4.2 Efeitos Sistêmicos do Extrato Etanólico da Entrecasca de Caesalpinia
4.2.2 Atividade de MPO e Concentração de MDA no Pulmão, Baço, Fígado e Rim
Vinte e quatro horas depois da indução da cistite hemorrágica pela ciclofosfamida, observou-se que no pulmão dos animais previamente tratados com veículo a atividade de MPO mostrou-se elevada (P<0,05) quando comparado com grupo veículo + salina. Quando se comparou os grupos que receberam tratamento prévio com EECp, observou-se que as doses de 200 e 400 mg/kg foram eficazes em diminuir (P<0,05) a atividade de MPO no tecido pulmonar, ao passo que para a dose de 100 mg/kg de EECp foi encontrada uma tendência a menores valores, que também foi observada no grupo pré-tratado com mesna (Figura 11A). De modo diferente, a indução da cistite hemorrágica, bem como os tratamentos utilizados, não alteraram a atividade de MPO no tecido esplênico (Figura 12A).
No fígado e no rim, foram encontrados níveis de MPO bem próximos do limite de detecção da técnica utilizada (valores menores que 0,1 UMPO/mg de tecido), mas não foi observada diferença entre os grupos avaliados (dados não mostrados).
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Figura 11: Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na atividade de mieloperoxidase (MPO; painel A) e concentração de malondialdeído (MDA; painel B) no pulmão, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos. Os animais foram tratados com
veículo (tween 80 a 0,5%) ou EECp (100-400 mg/kg; p.o.) 1 hora antes da administração de ciclofosfamida (200 mg/kg; i.p.) ou salina (0,9 %; i.p.). O tratamento com mesna (40 mg/kg; i.p.) foi feito 5 minutos antes e 4 e 8 horas após a indução da cistite hemorrágica. (A) Atividade de MPO expressa como unidade (U) de MPO/mg de tecido pulmonar e (B) concentração de MDA expressa em pmol/mg de tecido pulmonar. Dados expressos como média ± EPM (n = 8); ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. # P<0,05 vs veículo + salina e * P<0,05 vs veículo + ciclofosfamida.
Com relação á produção MDA, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica, não foi observada diferença significativa entre os grupos injetados com ciclofosfamida ou salina e tratados previamente com veículo, tanto no tecido pulmonar (Figura 11B) quanto no esplênico (Figura 12B). No entanto, nos grupos pré-tratados com EECp, nas doses de 200 ou 400 mg/kg, os níveis de MDA encontrados no pulmão foram menores (P<0,05) do que aqueles
0 5 10 15 20 # Veículo + Salina EECp (mg/kg) 100 200 400 Mesna Veículo Ciclofosfamida * *
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encontrados no grupo veículo + ciclofosfamida (Figura 11B). Ainda sobre a concentração de MDA, quando se considerou este parâmetro no baço, observou-se que apenas a dose de 400 mg/kg de EECp reduziu (P<0,05) significativamente o nível de MDA quando comparado com o grupo veículo + ciclofosfamida (Figura 12B). O pré-tratamento com mesna reduziu (P<0,05) a produção de MDA apenas no pulmão (Figura 11B).
No tecido hepático e renal foram encontrados níveis detectáveis de MDA, mas não foi observada diferença entre os grupos avaliados (dados não mostrados).
Figura 12: Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna na atividade de mieloperoxidase (MPO; painel A) e concentração de malondialdeído (MDA; painel B) no baço, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos. Os animais foram tratados com
veículo (tween 80, 0,5%) ou EECp (100-400 mg/kg; p.o.) 1 hora antes da administração de ciclofosfamida (200 mg/kg; i.p.) ou salina (0,9 %; i.p.). O tratamento com mesna (40 mg/kg; i.p.) foi feito 5 minutos antes e 4 e 8 horas após a indução da cistite hemorrágica. (A) Atividade de MPO expressa como unidade (U) de MPO/mg de tecido esplênico e (B) concentração de MDA expressa em pmol/mg de tecido esplênico. Dados expressos como média ± EPM (n = 8); ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni. * P<0,05 vs veículo + ciclofosfamida.
0 10 20 30 40 Veículo + Salina EECp (mg/kg) 100 200 400 Mesna Veículo Ciclofosfamida
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4.2.3 Contagem Total e Diferencial de Leucócitos de Sangue Periférico
Considerando-se o número de leucócitos no sangue periférico, observou-se que a administração de ciclofosfamida no grupo de animais tratados previamente com veículo diminuiu significativamente o número de leucócitos totais (P<0,001) e de mononucleares (P<0,001), ao passo que o número de leucócitos polimorfonucleares mostrou-se aumentado nesse grupo (P<0,05), quando comparado com o grupo veículo + salina. O tratamento prévio com o EECp impediu este aumento no número de polimorfonucleares (P<0,05), comparando- se com o grupo veículo + ciclofosfamida, em todas as doses testadas (100-400 mg/kg). Porém a administração de EECp não foi capaz de alterar o número de leucócitos totais e mononucleares, mantendo-se a diferença significativa nestes dois parâmetros, quando comparado com o grupo veículo + salina (P<0,001). O pré-tratamento com mesna não resultou em alteração do número de leucócitos totais e mononucleares, mostrando ainda diferença (P<0,001) em relação ao grupo veículo + salina, bem como não foi capaz de afetar significativamente o número de leucócitos polimorfonucleares, quando comparado com o grupo veículo + ciclofosfamida (Tabela 2).
Tabela 2: Efeito do extrato etanólico de Caesalpinia pyramidalis (EECp) ou mesna sobre a contagem total e diferencial de leucócitos em sangue periférico, 24 horas após a indução da cistite hemorrágica em ratos.
Os animais foram tratados com veículo a 0,5%, EECp (100-400 mg/kg; 1 hora antes) ou mesna (40 mg/kg; 5 minutos antes e 4 e 8 horas depois da ciclofosfamida [CF]; i.p.). Resultados expressos como o número de células x 106/mL. Dados expressos como média ± EPM (n = 8); ANOVA seguida pelo
teste de Bonferroni. # P<0,05 ou ### P<0,001 vs veículo + salina e * P<0,05 vs veículo + CF.
Grupos Leucócitos Totais
(x 106/mL) Mononucleares (x 106/mL) Polimorfonucleares (x 106/mL) Veículo + Salina 13.2 ± 1.0 9.7 ± 0.8 3.0 ± 0.6 Veículo + CF 7.0- ± 0.9 ### 1.4 ± 0.2 ### 5.6 ± 0.8# EECp (100 mg/kg) + CF 3.7 ± 0.4 ### 0.9 ± 0.2### 2.8 ± 0.3* EECp (200 mg/kg) + CF 4.5 ± 0.6### 1.4 ± 0.3### 3.1 ± 0.4* EECp (400 mg/kg) + CF 3.8 ± 0.6### 1.2 ± 0.3### 2.6 ± 0.4* Mesna + CF 5.8 ± 1.6 ### 1.9 ± 0.6 ### 3.9 ± 1.1
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5 DISCUSSÃO
O desenvolvimento de mais alternativas viáveis para o tratamento da cistite hemorrágica induzida por antineoplásicos, como a ciclofosfamida, ainda é necessário na prática terapêutica. O uso de produtos naturais para suprir esta necessidade representa uma alternativa promissora, considerando-se os potenciais farmacológicos apresentados por plantas da região da Caatinga para o tratamento de diversas condições (AGRA et al., 2007; ALBUQUERQUE et al., 2007; DESMARCHELIER et al., 1999; RIBEIRO et al., 2012). O presente estudo demonstrou que o extrato etanólico da entrecasca de uma destas plantas, a
Caesalpinia pyramidalis pode interferir no desenvolvimento da cistite hemorrágica,
principalmente por afetar a lesão inflamatória na bexiga urinária, mas também por atuar em outros tecidos, a exemplo do pulmão.
No presente estudo a indução da cistite hemorrágica pela ciclofosfamida provocou migração de leucócitos, especialmente polimorfonucleares, para a bexiga urinária. Este influxo de leucócitos foi evidenciado pela elevação, neste órgão, na medida da atividade de MPO, uma enzima produzida por neutrófilos (KLEBANOFF, 2005) e confirmado pela análise histológica. Como nesta primeira fase da inflamação os neutrófilos são as células predominantes, a medida da atividade de MPO é um parâmetro confiável para avaliação do influxo de neutrófilos para os tecidos inflamados (BRADLEY et al., 1982; KLEBANOFF, 2005). Esses resultados estão de acordo com um estudo prévio que relatou o influxo de leucócitos para a bexiga urinária como uma característica importante da cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida (ASSREUY et al., 1999). O tratamento prévio com o EECp, nas doses de 100-400 mg/kg, reduziu a atividade de MPO, sugerindo, desta forma, a redução do influxo de neutrófilos para a bexiga urinária. O efeito inibitório do EECp sobre o influxo de neutrófilos para a bexiga urinária foi confirmado pela avaliação histológica, pois a dose de 100 mg/kg diminuiu o infiltrado de neutrófilos, ao passo que o tratamento com a dose de 400 mg/kg exibiu uma leve tendência a menores escores para este parâmetro. É interessante observar que existe uma discrepância para o efeito da dose de 400 mg/kg de EECp entre a dosagem de MPO e a contagem de polimorfonucleares na análise histológica. Esta dose reduziu apenas a atividade de MPO, mas não alterou de forma significativa o escore para influxo de leucócitos (Figura 6 e 8; Tabela 1). Apesar disto, o conjunto de resultados aponta
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para um efeito anti-inflamatório do EECp na bexiga urinária de animais com cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida.
O efeito anti-inflamatório do EECp foi demonstrado por estudos prévios do nosso laboratório. No estudo de Santos e colaboradores (2011) o EECp, na dose de 400 mg/kg, reduz a migração de leucócitos totais (e de leucócitos polimorfonucleares) para a cavidade peritoneal em modelo de peritonite induzida por carragenina em camundongos. Utilizando outro modelo de inflamação, o edema de pata de rato induzido também por carragenina, esses autores demostraram que o EECp reduz atividade de MPO na pata destes animais. Corroborando o estudo anterior, Santana e colaboradores (2012) demostraram que o EECp na dose de 400 mg/kg reduz a atividade de MPO no tecido pancreático induzida por obstrução do ducto biliopancreático. Isto foi observado tanto no tempo experimental de 6 horas quanto de 24 horas após a indução da pancreatite. Os resultados encontrados por esses autores estão de acordo com os do presente estudo que, por sua vez, aumenta as evidências de que o EECp possui efeito inibitório sobre a migração de leucócitos.
Em nenhum dos estudos prévios citados (SANTANA et al., 2012; SANTOS et al., 2011) foi observado um efeito tipicamente dose-dependente para o tratamento com o EECp, o que também não foi observado no presente estudo. De qualquer forma esse efeito antiquimiotático observado para o EECp é de grande relevância, uma vez que a migração leucócitária é uma característica muito importante de condições inflamatórias, incluindo a cistite hemorrágica (ASSREUY et al., 1999). Estas células estão relacionadas à lesão tecidual presente em muitos quadros inflamatórios, sendo que a MPO está envolvida na indução dessa lesão devido à produção de ácido hipocloroso (HClO), um poderoso oxidante (KLEBANOFF, 2005), embora, no presente estudo, a atividade de MPO foi utilizada apenas como um marcador indireto da presença de neutrófilos no tecido.
A administração de ciclofosfamida causou outras alterações histopatológicas na bexiga urinária tais como edema da submucosa, hemorragia, erosão e ulceração epitelial. Estas alterações foram acompanhadas por um aumento na massa da bexiga urinária, caracterizando edema neste órgão. Estas são características observadas na cistite hemorrágica induzida por oxazafosforinas, em animais de experimentação (KORKMAZ et al., 2005; OTER et al., 2004; RIBEIRO et al., 2012). O EECp exibiu apenas uma tendência a reduzir essas alterações histopatológicas, ressaltando-se que a dose de 100 mg/kg reduziu o escore total para os parâmetros histopatológicos, mas nehuma das doses reduziu a massa da bexiga urinária (Figuras 6 e 7; Tabela 1). O mesna, por sua vez, promoveu redução em todas as características histopatológicas acima citadas, bem como na atividade de MPO e massa da bexiga (Figuras 6,
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7 e 8; Tabela 1). Estes resultados indicam que o EECp possui efeito anti-inflamatório na bexiga durante a cistite hemorrágica, mas este efeito não é suficiente para reverter as alterações causadas pela ciclofosfamida.
Em continuidade aos efeitos da ciclofosfamida na bexiga urinária, observou-se que a concentração de MDA, um indicador de peroxidação lipídica, não foi alterada de forma importante quando mensurada 24 horas após a administração da ciclofosfamida (Figura 9), contrastando com dados de outros autores (ABRAHAM et al., 2008; 2009a, c). É importante observar que a concentração de MDA nestes estudos foi medida em tempos experimentais diferentes, após 16 horas da administração de ciclofosfamida. Desse modo não é descartada a possibilidade de ter havido peroxidação lipídica e consequentemente aumento na produção de MDA em outros tempos experimentais não avalidos neste estudo.
Contudo, é importante ressaltar que o EECp nas doses de 100 e 400 mg/kg reduziu a concentração basal de MDA na bexiga urinária, sendo que este efeito não foi observado para o mesna (Figura 9). Já foi demonstrado que o EECp possui propriedades antioxidantes in vitro (ALVIANO et al., 2008; SILVA et al., 2011). Posteriormente, nosso grupo de pesquisa demonstrou que o mesmo na dose de 400 mg/kg reduz os níveis de MDA local e sistemicamente, no pâncreas e no pulmão, respectivamente, após indução da pancreatite (SANTANA et al., 2012).
Foi sugerido que a produção de EROs é uma característica da cistite hemorrágica e que substâncias com propriedades antioxidantes podem proteger a bexiga urinária do dano causado pela ciclofosfamida. Acredita-se que a acroleína ao entrar na célula uroepitelial possa induzir a produção de EROs (KORKMAZ et al., 2007) ou interagir diretamente com subunidades nucleofílicas do NF-țB e da AP-1 (KEHRER & BISWAL, 2000). Desse modo, citocinas pró-inflamatórias como TNF-Į ou IL-1ȕ são expressas nas células uroepiteliais e o processo inflamatório é amplificado. Devido a isso, substâncias antioxidantes podem atuar nos eventos iniciais da cistite hemorrágica atenuando os danos ao sistema urinário ou ainda, em associação com o mesna, promover maior efeito protetor (KORKMAZ et al., 2007).
O estudo de Ozcan e colaboradores (2005) demonstrou que o mesna, quando usado sozinho, no protocolo de três doses (antes e depois de 4 e 8 horas da administração de ciclofosfamida), previne algumas alterações histopatológicas da bexiga urinária, como edema e inflamação, mas não diminui a produção de MDA, em modelo de cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida em ratos. No entanto, quando as duas últimas doses de mesna são substituídas por doses de quercetina ou 3-galato-epigalocatequina, todos os parâmetros
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histopatológicos (edema, inflamação, hemorragia e ulceração) além dos níveis de MDA são reduzidos.
A migração de leucócitos para os tecidos inflamados é um evento importante da resposta inflamatória, incluída aquela presente na cistite hemorrágica (ASSREUY et al., 1999). Por isso, o número de leucócitos circulantes, especialmente polimorfonucleares, pode estar aumentado em processos inflamatórios agudos (KOLACZKOWSKA & KUBES, 2013; KUMAR & SHARMA, 2010). Devido a isso, a contagem de leucócitos de sangue periférico foi utilizada neste estudo como um parâmetro sistêmico adicional para cistite hemorrágica.
Vinte e quatro horas após a administração de ciclofosfamida, observou-se redução no número de leucócitos totais, representada principalmente por leucócitos mononucleares, o que era esperado porque este agente alquilante tem efeito imunossupressor (DEWYS et al., 1970). Entretanto foi observado que a cistite hemorrágica foi acompanhada por um pequeno, porém significativo, aumento no número de leucócitos polimorfonucleares (Tabela 2), contrastando com outros autores que demonstram que a ciclofosfamida causa neutropenia em ratos (ADLER & KUZNETSKY, 1984; KUSANO et al., 2004). No entanto, muitos destes estudos utilizam doses muito baixas de ciclofosfamida, a exemplo do estudo de Kusano e colaboradores (2004), onde foi utilizada a dose de 25 mg/kg. Por outro lado, observa-se que doses de até 300 mg/kg de ciclofosfamida são utilizadas para induzir cistite hemorrágica em animais de experimentação (BOEIRA et al., 2011), podendo acarretar um quadro inflamatório sistêmico mais intenso.
A pesar de a ciclofosfamida ter diminuído o número de leucócitos totais, o aumento no número de células polimorfonucleares observado é sugestivo de maior inflamação sistêmica nestes animais. O referido parâmetro foi reduzido pelo EECp em todas as doses testadas, mas não pelo mesna. Este resultado está de acordo com o encontrado por Santana e colaboradores (2012), em estudo no qual o EECp (100-400 mg/kg) reduz o número de leucócitos polimorfonucleares do sangue periférico na pancreatite no tempo experimental de 6 horas. Esses autores também demostraram que 24 horas após a indução da pancreatite, a dose de 400 mg/kg de EECp reduz o número de polimorfonuecleares.
É importante destacar que, na maioria dos estudos experimentais de cistite hemorrágica, avalia-se principalmente as alterações que ocorrem na bexiga urinária (ABRAHAM et al., 2008; KORKMAZ et al., 2005; OZCAN et al., 2005; RIBEIRO et al., 2012). De modo diferente, no presente estudo considerou-se o efeito da ciclofosfamida em outros órgãos para inferir sobre o possível efeito protetor do EECp, na ocasião de ocorrência
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de lesão pela ciclofosfamida. Ao mesmo tempo, esta abordagem foi realizada para verificar se o EECp poderia causar alguma alteração em outros tecidos.
Dessa forma, o potencial lesivo da ciclofosfamida em órgãos como pulmão, baço, fígado e rim foi avaliado pela medida da atividade de MPO e concentração de MDA, que serviu ao mesmo tempo para inferir sobre possíveis efeitos deletérios do EECp nestes órgãos, que são muito importantes na manutenção da homeostase do organismo. Desta maneira, foi demonstrado que 24 horas após a indução da cistite hemorrágica, a atividade de MPO no pulmão foi elevada de forma importante, indicando que a ciclofosfamida pode ter induzido um quadro de inflamação pulmonar que acompanhou a cistite hemorrágica. Este resultado está de acordo com estudos prévios que mostram o potencial da ciclofosfamida para causar lesão pulmonar (PATEL, 1990; LIMPER, 2004). De modo interessante, O EECp quando administrado nas doses de 200 e 400 mg/kg atenuou a atividade de MPO pulmonar induzida pela ciclofosfamida (Figura 11A).
A capacidade do ECCp (400 mg/kg) de diminuiur o influxo de leucócitos já havia sido mostrada em um estudo anterior (SANTOS et al., 2011). Ainda, o resultado do presente estudo mostra correlação com o estudo de Santana e colaboradores (2012), que demonstraram que o EECp (100-400 mg/kg) reduz a atividade de MPO pulmonar 6 horas após a indução da pancreatite. Desse modo, o resultado do presente estudo sugere que o EECp pode atenuar a lesão pulmonar induzida pela ciclofosfamida.
No baço também foram mensurados altos níveis de MPO, que não foram alterados pelo tratamento com ciclofosfamida ou EECp (Figura 12A).
Já no fígado e rim a atividade de MPO encontrada foi baixa e próxima do limite de detecção da técnica utilizada (dados não mostrados). Estes resultados de baixa atividade estão de acordo com o encontrado por outros autores (DI PAOLA et al., 2013; OHTA et al., 2003) e refletem a falta de infiltrado neutrofílico nestes tecidos, o que sugere que não houve lesão causada pela ciclofosfamida ou pelo EECp. A concentração de MDA também não foi alterada no fígado ou rim dos animais (dados não mostrados). Contudo no pulmão e no baço, ainda que a ciclofosfamida não tenha induzido peroxidação lipídica, o EECp, nas doses mais altas, reduziu os níveis basais de MDA (Figuras 11B e 12B), denotando um possível efeito antioxidante do mesmo e concordando com o estudo de Santana e colaboradores (2012), em que o EECp (400 mg/kg) reduz a concentração de MDA no pulmão 24 horas após a indução da pancreatite.
Ainda com relação a outros efeitos sistêmicos da ciclofosfamida, observou-se que a indução da cistite hemorrágica foi acompanhada por aumento nos níveis plasmáticos de
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metabólitos do NO, medidos 24 horas após a administração do agente alquilante. Este aumento foi prevenido pelo EECp de modo mais intenso na dose de 400 mg/kg. De modo semelhante, o mesna também reduziu este parâmetro (Figura 10). O envolvimento do NO na cistite hemorrágica experimental e sua relação com o dano uroepitelial causado pela ciclofosfamida já está bem caracterizado (KORKMAZ, et al., 2007). Souza-Filho e colaboradores (1997) demostraram primeiramente que inibidores da NOS previnem o dano uroepitelial causado pela ciclofosfamida, e que a iNOS é a principal isoforma responsável pelo aumento da produção de NO, visto que a expressão da NOS constitutiva está diminuída na bexiga urinária de ratos tratados com ciclofosfamida, enquando que a isoforma induzível está elevada no mesmo tecido.
É de interesse também destacar o estudo de Xu e colaboradores (2000) que demonstraram que o plasma de ratos tratados com ciclofosfamida, quando aplicados a uma cultura primária de células de músculo liso de bexiga urinária de ratos, induz estas a expressarem iNOS. Isto é indicativo de que o plasma desses animais deve conter fatores que estimulam a expressão de iNOS, levando a grande produção de NO. O estudo de Oter e colaboradores (2004) mostra que níveis plasmáticos aumentados de nitrito e nitrato estão relacionados à lesão da bexiga urinária na cistite hemorrágica induzida por ciclofosfamida. Este mesmo estudo relata que a diminuição da produção de NO pelo inibidor seletivo da iNOS, S-metilisotiouréia, é acompanhada por uma redução nos escores dos parâmetros histopatológicos analisados (edema, hemorragia, inflamação e ulceração). No presente estudo, esta relação também pode ser feita, pois o tratamento com EECp reduziu os níveis de metabólitos do NO e atenuou a lesão da bexiga urinária, como pode ser observada pela redução do escore histológico total e para influxo de leucócitos (Tabela 1).
O efeito benéfico da administração de substâncias antioxidantes no tratamento da cistite hemorrágica tem sido demostrado. A explicação para esse efeito é baseada no fato de que o NO não é diretamente citotóxico e só é prejudicial na presença de concentrações equimolares de ânion O2-, situação na qual a formação de ONOO- é favorecida. O ONOO- é
um radical muito reativo e pode danificar constituíntes celulares incluíndo lipídios, proteínas e DNA (KORKMAZ et al., 2007; VIRÁG et al., 2003). Vale ressaltar que a acroleína pode induzir a produção de EROs e assim aumentar a expressão de iNOS e consequentemente a produção de NO, o que poderia ser atenuado por substâncias com propriedades antioxidantes (KORKMAZ et a., 2007). Este poderia ser um mecanismo sugestivo para a diminuição do NO pelo EECp, uma vez que este possui uma grande quantidade de compostos fenólicos responsáveis por sua atividade antioxidante (SILVA et al., 2011).
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Embora não tenha sido detectada peroxidação lipídica em nenhum dos tecidos avaliados, é possível que a administração de ciclofosfamida tenha alterado o estado redox