manutenção da stemness e favorecer a proliferação de células saudáveis. Como exemplos mais conhecidos, destacam-se o
air-lifting, que consiste em baixar o volume do meio de cultura
ao nível da superfície do epitélio (KAWAKITA et al., 2005; CHEN et al., 2010) e o feed layer, balizado na utilização, como camada alimentadora das células epiteliais, de co-cultura de fibroblastos de camundongo 3T3 letalmente irradiados ou tratados com mitomicina C (TANIOKA et al., 2006). O uso de células 3T3 de ratos permite a formação de camadas uniformes de epitélio. Discutem-se, todavia, questões éticas e de biossegurança associadas ao uso clínico. Há riscos vinculados ao uso de feed
layer, aumentam-se as chances de rejeição, de infecção e de
microquimerismo (BAYLIS et al., 2011).
Relativamente aos resultados clínicos do transplante de células tronco, poucos estudos foram realizados, por se tratar de tecnia recente. Baylis et al. (2011) revisaram e compilaram dados reportados por 28 ensaios clínicos conduzidos em
ISSN 21774780
Índia, da Itália, do Japão, de Taiwan e do Reino Unido. No total, 583 pacientes (597 olhos) foram incluídos na revisão. Os autores reportaram que o índice médio de sucesso global associado ao procedimento, ou seja, melhora na transparência corneal e na acuidade visual, sem considerar o agente causador da lesão, foi de 76% (variando entre 59% e 100%). Curvas atuariais de Kaplan-Meier revelaram que casos de insucesso ocorrem mais nos dois primeiros anos de pós-operatório e que, normalmente, advêm da exaustão das células cultivadas transplantadas.
O agente causal da deficiência límbica constitui fator determinante para o sucesso do transplante de membrana amniótica contendo células tronco do limbo. O índice de sucesso é de 86% considerando-se as afecções de origem inflamatória, de 75% nas queimaduras químicas ou nas térmicas e de 60% para as doenças congênitas. As complicações pós-operatórias mais frequentes são inflamação e infecção (BAYLIS et al., 2011). Importante ressaltar que o transplante de membrana amniótica contendo células tronco eleva a pressão intraocular, pode causar glaucoma ou contribuir para a progressão de glaucoma pré-existente (HOLLAND et al., 2015).
Deve-se considerar que a aplicação clínica de células tronco ainda excede os conhecimentos que se têm sobre a sua biologia. Nem todos os pacientes com deficiência límbica serão candidatos à transplantação de células tronco. O procedimento, quando alógeno, requer imunossupressão sistêmica, contraindicada para casos em que há insuficiência cardíaca congestiva e diabetes. Por vezes, alterações no filme lacrimal, palpebrais e retinianas podem contraindicar o procedimento (HOLLAND et al., 2015). Previamente à intervenção, condições oftálmicas e sistêmicas devem ser rigorosamente avaliadas. Comorbidades devem ser tratadas ou controladas. A seleção
do procedimento.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A membrana amniótica é um biomaterial versátil e constitui opção viável para se tratarem inúmeras afecções de superfície ocular, porém, há exceções. As indicações para emprego da membrana amniótica não representam práticas baseadas em evidência, pois advêm, principalmente, de estudos observacionais. Na escala hierárquica dos níveis de evidência terapêutica, proposta pela Universidade de Oxford, os estudos observacionais, em termos de confiabilidade, situam-se abaixo dos experimentais.
Na falta de evidências científicas para recomendação grau 1, torna-se impossível impedir o uso desnecessário de membrana amniótica. Há relatos sobre o seu emprego no tratamento de lesões corneais cuja boa evolução clínica se daria mesmo sem intervenção cirúrgica.
Mais observação temporal pós-operatória e melhor padronização dos critérios de sucesso adotados por diferentes centros se fazem necessários para o fortalecimento quanto às indicações de uso da membrana amniótica. Metanálises precisam ser desenhadas, comparando-se resultados entre diferentes autores. De qualquer modo e diante do cenário atual, apesar das incertezas, a membrana amniótica, contendo ou não células tronco, pode ser opção na reconstrução da superfície ocular de pacientes com deficiência límbica.
AGRADECIMENTOS
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Proc. 2012/17308-5, Proc. 2013/01494-7, Proc. 2013/25533-1, Proc. 2014/18007-4) e Conselho Nacional
467289/2014-0), que constituem a base de fomento à pesquisa demandada por este grupo.
REFERÊNCIAS Adds PJ, Hunt CJ, Dart JK. 2001. Amniotic membrane grafts, ‘fresh’ or frozen? A clinical and in vitro comparison. British Journal of Ophthalmology. 85:905-90w7.
Ahmad S, Figueiredo F, Lako M. 2006. Corneal epithelial stem cell: Characterization, culture and transplantation. Regenerative Medicine. 1:29-44.
Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, et al. 1981. Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet. 2(8254):1003-1005. Aldrovani M, Kobashigawa KK, Valdetaro GP, et al. 2015. Remodeling of higher order chromatin-DNA structure in rabbit corneal limbal epithelial progenitor cells grown on human intact and denuded amniotic membrane. In: Conference of the European
College of Veterinary Ophtlalmologists – ECVO. Helsinki, Finland, p.24.
Azuara-Blanco A, Pillai CT, Dua HS. 1999. Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction. British Journal Ophthalmology. 83( 4):399-402. Barros PSM, Garcia JA, Laus JL, et al. 1998. The use of xenologous amniotic membrane to repair canine corneal perforation created by penetrating keratectomy. Veterinary
Ophthalmology. 1(3): 119-123.
Barros PSM, Safatle AM, Godoy CA, et al. 2005. Amniotic membrane transplantation for the reconstruction of the ocular surface in three cases. Veterinary Ophthalmology. 8(3):189-192.
Battle JF, Perdomo FJ. 1993. Placental membranes as a conjunctival substitute.
Ophthalmology. 100:107
Baylis O, Figueiredo F, Henein C, et al. 2011. 13 years of cultured limbal epithelial cell therapy: a review of the outcomes. Journal Cell Biology. 112:993-1002.
Benson-Martin J, Zammaretti P, Bilic G, et al. 2006. The Young’s modulus of fetal preterm and term amniotic membranes. European Journal of Obstetrics and
Gynecology.128(2):103-107.
Brightbill F. 2008. Corneal Surgery: Theory, Technique and Tissue. Elsevier. USA. P. 207 Chen B, Mi S, Wright B, et al. 2010. Differentiation status of limbal epithelial cells cultures on intact and denuded amniotic membrane before and after air-lifting.
Chen JJY, Tseng SCG. 1990. Corneal epithelial wound healing in partial limbal deficiency. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 31:1301-1314.
Chen S, Mienaltowski MJ, Birk DE. 2015. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133:69-80.
Connon CJ, Doutch J, Chen B, et al. 2010. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal Ophthalmology. 94(8):1057-1061.
Cooper LJ, Kinishita S, German M, et al. 2005. An investigation into the composition of amniotic membrane used for ocular surface reconstruction. Cornea. 24( 6):722-729.
Cremonini DN, Ranzani JJT, Marques MEA, et al. 2007. Transplante de membrana amniótica canina criopreservada para cicatrização de córnea com deficiência de células límbicas em coelhos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 59:1462-1467.
Daniels JT, Dart JKG, Frcophth DM, et al., 2001. Corneal stem cell in review. Wound
Repair Regeneration. 9:483-494.
Davenger M, Evensen A. 1971. Role of the pericorneal papillary structure in renewal of corneal epithelium. Nature. 229:560-1.
De Roth A.1940. Plastic repair of conjuctival defects with fetal membranes. Archives
of Opthalmology. 23 522.
Dua HA, Miri A, Alomar T, et al. 2009. The role of limbal stem cells in corneal epithelial maintenance: Testing of dogma. Ophthalmology. 116(5):856-863.
Dua HS, Azuara-Blanco A. 1999. Amniotic membrane transplantation. British Journal
Ophthalmology. 83(6)748-752.
Dua HS, Azuara-Blanco A. 2000. A. Limbal stem cells of the corneal epithelium. Survey
of Ophthalmology. 44(5): 415-425.
Dua HS, Gomes JA, King AJ, et al. 2004. The amniotic membrane in ophthalmology.
Survey of Ophthalmology. 49(1):51-77.
Dua HS, Joseph A, Shanmuganathan VA, et al. 2003. Stem cell differentiation and the effects of deficiency. Eye. 17: 877-885.
Dua HS, Shanmuganathan VA, Powel-Richards AO, et al. 2005. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British
Journal Ophthalmology. 89:529-532.
corneal epithelial basement membrane, manifests the 5- chain of type IV collagen.
Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45(6):1771-1774.
Espana EM, Romano AC, Kawakita T, et al. 2003. Novel enzymatic isolation of an entire viable human limbal epithelial sheet. Investigative Ophthalmology and Visual
Science. 44:4275-4281
Gomes JAP, Komagome CM, Santos N, et al. 1999. Membrana amniótica nas cirurgias reconstrutivas da superfície ocular nas ceratoconjuntivites cicatriciais. Arquivos
Brasileiros de Oftalmologia. 62(5):562-576.
Griffith M, Osborne R, Munger R, et al. 1999. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286:2169-2172.
Grueterich M, Espana EM, Touhami A. 2002. Phenotypic study of a case with successful transplantation of ex vivo expanded human limbal epithelium for unilateral total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 109:1547-1552.
Hao Y, Ma DH, Hwang DG, al. 2000. Identification of antiangiogenic and antiinflamatory proteins in human amniotic membrane. Cornea. 19:348-352.
Hay ED. 1991. Cell biology of the extracellular matrix. 1st. New York: Plenum Press, p. 468.
Higa K, Shimmnura S, Kato N, et al. 2007. Proliferation and differentiation of transplantable rabbit epithelial sheets engineered with or without an amniotic membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48(2):597-604. Holland EJ, Mannis M, Barry Lee W. 2015. Doenças da Superfície Ocular. Saunders
Elsevier Rio de Janeiro, p. 317.
Hopkinson A, Mcintosh RS, Tighe PJ, et al. 2006. Amniotic membrane for ocular surface reconstruction: donor variations and the effect of handling on TGF-β content.
Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47(10):4316-4322.
John T. 2003. Human amniotic membrane transplantation: past, present, and future.
Ophthalmology Clinics of North American. 16:43-65.
Joseph A, Dua HS, King AJ. 2001. Failure of amniotic membrane transplantation in the treatment of acute ocular burns. British Journal of Ophthalmology. 85(9):1065-1069.
Kawakita T, Espana EM, He H, et al. 2005. Intrastromal invasion by limbal epithelial cells is mediated by epithelial-mesenchymal transition activated by air exposure.
American Journal of Pathology. 167:381-393.
Kenyon KR, Tseng SCG. 1989. Limbal autograft transplantation for ocular surface
Kim JC, Tseng SCG. 1995. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea. 14(5):473-84. Kim JS, Kim JC, Na BK, et al. 2000. Amniotic membrane patching promotes healing and inhibits proteinase activity on wound healing following acute corneal alkali burn. Experimental Eye Research. 70(3):329-337.
Kling S, Harilaos G, Marcos S. 2012. Corneal biomechanical properties from two-dimensional corneal flap extensiometry: application to UV-riboflavin cross-linking.
Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53(8):5010-5015.
Kobashiga KK, Aldrovani M, Padua IRM, et al. 2015. Human amniotic membrane promotes ex vivo expansion of rabbit limbal epithelial cells, without air-lifting or feed layer. In: Conference of the European College of Veterinary Ophtlalmologists – ECVO. Helsinki, Finland, p.17.
Kobayashi A, Sugiyama K. 2005. In vivo corneal confocal microscopic finding of the palisades of Vogt and its underlying limbal stroma. Cornea. 24(4):435-437.
Koizumi N, Rigny H, Fulwood NJ. 2007. Comparison of intact and denuded amniotic membrane as a substrate for cell-suspension culture of human limbal epithelial cells. Graefe’s for Archive Clinical and Experimental Ophthalmology. 245(1):123-134. Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, et al. 2001. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Investigative Ophthalmology and
Visual Science.42(7):1539-46.
Laus JL, Oriá AP. 1999. Doenças corneanas em pequenos animais. Revista de
Educação Continuada do CRMV SP. 2(1):26-33.
Lee SB, Li DQ, Tan DT, et al. 2000. Suppression of TGF-beta signaling in both normal conjunctival fibroblasts and pterygial body fibroblasts by amniotic membrane.
Current Eye Research. 20:325-334.
Lee SH, Tseng SC. 1997. Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. American Journal of Ophthalmology. 123:303-312.
Li F, Xu Y, Xu X, et al., 2014. Fms-related tyrosine kinase 3 ligand promotes proliferation of placenta amnion and chorion mesenchymal stem cells in vitro. Molecular Medicine
Reports. 10(1):322-328.
Li H, Niederkorn JY, Neelam S, et al. 2005. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 46(3):900-907.
ISSN 21774780
Lombardo G, Serrao S, Rosati M, et al. 2014. Analysis of the viscoelastic properties of the human cornea using Scheimpflug imaging in inflation experimental of eye globes. PLos One. 9(11):e112169.
Loureiro RR, Cristovam PC, Martins CM, et al. 2013. Comparison of culture media for ex vivo expansion of limbal epithelial progenitor cells. Molecular Vision. 19:69-77. Malhotra C, Jain AK. 2014. Human amniotic membrane transplantation: Different modalities of its use in ophthalmology. World Journal Transplantation. 4(2):111-21.
Mariappan I, Kacham S, Pursushotam J, et al. 2014. Spatial distribution of niche and stem cells in ex vivo human limbal cultures. Stem Cells Translational Medicine, pii: sctm.2014-0120.
McIntyre JA, Faulk WP. 1979. Antigens of human trophoblasts: effect of heterologous and anti-trophoblast sera on lymphocyte response in utero. The Journal of
Experimental Medicine. 49: 824.
Mei H, Gonzales S, Deng SX. 2012. Extracellular Matrix is an Important Component of Limbal Stem Cell Niche. FASEB Journal. 3(4):879-894.
Meller D, Pires RT, Mack RJ, et al. 2000. Thermal and chemical burns. Ophthalmology. 107:980-989.
Miri A, Al-Aquaba M, Otri AM, et al. 2012. In vivo confocal microscopic features of normal limbus. British Journal of Ophthalmology. 96(4):530-536.
Nakamura T, Inatomi T, Sotozono C, et al. 2006. Transplantation of autologous serum-derived cultivated corneal epithelial equivalentes for the treatment of severe ocular surface disease. Ophthalmology. 113:1765-1772.
Ovadia J, Nie Q. 2013. Stem Cell Niche Structure as an Inherent Cause of Undulating Epithelial Morphologies. Biophysical Journal. 104:237-246.
Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, et al. 1997. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet. 349(9057): 990-993.
Pontes KCS, Borges APB, Duarte TS, et al. 2008. Membrana amniótica canina utilizada como bandagem em úlcera superficial de córnea de coelhos – Aspectos clínicos.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 60(5):1069-1074.
Pontes KCS, Duarte TS, Machado DPD, et al. 2010. Membrana amniótica bovina, preservada em glicerina, no tratamento de úlcera de córnea em um cão e de sequestro corneal em dois felinos – Relato de casos. Revista Clínica Veterinária. 85:88-96.
Prabhasawat P, Barton K, Burkett G, et al. 1997. Comparison of conjunctival autografts, amniotic membrane grafts, and primary closure of pterygium excision.
Ophthalmology, 4(6):974-85.
Prabhasawat P, Tesavbibul N, Komolsuradej W, et al. 2001. Single and multilayer amniotic membrane transplantation for persistent corneal epithelial defect with and without stromal thinning and perforation. British Journal Ophthalmology. 85:1455-1463.
Puangsricharen V, Tseng SCG. 1995. Cytologic evidence of corneal diseases with limbal stem cell deficiency. Ophthalmology, 102:1476-1485.
Rama P, Matuska S, Paganoni G, et al., 2010. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New England Journal of Medicine. 363:147-155.
Rendal-Vasquez E, San-Luiz-Verdes A, Yebra TVP, et al. 2012. Culture of limbal stem cells on human amniotic membrane. Cell and Tissue Banking. 13:513-519.
Riau AK, Bererman RW, Lim LS, et al. 2010. Preservation, sterilization and de-epithelization of human amniotic membrane for use in ocular surface reconstruction.
Biomaterials. 31(2):216-225.
Robertson DM, Li L, Fisher S, et al. 2005. Characterization of growth and differentiation in a telomerase-immortalized human corneal epithelial cell line. Investigative
Ophthalmology and Visual Science. 46(2):479-478.
Roper-Hall MJ. 1965. Thermal and chemical burns. Transactions of the
Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 1965;85:631-53.
Rowe TF, King LA, MacDonald PC, et al. 1997. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 expression in human amnion mesenchymal and epithelial cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176(4):915-921.
Schermer A, Galvin S, Sun TT. 1986. Differentiation related expression of a major 64K corneal keratin in vivo and in culture suggests limbal location of corneal epithelial stem cells. Journal Cell Biology. 103(1):49-62.
Schwab IR. 1999. Cultured corneal epithelia for ocular surface disease. Transactions
of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 97:891-986.
Shimazaki J, Higa K, Morito F, et al. 2007. Factors influencing outcomes in cultivated limbal epithelial transplantation for chronic cicatricial ocular disorders. American
Journal of Ophthalmology. 143:945-953.
Shortt AJ, Secker GA, Munro PM, et al. 2007. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted
Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. Stem Cells. 25:1402-1409.
Silva Ricardo JR, de Barros SL, dos Santos MS, et al. 2010. Amniotic membrane transplantation for severe acute cases of chemical ocular burn and Stevens-Johnson syndrome. Arquivos Brasileiros de Oftalmologia. 72(2):215–20.
Solomon A, Ellies P, Anderson DF. 2002. Long-term outcome of keratolimbal allograft with or without keratoplasty for total limbal stem cell deficiency. Ophthalmology. 109(6):1159-1166.
Sorsby A, Symons HM. 1946. Amniotic membrane grafts in caustic burns of the eye (burns of the second degree). British Journal of Ophthalmology. 30:337-345. Tang J, Pan X, Weber PA, et al. 2011. Corneal modulus and IOP measurements in canine eyes using Goldmann applanation tonometry and Tono-pen. Investigative
Ophthalmology and Visual Science. 52(11):7866-7871.
Tanioka H, Kawasaki S, Yamasaki K, et al. 2006. Establishment of a cultivated human conjunctival epithelium as an alternative tissue source for autologous corneal epithelial transplantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47(9):3820-3827.
Thoft RA, Friend J. 1983. The X, Y, Z, hypothesis of corneal epithelial maintenance.
Investigative Ophthalmology and Visual Science. 24:1442-1443.
Thoft RA. Conjunctival transplantation. 1977. Archives of Ophthalmology. 195:1425-1427
Tsai RJ, Sun TT, Tseng SCG. 1990. Comparison of limbal and conjunctival autograft transplantation in corneal surface reconstruction in rabbits. Ophthalmology. 97(4):446-455.
Tseng SCG, Prabhasawat P, Barton K. 1998 Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency. Archives of Ophthalmology. 116(4):431-41.
Van Buskierk EM. 1989. The anatomy of the limbus. Eye. 3(2):101-108.
Vogt A. 1921. The limbus. In: Bonn-Bad G. Textbook and Atlas of Slit Lamp
Microscopy of the Living Eye. 3 ed. Wayenborgh: p.52-53.
Wang KM, Yoshida A, Kawashima H. et al. 2006. Immunogenicity and antigenicity of allogeneic amniotic epithelial transplants grafted to the cornea, conjunctiva and anterior chamber. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47(4):1522-1532.
