Efeito do extrato etanólico da entrecasca de Caesalpinia pyramidalis Tul. na cistite hemorrágica em ratos

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. ALEXANDRE SANTOS MATOS. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA ENTRECASCA DE Caesalpinia pyramidalis Tul. NA CISTITE HEMORRÁGICA EM RATOS. ARACAJU 2013.

(2) ŝ . ALEXANDRE SANTOS MATOS. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA ENTRECASCA DE Caesalpinia pyramidalis Tul. NA CISTITE HEMORRÁGICA EM RATOS. Dissertação apresentada ao núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de mestre em Ciências da Saúde . Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo. ARACAJU 2013.

(3) ŝŝ . FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. Matos, Alexandre Santos. M433e. Efeito do extrato etanólico da entrecasca de Caesalpinia pyramidalis Tul. na cistite hemorrágica em ratos / Alexandre Santos Matos ; orientador Enilton A. Camargo. – Aracaju, 2013. 83 f.. Dissertação (mestrado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, 2013.. 1. Cistite hemorrágica. 2. Caesalpinia pyramidalis. 3. Ciclofosfamida. 4. Cancer. 5. Medicina alternativa. I, Camargo, Enilton A., orient. II. Título. CDU 616.62-002.

(4) ŝŝŝ . ALEXANDRE SANTOS MATOS. EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DA ENTRECASCA DE Caesalpinia pyramidalis Tul. NA CISTITE HEMORRÁGICA EM RATOS . Dissertação apresentada ao núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de mestre em Ciências da Saúde .. Aprovada em: _____/_____/_____. __________________________________ Orientador: Prof. Dr. Enilton A. Camargo __________________________________ 1º Examinador: Profa. Dra. Sandra L. Santos __________________________________ 2º Examinador: Profa. Dra. Ivani A. de Souza. PARECER ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________.

(5) ŝǀ . DEDICATÓRIA. Aos meus pais, José Domingos e Maria Elza, por todo o sacrifício que fizeram para que eu pudesse estudar e pelo exemplo de integridade que sempre foram para mim. Á minha namorada, Níris Stéfany, por todo seu apoio e carinho e por tudo que temos construído juntos, no amor de Deus e por amor à Deus..

(6) ǀ . AGRADECIMENTOS A Deus, a quem tudo devo, pelo dom da vida e por ter conduzido todas as circunstâncias de modo que este trabalho se realizasse. Ao professor Enilton Camargo, por ter me aceitado como aluno, por sua enriquecedora orientação acadêmica, pelo apoio, paciência, atenção e por estar sempre disposto a ajudar em todas as situações. Aos meus pais, José Domingos e Maria Elza, aos meus irmãos Rodrigo e Vinícius, que sempre me apoiaram e me incentivaram nessa jornada. A Dênyson e à Janaína, pela colaboração imprescindível na construção dos resultados, sem a qual este trabalho não teria sido possível. Eles foram responsáveis pela maior parte deste trabalho. A todos os colegas e amigos do LAFAPI pela convivência e pela contribuição nos experimentos. A Alan, por sua contribuição em longos dias de experimentos. A Jândson, pela orientação na parte experimental e por ter me auxiliado em vários experimentos. A todos os membros do GOU, especialmente Fernando, Cátia e Bárbara, pelas partilhas de vida e por suas orações. À Níris Stéfany, pelo apoio nas horas difíceis, por sua presença em minha vida. A Alex Victor e à Bruno, pela amizade. Á UFS, pela oportunidade e pelo espaço onde pude realizar este trabalho, e à CAPES, pela bolsa concedida..

(7) ǀŝ . RESUMO MATOS, Alexandre Santos. Efeito do extrato etanólico da entrecasca de Caesalpinia pyramidalis Tul. na cistite hemorrágica em ratos. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) UFS/SE, Aracaju, 2013. Introdução: A cistite hemorrágica (CH) é o principal efeito indesejado associado à quimioterapia com ciclofosfamida (CF). Esta condição é caracterizada pela presença de macro e micro hematúria, disúria, dor suprapúbica e aumento da frequência urinária. Acredita-se que a acroleína, metabólito da CF, induz a geração de espécies reativas de oxigênio no uroepitélio, resultando em CH. A prevenção desta patologia é feita com mesna, que atua impedindo o contato da acroleína com o uroepitélio. Entretanto, substâncias antioxidantes tem efeito protetor na CH e acredita-se que elas comprometam a produção de peroxinitrito por diminuir a produção de ânion superóxido e, desse modo, substâncias de origem natural com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias podem representar uma alternativa em potencial no tratamento da CH. O extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias e, portanto, acredita-se que o mesmo possa modular vias inflamatórias envolvidas na CH. Objetivo: O presente estudo investigou o efeito do EECp na prevenção da CH induzida por CF. Métodos: A CH foi induzida pela injeção i.p. de CF (200 mg/kg) em ratos Wistar. Outro grupo recebeu somente salina (0,9%) pela mesma via. Os animais foram pré-tratados 1 h antes da injeção de CF ou salina com veículo (Tween 80 a 0,5%; v.o.) ou EECp (100-400 mg/kg; v.o.). O mesna foi administrado 5 min. antes e 4 e 8 h depois da indução da CH. Foram utilizados 6 grupos experimentais: (i) Veículo+Salina; (ii) Veículo+CF; (iii) EECp (100 mg/kg)+CF; (iv) EECp (200 mg/kg)+CF; (v) EECp (400 mg/kg)+CF; (vi) Mesna+CF. Após 24 h da injeção de CF ou salina os animais foram eutanasiados e alguns parâmetros inflamatórios foram medidos: (i) atividade de mieloperoxidase (MPO) na bexiga e no pulmão; (ii) concentração de malondialdeído (MDA) na bexiga e no pulmão; (iii) índice de edema na bexiga; (iv) concentrações séricas de nitrito e nitrato; (v) contagem total e diferencial de leucócitos em sangue periférico e (vi) análise histológica da bexiga. Resultados: A injeção de CF aumentou a atividade de MPO na bexiga (P<0,001) e alterou significativamente todos os parâmetros histopatológicos analisados, além de provocar aumento da massa da bexiga (P<0,01), sem alterar a concentração de MDA neste tecido, quando comparado ao grupo Veículo+Salina. Sistemicamente, observou-se elevação dos níveis séricos de nitrito e nitrato e da atividade de MPO pulmonar, bem como diminuição da contagem total de leucócitos e mononucleares, com aumento no número de polimorfonucleares, em relação ao grupo Veículo+Salina. O EECp causou a redução do influxo de leucócitos para a bexiga induzido pela CF, evidenciado pela diminuição do escore histológico (P<0,05 para 100 mg/kg) e a da atividade de MPO (P<0,001 para 100 e 400 mg/kg e P<0,05 para 200 mg/kg) na bexiga, acompanhado da diminuição do escore histológico total (P<0,05 para 100 mg/kg) e da concentração basal de MDA (P<0,05 para 100 e 400 mg/kg), quando comparado ao grupo Veículo+CF. Sistemicamente, a administração de EECp atenuou a lesão pulmonar induzida pela CF, demonstrada pela redução da atividade de MPO (P<0,05 para 200 e 400 mg/kg) e da concentração basal de MDA (P<0,05 para 200 e 400 mg/kg) neste tecido; reduziu as concentrações séricas de nitrito e nitrato (P<0,05 para 100 mg/kg e P<0,01 para 400 mg/kg) e diminuiu o número de leucócitos polimorfonucleares no sangue (P<0,05 para todas as doses usadas), quando comparado ao grupo Veículo+CF. Conclusão: Estes resultados permitem concluir que o EECp tem efeito anti-inflamatório e antioxidante moderados na CH, bem como atenua a lesão pulmonar induzida pela CF, podendo ser utilizado em estudos envolvendo estratégias terapêuticas futuras para o tratamento de efeitos associados à quimioterapia com CF. Pavras-chave: cistite hemorrágica; Caesalpinia pyramidalis; ciclofosfamida..

(8) ǀŝŝ . ABSTRACT MATOS, Alexandre Santos. Effect of ethanol extract of the inner bark of Caesalpinia pyramidalis Tul. on the hemorrhagic cystitis in rats. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) UFS/SE, Aracaju, 2013. Introduction: Hemorrhagic cystitis (HC) is the main side effect of cyclophosphamide (CP) chemotherapy. This condition is characterized by the macro and microhaematuria, dysuria, suprapubic pain and increased urinary frequency. It is believed that acrolein, a CP metabolite, induces the generation of reactive oxygen species in the uroepithelial cell, resulting in peroxynitrite formation, which can cause damage to these cells. Mesna is the choice drug used to prophylactically treat HC, because it prevents the acrolein contact with the uroepithelium. Besides, antioxidant substances are thought to have a protective effect on HC, mainly because of the reduction of peroxynitrite formation through the inhibition of superoxide production. In this way, natural compounds or extracts with antioxidant and anti-inflammatory properties may possess potential to treat HC. Objectives: In the present study the effect of the ethanol extract of the inner bark of Caesalpinia pyramidalis (EECp) was investigated in the HC model in rats. Methods: In order to induce HC, animals received an i.p. injection of CP (200 mg/kg). A control group received only saline (0.9%) by the same route. One hour before this injection, animals were pre-treated with vehicle (Tween 80, 5%, p.o.) or EECP (100-400 mg/kg, p.o.). Mesna was used as a control and was administrated 5 min before and 4 and 8 h after the CP injection. In this manner, there were used 6 experimental groups: (i) Vehicle+Saline; (ii) Vehicle+CP; (iii) EECp (100 mg/kg)+CP; (iv) EECp (200 mg/kg)+CP; (v) EECp (400 mg/kg)+CP; (vi) Mesna+CP. After 24 h of CP or saline injection, animals were euthanized and the inflammatory/oxidative parameters were measured: (i) myeloperoxidase (MPO) activity in the urinary bladder and lung tissues; (ii) malondialdehyde (MDA) concentration in the urinary bladder and lung tissues; (iii) edema index in bladder; (iv) serum concentrations of nitrite and nitrate; (v) total and differential leukocyte counts in the peripheral blood; (vi) histological analyses of the urinary bladder. Results: The injection of CP increased the MPO activity in the urinary bladder (P<0.001) and significantly altered all the histological parameters evaluated, when compared with the saline+vehicle group. Besides, it augmented the bladder weight (P<0.01), when compared with the saline+vehicle group, without changing the MDA concentrations. Systemically, we observed higher serum concentration of nitrite and nitrate and lung MPO activity, as wells as a decrease in the total leukocyte and mononuclear counts, with a slight increase in the polymorphonuclear counts (P<0.05), when compared with saline+vehicle group. Pre-treatment with EECp reduced the leukocyte influx to the urinary bladder, evidenced by the reduction of the MPO activity (P<0.001 for 100 and 400 mg/kg and P<0.05 for 200 mg/kg) and the histological score (P<0.05 for 100 mg/kg), accompanied by the diminution of the total histological score (P<0.05 for 100 mg/kg) and the basal concentration of MDA (P<0.05 for 100 and 400 mg/kg), when compared with the vehicle+CP group. It was also observed an attenuation of the lung injury caused by CP administration, by the reduction of the MPO activity (P<0.05 for 200 and 400 mg/kg) and basal MDA concentration (P<0.05 for 200 and 400 mg/kg), when compared with the vehicle+CP group. The pretreatment with EECp also reduced the serum concentration of the nitrate and nitrite (P<0.05 for 100 mg/kg and P<0.01 for 400 mg/kg), in addition to the polymorphonuclear cell counts (P<0.05 for all doses used), without any significant alteration in the total leukocyte and mononuclear counts. Conclusions: These results suggested that EECp possesses moderate anti-inflammatory and antioxidant effects on the HC and attenuates the CP-induced lung injury, being of interest for future studies involving therapeutical strategies to treat the effects associated with the chemotherapy with CP. Key-words: hemorrhagic cystitis, cyclophosphamide, Caesalpinia pyramidalis..

(9) ǀŝŝŝ . LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química das oxazafosforinas (ciclofosfamida e ifosfamida)........................2 Figura 2. Metabolismo da ciclofosfamida...................................................................................4 Figura 3. Vias inflamatórias induzidas pela acroleína na bexiga urinária................................10 Figura 4. Estrutura química do mesna e do dimesna................................................................12 Figura 5. Linha de tempo referente ao delineamento experimental para verificação do efeito preventivo do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp; painel A) ou mesna (painel B) sobre a cistite hemorrágica (CH) induzida pela ciclofosfamida..............................20 Figura 6. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna sobre parâmetros histopatológicos na bexiga urinária, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos................................................................................................................25 Figura 7. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna sobre a formação de edema na bexiga urinária, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos...........................................................................................................................................26 Figura 8. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na atividade de mieloperoxidase (MPO) na bexiga urinária, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos................................................................................................................27 Figura 9. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na concentração de malondialdeído (MDA) na bexiga urinária, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos................................................................................................................28 Figura 10. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou Mesna na concentração de nitrito e nitrato sérico (NOX –), 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos................................................................................................................29 Figura 11. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na atividade de mieloperoxidase (MPO; painel A) e concentração de malondialdeído (MDA; painel B) no pulmão, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos......................30 Figura 12. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na atividade de mieloperoxidase (MPO; painel A) e concentração de malondialdeído (MDA; painel B) no baço, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos...........................31.

(10) ŝǆ . LISTA DE TABELAS Tabela 1. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna sobre parâmetros histopatológicos na bexiga urinária, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos................................................................................................................26. Tabela 2. Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna sobre a contagem total e diferencial de leucócitos em sangue periférico, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos.....................................................................................................32.

(11) ǆ . LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS . AP-1. proteína ativadora-1. ANOVA. análise de variância. BHT. butil-hidroxitolueno. CEPA. comitê de ética em experimentação animal. CONCEA. Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal. CH. cistite hemorrágica. CF. ciclofosfamida. cNOS. óxido nítrico sintase constitutiva. DNA. ácido desoxirribonucleico. DIMESNA. ditiodietanosulfonato de sódio. EECp. extrato etanólico da entrecasca de Caesalpinia pyramidalis. EPM. erro padrão da média. EROs. espécies reativas de oxigênio. HClO. ácido hipocloroso. H2O2. peróxido de hidrogênio. HTAB. brometo de hexadeciltrimetilamônio. IFN-Ȗ. interferon- Ȗ. iNOS. óxido nítrico sintase induzível. IL-1ȕ. interleucina-1ȕ. I-țB. inibidor do fator nuclear țappa B. IL-11. inlerleucina-11. IL-4. interleucina-4. INCA. Instituto Nacional do Câncer. i.p.. intraperitoneal. L-NAME. NȦ-Nitro-L-arginina metil Éster. L-NOARG. NȦ-Nitro-L-arginina. MDA. malondialdeído. MESNA. 2-mercaptoetano sulfonato de sódio. MPO. mieloperoxidase. NaCl. cloreto de sódio. NADPH oxidase. complexo enzimático da NADPH oxidase.

(12) ǆŝ . NF-țB. fator de transcrição nuclear țappa B. NOS. óxido nítrico sintase. NO. óxido nítrico. NOX-. nitrito e nitrato. O2 -. ânion superóxido. OH-. ânion hidroxila Organização Mundial da Saúde. OMS ONOO. -. peroxinitrito. PAF. fator ativador de plaquetas. PARP. poli (ADP-ribose) polimerase. p.o.. via oral. RNA. ácido ribonucleico. SOD. superóxido dismutase. SUS. Sistema Único de Saúde. TBA. ácido tiobarbitúrico. TBARS. substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. TCA. ácido tricloroacético. TNF-Į. fator de necrose tumoral- Į. UMPO. unidade de mieloperoxidase. V.O.. via oral. VS. versus.

(13) ǆŝŝ . SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 1 1.1 Câncer, Oxazafosforinas e Cistite Hemorrágica.................................................. 1 1.1.1 Câncer................................................................................................................... 1. 1.1.2 Oxazafosforinas e Cistite Hemorrágica............................................................... 2 1.1.3 Metabolismo da Ciclofofamida............................................................................. 4. 1.2 Fisiopatologia da Cistite Hemorrágica.................................................................. 5 1.3 Tratamento da Cistite Hemorrágica...................................................................... 11. 1.4 Produtos Naturais.................................................................................................... 14. 2. OBJETIVOS................................................................................................................. 17 2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 17. 2.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 17. 3 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 18. 3.1 Drogas e Reagentes.................................................................................................. 18. 3.2 Coleta da Planta e Preparo do Extrato Etanólico da Entrecasca de Caesalpinia pyramidalis.................................................................................................... 18 3.3 Animais..................................................................................................................... 18. 3.4 Indução da Cistite Hemorrágica por Ciclofosfamida.......................................... 19 3.5 Delineamento Experimental................................................................................... 19 3.6 Análise Histológica.................................................................................................. 21 3.7 Determinação do Índice da Bexiga Urinária......................................................... 21. 3.8 Medida da Atividade de MPO na Bexiga Urinária, Pulmão e Baço.................................................................................................................................... 21. 3.9 Determinação dos Níveis Teciduais de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) na Bexiga Urinária, Pulmão e Baço..................................... 22. 3.10 Determinação dos Níveis de Nitrito e Nitrato (NOX-) Séricos............................ 22. 3.11 Contagem Total e Diferencial de Leucócitos de Sangue Periférico.................. 23 3.12 Análise Estatística.................................................................................................. 23. 4 RESULTADOS.............................................................................................................. 24. 4.1 Efeito do Extrato Etanólico da Entrecasca de Caesalpinia pyramidalis (EECp) sobre a Bexiga Urinária..................................................................................... 24 4.1.1 Alterações Histopatológicas na Bexiga Urinária................................................. 24. 4.1.2 Edema da Bexiga Urinária................................................................................... 24.

(14) ǆŝŝŝ . 4.1.3 Atividade de MPO e Concentração de MDA........................................................ 27. 4.2 Efeitos Sistêmicos do Extrato Etanólico da Entrecasca de Caesalpinia pyramidalis (EECp)........................................................................................................... 28. 4.2.1 Concentração Nitrito e Nitrato (NOX-) Sérico..................................................... 28. 4.2.2 Atividade de MPO e Concentração de MDA no Pulmão, Baço, Fígado e Rim... 29 4.2.3 Contagem Total e Diferencial de Leucócitos de Sangue Periférico..................... 32. 5 DISCUSSÃO.................................................................................................................. 33 6 CONCLUSÃO............................................................................................................... 41 7 REFERÊNCIAS............................................................................................................ 42 ANEXO A..................................................................................................................... 50. ANEXO B..................................................................................................................... 51. ANEXO C..................................................................................................................... 52. ANEXO D..................................................................................................................... 78.

(15) ϭ . 1 INTRODUÇÃO. 1.1 Câncer, Oxazafosforinas e Cistite Hemorrágica. 1.1.1. Câncer. O câncer é uma doença que afeta grande parte da população mundial, constituindo-se um importante problema de saúde pública, principalmente em países desenvolvidos. Devido ao aumento da expectativa de vida e de comportamentos que predispõem ao câncer, como o fumo de cigarros e o consumo de alimentos industrializados, o número de casos de câncer tem aumentado nos últimos anos em todo o mundo (BRASIL, 2011; GUERRA et al., 2005; JEMAL et al., 2011). Para o ano de 2008 foram estimados 12,7 milhões de novos casos de câncer e 7,6 milhões de mortes por câncer, sendo que 54% dos casos novos e 64% das mortes ocorreram em países desenvolvidos. O principal tipo de câncer em homens é o de pulmão, representando 17% do número total de casos novos de câncer e 23% do número total de mortes por câncer. Entre as mulheres, o câncer da mama é o mais frequente, representando 23% do número total de casos novos. A neoplasia da mama é a principal causa de morte em mulheres (14% do número total de mortes por câncer) tanto em países desenvolvidos quanto em países em desenvolvimento (JEMAL et al., 2011). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), no ano de 2030, são esperados 27 milhões de casos incidentes de câncer e 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com algum tipo dessa patologia (BRASIL, 2011). Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), no Brasil, as estimativas para os anos de 2012 e 2013 são de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer. Depois do câncer da pele não melanoma, o da próstata e o da mama feminina são os mais incidentes. O número de casos novos esperados para os cânceres da próstata e da mama feminina são 60 e 53 mil, respectivamente. Seguem-se a estes, os cânceres de cólon e reto (30 mil casos novos), pulmão (27 mil casos novos), estômago (20 mil casos novos) e colo uterino (18 mil casos novos; BRASIL, 2011)..

(16) Ϯ . Estas estimativas demonstram que o câncer é um grave problema de saúde pública de difícil solução, representando uma ameaça à vida de milhares e milhares de pessoas em todo o mundo (BRASIL 2011; GUERRA et al., 2005; JEMAL et al., 2011).. 1.1.2 Oxazafosforinas e Cistite Hemorrágica A quimioterapia para tratamento do câncer envolve substâncias que possuem atividade citotóxica e que atuam em eventos-chave do ciclo celular impedindo, assim, a divisão celular. Dentre os fármacos antineoplásicos com ação citotóxica, encontram-se as oxazafosforinas ciclofosfamida e ifosfamida (Figura 1), que são agentes alquilantes capazes de formar ligações com o DNA, impedindo assim sua replicação. As oxazafosforinas são agentes alquilantes pertencentes à classe das mostardas nitrogenadas, sendo a ciclofosfamida e a ifosfamida (um análogo sintético da ciclofosfamida) as mais importantes clinicamente. Estas substâncias são utilizadas para tratar vários tipos de cânceres e apresentam efeitos indesejáveis importantes relacionados ao sistema urinário. Muitas vezes, a quimioterapia com esses fármacos precisa ser interrompida devido à ação de seus metabólitos tóxicos (DE ALMEIDA et al., 2005; RIBEIRO et al., 2012; STILLWELL et al., 1988).. Figura 1: Estrutura química das oxazafosforinas (ciclofosfamida e ifosfamida).. A ciclofosfamida é a oxazafosforina mais utilizada em oncologia e produz resposta clínica em várias neoplasias, como tumores de ovário (MCGUIRE et al., 1996) e da mama feminina (MARSHALL et al., 2011) e linfomas não-Hodgkin (TRAVIS et al., 1995). Devido à suas propriedades imunossupressoras, é também utilizada no tratamento de várias doenças autoimunes como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide (MONACH et al., 2010), granulomatose de Wegener (KNIGHT et al., 2004) e anemia aplástica (DEZERN et al., 2011). Este agente alquilante também é utilizado em regimes de condicionamento antes de transplante de medula óssea (DEZERN et al., 2011)..

(17) ϯ . A ciclofosfamida é administrada por via oral ou intravenosa e, por ser utilizada em um grande número de patologias, as doses deste fármaco são muito variáveis. No tratamento do lúpus eritematoso sistêmico, relata-se que uma dose de 1 g/m2 de ciclofosfamida, a cada mês, durante seis meses, melhora os sintomas da doença (MARTINELLI et al., 1996). Doses altas, a partir de 120 mg/kg (5000 mg/m2), por dois a quatro dias, são utilizadas no condicionamento antes do transplante de medula óssea e doses de 50 mg/kg por dia, durante 4 dias mostram bons resultados no tratamento da anemia aplástica (DEZERN et al., 2011). A despeito dos benefícios terapêuticos da ciclofosfamida, o uso deste fármaco pode provocar danos graves ao sistema urinário. A bexiga urinária é a parte do trato urinário mais afetada pelas oxazafosforinas, e seus efeitos tóxicos sobre este órgão têm sido atribuídos ao tempo de contato com a acroleína, um metábólito tóxico derivado da ciclofosfamida e da ifosfamida, que é liberado na urina (Figuras 2 e 3; KORKMAZ et al., 2007; RIBEIRO et al., 2012). A cistite hemorrágica é o principal efeito colateral associado ao uso das oxazafosforinas e pode ser descrita como uma patologia inflamatória da bexiga urinária caracterizada pela presença de macro e micro hematúria, disúria, dor suprapúbica e aumento da frequência urinária (MANIKANDAN et al., 2010; STILLWELL et al., 1988). Histologicamente, em seres humanos, um grande espectro de alterações importantes da mucosa da bexiga urinária pode ser observado (LIMA et al., 2007). Em animais de experimentação, alterações histopatológicas como hemorragia, edema, erosão e ulceração do uroepitélio, assim como aumento da massa da bexiga urinária (edema) são frequentemente observadas após a administração de ciclofosfamida ou ifosfamida (KORKMAZ et al., 2005; OTER et al., 2004; RIBEIRO et al., 2012). Já foi descrito um caso de cistite hemorrágica grave após uma única dose de 600 2. mg/m em paciente do sexo feminino com câncer da mama (MARSHALL et al., 2011). Tem sido reportado que o uso de altas doses de ciclofosfamida no tratamento da granulomatose de Wegener (doses cumulativas de 113 g; KNIGHT et al., 2004) e de linfomas não-Hodgkin (doses cumulativas de 20-49 g; TRAVIS et al., 1995) aumenta significativamente o risco de desenvolver câncer da bexiga urinária..

(18) ϰ . 1.1.3 Metabolismo da Ciclo clofosfamida Tanto a ciclofosfam amida quanto a ifosfamida são pró-fármacos os e requerem ativação hepática para exercerem seus s efeitos biológicos. A ciclofosfamida, ao entrar na corrente sanguínea, é transportadaa na n forma inativa para ser transformada em sua forma ativa pelas enzimas microssomais hepá páticas. Essa ativação é feita pelas enzimas oxi xidases de função mista do citocromo p450 com a consequente formação da mostarda de fosf osforamida, responsável pela ação citotóxica das ooxazafosforinas. A acroleína, que tem sido do identificada como a responsável pelos danos ca causados ao sistema urinário, também é forma mada nesse processo. O metabolismo hepático da ciclofosfamida ci dá origem aos compostos 4-hi hidroxiciclofosfamida e aldofosfamida. Estes comppostos são transportados pelo sangue até ass ccélulas tumorais, onde são convertidos a mostarda rda de fosforamida, o composto citotóxico ativo, ati e acroleína que é responsável pelo surgiment ento da cistite hemorrágica associada ao trata tamento quimioterápico com a ciclofosfamida ou ifo ifosfamida (Figura 2; PATEL, 1990; ZHANG et e al., 2005).. Figura 2: Metabolismo da ciiclofosfamida.. Os efeitos citotóxico icos das oxazafosforinas dependem da capacid idade que os compostos desta classe tem de alquila ilar o DNA e o passo inicial para essa reação ão é a formação de um intermediário que apresenta nta um íon de carbono com apenas seis elétro trons em sua camada de.

(19) ϱ . valência. Estes íons são muito reativos e reagem espontaneamente com moléculas que apresentam grupos doadores de elétrons, como os grupos hidroxila e o nitrogênio de bases nitrogenadas. O átomo de nitrogênio que ocupa a posição 7 da guanina é suscetível à formação de ligação covalente com agentes alquilantes. Por ser muito nucleofílico, este átomo representa o principal alvo para sofrer a reação de alquilação (DE ALMEIDA et al., 2005; ZHANG et al., 2005). Os efeitos indesejados sobre o sistema urinário não depedem da atividade antineoplásica das oxazafosforinas, mas da formação da acroleína como subproduto do metabolismo das oxazafosforinas e sua ação principalmente nas células epiteliais da bexiga urinária (KORKMAZ et al., 2007). A acroleína é um composto altamente eletrofílico. É encontrado em alimentos, como o óleo vegetal submetido a altas temperaturas ou batatas fritas (WALTZEK et al., 2012). É também formado durante a combustão de materiais orgânicos e, devido a isso, existe em todos os tipos de fumaça, incluindo a fumaça de cigarros (BEAUCHAMP et al., 1985). Esse composto é usado como herbicida e é conhecido como o mais reativo dos aldeídos Į-ȕ-insaturados. Devido à sua natureza eletrofílica, é capaz de se ligar rapidamente e depletar compostos nucleofílicos como a glutationa (ZITTING & HEINONEN, 1980). Além disso, pode reagir com os aminoácidos cisteína, histidina e resíduos de lisina, além de regiões nucleofílicas no DNA, sendo essas as razões da citoxicidade observada em células expostas a altas concentrações de acroleína (KEHRER & BISWAL, 2000). Outro efeito da acroleína é que este metabólito induz a lipoperoxidação e, além disso, é um dos aldeídos formados nesta reação (ADAMS & KLAIDMAN, 1993).. 1.2 Fisiopatologia da Cistite Hemorrágica. A cistite hemorrágica é uma patologia inflamatória da bexiga urinária decorrente da terapia do câncer com oxazafosforinas, principalmente pela ação da acroleína sobre o uroepitélio. A acroleína foi identificada como a principal responsável por esta patologia. Esta molécula é capaz de reagir com a glutationa, diminuindo seus níveis, e de reagir com resíduos de aminoácidos em proteínas, além de regiões nucleofílicas no DNA e RNA (KERHER & BISWAL, 2000; KORKMAZ et al., 2007). O seu efeito citotóxico direto parece exigir altas concentrações deste composto. No entanto, níveis suficientemente altos para causar dano uroepitelial direto não foram encontrados em pacientes em tratamento antineoplásico com.

(20) ϲ . agentes alquilantes, cujas concentrações urinárias de acroleína foram monitoradas (TAKAMOTO et al., 2004). Este fato sustenta a hipótese de que o dano uroepitelial não é causado somente pela ação citotóxica da acroleína. Isto é sugestivo de que esta substância deve ativar vias importantes do processo inflamatório envolvendo vários mediadores que potencializam seu efeito citotóxico e o subsequente dano uroepitelial (KORKMAZ et al., 2007; RIBEIRO et al., 2012). Contudo foi evidenciado que em baixas doses (não-letais), em linhagem de células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano, a acroleína parece exibir outros efeitos tais como inibição da proliferação celular. É provável que este efeito seja devido à depleção de glutationa e inibição da via da proteína ativadora-1 (AP-1), um importante fator de transcrição nuclear (BISWAL et al., 2002). Foi observado ainda, nesta mesma linhagem de células, que a acroleína diminui a ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-țB) de uma maneira independente do aumento de sua proteína inibitória, a I-țB (HORTON et al., 1999). Estudos experimentais tem demonstrado a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) na patogênese da cistite hemorrágica e há evidências de que o estresse oxidativo representa uma etapa importante do dano uroepitelial causado pela acroleína. Vários agentes antioxidantes possuem efeitos preventivos na cistite hemorrágica experimental. Desse modo, tem sido proposto que as EROs estão presentes nesta patologia e que o sequestro de radicais livres pode atenuar o dano à bexiga urinária causado pela acroleína, em animais de experimentação (KORKMKAZ et al., 2007). De fato, a S-alilcisteína, um composto organossulfurado, ao qual se atribui a capacidade de sequestrar radicais livres e de regular o estado tiol da célula, diminui a lipoperoxidação bem como aumenta a atividade de enzimas antioxidantes, prevenindo o dano uroepitelial causado pela ciclofosfamida (BATHIA et al., 2008). Além disso, Vieira e colaboradores (2004) demonstraram que a substituição das duas últimas doses do protocolo clássico de mesna por ternatina, um flavonóide de uso popular no Brasil, previne a cistite hemorrágica induzida por ifosfamida e ciclofosfamida em camundongos (VIEIRA et al., 2004). Efeito semelhante foi observado para os flavonóides quercetina e 3-galatoepigalocatequina, que protegem o uroepitélio do dano causado pela ciclofosfamida em camundongos (OZCAN et al., 2005). Foi também observado que a rutina, flavonóide isolado de Phyllanthus niruri, exibe efeito anti-inflamatório e reduz a lipoperoxidação no fígado em modelo de cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida (BOEIRA et al., 2011). Além destes, outros antioxidantes como o Į-tocoferol (YILDRIM et al., 2004), o ȕcaroteno (SADIR et al., 2007) e a melatonina (SENER et al., 2004) também são capazes de.

(21) ϳ . prevenir o dano ao uroepitélio causado pelas oxazafosforinas. Substâncias como a glutationa e amifostina (um agente citoprotetor utilizado para proteger as células saudáveis dos efeitos citotóxicos da quimioterapia do câncer) exercem proteção do uroepitélio em modelo de cistite hemorrágica induzida por ifosfamida ou seu metabólico urotóxico, a acroleína (BATISTA et al., 2007). As EROs são produzidas constantemente como uma consequência do metabolismo oxidativo da célula. O radical livre mais importante gerado nesse processo é o ânion superóxido (O2-), resultante da redução do oxigênio molecular por transportadores de elétrons. As EROs incluem ainda o ânion hidroxil (OH-), um radical muito reativo, e a espécie nãoradicalar peróxido de hidrogênio (H2O2). A célula é naturalmente equipada com um sistema de defesa antioxidante que mantém o equilíbrio de seu estado redox (SIES, 1997). Esse sistema de defesa antioxidante é representado principalmente pelas enzimas superóxido dismutase (SOD), que converte o O2- em H2O2, catalase, responsável pela conversão do H2O2 em água (JOHNSON & GIULIVI, 2005) e a glutationa peroxidase que atua através do ciclo redox da glutationa (SIES, 1999). No entanto, quando a produção de EROs supera a capacidade antioxidante da célula, a consequência é o estresse oxidativo. O excesso de radicais livres, por sua vez, apresenta efeitos prejudiciais aos componentes celulares, como a peroxidação dos lipídios de membrana e agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, além de danos às enzimas e ao DNA (SIES, 1997). Além dos danos diretos aos componentes celulares, as EROs podem potencializar a resposta inflamatória por meio da indução de fatores de transcrição, como o NF-ߢB, que se encontra normalmente no citoplasma inativado pela ação da I-țB. A exposição da célula a EROs ou citocinas como o TNF-Į ou a IL-1ȕ induz a fosforilação do I-țB por uma proteína quinase e sua consequente dissociação do complexo, permitindo a translocação do NF-ߢB para o núcleo. O NF-ߢB então se liga a regiões específicas do DNA e induz a transcrição de vários genes de proteínas pró-inflamatórias, o que poderia potencializar o efeito da acroleína na lesão da bexiga urinária (KORKMAZ et al., 2007). O óxido nítrico (NO) também está envolvido na patogênese da cistite hemorrágica. O estudo de Souza-Filho e colaboradores (1997) demonstrou que a ciclofosfamida diminui a expressão de óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS), ao passo que a isoforma induzível da óxido nítrico sintase (iNOS) mostrou-se elevada na bexiga urinária. Neste mesmo estudo, os inibidores não-seletivos das NOS, NȦ-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) e o NȦ-Nitro-Larginina (L-NOARG) reduzem o extravasamento de proteínas plasmáticas para a bexiga urinária e o aumento da massa da bexiga urinária induzidos pela ciclofosfamida. No entanto,.

(22) ϴ . esse efeito foi completamente revertido pela administração de L-arginina, substrato da NOS, mas não pela D-arginina. Este estudo também demonstrou que o PAF contribui para ativação da iNOS, uma vez que a administração do antagonista do PAF (BN 522021) diminui a atividade de iNOS, sem afetar a atividade da NOS constitutiva. Posteriormente, em outro estudo, foi demonstrado que a exposição de uma cultura de células de músculo liso de bexiga urinária de rato ao plasma de ratos tratados com ciclofosfamida induz a expressão de iNOS e aumento de metabólitos do NO. Essas células, quando expostas ao TNF-Į e IFN-Ȗ, exibem níveis aumentados de NO, efeito não observado quando apenas TNF-Į ou IFN-Ȗ estão presentes no meio de cultura. O L-NAME e a S-metilisotiouréia (inibidor seletivo de iNOS) revertem o aumento dos níveis de NO induzidos por TNF-Į e IFN-Ȗ. Além disso, quando a ciclofosfamida ou seu metabólito acroleína são adicionados ao meio de cultura não se observa aumento nos níveis de NO. Devido a isso, os autores sugerem a participação de citocinas na indução da iNOS e consequente produção de NO nas células musculares da bexiga urinária (XU et al., 2001). O efeito benéfico da inibição da produção de NO por inibidores da NOS bem como a participação de citocinas na ativação da iNOS tem sido relatado por outros pesquisadores. Korkmaz e colaboradores (2003) demonstraram que S-metilisotiouréia inibe a lesão tecidual da bexiga urinária causada pela ciclofosfamida em ratos. O estudo de Oter e colaboradores (2004) também demonstra que S-metilisotiouréia diminui o edema da bexiga urinária, os níveis de NO e alterações histopatológicas tais como edema, hemorragia, inflamação e ulceração. Foi observado também que este composto diminui a hematúria causada pela ciclofosfamida em ratos. Curiosamente, os animais tratados com L-arginina, substrato da iNOS, mostram um nível de hematúria maior do que aquele encontrado nos animais tratados somente com ciclofosfamida. Esses dados mostram que o NO produzido pela iNOS está envolvido nos eventos que levam ao dano uroepitelial observado na cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida ou ifosfamida e que a expressão de iNOS, nas células da bexiga urinária, parece exigir a ação sinérgica de citocinas (KORKMAZ et al., 2003; OTER et al., 2004; SOUZA-FILHO et al., 1997; XU et al., 2001). As citocinas são mediadores cruciais do processo inflamatório com papéis fisiológicos diversos, e algumas delas tem sido implicadas na modulação da resposta inflamatória na cistite hemorrágica induzida por oxazafosforinas. O TNF-Į e a IL-1ȕ são as principais citocinas pró-inflamarórias e o seu papel na cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida ou ifosfamida tem sido investigado. O tratamento prévio de animais com soro anti-TNF-Į ou.

(23) ϵ . anti-IL-1ȕ reduz o edema da bexiga urinária e o extravasamento de proteínas plamáticas para este tecido em camundongos injetados com ciclofosfamida. Além disso, algumas alterações histopatológicas da bexiga urinária tais como erosão da mucosa, hemorragia, edema, migração de leucócitos, deposição de fibrina e ulcerações são reduzidas pelo pré-tratamento com soro anti-TNF-Į ou anti-IL-1ȕ (GOMES et al., 1995). De modo semelhante, o estudo de Ribeiro e colaboradores (2002) demonstrou que o tratamento com soro anti-TNF-Į, ou antiIL-1ȕ diminui o edema da bexiga urinária e as alterações microscópicas na bexiga urinária. O tratamento com L-NAME, talidomida (um inibidor de TNF-Į) ou pentoxifilina (inibidor não específico de TNF-Į e IL-1ȕ) também reduz esses parâmetros. Outro dado importante deste estudo foi a inibição da expressão de iNOS pelo tratamento com os soros anti-TNF-Į ou antiIL-1ȕ. Estes dados aumentam as evidências de que a sinalização por citocinas próinflamatórias é necessária para a expressão de iNOS na bexiga urinária na cistite hemorrágica experimental. Outros estudos investigaram o efeito de citocinas anti-inflamatórias na cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida ou ifosfamida. Mota e colaboradores (2007) demonstraram que a interleucina-11 (IL-11), uma citocina com efeito protetor em várias doenças inflamatórias, reduz o edema da bexiga urinária e o extravasamento de proteínas plasmáticas para a bexiga urinária, além de reduzir alterações microscópicas. Recentemente foi demonstrado que o tratamento com IL-4 exógena atenua a expressão de mediadores inflamatórios tais como TNF-Į, IL-1ȕ e iNOS. Em adição, animais tratados com soro anti-IL4, assim como animais nocautes para IL-4, exibem um grau de cistite hemorrágica maior do que aquele observado em animais tratados somente com ifosfamida (MACEDO et al., 2012). Como discutido acima, o principal mecanismo que leva à lesão da bexiga urinária vista na cistite hemorrágica é o aumento da expressão de iNOS e a consequente elevação dos níveis de NO. Esse evento, por sua vez, está sob a regulação de citocinas como TNF-Į e IL-1ȕ, além de outros mediadores inflamatórios como IFN-Ȗ e PAF. No entanto o NO não exerce efeito citotóxico direto e tem sido sugerido que o peroxinitrito (ONOO-), um radical formado pela reação do ânion superóxido com o NO, está no final da cascata de eventos inflamatórios que conduzem à cistite hemorrágica (Figura 3; KORKMAZ et al., 2007). É sabido que o ONOO- leva a um aumento na ruptura da fita do DNA, o que resulta na ativação da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP polimerase), uma enzima de reparo do DNA, que quando ativada pode levar à morte celular por necrose. Esta enzima catalisa a clivagem do NAD+ em nicotinamida e ADP-ribose. Este último é utilizado pela PARP polimerase para sintetizar polímeros de ADP-ribose ligados covalentemente a proteínas.

(24) ϭϬ . aceptoras nucleares. Esses polímeros facilitam o recrutamento de proteínas de reparo do DNA para os locais de lesão do DNA. Entretanto, quando o grau de lesão do DNA é alto, a PARP polimerase é excessivamente ativada, levando à depleção de NAD+, o que compromete o funcionamento da via glicolítica, do ciclo de Krebs e o transporte de elétrons na mitocôndria. Como consequência, o nível de ATP diminui e a célula utiliza ATP e nicotinamida para sintetizar NAD+, na tentativa de restabelecer o funcionamento do metabolismo energético. Isto resulta na depleção de ATP, que é um evento decisivo na indução da morte celular por necrose (VIRÁG et al., 2003).. Figura 3: Vias inflamatórias induzidas pela acroleína na bexiga urinária. A acroleína ao entrar na célula uroepitelial provoca aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e/ou ativa as vias do fator de transcrição nuclear țappa B (NF-țB) ou da proteína ativadora-1 (AP-1) levando à expressão de citocinas e de óxido nítrico sintase induzível (iNOS). A iNOS produz grande quantidade de NO favorecendo a produção de peroxinitrito (ONOO-) que causa dano ao DNA. Isto induz a ativação da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP polimerase) resultando em morte celular e necrose (Adaptado de KORKMAZ et al., 2007).. A participação da PARP polimerase na indução da cistite hemorrágica tem sido demonstrada em estudos experimentais. Foi observado que o composto 1400W, um inibidor seletivo da iNOS, reduz os níveis de nitrito e nitrato na urina e a atividade de iNOS na bexiga urinária. Este efeito foi acompanhado por uma melhora nos parâmetros histopatológicos da bexiga urinária tais como edema, hemorragia, inflamação e ulceração, além de uma diminuição na massa da bexiga urinária. O mesmo estudo demonstrou que o tratamento com ebseleno, um composto capaz de sequestrar ONOO-, e 3-aminobenzamida, um inibidor da.

(25) ϭϭ . PARP polimerase, não tem efeito sobre a atividade de iNOS nem sobre os níveis de nitrito e nitrato, mas reduzem os parâmetros histopatológicos acima citados, bem como o edema da bexiga urinária (KORKMAZ et al., 2008). O fato de que um inibidor da PARP polimerase (3-aminobenzamida), que não tem efeito sobre a expressão de iNOS, nem sobre a formação de ONOO-, diminui a lesão da bexiga urinária, sustenta a hipótese de que a ativação da PARP polimerase é o evento principal na indução da cistite hemorrágica. Ao mesmo tempo, esses dados sugerem que o ONOO- é o responsável por desencadear a ativação da PARP polimerase, uma vez que o tratamento com ebseleno não diminui a produção de NO, mas mesmo assim promove melhora nos aspectos histopatológicos da bexiga urinária (KORKMAZ et al., 2008). Todos os achados citados anteriormente indicam que o surgimento e o grau da lesão da bexiga urinária na cistite hemorrágica dependem de vários mediadores inflamatórios. Estes são induzidos nos estágios iniciais e amplificam a resposta inflamatória na cistite hemorrágica. O ONOO- atua no final da cascata de eventos que levam à cistite hemorrágica, sendo o responsável pela indução da ativação da PARP polimerase, que é o evento mais importante envolvido na indução da cistite hemorrágica (KORKMAZ et al., 2007; 2008).. 1.3 Tratamento da Cistite Hemorrágica. Existem várias estratégias terapêuticas para a prevenção da cistite hemorrágica. As medidas preventivas mais clássicas incluem a irrigação contínua da bexiga urinária, administração intravesical de formalina, irrigação intravesical com alumínio e terapia com oxigênio hiperbárico (MUKHTAR & WOODHOUSE, 2010). Atualmente, o mesna (2mercaptoetano sulfonato de sódio) é o fármaco de escolha para prevenir a cistite hemorrágica em pacientes em tratamento com oxazafosforinas (LIMA et al., 2007; SIU & MOORE, 1998) O mesna (Figura 4) reduz a incidência de cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida ou ifosfamida, mas não tem efeito quando essa patologia já está desenvolvida, o que restringe seu uso apenas como agente profilático (LIMA et al., 2007; SIU & MOORE, 1998; SHAW & GRAHAM, 1987). Antes da introdução do mesna, a incidência de cistite hemorrágica era muito alta e chegava a 68% dos pacientes submetidos ao tratamento com oxazafosforinas, com uma taxa de mortalidade de 4% para os casos mais graves. Entretanto, com o uso clínico do mesna, a incidência de cistite hemorrágica caiu para 5% e doses maiores.

(26) ϭϮ . de oxazafosforinas puderam ram ser utilizadas, melhorando a resposta tera rapêutica no tratamento de neoplasias (LIMA et al., l., 2007).. Figura 4: Estrutura química ica do mesna e do dimesna.. O mesna tem uma estrutura e polar e isso dificulta a sua entradaa nas n células, impedindo que este composto interfira ra na atividade antineoplásica dos agentes alqu quilantes. Ao alcançar a circulação sanguínea, o meesna é imediatamente oxidado a dimesna (dit ditiodietanosulfonato de sódio) por meio da formaçã ação de pontes dissulfeto entre as sulfidrilas terminais. te O dimesna é um dissulfeto inativo, o que ue é um fato muito vantajoso porque isso torn rna improvável que esse composto reaja em nívell plasmático p e interfira no efeito citotóxicoo da ciclofosfamida ou ifosfamida. No entanto o dimesna d presente no filtrado glomerular pode de ser reabsorvido pelo epitélio tubular proximal sendo se em seguida reduzido a mesna pelas en enzimas tiotransferase e glutationa redutase. O meesna é então secretado na luz tubular ond nde pode reagir com a acroleína e neutralizá-la (GO GOREN et al., 1989; SHAW & GRAHAM, 19 1987). Devido à alta solubil bilidade do mesna, a sua depuração renal é rá rápida e sua meia-vida plasmática é de apenas um ma hora e meia. Por essas razões, para garant ntir que o mesna esteja presente numa concentraçã ção suficiente para neutralizar a acroleína enq nquanto esta está sendo eliminada, o tratamento pprofilático com mesna é feito em três dos oses (20% da dose de ciclofosfamida ou ifosfamid ida), uma antes e as outras duas após (4 e 8 horas) h a administração do agente alquilante porr via intravenosa. O mesna administrado po por via oral tem uma biodisponibilidade próxima ma de 50% da intravenosa, sendo necessár sária doses duas vezes maiores que a intravenosa osa para manter a atividade protetora. Reco ecomenda-se uma dose intravenosa (20% da dose se de ciclofosfamida ou ifosfamida) seguidaa de doses orais, 2 e 6 horas depois da administraç ração de ciclofosfamida ou ifosfamida correpo pondente a 40% da dose do agente alquilante. O mesna me exerce seu efeito protetor por reagir ccom o grupo sulfidrila livre da acroleína formando do um produto inerte (SHAW & GRAHAM, 19 1987). A despeito do usoo profilático do mesna, a cistite hemorrágica ca ainda representa um desafio no tratamento do câncer c com agentes antineoplásicos. Lima e colaboradores (2007).

(27) ϭϯ . demonstraram que mesmo recebendo o tratamento com o protocolo padrão de três doses de mesna, 66,7% dos pacientes submetidos à quimioterapia com ifosfamida apresentam alterações citoscópicas e 100% apresentam alterações microscópicas como edema e ulceração. Em outro estudo, foi demostrado que a substituição da última ou das duas últimas doses do protocolo clássico do mesna por dexametasona reduz o edema da bexiga urinária e as alterações macroscópicas e microscópicas neste órgão na cistite hemorrágica induzida pela ifosfamida. O tratamento com as três doses de mesna também reduz esses parâmetros. Entretanto, a substituição das duas últimas doses de mesna por dexametasona parece ser mais eficiente do que o tratamento com três doses de mesna. Isto porque somente 16,7% dos animais tratados com mesna mais duas doses de dexametasona apresentam alterações microscópicas. No entanto, essas alterações foram observadas em 33,3% dos animais que receberam tratamento com as três doses de mesna. Neste estudo, ainda, as duas últimas doses de mesna foram substituídas pela associação de mesna com dexametasona. Observou-se que esta forma de tratamento resulta em 100% de redução do edema da bexiga urinária e das alterações microscópicas na bexiga urinária tais como erosão, ulceração epitelial e infiltrado leucocitário. Além disso, aumenta a prevenção de formação de edema da bexiga urinária em 17,93%, em relação ao tratamento somente com três doses de mesna (VIEIRA et al., 2003). Esses dados mostram que o tratamento com mesna, apesar de ser eficaz, não previne totalmente a bexiga urinária de danos causados pelas oxazafosforinas e, ainda, que a associação do mesna com um agente anti-inflamatório pode potencializar seu efeito protetor na cistite hemorrágica associada às oxazafosforinas (LIMA et al., 2007; VIEIRA et al., 2003). Tem sido demostrado, em animais de experimentação, que a administração de ciclofosfamida induz a produção de vários mediadores inflamatórios na bexiga urinária (KORKMAZ et al., 2007). No entanto, o mesna não é um composto anti-inflamatório nem possui propriedades antioxidantes e, portanto, não pode atuar na modulação de vias inflamatórias envolvidas na cistite hemorrágica (SHAW & GRAHAM, 1987). Desse modo, a associação de mesna com anti-inflamatórios esteroidais como a dexametasona pode ser utilizada para melhorar o tratamento da cistite hemorrágica, porém fármacos desta classe possuem muitos efeitos indesejáveis (VIEIRA et al., 2003). Outra observação experimental importante, é o fato de que substâncias antioxidantes podem prevenir as lesões da bexiga urinária na cistite hemorrágica (KORKMAZ et al., 2007). Por essas razões, substâncias de origem natural com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias podem representar uma alternativa em potencial para o tratamento da cistite hemorrágica..

(28) ϭϰ . 1.4 Produtos Naturais Nos últimos anos muitos esforços foram empregados para o entendimento e a confirmação das propriedades medicinais de plantas utilizadas pela população. A biodiversidade dos biomas brasileiros, especialmente a Caatinga, tem inspirado muitas pesquisas em busca de descrever as atividades biológicas dessas plantas e, sobretudo, suas atividades farmacológicas. Sabe-se que a natureza é uma fonte de substâncias que possuem propriedades antioxidantese que tem grande potencial para exercer atividade farmacológica, especialmente atividade anti-inflamatória (ALBUQUERQUE & HANAZAKI, 2007; BRASIL, 2006; CALIXTO et al., 2004; DESMARCHELIER, 1999). Neste contexto, a Caatinga, o bioma ao qual o estado de Sergipe pertence, é promissor como fonte de produtos naturais oriundos de plantas utilizadas popularmente para o tratamento de diversas enfermidades. A Caatinga atinge quase 1 milhão de metros quadrados no Nordeste do Brasil. Sua vegetação xerófila é assolada por longos períodos de secas e altas temperaturas e, devido à baixa renda familiar, o uso de plantas medicinais é muito disseminado na região (ALBUQUERQUE et al., 2007; DESMARCHELIER, 1999). O estudo da diversidade biológica da Caatinga tem sido impulsionado nos últimos anos pelo Ministério da Saúde, que busca inserir no âmbito do SUS a fitoterapia e o programa de pesquisas em plantas medicinais. Dada a importância do estudo e utilização da diversa flora brasileira como alternativa a tratamentos convencionais, isto é feito através de uma abordagem etnodirigida, tendo como base o conhecimento construído localmente a respeito dos recursos naturais e da aplicação dos mesmos (ALBUQUERQUE & HANAZAKI, 2007; BRASIL, 2006). Várias espécies de plantas pertencentes a diversas famílias comumente encontradas na Caatinga são muito utilizadas na medicina popular para tratar diversas condições patológicas (AGRA et al., 2007). Em um estudo identificou-se que num total de 126 espécies utilizadas como medicinais, 6 pertenciam ao gênero Caesalpinia (AGRA et al., 2008). Caesalpinia ferrea é uma espécie deste gênero utilizada na medicina popular no tratamento de anemia, disenteria e diarréia. Já a Caesalpinia echinata é utilizada para tratar úlceras externas, e a Caesalpinia mycrophylla, utilizada como sedativo (AGRA et al., 2007). Caesalpinia minax é outra planta deste gênero utilizada na medicina popular para tratar gripe, disenteria e inflamação associada ao reumatismo (CHENG et al., 2009). A Caesalpinia pyramidalis Tul., uma espécie pertencente ao gênero Caesalpinia e à família Fabaceae, é comumente encontrada na Caatinga, habitando terrenos pedregosos. É.

(29) ϭϱ . conhecida popularmente como “catingueira” ou “pau-de-rato” e tem sua entrecasca utilizada na medicina popular como afrodisíaca, antipirética, anti-inflamatória e expectorante na forma de decocto ou “garrafada” (AGRA et al., 2007; BAHIA et al., 2005; MENDES et al., 2000). Vários compostos de C. pyramidalis já foram isolados. Compostos como o ácido 4-oȕ-glicopiranosiloxi(Z)-7-hidroxicinâmico. e. o. ácido. 4-o-ȕ-D-glicopiranosiloxi(Z)-8-. hidroxicinâmico (MENDES et al., 2000), bem como os flavonóides caesalflavona, podocarpusflavona, agastiflavona, apigenina, canferol (BAHIA et al., 2005), ioniflavona, amentoflavona e 5’-hidroxi-amentoflavona (BAHIA et al., 2010) estão presentes no extrato clorofórmico das folhas desta planta. Além destes, outros compostos fenólicos como lupeol e sitosterol foram isolados do extrato clorofórmico das folhas de C. pyramidalis. No extrato clorofórmico do caule foram encontrados os compostos 4,4’-diidroxi-2’-metoxi-chalcona, galato de metila e (-)-siringaresinol. Recentemente foi sugerida a presença do flavonóide rutina no extrato etanólico da entrecasca de C. pyramidalis (EECp; SANTANA et al., 2012). O estudo de Silva e colaboradores (2011) demonstrou que as folhas e a casca de C. pyramidalis possuem uma grande quantidade de taninos totais e de compostos fenólicos totais, especialmente flavonóides. Nesse estudo foi também observado que a C. pyramidalis possui elavada atividade antioxidante e alta capacidade de quelar íons ferro in vitro. A atividade antioxidante in vitro de C. pyramidalis já havia sido relatada por Alviano e colaboradores (2008) em um estudo anterior. Confirmando o efeito da C. pyramidalis observado na medicina popular, o estudo de Santos e colaboradores (2011) demostrou que o EECp possui atividade anti-inflamatória em modelos de inflamação em animais. Neste estudo, o EECp reduz a atividade de mieloperoxidase (MPO) e o edema de pata induzidos pela carragenina, bem como o influxo de leucóticos para a cavidade peritoneal de camundongos com peritonite induzida também por carragenina. Foi observado ainda que o EECp apresenta atividade antinociceptiva em testes como o da formalina e da placa quente e no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Santana e colaboradores (2012), mais recentemente, demonstraram que o EECp possui efeito anti-inflamatório em modelo de pancreatite induzida por obstrução do ducto biliopancreático. Os autores observaram que o EECp reduz a atividade de MPO no pulmão e no pâncreas, bem como a concentração de malondialdeído (MDA), um indicador de peroxidação lipídica, nestes tecidos, sugerindo que a C. pyramidalis tem atividade antioxidante in vivo. Foi observado também, pelos mesmos autores, que o EECp reduz o número de leucócitos totais bem como de mono e polimofonucleares após 24 horas da.

(30) ϭϲ . indução da pancreatite. Além disso, no mesmo estudo, o EECp reduz a hiperalgesia abdominal e concentração de enzimas pancreáticas como lipase e amilase. Como já foi discutido, muitas vias inflamatórias importantes estão envolvidas na cistite hemorrágica (KORKMAZ et al., 2007). O mesna, que é o fármaco utilizado atualmente para a prevenção da cistite hemorrágica, não possui atividade anti-inflamatória nem propriedades antioxidantes. Seu efeito profilático se dá por meio de sua ligação à acroleína antes que esta entre em contato com o uroepitélio. Desse modo, o mesna não pode modular a resposta inflamatóra na cistite hemorrágica (SHAW & GRAHAM, 1987). Além disso, observa-se que pacientes em tratamento com oxazafosforinas, mesmo com o uso profilático do mesna, desenvolvem alterações na bexiga urinária como edema e hemorragia (LIMA et al., 2007). Isto demonstra que o mesna não exerce proteção total da bexiga urinária contra os danos causados pela acroleína. Ao mesmo tempo, indica que a cistite hemorrágica ainda representa um desafio no tratamento quimioterápico do câncer com oxazafosforinas. Já foi demostrado que a associação de mesna com dexametasona, um anti-infamatório esteroidal, é mais eficiente na proteção da bexiga urinária de ratos tratados com oxazafosforinas do que o tratamento somente com mesna (VIEIRA et al., 2003). Somado a isso, muitos estudos experimentais tem demostrado que substâncias antioxidantes previnem as lesões, na bexiga urinária, causadas pela acroleína, atuando, provavelmente, nos estágios iniciais da resposta inflamatória na cistite hemorrágica (KORKMAZ et al., 2007). Diante disso, os produtos de origem natural, como os extratos de plantas, bem como substâncias isoladas destes, podem ser utilizados como terapia coadjuvante no tratamento da cistite hemorrágica. Muitos extratos de plantas são ricos em substâncias com propriedades antioxidantes e que tem potencial para exercer atividade anti-inflamatória (CALIXTO et al., 2004). Por isso, esses extratos de plantas podem representar uma alternativa em potencial para melhorar o tratamento da cistite hemorrágica. Como descrito anteriormente, o EECp possui propriedades antioxidantes in vitro (SILVA et al., 2011) e in vivo (SANTANA et al., 2012), bem como atividade antiinflamatória em animais de experimentação (SANTANA et al., 2012; SANTOS et al., 2011). Desse modo, sugeriu-se a possibilidade de que o EECp possa atenuar a lesão da bexiga urinária na cistite hemorrágica. Portanto, o EECp foi testado no modelo de cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida em ratos para investigar seu efeito protetor, o que, se comprovado, poderia orientar estudos futuros com o EECp neste mesmo modelo..

(31) ϭϳ . 2 OBJETIVOS. 2.1 Objetivo Geral Investigar o efeito do extrato etanólico da entrecasca de Caesalpinia pyramidalis (EECp) na prevenção da cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida.. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar o efeito do EECp no quadro inflamatório na bexiga urinária associado à cistite hemorrágica; Investigar o efeito do EECp sobre a lesão em outros órgãos causada pela ciclofosfamida; Avaliar a atividade antioxidante do EECp na cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida..

(32) ϭϴ . 3 MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Drogas e Reagentes. Ciclofosfamida, mesna, brometo de hexadeciltrimetilamônio, hidrocloreto de odianisidina e a solução de Turk foram obtidos da Sigma (EUA). Isoflurano foi obtido da Crisália, Itapira-SP, Brasil. Os outros reagentes foram obtidos da Merk, Alemanha.. 3.2 Coleta da Planta e Preparo do Extrato Etanólico da Entrecasca de Caesalpinia pyramidalis. A entrecasca de Caesalpinia pyramidalis foi coletada no povoado Xingó, município de Canidé do São Francisco-SE (09°66'00"S, 37°78'94"W) em setembro de 2008. Um espécime foi identificado pela botânica Dr. Ana Paula Prata, do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Sergipe e depositado no Herbário da Universidade Federal de Sergipe (Av. Marechal Rondon São Cristóvão, Sergipe, 49100-000, Brasil) sob o número ASE 13.164. A entrecasca foi seca em estufa e em seguida pulverizada (2,840 kg) e posteriormente submetida à extração com etanol a 90% em percolador de aço inoxidável durante cinco dias. O extrato foi filtrado a vácuo e o solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo (45°C). A porcentagem de rendimento do EECp foi de 2,6% (73,8 g).. 3.3 Animais . Ratos Wistar pesando entre 220 e 270 g foram utilizados neste estudo, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram divididos em caixas contendo 5 animais cada e mantidos em temperatura de 21 ± 2°C, sob ciclo de claro/escuro de 12 horas e ração (Purina®) e água ad libitum. Oito horas antes do experimento os animais foram privados de ração, mas permaneceram com livre acesso a água. Os procedimentos.