i
CAROLINE COSTA MESQUITA
ESTUDO DA VARIAÇÃO CIRCADIANA DA UPR NO
HIPOTÁLAMO E SUAS IMPLICAÇÕES NA
INGESTÃO ALIMENTAR.
CAMPINAS
2015
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
CAROLINE COSTA MESQUITA
ESTUDO DA VARIAÇÃO CIRCADIANA DA UPR NO
HIPOTÁLAMO E SUAS IMPLICAÇÕES NA
INGESTÃO ALIMENTAR
Tese apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, para obtenção do título de Doutora em Farmacologia.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINE COSTA MESQUITA E ORIENTADA PELO PROF. DR. GABRIEL FORATO ANHÊ.
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2015
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Mesquita, Caroline Costa,
M562e MesEstudo da variação circadiana da UPR no hipotálamo e suas implicações na ingestão alimentar / Caroline Costa Mesquita. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
MesOrientador: Gabriel Forato Anhê.
MesTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
Mes1. Resposta a proteínas não dobradas. 2. Hipotálamo. 3. Ingestão de alimentos. 4. Glucocorticoides. I. Anhê, Gabriel Forato,1980-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: A study about the circadian variation of UPR at the hypothalamus and
its consequences in food intake
Palavras-chave em inglês:
Unfolded protein response Hypothalamus
Eating
Glucocorticoids
Área de concentração: Farmacologia Titulação: Doutora em Farmacologia Banca examinadora:
Gabriel Forato Anhê [Orientador] Roger Frigério Castilho
André Almeida Schenka Luciana Chagas Caperuto
Carla Roberta de Oliveira Carvalho
Data de defesa: 15-05-2015
Programa de Pós-Graduação: Farmacologia
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
vii
MESQUITA, C.C. Estudo da variação circadiana da UPR no hipotálamo e suas implicações na ingestão alimentar 2015. Tese de Doutorado [Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil, 2015].
RESUMO
Os ritmos circadianos de ingestão alimentar se estabelecem com objetivo de manter a homeostasia de nutrientes no meio celular, frente a variações intrínsecas ao ciclo claro/escuro. Neste sentido, a gliconeogênese de roedores é suprimida no período noturno, no qual há ocorrência de um surto alimentar bifásico que compreende aproximadamente 90% de todo o aporte calórico diário. Estes eventos apresentam, entre si, uma relação causal, onde o próprio aumento dos nutrientes circulantes, principalmente a glicose, controla a gliconeogênese. O padrão inverso é observado na fase clara do ciclo claro/escuro. Recentes estudos têm demonstrado que, a ativação farmacológica de vias da
Unfolded Protein Response (UPR), no sistema nervoso central, resulta em resistência à
ação anorexigênica da insulina e, consequentemente, aumento da ingestão alimentar através de um mecanismo não completamente esclarecido. A UPR é uma resposta celular adaptativa que atenua a taxa de tradução de mRNAs, aumenta a proteólise e, deste modo, recupera o fenótipo celular. Esta reposta, quando ativada cronicamente, pode resultar em morte celular programada e resistência à insulina. No entanto, ainda não estava claro se a via do ATF6 da UPR tem, de fato, uma relação com o ritmo alimentar. Para responder a esse questionamento, realizamos análises da variação circadiana das proteínas envolvidas na via da UPR, imunoprecipitações com animais adrenalectomizados, e aplicação de dexametasona subcutânea. Os resultados demonstram que o ATF6 teve um aumento noturno atingindo o máximo de transição da fase clara para fase escura. A partir desse fato, foram realizados ensaios de imunuprecipitações em ratos adrenalectomizados para evidenciar as associações dos complexos CRTC2/ATF6 e CRTC2/CREB1. Contudo, nossos dados suportam a hipótese que os níveis fisiológicos de glicocorticóides podem reprimir a expressão CRH e estimular a ingestão de alimentos, através de uma via dependente de ATF6. Estes eventos, por consequência, poderão reduzir a atividade transcricional do CREB1, sobre o CRH, corroborando com os dados da literatura que apontam que os glicocorticóides endógenos dos roedores (principalmente a corticosterona) exercem um conhecido papel no controle da ingestão alimentar, decorrente principalmente da modulação da expressão do neurotransmissor anorexigênico CRH.
Palaves-chaves: Unfolded Protein Response (UPR), hipotálamo, glicocorticóides, e ingestão alimentar.
ix
MESQUITA, C.C. A study about the circadian variation of UPR at the hypothalamus and its consequences in food intake. 2015. Doctoral Thesis [Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, São Paulo, Brazil, 2015].
ABSTRACT
The circadian cycles of food intake have an important role in the homeostasis of cellular environment, acting over intrinsic changes to the sleep/wake cycle. Therefore, mice gluconeogenesis is suppressed at night where a food outbreak, responsible by 90% of all daily caloric ingestion, occurs. These events are connected by a causal relation, where the current nutrient increasing, mostly glucose, controls gluconeogenesis. The oppose pattern is verified during the light stage of the sleep/wake cycle. Recent studies have indicated that pharmacological activation of Unfolded Protein Response (UPR) pathways, at central nervous system, implies in resistance to the anorectic insulin effect, and, consequently, increase of the food intake activity trough a not fully explained engine. UPR is an adaptive cellular response that reduces mRNA’s transcriptional rate, increases proteolysis, and therefore, restores cellular phenotype. This response, when constantly enabled, may induce cellular death and insulin resistance. However, it was not clear yet if the UPR’s ATF6 pathway has, indeed, a connection with the feed rhythm. To answer to this question, we did several analysis of the circadian variation of the proteins connected to the UPR’s pathway, adrenalectomized animals immunopreciptations and subcutaneous dexamethasone applications. The results demonstrated that ATF6 has a nightly increase and has reached the maximum of transcription rate from the light to the dark cycle. From this point, it was made immunopreciptations tests in adrenalectomized mice to evidence the association between CRTC2/ATF6 and CRTC2/CREB1 complexes. However, our data support the hypothesis that the physiological levels of glucocorticoids may suppress CHR expression and stimulate food intake trough an ATF6 dependent pathway. Those events, therefore, may reduce CREB1’s transcriptional activity, confirming other studies data that indicates that endogenous mice glucocorticoids (mainly corticosterone) play an well-known role in food intake control, mainly due from modulation of the expression of the anorectic neurotransmitter CRH.
Key-words: Unfolded Protein Response (UPR), hypothalamus, glucocorticoids, and food intake.
xi SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO...01
1.1. RETICICULO ENDOPLAMÁTICO...01
1.2. VIAS DE ATIVAÇÃO EM RESPOSTA AO ESTRESSE CELULAR...02
1.3. SENSORES DO ESTRESSE DO RETÍCULOENDOPLASMÁTICO...04
1.3.1.PROTEÍNA CINASE RESIDENTE NO RETICULO ENDOPLASMÁTICO SEMELHANTE À PKR – PERK...04
1.3.2.FATOR DE TRANSCRIÇÃO 6 – ATF6...05
1.3.3.PROTEÍNA CINASE DEPENDENTE DE INOSITOL – IRE1...06
1.4.RITMOS CIRCADIANOS E METABOLISMO...08
1.5 PAPEL DA ADRENAL NA REGULAÇÃO DA FISIOLOGIA CIRCADIANA...10
1.6 RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE DO RETICULO E O DIABETES...13
2. JUSTIFICATIVA...14
3. OBJETIVOS...16
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...16
3.1.1. EXPRESSÃO DO PERFIL CIRCADIANO DE ATF6 EM RATOS WISTAR...16
3.1.2.CIRURGIA DE ADRENALECTOMIA E CONTROLE EM RATOS WISTAR...16
3.1.3.APLICAÇÃO SUBICUTÂNEA DE DEXAMETASONA EM RATOS WISTAR.... 16
4. METODOLOGIA...17
4.1. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...17
4.2. ANÁLISE DA VARIAÇÃO CIRCADIANA DA VIA UPR...17
4.3.RITMO ALIMENTAR E ALTERAÇÕES CIRCADIANAS HIPOTALÂMICAS DO ATF6...19
4.4.ENSAIO DE IMUNOPRECIPITAÇÃO DO COMPLEXO CREB1/CRTC2...20
4.5.DOSAGEM DE CORTICOSTERONA...22
4.6.RELAÇÃO ENTRE PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ADRENOCORTICOIDES E INGESTÃO ALIMENTAR E VARIAÇÃO CIRCADIANA DO ATF6...22
4.7. EXPRESSÃO CIRCADIANA DO mRNA CRH...24
4.8.EFEITO AGUDO DA APLICAÇÃO DE DEXAMETASONA SUBCUTÂNEA...24
4.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA...25
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...26
5.1. ANÁLISE DA VARIAÇÃO CIRCADIANA DA VIA UPR...26
5.2.RITMO ALIMENTAR E ALTERAÇÕES CIRCADIANAS HIPOTALÂMICAS DO ATF6...32
5.3. IMUNOPRECIPITAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE CREB1/CRTC2...33
5.4. DOSAGEM DE CORTICOSTERONA...35
5.5.RELAÇÃO ENTRE PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ADRENOCORTICOIDES E INGESTÃO ALIMENTAR E VARIAÇÃO CIRCADIANA DO ATF6...35
xii
5.7. EFEITO AGUDO DA APLICAÇÃO DE DEXAMETASONA SUBCUTÂNEA...43 6. CONCLUSÃO...49 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...50
xiii
Não sei se a vida é curta ou longa para nós, mas sei que nada do que vivemos tem sentido, se não tocarmos o coração das pessoas. Muitas vezes basta ser: colo que acolhe, braço que envolve, palavra que conforta, silencio que respeita, alegria que contagia, lágrima que corre, olhar que acaricia, desejo que sacia, amor que promove.
E isso não é coisa de outro mundo, é o que dá sentido à vida. É o que faz com que ela não seja nem curta, nem longa demais, mas que seja intensa, verdadeira, pura enquanto durar. Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.
xiv
Somewhere over the rainbow Way up high And the dreams that you dreamed of Once in a lullaby ii ii ii Somewhere over the rainbow Blue birds fly And the dreams that you dreamed of Dreams really do come true ooh ooh
Someday I'll wish upon a star Wake up where the clouds are far behind me ee ee eeh Where trouble melts like lemon drops High above the chimney tops thats where you'll find me Somewhere over the rainbow blue birds fly And the dream that you dare to, why, oh why can't I?
Well I see trees of green and Red roses too I'll watch them bloom for me and you And I think to myself What a wonderful world Well I see skies of blue and I see clouds of white And the brightness of day I like the dark and I think to myself What a wonderful world
The colors of the rainbow so pretty in the sky Are also on the faces of people passing by I see friends shaking hands Saying, "How do you do? " They're really saying, I... I love you I hear babies cry and I watch them grow They'll learn much more Than we'll know And I think to myself What a wonderful world (w) oohoorld
Someday I'll wish upon a star Wake up where the clouds are far behind me Where trouble melts like lemon drops High above the chimney top that's where you'll find me Oh, Somewhere over the rainbow way up high And the dream that you dare to, why, oh why can't I
xv
Dedico este trabalho aos meus pais, Nete e Antônio Paulo, meus irmãos, Antônio Paulo Jr e Luis Henrique, meu companheiro André, e ao meu amigo Danilo por toda compreensão, suporte e amor. Minha eterna gratidão.
xvi
Epígrafe “Se enxerguei mais longe, foi porque me apoiei sobre os ombros de gigantes.” Isaac Newton
xvii
AGRADECIMENTOS
Acredito que grandes pessoas são e foram responsáveis pelos ensinamentos adquiridos ao longo da minha vida, sou um pouco de cada uma delas! Sendo assim, não posso deixar de agradecer a todos que passaram pela minha vida e contribuíram na formação da pessoa e profissional que sou hoje e que estão sempre presentes nos meus pensamentos. Em especial, gostaria de agradecer:
Aos meus pais, que me proporcionaram o aprendizado, mostrando o valor da luta, da perseverança e do amor. Obrigada por acreditarem em mim e por serem pais maravilhosos! Aos meus grandiosos irmãos, pelo carinho e compreensão mesmo à distância vocês sempre se fizeram presente. Tenho muito de vocês em mim!
Ao meu amor, meu melhor amigo André que durante esses anos permaneceu sempre ao me lado me incentivando e apoiando em todas as decisões. Obrigada por me fazer sentir que o amor é o lar. Minhas conquistas sempre trazem muito de ti!
Ao meu orientador Gabriel Forato Anhê, pela imensa paciência ao longo deste último, pela sua competência em analisar e interpretar os resultados, pela ajuda incansável, pelos esclarecimentos e auxílio científico em relação à via UPR todos esses processos foram essenciais para a realização deste trabalho. Por me dar apoio, orientação e instrumentos para concluir esta importante etapa sem deixar para trás oportunidades que surgiram ao longo do caminho. Meu sincero agradecimento!
Ao Prof. Lício Velloso, que durante a formação do laboratório nos acolheu de forma generosa. Obrigada Professor!
Aos colaboradores Ernani Uchoa e Maria Valci do departamento de Fisiologia da faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por toda assistência técnica na execução da cirurgia adrenalectomia e acolhida.
xviii
Ao meu irmão ‘não-biológico’ Danilo pela amizade incondicional e companheirismo em todos o momentos de dificuldade tornando o percurso mais emocionante. Sei que sempre poderei contar com você, Valeu meu irmão-amigo!
Agradeço especialmente aos amigos Ana Paula, Carol Solon, Danilo, Thyelle pela realização de experimentos que fizeram parte deste trabalho, pelas exaustivas horas de trabalho durante toda a madrugada, compartilhamento de músicas de extremo bom gosto, risadas compartilhadas e por muitas vezes ao longo deste ano compreenderam minha ausência e distância necessárias para conclusão deste trabalho.
A todos os integrantes e ex-integrantes do laboratório, vizinhos e amigos que contribuíram para realização desta etapa, sendo pelo bom convívio, pela disponibilidade no uso de equipamentos, empréstimo de reagentes, e compartilhamento de ideias nos momentos de aperto.
Gostaria de agradecer também a todos os professores que fizeram parte da banca de qualificação pela colaboração e compreensão na construção deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos aos Profº. Edson Antunes, Profª. Sisi, Profº. Roger Castilho. Agradeço também àqueles que participaram indiretamente da realização deste trabalho, todos os funcionários envolvidos, professores, secretários, setor de informática e manutenção. Em especial quero agradecer à Bruno, Maísa, Sr, Miguel, Sr Toninho, e Sr. Aguinaldo que sempre com muita delicadeza, profissionalismo e alegria colaboraram na execução deste trabalho.
Agradeço aos recursos financeiros da Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP), conselho nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) e da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) pela concessão de bolsa durante o período que estive matriculado no mestrado e no doutorado.
xix
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Estresse do Retículo Endoplasmático...02
Figura 02. Ativação da via UPR – PERK ...05
Figura 03. Ativação da via UPR – ATF6...06
Figura 04. Ativação da via UPR – IRE1...07
Figura 05. Demonstração do fotoperíodo claro-escuro em relação à escala Zeitgeber...09
Figura 06. Zeitgeber em que os animais foram eutanasiados ...18
Figura 07. Horários da eutanásia em relação à escala Zeitgeber ...20
Figura 08. Alterações circadianas hipotalâmicas pPREK ...27
Figura 09 Alterações circadianas hipotalâmicas ATF4...28
Figura 10. Alterações circadianas hipotalâmicas CHOP...29
Figura 11. Alterações circadianas hipotalâmicas GADD34...30
Figura 12. Alterações circadianas hipotalâmicas ATF6...31
Figura 13. Variação Circadiana x Ritmo Alimentar ...32
Figura 14. Associação do complexo CREB1/CRTC2 em hipotálamo de ratos...34
Figura 15. Análise de corticosterona plasmática em SHAM e ou adrenalectomia...35
Figura 16. Análise da ingestão alimentar no hipotálamo de animais submetidos à cirurgia...36
Figura 17. Análise das alterações circadianas hipotalâmicas SHAM e ou adrenalectomia...38
Figura 18. Imunoprecipitação em hipotálamo de ratos submetidos à cirurgia...40
Figura 19. Expressão circadiana do CRH em hipotálamo de ratos SHAM ou adrenalectomia...42
Figura 20. Repercussão na ingestão alimentar após aplicação de dexametasona...44
Figura 21. Expressão do CRH em hipotálamo de ratos submetidos à dexametasona subcutânea...45
Figura 22. Expressão do ATF6 no hipotálamo de ratos submetidos a aplicação de dexametasona...46
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS ADX – Adrenalectomia
ASK1 – do inglês, Apoptosis signal-regulating kinase 1 AMPc – Adenosina monofosfato cíclica
ATF4 – do inglês, Activated transcription factor 4 ATF6 – do inglês, Activated transcription factor 6 ATP – Adenosina trifosfato
CREB – do inglês, cAMP responsive element binding protein CRH – do inglês, corticotropin releasing hormone
CRTC2 – do inglês, CREB regulated transcription coactivator 2 BiP – do inglês, immunoglobulin binding protein
CHOP – do inglês, CCAAT/Enhancer-binding protein homologous protein DEXA – Dexametasona
DM – Diabetes Mellitus
DMT2 – Diabetes Mellitus tipo II DNA – Ácido desoxirribonucleico
eIF2-α – do inglês, Eukaryotic translation-initiation factor 2 alpha ERAD – Sistema de degradação associado ao RE
G6Pase – Glicose-6-fosfatase
GADD34 – do inglês, Growth arrest and DNA damage inducicle gene GCN2 – do inglês, General control nonrepressed 2
GADD153 – do inglês, Growth arrest–DNA damage gene Grp78 – do inglês, Glucose-regulated protein-78
IRE1 – do inglês, Inositol-requiring protein 1 IRS1 – do inglês, Insulin receptor substrate JNK – do inglês, c-Jun-N-terminal kinase kDa – kilodalton
mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro NSQ – Núcleo supraquiasmático
PEPCK – do inglês, Fosfoenol-piruvato-carboxiquinase PERK – do inglês, PKR-like ER kinase
PHG – Produção de Glicose Hepática
PKR – do inglês, RNA like endoplasmic reticulum kinase RE – Retículo endoplasmático
RNA – Ácido ribonucleico
RT-PCR – Reação da polimerase em cadeia com transcriptase reversa S1P – do inglês, Site-1-proteases
S2P – do inglês, Site-2-proteases SHAM – Cirurgia Controle
SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida SNC – Sistema Nervoso Central
TRAF2 – do inglês, Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 TRB3 – do inglês, Tribbles related protein 3
UPR – do inglês, Unfolded Protein Response XBP1 – do inglês, X-box-binding
1 1 INTRODUÇÃO
1.1 Retículo Endoplasmático
O retículo endoplasmático (RE) é uma organela complexa tanto em termos de estrutura quanto de função. Ela exerce um papel crítico em uma vasta gama de processos incluindo síntese, dobramento e modificação das proteínas (1) e ainda processa a biossíntese de aproximadamente um terço das proteínas em células eucarióticas, além de conter a maior concentração de íons Ca2+ dentro da célula, devido ao transporte ativo de íons de Ca2+ por cálcio ATPases (1, 2).
O retículo endoplasmático é dividido em duas estruturas distintas quanto as suas formas e funções: Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) e Retículo Endoplasmático Liso (REL). O primeiro é composto por ribossomos que são responsáveis pela síntese e secreção proteica. Já o segundo é livre de ribossomos e, desta forma, não participa do mecanismo de síntese de proteínas, no entanto, é importante para a síntese de ácidos graxos e fosfolipídeos, metabolização de carboidratos, montagem da camada bilipídica e regulação da homeostase do cálcio (3).
Essa organela caracteriza-se como um ambiente único para dobramento de proteínas oxidativas e modificação após o processo de tradução de polipeptídios que serão destinados à membrana plasmática, organelas intracelulares ou ambiente extracelular (4).
As proteínas recém-sintetizadas no lúmen do RE rugoso passam pelo processo de dobramento e montagem através do auxílio de chaperonas moleculares como, por exemplo, a Bip (binding Ig protein), além de mediadores adicionais para o processo de dobramento de proteína que catalisam a formação de pontes de dissulfeto, a glicosilação e conformação apropriada das proteínas, permitindo assim que apenas proteínas dobradas corretamente sejam transportadas para o aparelho de Golgi (4, 5).
As proteínas não dobradas adequadamente são retidas no interior do RE. Havendo acúmulo excessivo de proteínas, há um recrutamento de chaperonas, que possuem a finalidade de normalizar as alterações celulares e reestabelecer a homeostase de proteínas mal dobradas. Caso o acúmulo não seja normalizado, a proteínas mal dobradas são transportadas para o citoplasma através do mecanismo de degradação ER-associado (ERAD) e degradadas pela proteossoma (6).
2
Recentes estudos demonstram que a formação de proteínas mal dobradas e desdobradas tem impactos relevantes na incidência de diversas patologias tais como: diabetes, inflamação, e doenças neurodegenerativas, a exemplo da doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença bipolar, conhecidas também como "doenças conformacionais" (6).
1.2 Vias de Ativação em Resposta ao Estresse Celular.
O processo de dobramento no lúmen do reticulo é muito sensível e pode ser comprometido por insultos patológicos, sendo possível: infecções virais, toxinas ambientais e citocinas inflamatórias.
Figura 01: Existem diversas causas de estresse RE, uma delas é a sobrecarga da proteína. O estresse do RE habilita um mecanismo de adaptação denominado Unfolded Protein Response (UPR) que, por sua vez possui duas saídas: 1) homeostase (verde) e 2) apoptótico (vermelho). A primeira saída leva à resolução do estresse RE, enquanto a segunda saída de apoptose é resultante ao mecanismo da UPR insuficiente, favorecendo a ativação de pró-apoptótica.
O dobramento das proteínas pode ser afetado ainda por processos fisiológicos, tais como o acúmulo de grandes quantidades de proteínas imaturas no RE ocasionado por um excesso de nutrientes que estimulam, por exemplo, a produção da insulina (Figura 01). Quando há excesso de proteínas localizadas no reticulo ocorre sobrecarga da capacidade de dobramento, condições
3
essas que alteram a homeostase do RE e comprometem seu adequado funcionamento, gerando um estado conhecido como estresse do reticulo endoplasmático que, em resposta celular ao estresse, ativa um mecanismo adaptativo a proteínas desdobradas chamado de Unfolded Protein
Response, a UPR (1, 7).
O acúmulo de proteínas desdobradas (unfolded protein) ou mal dobradas (misfolded
protein) no lúmen do RE desencadeia a UPR, que age para aliviar o estresse do RE por meio de
três mecanismos, sendo eles: (a) aumento da capacidade de dobramento, (b) redução da taxa tradução geral proteínas, e (c) promoção da degradação de proteínas mal formadas (8).
Durante a UPR, são sentidas perturbações na homeostase do RE que, ao serem traduzidas para o citoplasma e núcleo celular, causam uma resposta compensatória. Diversas proteínas agem como sensores neste processo, estas proteínas possuem domínio transmembrânico, ou seja, possuem um domínio luminal e outro citoplasmático funcionando, desta forma, como um sinalizador da função reticular, sendo capaz de identificar proteínas mal dobradas tanto no citosol, quanto no lúmen do RE, detectando assim qualquer aumento na concentração de proteínas mal dobradas (1, 9).
Em princípio, a UPR tem por objetivo reestabelecer o funcionamento normal do RE, dispondo de múltiplas estratégias que agem ora simultaneamente, ora sequencialmente.
Um exemplo destas estratégias é a expressão de uma família de proteínas conhecidas como chaperonas, que abrangem a GRP78 (Glucose-regulated protein-78) uma proteína que utiliza ATP para promover o dobramento e evitar a agregação de proteínas no lúmem do RE e, dessa forma, agir como sinalizadoras da função reticular. (10) Além disso, a quantidade de proteína em trânsito no RE é reduzida pela inibição de proteína temporária na via de transdução (1, 9).
No entanto, se a resposta adaptativa ao excesso de proteínas mal dobradas não for suficiente para evitar a morte celular, o estresse do RE conduz à apoptose, através da ativação do sistema de degradação associado ao RE (ERAD) que, por sua vez, reduz as falhas no dobramento de proteínas (10).
A literatura descreve três ramos da sinalização da UPR, sendo eles: PERK (protein kinase RNA (PKR)-like ER kinase), ATF6 (Activated transcription factor 6) e IRE1
4
autofosforilação-luminal mediada pelo domínio citoplasmático (8). Por outro lado, o ATF6 sofre PIR (proteólise intramembranar regulada), resultando na acumulação de fragmentos clivados de domínios citoplasmáticos que entram no núcleo a fim de regular a transcrição de gene. A ativação inicial dos três sensores tem se apresentado como dependente da dissociação da GRP78, em resposta ao estresse do RE (11). No próximo capítulo, serão analisados aspectos gerais dos sensores e a sua relação com os vários aspectos do metabolismo celular.
1.3 Sensores do Estresse do Retículo Endoplasmático.
1.3.1 Proteína Cinase Residente no Reticulo Endoplasmático semelhante à PKR – PERK.
No estado basal, as três proteínas de sinalização da UPR são inibidas pela ligação da chaperona Grp78 (BIP) (10). O recrutamento da Grp78, pelas proteínas desdobradas, libera a atividade da PERK, ATF6 e IRE1, que desencadeiam eventos inicialmente relacionados à adaptação da célula ao distúrbio no funcionamento do RE, mas que também podem desencadear a execução por apoptose (12).
O ramo da sinalização que se inicia com a ativação da PERK (Figura 02) é o primeiro evento disparado pela UPR. A PERK é uma cinase seril-treonil que, quando dissociada da Grp78, homodimeriza-se e induz, por autofosforilação, a ativação de seu domínio cinase. A proteína-alvo da PERK é o fator de iniciação eIF2α, que se inativa por fosforilação. Assim, o resultado da ativação da PERK na UPR é a inibição generalizada da taxa de tradução de mRNA e, consequentemente, a redução do aporte de proteínas no RE (13, 12).
Embora seja observada uma redução geral da taxa de tradução, certos mRNAs ganham uma vantagem seletiva para a tradução nestas condições, a exemplo do fator de transcrição ATF4. O ATF4 é um fator de transcrição que modula a expressão de diversos genes relacionados à UPR, dentre eles CHOP e XBP-1. É importante ressaltar que neste ponto da UPR não há aumento do conteúdo proteico de CHOP, pois a taxa de transcrição celular está reduzida (13).
Neste contexto, o mecanismo que é relativamente mais conhecido até o presente momento é o da integração da via que resulta na fosforilação do eiF2α e aumento da expressão do ATF4. Como mencionado anteriormente, quando é manifestado estresse no RE esta via é ativada
5
pela PERK. No entanto, quando ocorre, por exemplo, carência de aminoácidos esta mesma via é ativa por uma proteína conhecida com GCN2. Ainda, quando a célula é exposta a um agente viral com RNA dupla fita esta mesma via é ativa pela PKR, resultado assim, em adaptações celulares a diferentes variações ambientais que são potencialmente adversas (14, 15).
Figura 02: Ativação da via UPR. PERK atua na fosforilação da proteína eIF2α, levando à inibição de eventos traducionais e simultâneo aumento seletivo da tradução do fator de transcrição ATF4 que induz a expressão de genes envolvidos na ativação da via UPR.
1.3.2 Fator de Transcrição 6 – ATF-6
O ATF6 é um fator de transcrição transmembrânico que, em situações basais, encontra-se voltado para o lúmen do retículo. Quando encontra-se configura um cenário de stress no RE, o ATF6 sofre PIR (Proteólise Intramembranar Regulada) (Figura 03 dissociando-se da Grp78 e disparando um mecanismo de ativação distinto do anteriormente descrito). O ATF6 transloca-se a partir do RE para o aparelho de Golgi, onde é clivado por proteases de serina residentes S1P e S2P (proteases, local 1 e local 2). Essa clivagem produz um domínio citoplasmático livre e libera o fator de transcrição ativo no citosol (p50 kDa ATF6) que transita fragmentos para o núcleo, resultando na ativação de genes alvo da UPR como GRP78, CHOP e XBP1 (16).
6 Figura 03: Ativação da via UPR. ATF6 é ativado após clivagem e migração até o aparelho de Golgi, onde é liberado na sua forma citoplasmática e tem como principal função induzir um aumento da expressão de XBP-1.
1.3.3 Proteína Cinase Dependente de Inositol – IRE1
A participação imediata da IRE1 (Figura 04) na UPR reside em sua atividade endonucleásica e, a exemplo da via PERK, tem um resultado final reparador que visa adaptar a célula ao acúmulo de proteínas mal dobradas. Após sua ativação, esta enzima processa uma região do mRNA do fator de transcrição XBP-1 (X Box Protein 1) que fora previamente transcrito pela ação do ATF4 e ATF6. Este mRNA processado origina uma proteína com maior atividade transcricional. O XBP-1, num primeiro momento, induz a expressão de genes relacionados ao aumento do processamento de proteínas acumuladas no RE e à ERAD.
Esta ação do XBP-1 é, em última análise, a derradeira tentativa corretiva da UPR. Caso as ações citadas anteriormente não garantam a retomada da homeostasia no RE e se a ativação da IRE1 persistir, o XBP-1 oriundo de seu processamento alternativo induz, tardiamente, a transcrição do gene da proteína p58kip. Esta última exibe notável atividade inibidora sobre a PERK, liberando, desta forma, a tradução de diversos mRNAs que se acumularam na célula
7
durante a UPR, inclusive o do CHOP, que desempenha um papel determinante na apoptose desencadeada pela UPR (17).
Outro evento da UPR que resulta em morte celular também decorre da ativação persistente da IRE, mas que é independente de sua atividade endoribonucleásica. A permanência da IRE-1 em sua forma fosforilada resulta no recrutamento da proteína TRAF2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2) e ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1). A formação deste complexo resulta na ativação da proteína JNK (18). Nos últimos anos se demonstrou um papel fundamental da JNK na morte celular, inclusive na que ocorre na célula β pancreática durante a história natural do Diabetes Mellitus tipos 1 e 2, e também na resistência à insulina em tecidos periféricos, este último efeito depende de sua capacidade de fosforilar o IRS1 em resíduos seril e, desta maneira, impedir a transmissão do sinal intracelular da insulina (19, 20).
Além de sua participação em tecidos periféricos e em ilhotas pancreáticas, estudos recentes demonstram que a ativação da UPR no sistema nervoso central resulta em resistência a insulina e a leptina no hipotálamo, o que leva a uma diminuição do efeito anorexigênico destes hormônios resultando em uma maior ingestão alimentar (21).
Figura 04: Ativação da via UPR. IRE1 é responsável pelo processamento do RNAm de XBP-1, levando-o à sua forma ativa que atua como fator de transcrição nuclear.
8 1.4 Ritmos Circadianos e Metabolismo
Os ritmos circadianos são uma característica crítica e proeminente das células, tecidos e órgãos, que auxiliam o organismo a executar suas funções com mais eficiência (22).
Na sociedade moderna, não é surpreendente que ocorra o desenvolvimento e/ou progressão de uma grande variedade de doenças advindas do desalinhamento entre ritmos naturais (com base no dia de 24 horas) incluindo doenças inflamatórias e metabólicas.
O relógio circadiano é um mecanismo sofisticado que tem como principal função sincronizar o sistema endógeno em um período de 24 horas. Esse processo é realizado em uma ampla variedade de organismos, desdes de organismos simples tais como fungos, até sistemas muito mais complexos, como mamíferos. Os ritmos circadianos controlam uma variedade de processos biológicos, incluindo: ciclo do sono, temperatura corporal, secreção hormonal, função intestinal, homeostase da glicose metabólica e função imunológica (22).
O ritmo biológico é regulado pelo núcleo supraquiasmático (NSQ) na região do hipotálamo. O NSQ é regulado por estímulos de células ganglionares da retina e é por este mecanismo que direciona os aspectos fisiológicos das fases clara e escura do ciclo. Os ritmos circadianos se encontram em quase todas as células do corpo, incluindo a periferia, e atuam como sincronizador do sistema imunológico, do coração, do tecido adiposo, do pâncreas e do fígado (23).
Tem sido demonstrado que a expressão dos genes relógio (clock genes) afeta diversos tecidos, desse modo, os ambientes externos interferem no alinhamento circadiano interno (24).
Os relógios circadianos (do latim circa diem - cerca de um dia) permitem a pontualidade com um período de cerca de 24h sem estímulos externos, mas são sincronizados com o tempo por meio de condições ambientais tais como luz e alimentos (chamados zeitgebers, do alemão "cronômetros") (24).
A escala ZEITGEBER (Figura 05) é utilizada para descrever variáveis rítmicas ambientais, por exemplo, a ciclo claro-escuro ambiental, sendo os valores da escala ZT que vão de 0-12 representam o período claro do ciclo (das 7h às 19h) e os valores da escala ZT que vão de 12-24 representam o período escuro do ciclo (das 19h às 7h).
9 Figura 05: Demonstração do fotoperíodo claro-escuro em relação à escala Zeitgeber.
Apenas alguns genes metabólicos são alvos diretos dos genes circadianos, esses alvos incluem muitos fatores de transcrição e alguns moduladores de transcrição e tradução. Os genes controlados pelo ciclo circadiano incluem fatores reguladores de lipídios, biossíntese do colesterol, o metabolismo de carboidratos, fosforilação oxidativa, e os níveis de glicose. A alimentação é um fator ambiental que afeta seletivamente ritmicidade circadiana no intestino e no fígado (27, 28).
Quando a alimentação ocorre em períodos incorretos, podem ser observados desalinhamentos no ciclo circadiano interno Por exemplo, restringir a alimentação na fase clara para roedores com hábito noturno resulta em desordem entre os ritmos centrais e periféricos, incluindo os localizados no fígado (29).
Estudos recentes sugerem que o cenário de desalinhamento está relacionado com ganho de peso, obesidade e disfunções metabólicas. De fato, segundo Arble, roedores que se alimentaram em horários inapropriados ganharam mais massa em comparação a animais semelhantes que foram submetidos a uma alimentação regular (30, 31). Este fenômeno também foi observado em humanos que não se alimentam logo pela manhã ou que possuíram padrões alimentares trocados entre dia e noite, resultando em maior ganho de massa frente aos que consumiram alimentos em períodos mais apropriados (32, 33).
Tanto o hábito alimentar de roedores, quanto a capacidade do fígado em liberar glicose para a circulação, variam de maneira coordenada ao longo do dia, de modo a manter um aporte constante de glicose para os tecidos vitais. Desta forma, a ingestão alimentar ocorre num padrão bifásico clássico em ratos, constituído de dois surtos que ocorrem ambos no período escuro do
10
ciclo claro/escuro de 12h/12h. De maneira contrária, a gliconeogênese é suprimida durante a noite como, principalmente, um resultado direto do aumento da glicose advinda da alimentação e da insulinemia (34). É importante ressaltar que, outros eventos, independentes do hábito alimentar predominantemente noturno, determinam esta supressão da gliconeogênese durante a ausência de luz. Um importante perfil circadiano é o aumento do tônus simpático, para o fígado, durante a noite (35). Além disto, foi demonstrado recentemente que o aumento noturno de melatonina (chamado de acrofase) ajusta este parâmetro metabólico de modo que sua ausência cause um avanço de fase antecipando a gliconeogênese para as ultimas horas do escuro (chamado de nadir) (36). Outro bom exemplo é o cortisol (equivalente à corticosterona em animais roedores), que é secretado em antifase à melatonina, ou seja, quando há o pico de melatonina (chamado de acrofase) observa-se a menor concentração plasmática de cortisol (o nadir).
O NSQ regula tanto a glândula pineal quanto o córtex da adrenal, ou seja, essa inervação simpática modula a secreção de melatonina, como também as oscilações diárias dos níveis de glicocorticoides, dessa forma os dois hormônios participam de forma sincronizada na regulação dos ritmos circadianos (37).
1.5 O papel da adrenal na regulação da fisiologia circadiana.
O NSQ possui um papel determinante na regulação do ritmo circadiano e tem sido extensivamente estudado, porém ainda temos uma compreensão limitada de como a função do relógio periférico contribui para a regulação dos processos fisiológicos, além disso, é sabido que as glândulas adrenais desempenham um papel especial neste contexto já que, os hormônios secretados por elas demonstram forte ritmicidade circadiana e influência nos processos fisiológicos (24).
A ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) começa com a liberação de CRH pelo PVN no hipotálamo. O CRH é liberado na circulação sanguínea porta-hipofisária e estimula a secreção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) na circulação sanguínea geral, que por sua vez, age estimulando a liberação de glicocorticoides (como a corticosterona) na corrente sanguínea (25).
11
Para tanto, a liberação desses hormônios possui dois mecanismos de controles e está submetida à duas alças de retroalimentação negativa principais: uma rápida e outra lenta. A alça de retroalimentação negativa rápida age diretamente no hipotálamo através da regulação da expressão de RNA mensageiro para CRH e VP, resultando na inibição da síntese e liberação de ACTH, dura 5-10 minutos. Enquanto que a alça de retroalimentação negativa lenta ocorre na adeno-hipófise e atua através da redução da expressão de RNA mensageiro para o precursor de ACTH e pode persistir por até 4 horas (26).
A glândula adrenal é um relógio circadiano periférico que modula o ritmo circadiano de glicocorticoides. Esta regulação ocorre através da interação entre relógio periférico e mestre, localizado no núcleo supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo. Os ritmos dos glicocorticóides estão envolvidos na adaptação de respostas ao estresse (Jetlag e trabalho em regime de turnos), modulação imunológica e cognitiva, participando inclusive da coordenação do consumo/gasto energético e adaptação ao ambiente externo (38, 24).
Nesse contexto, estudos evidenciam que ratos com a função de relógio desajustada desenvolveram, com maior frequência, distúrbios metabólicos. A regulação do relógio circadiano está ligada a diversas vias do metabolismo energético e, potencialmente, relacionada ao desenvolvimento de doenças, tais como: obesidade, diabetes e dislipidemia (39, 40).
No interior do sistema nervoso central (SNC), o hipotálamo é o centro de detecção e regulação do estado nutricional. Embora a importância da detecção hipotalâmica de glicose para a homeostasia do nutriente seja clara, os mecanismos de ligação da glicose que incorrem em alterações na expressão dos genes, ainda permanecem fracamente definidos na literatura (41).
Conforme descrito por Lerner e colaboradores, o elemento de ligação de proteína em resposta ao AMP cíclico (CREB1) o coativador transcricional 2 de atividade regulada de CREB (CRTC2) exercem um papel fundamental na manutenção da homeostase da glicose, verificado no fígado. É apontada também, a expressão do CRTC2 em uma série de regiões do SNC, inclusive no hipotálamo (41).
A ativação do CRTC2 é um processo que exerce uma função fundamental no equilíbrio da glicose, em resposta ao estado de jejum que, desta forma, inicia a programação gliconeogênica, no fígado (42, 43,44).
12
Durante o período de jejum é secretado, pelo pâncreas, o hormônio glucagon que, atuando no fígado, ativa o CREB1 e seu coativador CRTC2. No período de jejum, há aumento da circulação de glucagon pancreático que estimula a programação gliconeogênica através da sinalização de AMPc, resultando em estímulo da atividade do CRTC2 através da sua desfosforilação, e posterior migração para o interior nuclear que, por sua vez, aumenta a associação com CREB1 nos elementos responsivos específicos dos genes gliconeogênicos tais como glicose-6-fosfatase (G6Pase) e fosfoenol-piruvato-carboxiquinase (PEPCK) (39, 41).
Por outro lado, durante o processo de alimentação, a insulina inativa o coativador CRTC2 por meio de fosforilação e exportação nuclear. Sendo assim, o CRTC2 regula de forma adaptativa o metabolismo energético no fígado (39).
Pesquisadores demonstraram que, frente a um estresse de retículo endoplasmático induzido por tapsgargina (um inibidor específico e irreversível das bombas de Ca 2+ SERCA) ou um antibiótico isolado de Streptomyces lysosuperficus (caracterizado como uma substância inibidora da proliferação de bactérias, fungos e leveduras) há um aumento da expressão dos genes do estresse, por exemplo, o ATF6, resultando em um aumento da associação CRTC2/ATF6 e uma redução na associação CREB1/CRTC2, repercutindo na diminuição de genes gliconeogênicos. Neste cenário, o aumento do estresse de retículo desencadeia desfosforilação do CRTC2 que atua como sensor duplo, tanto no estresse de retículo, como na sinalização hepática durante o período de jejum (45). Deste modo, estes autores descreveram que, a associação do CRTC2 com o ATF6 impede que o complexo CRTC2/CREB1 seja formado. Deste modo a formação do complexo CRTC2/ATF6 deve ser inversa a do CRTC2/CREB1.
É sabido que a fosforilação do CRTC2 hipotalâmico em condições basais e a localização subcelular sofrem alterações por consequência do estado nutricional. O CRTC2 fosforilado é, posteriormente, sequestrado no interior do citoplasma e desfosforilado, em resposta aos sinais do AMPc e transportado para o núcleo, que por sua vez associa-se com CREB1 ativa elemento AMPc-resposta (CRE) (41).
Ainda em relação ao CREB1 e seu coativador CRTC2, estudos recentes evidenciaram que o CRTC2 é necessário para a ativação transcricional do gene hormonal de liberação de corticotropina (CRH) e a regulação do gene CRH é dependente da ativação AMPc, que participa da via de sinalização da proteína quinase A (PKA) (46).
13
A evidência descrita acima sugere que a ativação da transcrição do CRH demanda a presença de um coativador CREB1 que, por sua vez, necessita um AMP cíclico para sua ativação. Estudos recentes têm confirmado esta premissa e fornecido evidências significativas que o referido papel de co-ativador pode ser desempenhado pelo CRTC2.
1.6 Relação entre Estresse do Reticulo Endoplasmático e o Diabetes Mellitus Tipo 2
O diabetes mellitus (DM) é considerado uma patologia multifatorial, associada à obesidade, à dislipidemia, à disfunção endotelial, à inflamação e à hipertensão (47). O diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) é uma das doenças mais comuns no mundo desenvolvido sendo considerada um problema de saúde global (48).
A resistência à insulina periférica, a disfunção da produção hepática de glicose (PHG) e a secreção de insulina inadequada são processos característicos do DMT2. Além dos processos supracitados, esta doença envolve alterações na sinalização da insulina, elevando as concentrações dos marcadores de estresse do retículo endoplasmático (RE), tais como GRP78, XBP1s, sendo detectados no fígado e no tecido adiposo de indivíduos obesos resistentes à insulina (49,50).
Há uma grande evidência de que a falência e insuficiência das células-β ocorre em decorrência ao estresse do RE não corrigido, levando à crônica e/ou forte ativação dos sinalizadores da função reticular como PERK, IRE1 e ATF6 observados no diabetes tipo 2 (51).
O fígado é um órgão singular quanto à capacidade de controlar o metabolismo de carboidratos. Esta característica advém do fato deste órgão apresentar capacidade tanto de captar quanto de liberar glicose para a circulação, de acordo com a demanda nutricional do organismo. De maneira geral, a produção hepática de glicose (PHG) é determinada pela taxa de glicogenólise e gliconeogênese. As evidências acumuladas nos últimos 60 anos demonstram que, além do controle direto da PHG pela glicose, este fenômeno é modulado por hormônios conhecidos como contrarreguladores da ação da insulina e pela própria insulina (52).
14 2 JUSTIFICATIVA
Recentemente, nosso grupo demonstrou que certas vias de sinalização da UPR apresentam uma variação circadiana no território hepático (36). Dentre várias descobertas experimentais, demonstramos que a via que resulta em aumento da expressão do ATF4 apresenta um perfil crescente a partir do início da fase clara que coincide com baixa ingestão alimentar. Outras vias próprias da UPR passam a apresentar variação circadiana no fígado somente quando o animal é suprimido de produção endógena de melatonina (36).
Paralelo a isto, foi descrito que a ativação do estresse de RE no hipotálamo com indutores químicos (tapsigargina) gera, além de aumento de ingestão alimentar, resistência hepática à ação da insulina (45). De maneira geral, sabe-se que o núcleo supraquiasmático, uma região do hipotálamo, é conhecido por funcionar como um relógio endógeno que modula vários aspectos fisiológicos ao longo do ciclo claro escuro (46).
Apesar deste achado, ainda não se sabe se existe uma variação circadiana hipotalâmica da UPR e se isto tem alguma implicação na ingestão alimentar. Além disso, até o presente momento não há elucidações claras sobre o papel do ATF6 hipotalâmico no controle do comportamento alimentar e sua possível relação com o CRTC2 como uma componente chave na oscilação circadiana.
Os glicocorticoides, tais como a corticosterona são hormônios da classe esteroidal secretados pelo córtex adrenal que exercem, principalmente, funções metabólicas e imunológicas. A síntese dos hormônios adrenocorticais é realizada a partir da molécula do colesterol.
Os glicocorticoides também têm um papel importante no comportamento alimentar. Estudos comprovam que o aumento no nível de glicocorticoides estimula a ingestão alimentar e a expressão do ATF6 em tecidos não neuronais (39).
Já existem relatos na literatura de que o perfil rítmico da corticosterona, presente em roedores, apresenta elevações circadianas no final da fase clara do ciclo claro/escuro, antecedendo, assim, o surto alimentar (31).
Considerando o acima exposto, a hipótese do nosso trabalho foi avaliar a participação dos glicocorticóides na ritmicidade das associações CRTC2/ATF6 e CREB1/CRTC2 no hipotálamo e sua relação com a ingestão alimentar. Para tanto, observamos o comportamento
15
destas associações na ausência de corticosterona em ratos adrenalectomizados e, ratos que receberam glicocorticóide exógeno (dexametasona).
16 3 OBJETIVO
O presente projeto tem, como objetivo geral, avaliar a ritmicidade da UPR no hipotálamo e suas relações com a ingestão alimentar, além de investigar a influência da corticosterona na regulação da expressão do CRH e na ingestão alimentar, através de mecanismos dependentes do ATF6.
3.1. Objetivos específicos
3.1.1. Expressão do perfil circadiano das proteínas envolvidas na UPR.
Avaliar o perfil da variação circadiana das proteínas envolvidas do retículo endoplasmático exposto ao ciclo claro/escuro de 12h/12h. Em especial avaliar a ritmicidade da expressão do ATF6, participante da via da UPR, se apresenta um zenith noturno em animais ad
libitum ou regime 6 refeições.
3.1.2. Cirurgia de adrenalectomia e controle em ratos wistar.
Após a determinação da acrofase da expressão ATF6, avaliar se a corticosterona endógena influencia a ritmicidade do conteúdo das proteínas ATF6, CREB1 e CRTC2, a relação entre a associação CREB1/CRTC2 e entre ATF6/CRTC2, os níveis do mRNA do CRH no hipotálamo de ratos submetidos ou a cirurgia SHAM (controle) ou adrenalectomia e analisar a ingestão alimentar.
3.1.3 Aplicação subcutânia de Dexametasa em ratos wistar.
Verificar se a participação do glicocorticoide sintético altera a ritmicidade do ATF6 hipotalâmico, a relação com a associação CREB1/CRTC2 e entre ATF6/CRTC2, a ingestão alimentar e a expressão de CRH em ratos wistar machos com hipercorticosteronemia induzida por dexametasona.
17 4 METODOLOGIA
4.1 Considerações Éticas
Este estudo foi apreciado e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Amimais (CEUA/UNICAMP), cujo projeto sob o número de protocolo 2607-01 (Apêndice A). Além disso, os animais foram fornecidos pelo Biotério Central da UNICAMP (CEMIB) e mantidos em fotoperíodo (12h claro/12h escuro) e temperatura controlada, com alimentação e água ad libitum. Em todos os protocolos experimentais, os animais apresentavam massa entre 200 e 250 gramas.
4.2 Análise da variação circadiana da via UPR.
O experimento consistiu em analisar as alterações circadianas hipotalâmicas na expressão de proteínas envolvidas no UPR em ratos expostos a um ciclo claro/escuro de 12h/12h. Os parâmetros analisados foram a expressão de proteínas ATF6, ATF4, CHOP, GADD34 e a fosforilação de PERK em hipotálamos de ratos.
Animais e Tratamentos
Para isso, o experimento foi realizado com ratos da linhagem Wistar adultos, mantidos em caixas coletivas (4 animais/gaiola) sob condições controlada 22 ± 2ºC de umidade relativa do ar por volta de 55 ± 10%, com ciclo biológico rigoroso (12:00 horas claro/12:00 horas escuro), com as luzes se acendendo às 07:00 horas e recebendo ração balanceada (Nuvital) e água ad
libitum. Esses procedimentos foram padronizados no estudo de ritmo circadiano.
Eutanásia
Os animais foram anestesiados com tiopental sódico na dose de (50mg/kg) intraperitoneal (i.p) e decapitados.
O referencial temporal utilizado para eutanásia foi a escala ZEITGEBER, que descreve variáveis rítmicas ambientais como, por exemplo, o ciclo claro-escuro ambiental. No nosso caso os valores da escala ZT de 0-12 representam o período claro e os valores da escala ZT que vão de
18
12 a 24 representam o período escuro do ciclo. Os animais foram eutanasiados nos ZT24, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 ou ZT20.
Demonstração do fotoperíodo claro-escuro em relação à escala ZT
PERÍODO CLARO PERÍODO ESCURO
Figura 06: Zeitgeber que os animais foram eutanasiados.
Imunoblotting
O tecido hipotalâmico de cerca de 1mm de diâmetro foi retirado e homogeneizado utilizando um equipamento chamado de Polytron (Kinematica. Suíça) em tampão de extração (SDS 1%, Tris (pH 7,4) 100mM, pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 100mM, EDTA 10mM, ortovanadato de sódio 100mM) e incubadas à 96ºC por 10 min. Em seguida, as amostras foram centrifugadas para a remoção do material insolúvel. Após centrifugação, parte do sobrenadante das amostras foi utilizada para determinação do conteúdo protéico por espectrofotometria com reagente Bradford (Biorad, CA, USA) e o restante foi acrescido de tampão Laemmli 5X e incubado à 96ºC por 10 min. A mesma quantidade de proteínas totais de cada amostra tratada com Laemmli foi fracionado em SDS-PAGE (2,6%C e 8-12%T) em aparelho para minigel (Mini-Protean, Bio-Rad). Após separação eletroforética, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, CA, USA). As membranas foram então bloqueadas com uma solução contendo BSA 5%, Tris-Base, NaCl e Tween-20 por 2 horas a temperatura ambiente. Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpos específicos contra ATF6, ATF4, PERK, CHOP, GADD34 por 4 horas a temperatura ambiente. Depois de marcadas com anticorpo primário, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase por 1 hora à temperatura ambiente (GE Healthcare, USA).
19
Antes da detecção, as membranas foram incubadas por 1 minuto com uma solução contendo luminol, ácido p-cumárico e H2O2 e, então, expostas durante tempos variados a filmes de raio-X. Depois de revelados, esses filmes foram submetidos à análise de densitometria óptica pelo software Scion Image (Scioncorp, NIH, USA).
4.3 Ritmo alimentar e alterações circadianas hipotalâmicas do ATF6
Esse experimento teve como objetivo avaliar se as alterações circadianas nas proteínas da UPR eram consequência direta do ritmo alimentar preferencialmente noturno. Para atingir este fim, ratos foram expostos a um regime de 6 refeições diárias distribuídas ao longo do dia com intervalos de 4 horas. O parâmetro analisado foi à expressão de ATF6, em hipotálamos de ratos.
Animais e Tratamentos
Ratos da linhagem Wistar adultos foram mantidos em caixas individuais sob condições controlada 22 ± 2ºC, umidade relativa do ar 55 ± 10%, e com ciclo biológico rigoroso (12:00 horas claro/12:00 horas escuro), com as luzes se acendendo às 07:00 horas, recebendo ração balanceada (Nuvital) e água ad libitum até a 8ª semana de vida.
Após a 8ª semana de vida, os animais foram divididos em dois grupos que passaram a receber alimentação ad libitum ou um regime de 6 refeições por dia. O regime de 6 refeições diárias consistiu em refeições de 15 minutos durante o período claro e 11 minutos durante o período escuro. Estes intervalos foram ajustados de modo que os animais pudessem ingerir a mesma quantidade de ração durante cada refeição. O momento de início das refeições foram, na escala ZEITGEBER, ZT22; ZT2; ZT6; ZT 10; ZT 14; ZT18.
Eutanásia
Após 20 dias expostos a alimentação ad libitum ou alimentação agendada os animais foram eutanasiados nos ZT indicados como demonstra figura abaixo e o hipotálamo foi removido e processado para western blot.
20 Demonstração do fotoperíodo claro-escuro em relação à escala ZT
PERÍODO CLARO PERÍODO ESCURO
Figura 07: As setas pretas indicam os horários nos quais os animais foram eutanasiados e as setas vermelhas indicam os horários nos quais os animais foram expostos ao regime de 6 refeições a cada 4 horas.
4.4 Ensaio de Imunoprecipitação do complexo CREB1/CRTC2.
O objetivo principal desse protocolo foi investigar a associação entre CREB1/CRTC2 em hipotálamo de ratos expostos a ciclo claro/escuro de 12h/12h. A metodologia utilizada foi o ensaio de imunoprecipitação.
Animais e Tratamentos
Ratos da linhagem Wistar adultos foram mantidos em caixas coletivas (4 animais/gaiola) sob condições controlada 22 ± 2ºC, umidade relativa do ar 55 ± 10%, e com ciclo biológico rigoroso (12:00 horas claro/12:00 horas escuro), com as luzes se acendendo às 07:00 horas, recebendo ração balanceada (Nuvital) e água ad libitum. Ao completarem 8ª semanas de vida e expostos à condição acima descrita, estes animais foram eutanasiados.
21 Eutanásia
A eutanásia dos animais e a coleta do tecido hipotalâmico foram realizadas conforme descrita na metodologia anterior.
Os animais com alimentação ad libitum foram eutanasiados no ZT4 ou ZT16. O hipotálamo foi removido e processado para imunoprecipitação de CREB1 ou CRTC2.
Imunoprecipitação
Os hipotálamos foram homogeneizados utilizando o equipamento Polytron (Kinematica - Suíça) em tampão de extração (Triton-X 100 10%, Tris (pH 7,5) 100mM, pirofosfato de sódio 100mM, fluoreto de sódio 100mM, EDTA 10mM, ortovanadato de sódio 100mM, PMSF 2mM e aprotinina 0,01mg/mL), seguida de centrifugação (12000 rpm, 40 min e 4°C) para a remoção do material insolúvel. Parte do sobrenadante foi utilizada para determinação do conteúdo protéico por espectrofotometria com reagente Bradford (Biorad, CA, USA), parte diluída em tampão Laemmli, fervido por 10 min e armazenado a -80C. O restante foi incubado com anticorpo específico contra CREB1 ou CRTC2 (Santa Cruz, CA, USA) e proteína A sepharose 6MB por 24 horas a 4ºC. Após esta incubação, o precipitado foi lavado e recebeu o mesmo tratamento que as amostras de extrato protéico total e fracionado por SDS-PAGE em aparelho para minigel
(Mini-Protean, Bio-Rad). Após a corrida no gel, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
nitrocelulose (Biorad, CA, USA). As membranas foram então bloqueadas com uma solução basal contendo leite 5%, Tris-Base, NaCl e Tween-20 por 2 horas a temperatura ambiente e a seguir incubadas com anticorpos contra CRTC2 ou ATF6 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA e
IMUGENIX) por 24 horas sob refrigeração. Após marcação com anticorpo primário, as
membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado à peroxidase por 1 hora à temperatura ambiente (GE Healthcare, USA). Antes da detecção, as membranas foram incubadas por 1 minuto com uma solução contendo luminol, ácido p-cumárico e H2O2. As membranas foram então expostas durante tempos variados a filmes de raio-X. Depois de revelados, esses filmes foram submetidos a análise de densitometria óptica pelo software Scion Image (Scioncorp, NIH, USA).
22 4.5 Dosagem de Corticosterona em animais submetidos à cirurgia controle SHAM ou adrenalectomia ADX.
A fim de validar o procedimento cirúrgico (adrenalectomia), realizamos dosagens de corticosterona a partir das amostras de plasma coletadas de animas adrenalectomizados.
Ratos da linhagem Wistar adultos, foram mantidos em caixas coletivas (4 animais/gaiola) sob condições controlada 22 ± 2ºC, umidade relativa do ar 55 ± 10%, e com ciclo biológico rigoroso (12:00 horas claro/12:00 horas escuro), com as luzes se acendendo às 07:00 horas, recebendo ração balanceada (Nuvital) e água ad libitum. Ao completarem oito semanas de vida, estes foram submetidos a procedimento cirúrgico SHAM ou adrenalectomia, conforme descrito anteriormente.
Os animais SHAM e adrenalectomizados foram eutanasiados no ZT8 (15h), seis dias após a cirurgia. Após a decapitação, o plasma foi coletado partir do tronco e mantido sob-refrigeração para, posteriormente, ser utilizado na dosagem de corticosterona, a partir da metodologia de ELISA através do kit da Neogen Corporation (Cat. No. 402810) para corticosterona.
4.6 Relação entre produção endógena de adrenocorticóides e ingestão alimentar e variação circadiana de ATF6 no hipotálamo.
Esse protocolo consistiu na avaliação da ingestão alimentar, variação circadiana de ATF6, CREB1 e CRTC2, além disso, associação da formação do complexo CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2 no hipotálamo de ratos expostos a cirurgia controle (SHAM) ou adrenalectomia (ADX).
Animais e Tratamentos
Ratos da linhagem Wistar adultos foram mantidos em caixas coletivas (4 animais/gaiola) sob condições controlada 22 ± 2ºC, umidade relativa do ar 55 ± 10%, e com ciclo biológico rigoroso (12:00 horas claro/12:00 horas escuro), com as luzes acendendo às 07:00 horas, recebendo ração balanceada (Nuvital) e água ad libitum .
23
Os procedimentos cirurgicos foram realizados entre o período das 07h00 às 15:00). Inicialmente, os animais foram anestesiados com uma injeção (i.p) com ketamina (4ml/kg), xilazina (1ml/kg) posicionados em decúbito ventral numa mesa cirúrgica.
Os animais foram submetidos a uma incisão na pele e no tecido subcutânio na linha média, tendo como referência o ângulo entre a última costela e a coluna vertebral. Foi introduzida uma pinça até a cavidade abdominal, para separar os bordos da incisão, possibilitando a visualização dos órgãos abdominais. A glândula adrenal está localizada no pólo superior do rim, junto à gordura perirrenal. Após a remoção da adrenal, as incisões foram suturadas e os animais receberam 3 gotas de dipirona sódica para analgesia após o procedimento cirurgico.
Grupos experimentais
Grupo SHAM: Os animais sham foram submetidos a procedimentos cirúrgicos semelhantes, mas sem a remoção das glândulas adrenais. Após a cirurgia receberam garrafas contendo água corrente.
Grupo ADX: Animais adrenalectomizados (tiveram a glândula adrenal removida), conforme descrição acima. Após a cirurgia receberam garrafas contendo solução de NaCl 0,9%.
Ingestão alimentar
A ingestão alimentar foi mensurada seis dias após a cirurgia. Os animais foram jejuados a partir do ZT10 (17h) até o ZT1 (8h), totalizando 16h de jejum. A realimentação ocorreu do ZT1(8h) ao ZT3(10h). Durante este período os animais permaneceram com aporte hídrico e a massa de ração foi medida antes do ZT1 e após o ZT3.
Eutanásia
A eutanásia dos animais e a coleta do tecido hipotalâmico foram realizadas conforme descrita na metodologia anterior.
24
Os animais foram eutanasiados no ZT4 ou ZT16. Após a remoção do hipotálamo, foi processado para extração de proteínas totais, pela técnica de Western Blot e processados para relação da associação de CREB1 ou ATF6, pela técnica de imunoprecipitação.
4.7 Expressão circadiana do mRNA CRH
Nesse protocolo foi avaliado o perfil de expressão circadiana do mRNA que codifica o CRH em hipotálamo de ratos submetidos à cirurgia SHAM ou adrenalectomia, pela técnica de Extração de RNA e PCR (Reação de polimerase em cadeia) em tempo real. Os animais SHAM e ADX foram eutanasiados nos ZT4, ZT8, ZT12, ZT16, ZT20 e ZT24.
Reação de polimerase em cadeia
Para a extração do RNA total, as amostras hipotalâmicas foram homogeneizadas com 1mL do reagente Quiazol (Quiagen, US). Em seguida, 2 microgramas do RNA total de cada amostra foi usado para sintese do cDNA para avaliar a expressão do mRNA do CRH. O cDNA foi sintetizado por transcrição reversa usando oligo-dT e o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (life technologies).
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqManTM
(Applied Biosystems) e os cDNAs como moldes. Os kits de iniciadores utilizados foram o
TaqMan Gene CRH: Rn01462137_m1 e o TaqMan gene GAPDH: Mm99999915_g1 (TaqManTM - Applied Biosystems). O GAPDH foi amplificado com constitutivo das reações. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System
SDS Software (Applied Biosystems).
4.8 Efeito agudo da aplicação de dexametasona subcutânea
Este protocolo objetivou analisar se a injeção subcutânea de glicocorticoide sintético (dexametasona – DEXA) modula a ingestão alimentar e os parâmetros de sinalização no hipotálamo que culminam o controle da expressão do CRH. Para definir a dosagem de dexametasona eficiente para o experimento, foram realizados ensaios com as dosagens de 2, 20 e 200µg/kg, a fim de avaliar o curso temporal do ATF6 para cada uma das dosagens citadas. O
25
resultado efetivo foi obtido a uma dosagem de 200µg/kg De posse desta premissa, foram realizados os seguintes experimentos.
Análise da ingestão alimentar após 2 horas da injeção subcutânea de dexametasona na dose de 200µg/kg.
Análise da expressão do CRH em hipotálamo de ratos submetidos à aplicação de dexametasona subcutânea 200µg/kg.
Análise do curso temporal da expressão de ATF6 no hipotálamo, nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos após a injeção subcutânea de dexametasona na dose 200µg/kg.
Análise da associação entre CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2 após a injeção subcutânea de dexametasona na dose de 200µg/kg
4.9 Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média erro padrão da média (EPM) e analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA de uma via com pós-teste de Tukey, ou duas vias com pós-teste de Student, quando apropriado). Também foi realizado, quando adequado, o teste de Student. Em todos os resultados foram adotados 5% como limite de significância estatística (p < 0,05).
26 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Análise da variação circadiana da via UPR.
O estresse do retículo endoplasmático é responsável por diversas doenças como diabetes, obesidade e doenças neurodegenerativas, além de outras doenças associadas. Como já descrito anteriormente, as causas dessas patologias estão relacionadas com a dissociação entre os sinais temporais do relógio biológico e o do cronograma sono/atividade, por exemplo, do trabalhado noturno.
Para investigar os mecanismos que conduzem à dessincronização interna, fizemos um conjunto de experimentos em modelos animais expostos a sua fase de atividade normal (fase clara/escura do ciclo de 12h/12h) na qual, não apresentaram ritmos diários alterados ou padrões de alimentação alterados. Para tanto, primeiramente foram verificadas as alterações circadianas no ramo da UPR e suas ligações com o comportamento alimentar.
Foram adicionadas nos resultados figuras representativas dos blots (filme e Ponceau) e as respectivas figuras de p-PERK (Figura 08), ATF4 (Figura 09), GADD34 (Figura 10), e CHOP (Figura 11) e ATF6 (Figura 12), com número amostral variando entre 9 a 13. Os dados foram normalizados com Ponceau. Os valores são expressos Média+Erro com pós-teste de Tukey.
