Caracterização química dos óleos essenciais e extratos supercríticos de três espécies de Piper de Sergipe

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA. Caracterização Química dos Óleos Essenciais e Extratos Supercríticos de Três Espécies de Piper de Sergipe. São Cristovão-SE 2014 1 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(2) Caracterização Química dos Óleos Essenciais e Extratos Supercríticos de Três Espécies de Piper de Sergipe. RAFAELY NASCIMENTO LIMA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe, como um dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.. Orientador: Prof. Dr. Péricles Barreto Alves. São Cristovão-SE 2014 2 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. L732c. Lima, Rafaely Nascimento Caracterização química dos óleos essenciais e extratos supercríticos de três espécies de Piper de Sergipe / Rafaely Nascimento Lima ; orientador Péricles Barreto Alves. – São Cristóvão, 2014. 140 f. : il. Dissertação (mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2014.. 1. Química orgânica. 2. Essências e óleos essenciais. 3. Extração com fluído supercrítico. 4. Plantas medicinais. 5. Inseticidas. 6. Citotoxicidade. I. Alves, Péricles Barreto, orient. II. Título. CDU 547.913. 1 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(4) 2 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(5) AGRADECIMENTOS. ―Aqueles que passam por nós, não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós”. Antonie de Saint- Exupéry. Mais um ciclo se completa e com ele a oportunidade de deixar gravado o agradecimento as pessoas que contribuíram diretamente na minha jornada de estudos e conquistas. Agradeço a Deus pela dádiva da vida e por ter escolhido dois anjos com a permissão de me conceberem numa família maravilhosa, anjos que me orientaram e educaram. Muito obrigada, Marivania Lima (mainha) e Regivaldo Lima (painho) por todo o suporte e dedicação. Agradeço a minha avó (Maria Lúcia Martins) por ter com todo carinho e amor morado comigo durante quatro anos, mulher que é guerreira e sempre disposta a ajudar. A minha irmã Reniely Lima pelos enjoos e brigas, por que é assim que ela demostra que me ama. A minha irmã Regivania Lima pelos momentos de descontração e divertimento. A minha irmã Regiane Lima por ser chata e me fazer rir da chatice dela. A minha irmã Rayany Lima que tenho quase como uma filha, meu fucinho. Enfim, “My True Loves” muito obrigada. Agradeço a Charlene dos Anjos pelo companheirismo, amizade e ajuda incondicional. A Leociley Rocha pela amizade e momentos de curtição. A Darlisson de Alexandria, Iara Matos, Michel Rubens, Fátima Costa, Bruno Araújo, Pedro Ellison, seu João dos Anjos e mainha Telma dos Anjos por me aturarem e praticamente me adotarem. Ao prof. Dr. Adalto Ribeiro (UFS) pela iniciativa de apresentar e identificar as plantas estudadas nesse trabalho. Ao prof. Dr. Lúcio Filho (UEM) por disponibilizar seu laboratório para pesquisa com Fluido Supercrítico. Aos prof. Dr. Daniel Bezerra (FIOCRUZ) e Dra. Gilvandete Santiago (UFC) pela realização dos testes biológicos. Ao prof. Dr. Emmanoel Costa (UFS) pelos conhecimentos transferidos e ajuda ao desenvolvimento do trabalho, ao prof. Dr. Alberto (UFS) e Prof. Dr. Sandro Navickiene (UFS) pela disponibilidade em ajudar.o prof. Dr. Anderson Barison (UFPR) e ao quase doutor Alan Diego pelas análises de RMN e por fim, mas não menos importante a painho 2, meu orientador prof. Dr. Péricles Alves (UFS) pela oportunidade de ingressar no meio cientifico e contribuição incondicional para o desenvolvimento do Mestrado. A Universidade Federal de Sergipe A Capes pelo auxílio financeiro Ao projeto do edital PROMOB-Fapitec/Capes Obrigada a todos... E saibam que vocês alimentam a minha alma e me fazem feliz!. 3 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(6) SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS..................................................................................................... 7 LISTA DE TABELAS .................................................................................................... 9 LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................... 11 LISTA DE ESQUEMAS .............................................................................................. 11 LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... 12 RESUMO....................................................................................................................... 13 ABSTRACT .................................................................................................................. 14 1.. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15 1.1.. Importância das plantas medicinais ................................................................. 15. 1.2.. Óleos essenciais ............................................................................................... 16. 1.3.. Métodos de extração tradicional ...................................................................... 16. 1.3.1. 1.4.. Extração com Fluido Supercrítico (EFS).................................................. 17. Planejamento experimental e estatística .......................................................... 19. 2.. JUSTIFICATIVAS PARA A UTILIZAÇÃO DA EFS ...................................... 21. 3.. REVISÂO DA LITERATURA ............................................................................ 22 3.1.. Família Piperaceae ........................................................................................... 22. 3.2.. Gênero Piper .................................................................................................... 22. 3.2.1. Rota biossintética dos principais metabólitos secundários do gênero Piper....... ................................................................................................................. 24 3.3.. 4.. Piper hispidum ................................................................................................. 27. 3.3.1.. Considerações gerais sobre P. hispidum .................................................. 27. 3.3.2.. Composição química dos óleos essenciais ............................................... 27. 3.3.3.. Composição química dos extratos de P. hispidum ................................... 30. 3.4.. Piper arboreum ................................................................................................ 35. 3.5.. Piper klotzschianum ......................................................................................... 37. 3.6.. Extração com fluido supercrítico de espécies do gênero Piper ....................... 40. OBJETIVOS .......................................................................................................... 43 4.1.. Geral ................................................................................................................. 43. 4.2.. Específicos ....................................................................................................... 43 4. Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(7) 5.. METODOLOGIA ................................................................................................. 44 5.1.. Processo de secagem e moagem de partes das espécies em estudo ................. 44. 5.2.. Obtenção de óleos essenciais por hidrodestilação ........................................... 44. 5.3. Planejamento fatorial para extração supercrítica da P. klotzschianum e P. hispidum ...................................................................................................................... 45 5.4.. Obtenção dos extratos supercríticos ................................................................ 47. 5.5.. Teor de umidade das folhas secas para SFE .................................................... 48. 5.6.. Análise e identificação dos constituintes do óleo essencial extraído por HD.. 48. 5.6.1. Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas/Detector de Ionização em Chama (CG/EM/DIC) ....................................................................................... 48 5.7.. Identificação dos constituintes dos óleos essenciais hidrodestilados .............. 49. 5.8.. Análise e identificação dos constituintes dos extratos supercríticos ............... 49. 5.8.1.. Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas (CG/EM) ................... 50. 5.9. Análise Espectroscópica por Ressonância Magnética Nuclear (RMN/1D, 2D) das substâncias isoladas .............................................................................................. 50 5.10. Análise Espectroscópica na Região do Infravermelho-(IV) das substâncias isoladas ...................................................................................................................... 51 5.11.. Isolamento dos constituintes do extrato obtido por SC-CO2 da P. hispidum 51. 5.12.. Ensaios Biológicos ....................................................................................... 52. 5.12.1. Ensaio larvicida sobre Aedes aegypti ....................................................... 52 5.13.. Estudo da citotoxicidade em linhagens de células tumorais in vitro............ 52. 5.13.1. Preparo das amostras ................................................................................ 52 5.13.2. Células ...................................................................................................... 53 5.13.3. Triagem citotóxica .................................................................................... 53 6.. RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................ 55. Óleos essenciais obtidos por HD .................................................................................. 55 6.1. Resultados das análises dos voláteis obtidos por hidrodestilação das espécies estudadas ..................................................................................................................... 55 6.2. Caracterização química dos óleos essenciais obtido por hidrodestilação da P. klotzschianum.............................................................................................................. 56 6.3. Caracterização química dos óleos essenciais obtido por hidrodestilação da P. hispidum ...................................................................................................................... 59 6.4. Caracterização químicados óleos essenciais obtidos por hidrodestilação da P. arboreum ..................................................................................................................... 61 5 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(8) 6.5. Estudo comparativo entre as composições químicas dos óleos essenciais das P.klotzschianum, P. hispidum e P. arboreum ............................................................. 63 7.. Extratos supercríticos ........................................................................................... 66 7.1.. P. klotzschianum-Extração das folhas secas utilizando SC-CO2 ..................... 66. 7.2. Caracterização química dos extratos obtidos por SC-CO2 das folhas secas de P. klotzschianum.............................................................................................................. 69 7.1. P. klotzschianum- Extração das folhas secas utilizando SC-CO2 + cosolvente...... ................................................................................................................. 75 7.2. Caracterização química dos extratos obtidos por SC-CO2 + co-solventes da P. klotzschianum (folhas secas) ....................................................................................... 79 7.3.. P. hispidum –Extração das folhas secas SC-CO2 ............................................ 82. 7.4. Caracterização química dos extratos obtidos por SC-CO2 das folhas secas de P. hispidum ...................................................................................................................... 84 7.1.. P. hispidum – Extração das folhas secas com SC-CO2 + co-solventes ............ 87. 7.2. Caracterização química dos extratos obtidos por SC-CO2 + co-solvente da P. hispidum (folhas secas) ............................................................................................... 90 8.. 9.. Isolamento de substâncias do extrato obtido com SC-CO2 de P. hispidum ...... 93 8.1.. Estudo cromatográfico de GF-4 ....................................................................... 93. 8.2.. Identificação da substância PHC6_2 ............................................................... 94. 8.3.. Identificação da substância PHC9 ................................................................. 103. 8.4.. Identificação da substância PHC7 ................................................................. 111. Testes biológicos .................................................................................................. 126 9.1.. Ensaio larvicida sobre Aedes aegypti ............................................................. 126. 9.2.. Triagem citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro ...................... 127. 10. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 128 11. PERSPECTIVAS ................................................................................................ 130 12. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 131. 6 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(9) LISTA DE FIGURAS. Figura 1: Diagrama de fases mostrando a região supercrítica do dióxido de carbono-CO2 ........................................................................................................................................ 18 Figura 2: Estrutura dos constituintes majoritários obtidos da P. hispidum .................... 29 Figura 3: Constituinte majoritário presente nos óleos essenciais das diferentes partes de P. klotzschianum ............................................................................................................. 37 Figura 4: Outras substâncias identificadas no extrato hexânico das raízes de P. klotzschianum ................................................................................................................. 39 Figura 5: Fotos das espécies em estudo: (a) P. klotzschianum, (b) P. arboreum (c) P. hispidum ......................................................................................................................... 45 Figura 6: Aparato experimental utilizado para a extração supercrítica com CO2 e CO2 + co-solventes .................................................................................................................... 47 Figura 7: Cromatogramas de íons totais (TIC) de análises por CG/EM das partes de P. klotzschianumm .............................................................................................................. 56 Figura 8: Cromatogramas de íons totais de análises por CG/EM das partes de P. hispidum ......................................................................................................................... 59 Figura 9: Cromatogramas de íons totais de análises por CG/EM das partes de P. arboreum ........................................................................................................................ 61 Figura 10: TIC da amostra obtida utilizando SC-CO2 a 60 °C/200 bar - P. klotzschianum (folhas secas) .................................................................................................................. 70 Figura 11: Espectro de massas da piperovatina obtido dos extratos por SC-CO2 .......... 73 Figura 12: Espectro de massas da pipercalosidina obtido dos extratos por SC-CO2 ..... 74 Figura 13: Comparação de cromatogramas de íons totais obtidos utilizando 5% de cosolvente + SC-CO2- P. klotzschianum (folhas secas) ..................................................... 80 Figura 14:Cromatograma de íons totais da amostra obtida utilizando SC-CO2 a 80 °C/200 bar - P. hispidum (folhas secas) ......................................................................... 85 Figura 15:Comparação de cromatogramas de íons totais das amostras obtidas utilizando 5% de co-solvente SC-CO2-P. hispidum ........................................................................ 91 Figura 16: Substâncias isoladas e identificadas no estudo fitoquímico do extrato de SCCO2 das folhas de P. hispidum........................................................................................ 94 Figura 17: Espectro de absorção na região de Infravermelho da substância PHC6_2 ... 95 Figura 18: Cromatograma de íons totais da amostra PHC6_2 ....................................... 96 Figura 19: Espectro de massas do pico 1 da amostra PHC6_2 ...................................... 96 Figura 20: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da substância PHC6_2 ................ 97 Figura 21: Expansões das regiões de emissões de hidrogênios da substância PHC6_2 97 Figura 22: Ampliação da região entre 1,5-7,5 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para a PHC6_2 ........................................................................................... 99 Figura 23: Ampliação da região entre 6,5-8,0 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para a PHC6_2 ........................................................................................... 99 Figura 24: Principais correlações a longa distância (HMBC) da substância PHC6_2 . 100 7 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(10) Figura 25: Ampliação da região entre 1,5-4,0 ppm do mapa de correlação a longa distância2J e 3J – (1H-13C)–HMBC para a PHC6_2 (150 MHz, CDCl3)....................... 101 Figura 26: Ampliação da região entre 5,0-7,5 ppm do mapa de correlação a longa distância 2J e 3J-(1H-13C )–HMBC (150 MHz, CDCl3) ................................................ 101 Figura 27: Espectro de massas da substância PHC6_2 ................................................ 103 Figura 28: Espectro de absorção na região de Infravermelho da substância PHC9 ..... 104 Figura 29: Cromatograma de Íons Totais da substância PHC9 .................................... 105 Figura 30: Espectro de massas da substância PHC9 .................................................... 105 Figura 31: Espectro de RMN 1H da substância PHC9 ................................................. 106 Figura 32: Expansões das regiões de emissões de hidrogênios da substância PHC9 .. 106 Figura 33: Ampliação da região entre 1,5-4,0 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para a PHC9 ............................................................................................. 108 Figura 34: Ampliação da região entre 5,5-7,2 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para a PHC9 ............................................................................................. 108 Figura 35: Principais correlações a longa distância (HMBC) da substância PHC9 ..... 108 Figura 36:Principais correlações a longa distância (HMBC) da substância PHC9 ...... 109 Figura 37: Ampliação da região entre 1,5-7,5 ppm do mapa de correlação a longa distância de 1H-13C – HMBC para a PHC9 .................................................................. 109 Figura 38: Espectro de Infravermelho da amostra PHC7 ............................................. 111 Figura 39: Cromatograma de íons totais da amostra PHC7 ......................................... 112 Figura 40: Espectros de massas das substâncias PHC7_1 e PHC7_2 respectivamente 112 Figura 41: Espectro de RMN 1H (600 MHz, CDCl3) da amostra PHC7 ...................... 113 Figura 42: Expansões das regiões de emissões de hidrogênios das substâncias PHC7_1 e PHC7_2. ....................................................................................................................... 114 Figura 43: Ampliação da região entre 1,5-4,0 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para PHC7_1 e PHC7_2 .......................................................................... 115 Figura 44: Ampliação da região entre 5,5-7,5 ppm do mapa de correlação direta de 1H13 C – HSQC para PHC7_1 e PHC7_2 .......................................................................... 116 Figura 45: Principais correlações a longa distância (HMBC) das substâncias PHC7_1 e PHC7_2 ........................................................................................................................ 116 Figura 46: Principais correlações a longa distância (HMBC) das substâncias PHC7_1 e PHC7_2 ........................................................................................................................ 117 Figura 47: Ampliação da região entre 6,0-8,0 ppm do mapa de correlação a longa distância de 1H-13C – HMBC para a PHC7_1 e PHC7_2............................................. 117 Figura 48: Ampliação da região entre 1,5 -4,0 ppm do mapa de correlação a longa distância de 1H-13C – HMBC para a PHC7_1 e PHC7_2............................................. 117 Figura 49: Espectro de massas das substâncias PHC7_1 e PHC7_2 ............................ 121 Figura 50: Comparação de cromatogramas de íons totais de compostos isolados e do extrato de P. hispidum .................................................................................................. 124. 8 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1: Fenilpropanóides presentes em alta concentração em espécies do gênero Piper............................................... ................................................................................ 24 Tabela 2: Compostos Majoritários (%) comuns às espécies de Piper analisadas por CG/EM ........................................................................................................................... 24 Tabela 3: Data de coleta das três Piper .......................................................................... 44 Tabela 4: Condições das EFS ......................................................................................... 46 Tabela 5: Rendimentos de óleos essenciais extraído de partes de espécies do gênero Piper ............................................................................................................................... 55 Tabela 6: Composição química dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação da P. klotzschianum ................................................................................................................. 56 Tabela 7: Composição química dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação da P. hispidum ......................................................................................................................... 59 Tabela 8: Composição química dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação da P. arboreum ........................................................................................................................ 61 Tabela 9: Rendimento dos extratos obtidos das folhas secas de P. klotzschianum por extração com SC-CO2 (ponto central) ............................................................................ 66 Tabela 10: Rendimento dos extratos obtidos das folhas secas de P. klotzschianum da extração com SC-CO2..................................................................................................... 67 Tabela 11: Compostos identificados nos extratos de P. klotzschianum (folhas secas) extraídos com SC-CO2 ................................................................................................... 70 Tabela 12: Rendimentos dos extratos obtidos por SC-CO2 e adição de co-solvente da espécie P. klotzschianum (folhas secas) ......................................................................... 76 Tabela 13: Teste de variância ANOVA (P. klotzschianum)........................................... 78 Tabela 14: Compostos identificados nos extratos de P. klotzschianum (folhas secas) extraídos com SC-CO2 + co-solventes............................................................................ 80 Tabela 15: Rendimento dos extratos de P. hispidum obtidos por extração com SC-CO2 (ponto central)................................................................................................................. 82 Tabela 16: Rendimento dos extratos de P. hispidum obtidos pela extração com SC-CO2 ........................................................................................................................................ 82 Tabela 17: Compostos identificados nos extratos de P. hispidum (folhas secas) extraídos com SC-CO2 ................................................................................................................... 85 Tabela 18: Rendimentos dos extratos obtidos por SC-CO2 e adição de co-solventes da espécie P. hispidum (folhas secas) ................................................................................. 87 Tabela 19: Teste de variância ANOVA (P. hispidum) ................................................... 89 Tabela 20: Compostos identificados nos extratos de P. hispidum (folhas secas) extraídos com SC-CO2 + co-solvente ............................................................................................ 91 Tabela 21: Relação entre grupos de frações/substâncias isoladas do extrato obtido por EFS das folhas secas de P. hispidum (PHCO2) .............................................................. 93 Tabela 22: Dados de RMN (1D e 2D) para substância PHC6_2.................................. 102 Tabela 23: Dados de RMN (1D, 2D) para a substância PHC9..................................... 110 9 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(12) Tabela 24: Dados de RMN (1D, 2D) para a substância PHC7_1................................. 119 Tabela 25: Dados de RMN (1D, 2D) para a substância PHC7_2................................. 120 Tabela 26: Tabela dos constituintes identificados por CG/EM, RMN (1D, 2D) e IV dos extratos de P. hispidum................................................................................................. 124 Tabela 27: Resultados obtidos de CL50 para as amostras de óleo essenciais das amostras testadas ......................................................................................................................... 126 Tabela 28: Porcentagem de inibição da proliferação celular em linhagens de HepG2 e HL60 ............................................................................................................................. 127. 10 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(13) LISTA DE GRÁFICOS. Gráfico 1: Gráfico comparativo dos percentuais de monoterpenos não oxigenados das espécies estudadas .......................................................................................................... 64 Gráfico 2: Gráfico comparativo dos percentuais de sesquiterpenos não oxigenados das espécies estudadas .......................................................................................................... 65 Gráfico 3: Gráfico comparativo dos percentuais de sesquiterpenos oxigenados das espécies estudadas .......................................................................................................... 65 Gráfico 4: Rendimento em função do tempo para as extrações por SC-CO2 da P. klotzschianum ................................................................................................................. 66 Gráfico 5: Gráfico de resposta superficial dos rendimentos das extrações por SC-CO2 P. klotzschianum ................................................................................................................. 68 Gráfico 6: Análise de variável significativa pelo gráfico de Pareto (P. klotzschianum). 69 Gráfico 7: Rendimento em função do tempo para as extrações por SC-CO2 + cosolventes da P. klotzschianum ........................................................................................ 77 Gráfico 8: Influência das variáveis nas extrações de P. klotzschianum por SC-CO2 + cosolvente ........................................................................................................................... 78 Gráfico 9: Rendimento em função do tempo para as extrações por SC-CO2 da P. hispidum ......................................................................................................................... 82 Gráfico 10: Gráfico de resposta superficial dos rendimentos das extrações por SC-CO2 P. hispidum ..................................................................................................................... 83 Gráfico 11: Análise de variável significativa pelo gráfico de Pareto (P. hispidum) ...... 84 Gráfico 12: Rendimento em função do tempo para as extrações por SC-CO2 + cosolventes da P. hispidum ................................................................................................ 88 Gráfico 13: Influência das variáveis na extração de P. hispidum por SC-CO2 + cosolvente ........................................................................................................................... 89. LISTA DE ESQUEMAS. Esquema 1: Rota biossintética para alguns monoterpenos encontrados no gênero Piper ........................................................................................................................................ 25 Esquema 2: Rota biossintética de alguns sesquiterpenos encontrados no gênero Piper 26 Esquema 3: Fracionamento cromatográfico de PHCO2 ................................................. 51 Esquema 4: Proposta de fragmentação para piperovatina .............................................. 73 Esquema 5: Proposta de fragmentação para pipercalosidina.......................................... 74 Esquema 6: Resultado do isolamento da fração GF-4 .................................................... 93 Esquema 7: Proposta de fragmentação da substância PHC6_2 .................................... 103 Esquema 8: Proposta de fragmentação para as substâncias PH7_1 e PHC7_2 ............ 122. 11 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS. ANOVA CC CCDP CG/DIC CG/EM CI50 CL50 D Dd Ddd dddt DMSO dt EFS EM HD HepG2 HL-60 HMBC HSQC Hz IR.exp. IR.lit. IV M+• J m. Análise de variância Cromatografia em Coluna Cromatografia em Camada Preparativa Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas Concentração Inibidora 50% Concentração Letal 50% Dupleto Duplo dupleto Duplo duplo dupleto Duplo duplo duplo tripleto Dimetilsulfóxido Duplo tripleto Extração com Fluido Supercrítico Espectro de Massas Hidrodestilação Carcinoma Hepatocelular Humano Leucemia Promielocítica Humana Correlações heteronucleares de múltiplas ligações Correlação heteronuclear de ligação direta Hertz Índice de retenção experimental Índice de retenção da literatura Infravermelho Íon molecular Constante de acoplamento Multipleto. m/z MHz RMN S SC-CO2 TIC U Δ. Massa/carga Megahertz Ressonância Magnética Nuclear Simpleto Dióxido de Carbono Supercrítico Cromatograma de Íons Totais Unidade de massa atômica Deslocamento químico. 12 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(15) RESUMO. Visando contribuir para o conhecimento químico das espécies P. klotzschianum, P. hispidum e P. arboreum, análises dos voláteis obtidos por hidrodestilação-(HD), extratos obtidos por extração com fluido supercrítico-(EFS) e identificação de compostos isolados foram realizadas por técnicas como CG/EM/DIC, RMN (1D, 2D) e IV. Sesquiterpenos presentes na P. klotzschianum, P. hispidum e P. arboreum como o (E)-cariofileno, biciclogermacreno e o germacreno D observados somente na P. klotzschianum e P. hispidum foram as principais substâncias responsáveis pelos altos percentuais de sesquiterpenos identificados obtidos por HD. Para os monoterpenos o βpineno (27,19±0,27%) e α-pineno (7,17±0,50%) identificados na composição química dos caules de P. klotzschianum e -3-careno (17,39±0,15%-19,13±0,48%) respectivamente presente nas folhas frescas e folhas secas da P. hispidum mereceram destaque. O maior rendimento de extrato utilizando dióxido de carbono supercrítico(SC-CO2) foi 1,36% (80 °C/220 bar) P. klotzschianum e 1,92% (80 °C/200 bar) para a P. hispidum, já com adição de modificadores 2,18% para a P. klotzschianum e 3,62% para a P. hispidum ambas utilizando 5% de metanol a 80 °C/220 bar. Pela análise de variância e teste F o co-solvente foi a variável que maior influenciou para os rendimentos dos extratos F=288,95 (P. klotzschianum) e F=409,59 (P.hispidum). Os constituintes majoritários identificados por CG/EM/DIC para a P. hispidum utilizando SC-CO2 e SC-CO2 + co-solventes foram o germacreno D (21,08%-80 °C/200 barisopropanol 1%) e o esqualeno (15,18%-80 °C/200 bar). Quatro substâncias inicialmente não identificadas por CG/EM/DIC foram isoladas dos extratos de SC-CO2 por meio de cromatografia em coluna-(CC) seguida de cromatografia em camada preparativa-(CCDP) N-[3-(6’-metoxi-3’,4’-metilenodioxifenil)-2(Z)-propenoil]pirrolidina (PHC7_1), N-[3-(6’-metoxi-3’,4’-metilenodioxifenil)-2(E)-propenoil]pirrolidina (PHC7_2), N-[7(3’,4’ metilenodioxifenil)-2(Z),4(E)-heptadienoil]pirrolidina (PHC6_2) e N-[7(3’,4’ metilenodioxifenil)-2(E),4(Z)-heptadienoil]pirrolidina (PHC9), dentre estas apenas a PHC7_1 foi citada na literatura sobre P. hispidum, as demais foram relatadas pela primeira vez na espécie, sendo a PHC6_2 e PHC9 inéditas na literatura. Na composição química dos extratos da P. klotzschianum o germacreno D (25,00±0,11%-40 °C/220 bar/isopropanol 3%), biciclogermacreno (15,41±0,23%-40 °C/220 bar/isopropanol 3%), 14-oxi-α-muuroleno (21,23±0,10%-80 °C/180 bar/etanol 3%), pipercalosidina (22,06±0,01%-40 °C/180 bar/metanol 1%) e (E)-cariofileno (11,66±0,05%-40°C/220 bar/isopropanol 3%) foram os constituintes majoritários presentes nos extratos obtidos com SC-CO2 ou com adição de modificadores. Dentre as amostras testadas na IC50 frente às células HepG2 e HL60 as amostras P. klotzschianum óleo dos caules (94,77±1,93%-HepG2), P. klotzschianum óleo dos frutos (90,53±1,10%-HepG2, 76,64±7,44%-HL60) e P. klotzschianum óleo das folhas frescas (93,24±0,70%-HepG2) apresentaram atividade citotóxica. Os óleos obtidos das folhas secas da P. klotzschianum (122,372±1,247 µg mL-1), folhas secas da P. hispidum (141,876±2,333 µg mL-1), folhas frescas da P. arboreum (187,901±2,106 µg mL-1) e folhas frescas da P. klotzschianum (223,051±1,253 µg mL-1) apresentaram atividade larvicida contra o mosquito Aedes aegypti. Palavras- chaves: Piper, extração supercrítica, óleos essenciais, larvicida, citotoxidade. 13 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(16) ABSTRACT. To contribute to the knowledge of the chemical species P. klotzschianum, P. hispidum and P. arboreum, analyzes of volatile obtained by hydrodistillation-(HD), extracts obtained by supercritical fluid extraction-(SFE) and identification of isolated compounds were performed using techniques such as GC/MS/FID, NMR (1D, 2D) and IV. Sesquiterpenes present in P. klotzschianum, P. hispidum and P. arboreum as the (E)-caryophyllene, bicyclogermacrene and germacrene D observed only in P.hispidum and P. klotzschianum were the main substances responsible for the high values obtained sesquiterpenes identified by HD. For the monoterpenes β-pinene (27.19±0.27%) and αpinene (7.17±0.50%) identified in the chemical composition of the stems of P. klotzschianum and -3-carene (17.39±0.15%, 19.13±0.48%) respectively present in fresh and dry leaves of P. hispidum also deserved highlighted. The highest yield of extract using supercritical carbon dioxide-(SC-CO2) was 1.36% (80 °C/220 bar) P. klotzschianum and 1.92% (80 °C/200 bar) for P. hispidum, already with the addition of modifiers 2.18% for P. klotzschianum and 3.62% P. hispidum both using 5% methanol at 80 °C/220 bar. By analysis of variance and F test the cosolvent was the variable that most influenced the yields of extracts for F = 288.95 (P. klotzschianum) and F = 409.59 (P.hispidum). The major compounds identified by GC/MS/FID of P. hispidum using SC-CO2 and SC-CO2 + co-solvents were germacrene D (21.08%-80 °C/200 barisopropanol 1%) and squalene (15.18%-80 ° C/200 bar). Four compounds not initially identified by GC/MS/FID were isolated from extracts of SC-CO2 by columnchromatography (CC) followed by preparative layer chromatography-(CCDP): N-[3-(6methoxy-3', 4'-methylenedioxyphenyl)-2(Z)-propenoyl]-pyrrolidine (PHC7_1), N-[3(6'-methoxy-3', 4'-methylenedioxyphenyl)-2 (E)-propenoyl]-pyrrolidine (PHC7_2), N[7 (3', 4' methylenedioxyphenyl)-2(Z), 4(E)-heptadienoil]-pyrrolidine (PHC6_2) and N[7 (3', 4' methylenedioxyphenyl)-2(E), 4(Z)-heptadienoil]-pyrrolidine (PHC9), among these only PHC7_1 was cited in the literature on P. hispidum, the others were first reported in the species, with an PHC6_2 PHC9 unpublished in the literature. In chemical composition of the extracts of P. klotzschianum, germacrene D (25.00±0.11%40 °C/220 bar/isopropanol 3%), bicyclogermacrene (15.41±0.23%-40 °C/220 bar/isopropanol 3%), 14-oxy-muuroleno-α (21.23±0.10%-80 °C/180 bar/ethanol 3%) pipercalosidina (22.06±0.01%-40 °C/180 bar/methanol 1%) and (E)-caryophyllene (11.66±0.05%-40 °C/220 bar/isopropanol 3%) are the major constituents present in the extracts obtained with SC-CO2 or addition modifier. Among the samples tested in front of IC50 HepG2 and HL-60 cells, the samples P. hispidum stems oil (94.77±1.93%HepG2), P. klotzschianum fruit oil (90.53±1.10%-HepG2, 76.64±7.44%-HL-60) and P. klotzschianum oil fresh leaves (93.24±0.70%-HepG2) had cytotoxic activity. The oil obtained from the dried leaves of P. klotzschianum (122.372±1.247 μg mL-1), dried leaves of P. hispidum (141.876±2.333 μg mL-1), fresh leaves of P. arboreum (187.901±2.106 μg mL-1) and fresh leaves P. klotzschianum (223.051±1.253 μg mL-1) showed larvicidal activity against the mosquito Aedes aegypti. Keywords: Piper, supercritical extraction, essential oils, larvicide, cytotoxicity.. 14 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(17) 1. INTRODUÇÃO. A natureza sempre despertou no homem um grande fascínio, não só pelos recursos oferecidos para sua alimentação e manutenção, mas por ser sua principal fonte de inspiração e aprendizado. A busca incessante pela compreensão das leis naturais e o desafio de transpor barreiras à sua sobrevivência, como o clima e as doenças, levaram o homem ao atual estágio de desenvolvimento científico (BOLZANI, JR. CLÁUDIO e BARREIRO, 2006). Por meio da pesquisa de produtos naturais e com a detenção dos valores e saberes populares da utilização de ervas para o tratamento de enfermidades, a sociedade científica visa à obtenção de extratos, óleos essenciais ou substâncias isoladas com potencial terapêutico que futuramente podem ser utilizadas como protótipos para síntese de moléculas e/ou produtos de interesse medicinal. A natureza, de forma geral, produz a maioria das substâncias orgânicas conhecidas. O reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos (PINTO, SILVA, et al., 2002). Essa fantástica variedade e complexidade dos metabólitos secundários biossintetizados pelas plantas são formados e evoluem como mecanismo de defesa dos vegetais às condições ambientais ricas em microrganismos, insetos, animais e também às condições de adaptação e regulação (REINBOTHE, DIETTRICH e LUCKNER, 1990).. 1.1.. Importância das plantas medicinais. Alguns fitofármacos, como por exemplo ginkgo, kava pironas, ginseng, erva de são joão, entre outros, reacenderam o interesse da indústria farmacêutica para os produtos de origem vegetal. Por volta de 1990, estimou-se que cerca de 80% da população mundial procuravam nas plantas a fonte principal de medicamentos (FLEURETIN e PELT, 1990). Está comprovado hoje, que grande parte da população mundial, principalmente aquelas de países em desenvolvimento usam como medicamentos extratos ou porções oriundas de plantas. Essa motivação da indústria 15 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(18) farmacêutica, em parte, ocorreu pela descoberta de quimioterápicos eficazes como vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), podofilotoxina, os análogos etoposídeo (VP-16-213; Vepeside®) e teniposídeo (VM-26; Vumon®), camptotecina e taxol (plaxitaxel; Taxol®) (MONTANARI e BOLZANI, 2001). Essa importância na obtenção de fitofármacos citados na literatura como produtos medicinais provenientes de origem vegetal que apresentam em suas composições óleos essenciais, extratos obtidos por prensagem, extratos obtidos por solventes orgânicos, por fluido supercrítico e substâncias isoladas, apresentam grande importância para a sociedade justamente devido as aplicações terapêuticas desde analgésica, antimicrobiana, cicatrizante, expectorante, relaxante, anti-séptica das vias respiratórias, larvicida, vermífuga, anti-inflamatória, antiviral e antiespasmódica (NASCIMENTO, NASCIMENTO, et al., 2007).. 1.2.. Óleos essenciais. Os óleos essenciais são produzidos principalmente pelas folhas, durante o desenvolvimento da planta em resposta, ou não, a algum tipo de estresse ambiental. Dependendo do ambiente no qual o vegetal se desenvolve e do tipo de cultivo, fatores extrínsecos como temperatura, umidade relativa, duração total de exposição ao sol e o regime de ventos exercem uma influência direta sobre a composição química dos óleos e voláteis da planta (YAMAMOTO, 2006). Estes podem ser obtidos por meio da destilação por arraste a vapor, processo baseado na passagem do vapor d’água através do material vegetal, fazendo com que substâncias com elevada pressão de vapor sejam extraídas por meio do rompimento das paredes celulares que armazenam esses metabólitos secundários. Como também pela infusão do material vegetal em água a temperatura de ebulição extraindo os compostos voláteis (óleos essenciais) de baixa massa molecular em sua maioria monoterpenos (C10) e sesquiterpenos (C15).. 1.3.. Métodos de extração tradicional. O método mais comum para o processamento de ervas envolve aquecer a amostra em água em ebulição por horas de modo que a maior parte dos ingredientes voláteis sejam condensados e coletados (Hidrodestilação-HD). Outro método envolve o 16 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(19) uso de solventes orgânicos (etanol, éter, clorofórmio e metanol). Quando métodos tradicionais (ex. extração com solventes) são utilizados os extratos consistem em diversos compostos, incluindo algumas substâncias indesejadas que se dissolvem com os produtos desejados. Assim, outros passos de purificação são necessários para remover as impurezas co-extraidas. Nestes processos, os tempos de processamento são longos de 2 a 7 dias e geralmente é necessário o uso de altas temperaturas de ebulição ou de extração que muitas vezes levando à degradação de compostos sensíveis ao calor. Além disso, os resíduos de solventes tóxicos são dificilmente removidos a partir dos extratos, influenciando diretamente a qualidade dos produtos. A HD é geralmente utilizada para a obtenção de voláteis de plantas, entretanto sua temperatura de processamento elevada pode levar à degradação de compostos sensíveis ao calor (MEIRELES, 2009). O processo de destilação possui várias desvantagens, tais como: quebra de componentes termolábeis, reações de hidratação de certos componentes químicos, longos tempo de destilação e a necessidade de procedimentos pós-extração para eliminação de água (GHASEMI, RAOFIE e NAJAFI, 2011). Com o passar do tempo, a necessidade de técnicas de isolamento alternativo com uma eficiência superior e seletividade estão sendo utilizadas como é o caso da Extração com Fluido Supercrítico (EFS).. 1.3.1. Extração com Fluido Supercrítico-(EFS). Um fluido supercrítico é definido como sendo formado acima do ponto crítico, ou seja, está acima da temperatura crítica (Tc) e pressão crítica (Pc) (PINTO, PINTO e JARDIM, 1996). Podem ser visualizados no diagrama do dióxido de carbono apresentado na Figura 1.. 17 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(20) Figura 1: Diagrama de fases mostrando a região supercrítica do dióxido de carbono-CO2. Fonte: Disponível em http://www.usp.br/gpqa/scf.asp. Acessado em 03-02-2014 EFS é uma técnica classificada como um procedimento brando e rápido de extração (15 min-120 min), que pode ser utilizado para a obtenção de óleos essenciais, extratos e compostos isolados, como é o caso da extração da cafeína para produzir café descafeínado ou da piperina alcaloide que dá a característica de pungência da pimenta preta (P. nigrum) para produção de produtos alimentícios (PERAKIS, LOULI e MAGOULAS, 2005, TELLO e CALVO, 2011). A EFS permite a obtenção de compostos de interesse de matrizes sólidas empregando fluxo de solvente(s) em condições supercríticas, que são propriedades intermediárias entre um gás e um líquido (MEIRELES, 2009). Acima do ponto crítico, algumas propriedades da substância, como densidade e viscosidade, são intermediárias entre um gás e um líquido. O fluido adquire uma densidade similar à de um líquido (poder de solvatação) e simultaneamente uma compressibilidade parecida com a de um gás (permeabilidade). O grande poder de solvatação ocasiona uma alta permeação do fluido na amostra, aumentando a probabilidade de uma extração completa (SKOOG e LEARY, 1995, STUART, MACLACHLAN e MCNAUGHTAN, 1996) Uma importante característica da EFS está relacionada à possibilidade de ajuste da densidade por meio da variação da pressão e temperatura levando a extração de 18 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(21) compostos de baixo peso molecular como no caso dos óleos essenciais (SKOOG e LEARY, 1995). Essa característica de densidade variável é responsável pela seletividade da EFS, vantagem, principalmente para matrizes complexas de origem ambiental (TAYLOR, 1996, ZOUGAGH, VALCÁREL e RIOS, 2004). O solvente mais utilizado na EFS é o dióxido de carbono devido a seus baixos parâmetros críticos (31 °C-73,8 bar), baixa toxicidade, não inflamabilidade, não reatividade, possibilidade de obtenção com alto grau de pureza, grande acessibilidade, baixo custo e ser gasoso em temperatura ambiente (o que facilita a separação do analito extraído) (TAYLOR, 1996). O dióxido de carbono supercrítico-(SC-CO2) só não pode ser considerado um fluido supercrítico perfeito porque o CO2 é apolar e dessa forma apresenta uma capacidade limitada de dissolver moléculas polares. Esta desvantagem geralmente é contornada pela adição de modificadores, também chamados de co-solventes ou "entrainers". Os modificadores podem ser solventes orgânicos, reagentes derivatizantes ou reagentes de par-iônico. Eles são adicionados continuamente no fluxo da EFS (acarretando na necessidade do uso de uma segunda bomba) ou diretamente na amostra. Neste caso, as vantagens são o favorecimento da dessorção do analito e a diminuição do volume de solvente, mas a desvantagem é a necessidade de um período estático adicional (TAYLOR, 1996, CAMEL, 1998). Uma característica importante na utilização da EFS é a secagem do material vegetal antes da extração com SC-CO2, pois a presença de água pode resultar na diminuição da eficácia, limitando o contato com solutos apolares ou por atuar como cosolvente. A secagem adequada do material de alimentação é essencial para uma ótima operação do sistema evitando também a oxidação do extrator, pois a água em condições críticas se torna corrosiva. A secagem é necessária para as plantas aromáticas evitando a decomposição e degradação dos compostos alvos (MEIRELES, 2009).. 1.4.. Planejamento experimental e estatística. A utilização de ferramentas computacionais que ajudam na interpretação dos resultados se faz necessária quando se detém grande quantidade de variáveis a serem analisadas. O planejamento experimental e a estatística multivariada aplicada à química são frequentemente utilizados no tratamento de dados. Essa área da quimiometria 19 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(22) desenvolve ferramentas computacionais que permitem explorar os resultados obtidos por meio de análises químicas, a fim de verificar a existência de similaridade entre as amostras que, por sua vez, correspodem às semelhanças na composição química (CORREIA e FERREIRA, 2007). Os processos estatísticos, para ponderar variáveis, estão divididos em dois grupos: a estatística univariada na qual trata as variáveis de forma isolada e a estatística multivariada que corresponde a um grande número de métodos e técnicas que utilizam, simultaneamente, todas as variáveis na interpretação teórica do conjunto de dados obtidos (VICINI e SOUZA, 2005) além de reduzir a representação dimensional dos elementos, organizando-os de maneira que facilita a visualização de todo o conjunto de dados (MOURA, LOPES, et al., 2006). Para melhor desempenho dos resultados adquiridos em trabalhos que apresentam grandes números de informações, alguns programas foram desenvolvidos para plotar gráficos e tabelas que possam representar todas as informações possíveis contidas em um conjunto de análises (CORREIA e FERREIRA, 2007). Neste trabalho o software statistica versão 7.0 foi utilizado para melhor entendimento dos resultados, como gráficos obtidos pela análise fatorial, método de Taguchi, gráficos de superfície de resposta e análise de variância. O método Taguchi é uma poderosa ferramenta de otimização que difere das práticas convencionais e pode economicamente satisfazer as necessidades de resolução de problemas e design de otimização com menor número de experimentos (PHADKE, 1989), a metodologia da função de Taguchi prova ser uma atraente e eficiente ferramenta em otimização de desempenho quando se utiliza muitas variáveis (AMES, MATTUCCI, et al., 1997) possibilitando determinar a melhor combinação de fatores e interações que influenciam no comportamento da variável-resposta de determinado processo. Geralmente, o uso do método requer menor esforço de amostragem, diminuindo o custo com ensaios, sem grandes prejuízos nas conclusões (ROSA, ROBIN, et al., 2009). O método de superfície de resposta é uma técnica estatística utilizada para a modelagem e análise de problemas nos quais a variável resposta é influenciada por vários fatores, e o objetivo é a otimização dessa resposta (CAMPARINI, PASSOS, et al., 2009). Por fim a análise de variância é utilizada para testar hipóteses sobre o meio de diferentes tratamentos testados (WAYNE, 2006) tendo. 20 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(23) como objetivo principal a comparação entre as médias dos grupos (GUIMARÃES e CABRAL, 2007).. 2.. JUSTIFICATIVAS PARA A UTILIZAÇÃO DA EFS. Na última década novas tendências na indústria de alimentos têm impulsionado para uma maior preocupação com a qualidade e segurança dos produtos, e isso têm aumentando a preferência por produtos naturais, como é o caso dos óleos essenciais de grande importância econômica, principalmente por suas propriedades biológicas. Entretanto averigua-se que nos últimos anos as regulamentações estão se tornando mais rígidas com relação aos níveis residuais de solventes, desperdício de água e utilização de solventes tóxicos, e isso tem impulsionado ao longo dos anos a tecnologia de EFS como principal alternativa para substituir solventes tradicionais de extração, fracionamento e isolamento de princípios ativos nas diversas áreas do conhecimento. Com isso o presente trabalho relata a utilização desta técnica para o estudo de duas espécies de Piper, a Piper klotzschianum coletada no Parque Ecológico Serra de Itabaiana que apresenta apenas um registro na literatura, despertando o nosso interesse na investigação das composições químicas dos voláteis obtidos por hidrodestilação, bem como as composições dos extratos obtidos por EFS, ainda inédito na literatura e a Piper hispidum encontrada no Parque Nacional do Ibura, espécie estudada em vários países na forma de extratos e voláteis, mas nenhum relato publicado sobre composições químicas de extratos pela EFS. Análises dos voláteis de Piper arboreum também encontrada no Parque Ecológico Serra de Itabaiana foram realizadas, espécie de grande potencial biológico. Sendo assim, este trabalho fundamenta-se no enriquecimento das informações científicas sobre o gênero Piper especificamente das espécies P. klotzschianum, P. hispidum e P. arboreum registradas pela primeira vez no estado de Sergipe.. 21 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(24) 3.. REVISÂO DA LITERATURA. 3.1.. Família Piperaceae. A família Piperaceae pertence à super ordem Nymphaeiflorae e ordem Piperales e incluem aproximadamente 3000 espécies distribuídas em cinco gêneros: Macropiper, Zippelia, Piper, Peperomia e Manekia. Piper, Peperomia e Manekia ocorrem no Brasil principalmente na região Amazônica e floresta Atlântica. As espécies dessa família podem apresentar hábito arbustivo, arbóreo ou herbáceo e crescem geralmente no interior ou na margem de formações florestais. Piper é o maior gênero dessa família incluindo mais de 1000 espécies já catalogadas (JARAMILLO e MANOS, 2001, MONTEIRO e GUIMARÃES, 2008). Desde o isolamento da piperina a partir da Piper nigrum os cientistas têm procurado por compostos fisiologicamente ativos em plantas da família Piperaceae. As amidas são os principais constituintes de várias espécies de Piper. Atualmente, elas podem ser consideradas alcaloides de acordo com a definição de Pelletier que formulou a seguinte definição: ―Um alcaloide seria uma substância orgânica de origem natural cíclica contendo um nitrogênio em um estado de oxidação negativo e cuja distribuição é limitada entre os organismos vivos‖ (PELLETIER, 1983). Amidas naturais podem ser classificadas como alcamidas de cadeia aberta, aristolactamas, 4,5-dioxoaporfinos, ceramidas,. amidas. com. grupos. pirrolidínicos,. piperidonas,. piperidinas,. ciclobutanamidas e ciclohexanamidas (NASCIMENTO, PAULA, et al., 2012). Inicialmente os interesses focaram na obtenção e identificação de amidas, mas com o passar dos anos, outras classes de compostos ganharam destaque como é o caso das lignanas e neolignanas (JENSEN, HANSEN e BOLL, 1993).. 3.2.. Gênero Piper O gênero Piper contém cerca de 1000 espécies representada por ervas arbustos e. árvores, sendo considerado economicamente e ecologicamente o mais importante da 22 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(25) família Piperaceae. Espécies desse gênero são largamente distribuídos na região tropical e subtropical do mundo (TEBBS, 1993, JARAMILLO e MANOS, 2001). Pesquisas reportam a presença de P. dilatatum, P. hispidum, P. tuberculatum e P. aduncum crescendo principalmente em regiões montanhosas na Venezuela, P. aduncum listada como remédio para dores de estômago na Jamaica (apud) (ASPREY e THORNTON, 1954), P. obliquum possuindo atividade antimicróbica no Equador (GUERRINIA, SACCHETTIA e ROSSI, 2009), P. amalago como agentes anti-dor e anti-inflamatório no México e Brasil (DOMINGUEZ e ALCORN, 1985). Espécies de Piper apresentam uma grande variedade de composição química, monoterpenos, sesquiterpenos, arilpropanoides, alcaloides, amidas, neolignanas, esteroides, kavapironas, chalconas, dihidrochalconas, piperolídeos, flavonas e flavanonas (PARMAR, et al., 1997; JAGBEER, RENU, AJIT, ANU, e SIDHARTH, 2011) bem como diferentes atividades biológicas, tais como antifúngica para as chalconas, flavononas (VIEIRA, DEALVARENGA e GOTTLIEB, 1980), flavonóides (PLAZAS, CUCA e DELGADO, 2008) e amidas (NAVICKIENE, ALECIO, et al., 2000); e atividade antiplasmódica para os derivados do ácido benzóico (AVELLA, DÍAZ e AURA, 1994; FRIEDRICH, SIEMS, et al., 2005). Isobutilamidas isoladas da P. nigrum demonstraram ter atividade larvacida contra o Aedes aegypti, sendo a retrofractamida A a mais ativa LC50 39 ppm (DE MORAIS, FACUNDO, et al., 2007). A relação entre a estrutura e atividade indicou que as N-isobutilamidas desempenham um importante papel na atividade larvacida. Alta eficiência também foi observado utilizando os extratos etanólicos da P. longum, seguido da P. sarmentosum e P. ribesoides, LC50 de 2,23, 4,06, e 8,13 ppm, respectivamente (CHAITHONG, CHOOCHOTE, et al., 2006). Em um estudo desenvolvido por Martins, Salgueiro et al., (1998) os óleos essenciais das folhas de P. capense obtidas no oeste da África tinham como componentes principais o α-pineno (32,5%) e (E)-cariofileno (12,6%). Dos frutos da P. nigrum, o limoneno (18,8%), (E)-cariofileno (15,4%), sabineno (16,5%) e β-pineno (15,4%). P. umbellatum o β-pineno (26,8%), α-pineno (17,6%) e (E)-nerolidol (12,4%). Em contrapartida os compostos majoritários presentes no óleo essencial extraído das folhas da P. guineense foram fenilpropanóides derivados do dilapiol (44,8%) seguido da miristicina (9,8%).. 23 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(26) Tabela 1: Fenilpropanóides presentes em alta concentração em espécies do gênero Piper metileugenol miristicina apiol safrol dilapiol. 70% 70% 80% 70-95% 31-97%. P. divaricatum P.arboreum var.arboreum P. krukoffii P. hispidinervum, P. callosum P. aduncum. Fonte: MAIA e ANDRADE, 2009; MESQUITA, CAVALEIRO, et al., 2005.. Fato também observado nos óleos essenciais da P. hispidinervum e P. aduncum coletadas em diferentes localidades da região amazônica, onde apresentaram grande concentração do fenilpropanóide dilapiol e safrol no qual o dilapiol foi considerado o responsável pelo efeito inseticida (MAIA, ZOHBI, et al., 1998) e o safrol, muito utilizado nas indústrias de cosméticos e inseticidas (BERGO, MENDONÇA e SILVA, 2005). Tabela 2: Compostos Majoritários (%) comuns às espécies de Piper analisadas por CG/EM. limoneno. P. aduncum 2,0. P. amalago 1,1. P. arboreum 4,9. P. cernuum 0,3. P. hispidum 5,8. P. submarginalum -. P. viscosanum 45,5. α-pineno. 3,2. 9,3. 1,1. 4,1. 4,6. 28,2. 5,1. β-pineno. 1,8. 0,3. 0,2. 2,1. 14,0. 11,9. 0,2. biciclogermacreno. -. 16,4. 4,7. -. 5,0. -. -. 1,9. 5,2. -. 1,4. 16,8. 2,2. -. -. 0,6. 1,2. 19,8. -. 0,4. 6,4. -. 0,4. 22,4. 7,4. -. -. -. -. -. -. Substância. (E)-cariofileno 6,7 17,8 4,6 10-epi-gamaeudesmol (E)-nerolidol 14,2 2,7 óxido de 2,6 18,0 36,5 cariofileno trans5,6 dihidroagarofurano Elemol 36,0 Fonte: MESQUITA, CAVALEIRO, et al.2005.. 3.2.1. Rota biossintética dos principais metabólitos secundários do gênero Piper. Santos, Moreira et al. (2001), analisaram os óleos essenciais de 10 espécies de Piperaceae da Mata Atlântica brasileira e verificaram que os compostos mais frequentes 24 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(27) identificados são os sesquiterpenos (E)-cariofileno e germacreno D provenientes da rota sintética do ácido mevalônico. No entanto, os monoterpenos não oxigenados (Z)-pocimeno, α-pineno e β-pineno também foram predominantes. Através de uma proposta biossintética (Esquema 1) observou-se que os monoterpenos têm como agente precursor o difosfato de geranila-(GPP) que são provindos da junção de uma unidade isoprenóide e uma unidade de difosfato de dimetilalila. Com a perda de um próton estéreoespecífico é possível à formação de três isômeros configuracionais o difosfato de geranila-(GPP), difosfato de linaloila-(LPP) e difosfato de nerila-(NPP), responsáveis pela formação dos monoterpenos seja por perdas de elétrons, rearranjos e/ou catálises enzimáticas (DEWICK, 2009).. OPP. E1. E1. OPP. difosfato de dimetilalila (DMAPP). H. OPP. H. H. H. Adição eletrolítica resultando em carbocátion terciário. OPP E. Z OPP. -H+ E4. OPP. H 3- careno difosfato de geranila (GPP) -H+. - pineno. E2. difosfato de linaloila (LPP). difosfato de nerila (NPP). -H+ E3. -H+ E5 -H+ -H+ E5. E6 cátion pinila. - pineno. - terpineno. limoneno. - mirceno. cátion nerila. E1= difosfato de geranila sintase E2=  terpineno sintase E3= limoneno sintase E4= 3- careno sintase E5= pineno sintase E6= mirceno sintase. Esquema 1: Rota biossintética para alguns monoterpenos encontrados no gênero Piper Fonte: Adaptado do DEWICK, 2009.. Levando em consideração os sesquiterpenos mais comuns identificados no gênero Piper o (E)-cariofileno e germacreno D, que tem o E,E-farnesila-PP como agente precursor e para o -cadinene e α-copaeno o (E), (Z)-farnesila-PP. O Esquema 2 mostra uma abordagem biossintética dos cátions precursores dos principais 25 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(28) sesquiterpenos encontrados em espécies do gênero Piper, o difosfato de (E), (E)farnesila perde um próton estereoespecífico com consecutiva saída do grupo difosfato, rearranjando para os cátions germacrila, humulila e cariofilila. A partir do cátion (E), (Z)-farnesila isômero do cátion (E), (E)-farnezila é formado o cátion cis-germacrila proveniente do ataque do par de elétrons da ligação dupla formando o anel bicíclico e por meio de um rearranjo Wagner- Meerwein-(W-M) do cátion cis-germacrila resulta o cátion cadinila (DEWICK, 2009).. OPP adição eletrofilíca. OPP. RH. HS. difosfato de geranil (GPP) E1 perda estereoespécifica de próton OPP H difosfato de farnesila (FPP). OPP. H. cátion E,E-farnesila. cátion germacrila e.g. germacreno B. cátion nerolidila. cátion humulila e.g. humuleno. cátion E,Z- farnesila cátion cariofilila e.g. cariofileno W-M deslocamneto 1,3- hidreto. H. cátion cis- germacrila. cátion cadinila e.g. - cadineno. E1= difosfato de farnesila sintase W-M= rearranjo de Wagner-Meerwein. Esquema 2: Rota biossintética de alguns sesquiterpenos encontrados no gênero Piper 26 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(29) Fonte: Adaptado do DEWICK, 2009.. 3.3.. Piper hispidum. 3.3.1. Considerações gerais sobre P. hispidum. A P. hispidum é conhecida popularmente como jaborandi, falso-jaborandi, matico, aperta-joão, matico-falso, aperta-ruão e beque. No uso popular as folhas, as raízes e os frutos são adstringentes, diuréticos e estimulantes e empregados como desobstruentes do fígado. Em Cuba é conhecida como ―platanillo-de-cuba‖, utilizada para deter hemorragias traumáticas, na Costa Rica por ―higuillo oloroso‖ ou por ―cordocillo-blanco‖ na América Central. As folhas são utilizadas sob a forma de banhos contra as hemorroidas, reumatismos e desinterias, quando frescas são usadas como emplastros em hérnia de umbigo de crianças, tendo o mesmo uso no estado seco e pó, sendo ainda consideradas hemostáticas apud (GUIMARÃES e GIORDANO, 2004; GUIMARÃES e MONTEIRO, 2006; ANDRADE, GUIMARÃES e MAIA, 2009). Sua existência abrange países da América do Sul: Argentina, Bolívia, Brasil onde incide principalmente nos estados do Amazonas, Pará, Piauí, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Rio de Janeiro, Rondônia (FACUNDO, POLLI, et al., 2008) Paraná, Santa Catarina, Mato Grosso, São Paulo e Mato Grosso do Sul (GUIMARÃES e GIORDANO, 2004), Colômbia, Equador, Guiana, Guiana Francesa, Paraguai, Peru, Suriname, Venezuela. Antilhas: Caribe, Cuba, República Dominicana, Haiti, Jamaica, Porto Rico, Tobago, Trinidad. Na América central: Belize, Costa Rica, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicarágua, Panamá (YUNCKER, 1972).. 3.3.2. Composição química dos óleos essenciais. Estudos no Brasil mostram uma grande diversidade de composição química e concentração nos óleos essenciais de P. hispidum. Isso pode ser atribuído à diversidade genética da espécie, com variedade de quimiotipos relativo à idade foliar da planta, as variáveis ambientais e métodos de extração. Do óleo essencial extraído das folhas da espécie em regiões montanhosas da Venezuela foram encontrados como componentes principais o α-pineno (15,3%), β-pineno (14,8%), β-elemeno (8,2%), óxido de 27 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(30) cariofileno (7,5%) e -3-careno (6,4%) (MORALES, ROJAS, et al., 2013). Entretanto, composições químicas da mesma espécie mostram o -cadineno (25,1%), canfeno (15,6 %), α-guiano (11,5%) e -elemeno (10,9%) como compostos majoritários (MACHADO, 1994), como também kusimeno (12,1%), -cadineno (13,2%), β-pineno (12,0%), αpineno (6,6%) (ASSIS, BRITO, et al., 2013). Em Cuba o β-eudesmol (17,5%) foi observado em alta concentração (PINO, MARBOT, et al., 2004). Da mesma forma ocorre na Colômbia onde o (E)-nerolidol (23,6%) foi encontrado como componente principal (BENITEZ, LEÓN e STASHENKO, 2009)l. Outro estudo realizado na Colômbia por Avila e Suávez (2007) reportou o βpineno (14,5 %) α-pineno (13,5%) e o linalol (9,6%) como componentes majoritários obtidos das folhas, sendo esses resultados similares aos encontrados por Morales, Rojas et al. (2013). No Brasil, α-copaeno (28,7%; 36,2%), α-pineno (13,9%; 7,1%), β-pineno (13,3%; 7,5%) e (E)-nerolidol (2,9%; 7,0%) foram relatados como componentes principais do óleo essencial obtido dos frutos maduros e imaturos da mesma espécie (SIMEONE, MIKICH, et al., 2011). O dilapiol (55,5%), elemicina (24,5%) e apiol (10,2 %) obtidos das raízes apresentaram uma composição bem diferenciada, tendo o dilapiol como composto majoritário (FACUNDO, POLLI, et al., 2008) (Figura 4).. 28 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.

(31) Figura 2: Estrutura dos constituintes majoritários obtidos da P. hispidum OCH3 O O. H. H. OCH3 (E)-cariofileno (3). canfeno (2). apiol (1). -copaeno (4). -3-careno (6). -cadineno (5). H3CO OCH3 H3CO. H3CO O O. OH. H3CO. dilapiol (7). -eudesmol (9). elemicina (8). -elemeno (10) OH. H H. -elemeno (11). -guiano (12). kusimeno (13). linalol (14). H H. OH. O H óxido de cariofileno (15). -pineno (16). -pineno (17). (E)-nerolidol (18). Fonte: MORALES, ROJAS, et al., 2013, FACUNDO, POLLI, et al., 2008, SIMEONE, MIKICH, et al., 2011, AVILA e SUÁVEZ, 2007, BENITEZ, LEÓN e STASHENKO, 2009, PINO, MARBOT, et al., 2004, ASSIS, BRITO, et al., 2013, MACHADO, 1994.. 29 Dissertação de Mestrado—Rafaely Nascimento Lima- NPGQ/UFS.