Toxigenomics: Principles and aplication. Dr. André D. Luchessi

(1)

Toxigenomics: Principles

and aplication

Dr. André D. Luchessi

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

• Em termos gerais toxigenômica são os estudos que

envolvem a pesquisa de mecanismos ou estudos de

predisposição a efeitos tóxicos.

(7)

GENES

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

• Anemia Falciforme

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

BLOCOS

(27)

TAG SNPs

MARIA JOÃO

(28)

POPULAÇÃO BRASILEIRA

(29)

Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11:65-89. doi: 10.1146/annurev-genom-082509-141523.

(30)

Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11:65-89. doi: 10.1146/annurev-genom-082509-141523.

(31)

(32)

(33)

Luchessi AD, Curi R, Costa-Neto CM. Revealing the translation control by transcriptome analysis. Einstein. 2006 Jul-Sep;4(3):237-40

(34)

Drake et al.,Mamm Genome, 2006.

(35)

• Organização do DNA – Nucleossomos • Ilhas CpG • Região promotora • Metilação do DNA • 5´ CAP • Splicing • Cauda poli A

• Degradação RNAm - miRNAs

• Formação do RNAt

Pré transcricional

Transcricional

Pós transcricional Pré traducional

• Formação cadeia peptídica Traducional

Mecanismos

(36)

(37)

Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al

CONTROLE

(38)

DNA Recombinante. 3° ed. James D. Watson. et al

(39)

DNA Recombinante. 3° ed. James D. Watson. et al

(40)

Espada J, Esteller M. Semin Cell Dev Biol. 2010 . DNA methylation and the functional organization of the nuclear compartment.

(41)

(42)

Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al

Comparação da sequência nucleotídica da região TATA de 60 genes diferentes de vertebrados

(43)

FATORES DE TRANSCRIÇÃO

(44)

Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al

(45)

Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

• Baixa precisão

• Baixa sensibilidade

• Baixa resolução

• Não automatizado

• Discriminação pelo tamanho dos fragmentos

• Resultados não expressos em números

PCR x TEMPO REAL

• Amplificação pode ser monitorada em tempo real

• Sem processamento pós-PCR

• Menor quantidade de amostra

• Mais sensível e específica que a PCR convencional

• Mais reprodutível que a PCR convencional

(55)

(56)

(57)

Fatores

• Preparo da reação (pipetagem, bolhas)

• Qualidade do DNA/cDNA molde • Presença de inibidores

• Seqüência dos iniciadores • Programa de amplificação • Concentração dos reagentes • Tamanho do amplicon

(58)

O SISTEMA ÓTICO

(59)

• Enzima uracil-N-glicosilase (UNG)

– Amplicon gerado contém dUTP

– Específica para deoxiuridina

– 500 _{C ativa; > 55}0 _{C inativa}

(60)

(61)

SISTEMAS

AMPLIFICAÇÃO

(62)

– Intercalante de DNA dupla fita

– Fluoróforo em suspensão no

master mix

– Inespecífico

– Permite curva de dissociação (melting)

– Não permite multiplex

– Quanto mais longa a cadeia de DNA, maior a fluorescência

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

– Baseia-se na atividade

5’-3’ exonuclease da Taq polimerase

– Funciona com sondas fluorescentes

– Altamente específico e sensível

– Não permite curva de dissociação

– Permite multiplex

(69)

Sonda:

• Localiza-se ~1-5 bases do primer sense

• Tm deve ser ~10ºC maior que Tm dos primers

• 1ª base não pode ser G (efeito Quencher)

• Não pode ter mais Gs do que Cs

• Não pode ter > 3 bases consecutivas iguais • Quencher fluorescente (TAMRA) ou não

fluorescente (NFQ)

• Pode ter ~30-40 bases (sonda TAMRA) ou ~15-20 bases (sonda com cauda MGB)

(70)

Absoluta:

• unidades palpáveis, determinando número de cópias,

• curva standard necessária para cada gene

Relativa:

• Análise comparativa de um gene alvo por meio dos Cts das amostras, gerando resultados relativos

TIPOS DE

(71)

(72)

QUANTIFICAÇÃO RELATIVA

deltaCT controle : 31 – 19 = 12

(73)

Quantificação Absoluta

• Fácil de entender os dados, porém muito mais caro e difícil de

desenvolver os padrões de curva standard

Quantificação Relativa

(74)

GENOTIPAGEM

C

(75)

(76)

(77)

Arranjos ordenados de fragmentos de DNA imobilizados sobre uma superfície sólida em alta densidade. Em geral, cada ponto no

arranjo corresponde a um gene específico, podendo existir dezenas de milhares de pontos em uma lâmina.

(78)

SÍNTESES

1- Oligo “espotado”

(79)

(80)

http://www.youtube.com/w atch?v=MuN54ecfHPw

(81)

LAG/UFRN

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

(95)

Inserto de DNA

Dois tipos de Oligos

(96)

(97)

(98)

(99)

(100)

AMPLIFICAÇÃO

(101)

(102)

(103)

(104)

(105)

(106)

SEQUENCIAMENTO

MOLDE

OLIGO DE

(107)

(108)

(109)

(110)

PRIMEIRA

(111)

(112)

(113)

SEGUNDA

(114)

(115)

(116)

(117)

(118)

(119)

(120)

(121)

(122)

ALINHAMENTO

(123)

(124)

(125)

(126)

(127)

(128)

(129)

(130)

(131)

(132)

(133)

(134)