IMUNOPRECIPITAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO ENTRE CREB1/CRTC2

Diante dos resultados de variação circadiana da expressão do ATF6, o próximo passo foi realizar ensaios de imunuprecipitações em tecidos hipotálamicos de ratos expostos a ciclo claro/escuro. Primeiramente investigamos a associação das proteínas CREB1/CRTC2 com o intuito de buscar evidências iniciais de variação circadiana em etapas a jusante ao ATF6.

Montminy e colaboradores mostraram que o CRTC2 funciona como um sensor duplo: tantopara estresse de retículo endoplasmático, quanto para sinais emitidos pelo fígado no período de jejum (45). Estes estudos anteriores demonstraram um papel importante do CREB1 e seu coativador (CRTC2) na promoção da gliconeogênese hepática. Deste modo, aventamos a hipótese de que tal associação também pudesse estar ocorrendo no hipotálamo.

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Para testar esta hipótese, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com hipotálamo de ratos expostos a ciclo claro/escuro de 12h/12h. Foi escolhido como ZT de interesse o ZT16, devido a ocorrência do pico do RNAm do CRH neste ZT. Na figura 14, estes resultados são apresentados.

Figura 14. Associação do complexo CREB1/CRTC2 em hipotálamo de ratos expostos a ciclo claro/escuro de 12h/12h. Os animais com alimentação ad libitum foram eutanasiados nos ZT indicados na figura e seus hipotálamos foram removidos para ensaio de imunoprecipitação de CREB1/CRTC2. As membranas com os imunoprecipitados de CREB1 foram incubadas com anticorpos contra CRTC2. Os dados representam a média±EPM. com Teste T Student *P<0,05 vs. ZT4.

Como visto na figura 14, ocorre uma redução de 31% da associação entre CREB1/CRTC2 no hipotálamo de ratos eutanasiados durante a noite (ZT16) quando comparado aos animais eutanasiados no ZT04. O ritmo de associação entre CREB1/CRTC2 está, ao nosso ver, de acordo com trabalhos que mostram que no fígado esta associação é estimulada pelo glucagon (37). A interpretação que nós fazemos é a de que durante a fase clara, devido a uma menor ingestão alimentar, os elevados níveis de glucagon devem contribuir positivamente para a formação com complexo CREB1/CRTC2 também no hipotálamo. Importante destacar que esta é a primeira descrição de que a formação deste complexo no sistema nervoso central varia de acordo com a fase do ciclo claro/escuro.

35 5.4 Dosagem de Corticosterona em animais submetidos à cirurgia controle SHAM ou adrenalectomia ADX.

Primeiramente, foi realizada a determinação dos niveis plasmático de corticosterona em animais adrenalectomizados para validação do procedimento cirurgico. Diante do resultado mostrado na figura 15 concluímos que a adrenalectomia foi efetiva, uma vez que não se detectou corticosterona nas amostras dos animais ADX.

-100 0 100 200 300 SHAM ADX [n g /m l] SHAM ADX

Corticosterona

ng

/mL

Figura 15. Análise de corticosterona plasmática em animais submetidos à cirurgia SHAM e ou adrenalectomia. Uma semana após o procedimento cirúrgico foram eutanasiados e o sangue foi coletado para mensuração dos níveis de corticosterona. Os dados representam a média±EPM com Teste T Student *P<0,05 vs. SHAM.

5.5 Relação entre produção endógena de adrenocorticóides e ingestão alimentar e variação circadiana de ATF6 no hipotálamo.

A ingestão de alimentos é regulada por diversos fatores, incluindo sinais de adiposidade, como a leptina e insulina, e sinais de saciedade, tais como a estimulação mecânica e química do estômago e no intestino delgado, bem como hormônios libertados durante a alimentação. Os glicocorticoides também desempenham um papel importante no controle do comportamento alimentar, e sua deficiência reduz a ingestão de alimentos e ganho de peso corporal (58). Concordantemente com a literatura, os dados apresentados na figura 16 confirmam que, em animais adrenalectomizados, a ingestão alimentar é reduzida.

36 Figura 16. Análise da ingestão alimentar no hipotálamo de animais submetidos à cirurgia. Os animais com alimentação ad libitum foram submetidos à cirurgia controle (SHAM – barra cinza) ou adrenalectomia (ADX- barra vermelha). Uma semana após o procedimento cirúrgico, a ingestão alimentar foi mensurada. Os dados representam a média±EPM. com Teste T Student *P<0,05 vs. SHAM

O resultado acima mostra uma redução de 33% na ingestão alimentar de animais ADX quando comparado com os animais SHAM. Diversos pesquisadores relatam esse fato, que a adrenalectomia (ADX) reduz a ingestão de alimentos, e que a reposição de corticosterona reverte este efeito em ratos (59, 58).

O passo seguinte foi avaliar se a variação da expressão das proteínas (ATF6, CREB1 e CRTC2) ocorre também no hipotálamo de animais adrenalectomizados, foi desenhado um experimento que utilizou a técnica do imunoblotting, em ratos SHAM e ADX, para cada uma das proteínas de interesse. As figuras abaixo (Figura 17) apresentam os resultados obtidos nesta análise.

37 (A)

(B)

CREB1 Ponceau

38 (C)

Figura 17. Análise das alterações circadianas hipotalâmicas em ratos submetidos a adrenalectomia. Após uma semana do procedimento cirúrgico foram eutanasiados nos ZT indicados na figura e seus hipotálamos foram removidos para mensuração dos níveis de ATF6 (A), CREB1 (B), CRTC2 (C). Os dados representam a média±EPM.

Os resultados não mostraram diferença estatística na variação circadiana das proteínas ATF6, CREB1 e CRTC2 tanto em animais SHAM quanto em ADX. Ainda assim, apenas no grupo SHAM, observamos uma tendência em favor do aumento da expressão de ATF6 no ZT16 (figura17A). Em princípio este dado está de acordo com aquele por nós apresentados anteriormente neste trabalho (ver figura 12). Naquele resultado não observamos diferença estatísticas na expressão do ATF6 comparando o ZT16 com o ZT4. Nós escolhemos o ZT16 como o ZT noturno para estes experimentos, pois foi nestes procedimentos que obtivemos as amostras para investigar a associação CRTC2/CREB1 e ATF6/CRTC2. A justificativa para isto se dá pelo fato de um delay de 4 horas ser possivelmente necessário para que o aumento do ATF6 dispare ativação de etapas downstream em sua sinalização (que ocorre em ZT12).

Independente disto, podemos observar no grupo ADX uma tendência para a redução da expressão de ATF6 no ZT16, podendo indicar o recrutamento do seu coativador CRTC2, que também apresenta a mesma tendência (figura 17 C), portanto, sugerimos que a formação do complexo ATF6/CRTC2 deve estar reduzida neste grupo.

- 0,5 1,0 1,5 2,0 SHAM ZT4 ADX ZT4 SHAM ZT16 ADX ZT16 [U .A ] SHAM ADX IB: CRTC2 CRTC2 Ponceau

SHAMZT4 ADXZT4 SHAMZT16 ADXZT16

U ni da des Ar bi tr ár ia s

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As análises de imunoprecipitações CREB1/CRTC2 e CRTC2/ATF6 foram realizadas em ratos SHAM e adrenalectomizados (Figura 18) a fim de verificar a relação entre produção endógena de adrenocorticóides e a variação circadiana hipotalâmica destas associações.

(A)

40 (B)

Figura 18. Associação do complexo CREB1/CRTC2 e CRTC2/ATF6 em hipotálamo de ratos submetidos à cirurgia. As membranas com os imunoprecipitados de CREB1 (A) e CRTC2 (B) foram incubadas com anticorpos contra CRTC2 e ATF6 respectivamente. Os dados representam a média±EPM com Teste T Student *P<0,05 vs. SHAM ZT4.

De acordo com os resultados da figura 18A, foi possível observar que a associação entre CREB1/CRTC2 está aumentada em 106% quando comparamos animais ADX com animais SHAM, no ZT16.

Como apresentado anteriormente na figura 14, onde foi executado o ensaio de imunoprecipitação CREB1/CRTC2 onde os animais não foram submetidos à adrenalectomia, foi observado que a expressão da associação CREB1/CRTC2 está diminuída no ZT16, quando comparado ao ZT04 em animais SHAM. O mesmo não ocorre na imunoprecipitação feita com animais ADX (figura 18A), de fato a expressão CREB1/CRTC2 é inversa ao observado nos animais SHAM, ou seja, em animais adrenalectomizados há um aumento da expressão CREB1/CRTC2 no ZT16 em comparação ao ZT04. Nossa interpretação é que esta diferença se deve a redução do pico de ATF6 hipotalâmico no ZT12 por ocasião da adrenalectomia.

Em paralelo, a figura 18B demonstra que a associação ATF6/CRTC2 não apresenta variação oposta à expressão da associação CREB1/CRTC2, no ZT16, quando comparamos animais ADX e SHAM, ou seja, apesar de esperarmos que a associação ATF6/CRTC2 fosse

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reduzida em animais ADX, comparados a animais SHAM no ZT16, este fato não se verificou, o que leva a acreditar que este comportamento ocorreria em uma ZT anterior, por exemplo, no ZT12.

Como foi observado na figura de variação circadiana do ATF6 (figura 12), há um zenith verificado no ZT12 que poderia indicar que, a associação ATF6/CRTC2 antecede a formação do complexo CREB/CRTC2 (no ZT16), isso porque pode haver um delay na via de sinalização. De fato, como proposto por Montminy, o recrutamento do ATF6 pelo CRTC2 é um evento que ocorre em resposta à UPR e como consequência diminui a formação do complexo CRTC2/CREB1.

As observações acima são importantes, na medida em que ainda não há trabalhos publicados que revelem uma participação direta da ação de glicocorticoides na associação dos complexos CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2, regulada via ATF6, no hipotálamo.

5.6 Expressão circadiana do mRNA CRH

Para mostrar se existia alguma correlação entre a ritmicidade da associação de CREB1 e a expressão do gene responsivo, o CRH, analisamos a expressão do mRNA do CRH em ratos ADX e SHAM ao longo do ciclo claro escuro.

Assim, foi avaliado o perfil de expressão circadiana do mRNA que codifica o CRH em hipotálamo de ratos submetidos à cirurgia SHAM ou adrenalectomizados (Figura 19), pela técnica de PCR (Reação de polimerase em cadeia) em tempo real. Os animais SHAM e ADX foram eutanasiados nos ZT4, ZT8, ZT12, ZT16, ZT20 e ZT24.

42 Figura 19. Expressão circadiana do CRH em hipotálamo de ratos submetidos à cirurgia SHAM ou adrenalectomia. Os animais com alimentação ad libitum foram submetidos a cirurgia controle (SHAM – linha pontilhada) ou adrenalectomia (ADX- linha continua). Uma semana após o procedimento cirúrgico foram eutanasiados nos ZT4, ZT8, ZT12, ZT16, ZT20 e ZT24 e seus hipotálamos foram removidos para avaliar a expressão do mRNA do CRH.

Os resultados da figura 19 demonstram que os animais SHAM apresentam uma variação circadiana na expressão de CRH marcada por um aumento no ZT16 de 57% quando comparado ao ZT12 do mesmo grupo. Esta ritmicidade é perdida no hipotálamo de animais ADX que apresentam níveis de mRNA do neuropeptídeo CRH constantemente aumentados em relação ao SHAM.

Os neuropeptídeos hipotalâmicos que participam da regulação do apetite são classificados em dois grandes grupos: os peptídeos orexigênicos – como o neuropeptídeo Y (NPY) e os peptídeos anorexigênicos – como o CRH. Esses neuropeptídeos participam da sinalização e manutenção da homeostase energética, além de estarem relacionados com o desenvolvimento estrutural e dos circuitos neuronais que atuam na modulação do comportamento alimentar de curto e longo prazo (60).

Há evidências acumuladas de que o CRH desempenha um papel importante como sinalizador anorexigênico fisiológico, já que o padrão de secreção de CRH apresenta correlação inversa com a ingestão alimentar. Além disso, estudos demonstraram que a indução experimental de restrição alimentar ativa o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, promove aumento do apetite e

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supressão de sinais endógenos anorexigênicos e, finalmente, a adrenalectomia leva a aumento da expressão de CRH (60, 61).

No estudo publicado por Zakrzewska e colaboradores, os pesquisadores investigaram a administração de dexametasona intracerebroventricular, durante repetidos dias, e verificaram alterações no peso corporal e na homeostase hormonal e metabólica, favorecendo ganho de massa. Estas alterações parecem ser mediadas principalmente através dos níveis de NPY e CRH, induzidos por infusão central de dexametasona (62).

Nossos experimentos sugerem, conforme apresentado anteriormente na figura 18, que a regulação do CREB1/CRTC2 também ocorre no hipotálamo de maneira circadiana em animais SHAM. A função do CREB1 no hipotálamo tem uma relevância no controle da expressão do CRH (41). A expressão do CRH é classicamente reprimida por glicocorticoides endógenos, explicando o porquê de pequenas doses de glicocorticoides poderem estimular a ingestão alimentar (62). Outra observação importante sobre a figura 19, é que a ritmicidade circadiana do CRH foi perdida em animais adrenalectomizados, indicando um papel importante da corticosterona na manutenção deste ritmo, sendo que a sua ausência pode gerar oscilações circadianas e alterações rítmicas alimentares.

Diante do exposto, os nossos resultados acrescentam à literatura o fato de que, em animais adrenalectomizados observamos um aumento do CRH em ambas as fases favorecendo a perda da ritmicidade na expressão do CRH. Como o CREB1 possui um papel fundamental na regulação transcricional do CRH, podemos sugerir que ocorrerá também perda de ritmicidade do CREB1 com influencia na formação do complexo CREB1/CRTC2, o que pode ser observado na figura 18A, além disso, foi também observado na figura 16 uma menor ingestão alimentar em animais adrenalectomizados, como já esperado, devido a propriedade anorexigênica do CRH. Esta atividade ocorre de forma inversa em animais submetidos à aplicação de dexametasona, que será apresentado a seguir.

5.7 Efeito agudo da aplicação de dexametasona subcutânea

Na seção anterior, foram apresentadas as expressões de proteínas hipotalâmicas em animais submetidos a adrenalectomia (ADX) ou cirurgia controle (SHAM), a fim de investigar o

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efeito da ausência de corticosterona na expressão de proteínas, na ingestão alimentar e seu impacto nas variações circadianas.

Para avaliar estes efeitos sob outro ponto de vista, decidimos analisar as associações entre proteínas hipotalâmicas CREB1/CRTC2 e CRTC2/ATF6, o curso temporal do ATF6 e o comportamento alimentar, agora influenciados por inserção exógena de glicocorticoide, através de aplicação subcutânea de dexametasona.

Nessa etapa dos experimentos, os ratos foram estimulamos com glicocorticóide sintético (dexametasona) com o intuito de simultaneamente estimular a ingestão alimentar e reprimir a expressão do CRH. Nestes experimentos foi utilizada uma dosagem de 200 microgramas de dexametasona subcutânea (sc). A ingestão alimentar foi monitorada durante todos os experimentos (Figura 20).

Figura 20. Repercussão na ingestão alimentar após aplicação de dexametasona. A figura demonstra que a dexametasona (200µg/kg – ZT1) estimula a ingestão alimentar após 2 horas da injeção subcutânea de dexametasona. Os dados representam a média±EPM com Teste T Student *P<0,05 vs. CTL.

Diante desses resultados, pode-se afirmar que a dexametasona estimulou a ingestão alimentar em 209% . Esse fato é concordante com a literatura e com experimentos em roedores,

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que evidenciam os efeitos dos glicocorticoides na indução de ingestão de alimentos ou na obesidade (62).

No hipotálamo, o CREB1 regula um conjunto diferente de genes, dentre estes destacamos o CRH. O CRH é um neurotransmissor hipotalâmico, com uma expressão muito elevada no núcleo paraventricular (NVP) e que apresenta ações anorexigênicas (63).

Como já é sabido, a expressão de CRH é estimulada pela ligação CREB1/CRTC2 e tem sua expressão bem reconhecida por ser suprimida através da ação de glicocorticóides. Deste modo, decidimos avaliar a supressão da expressão de CRH induzida por dexametasona (Figura 21).

Figura 21. Expressão do CRH em hipotálamo de ratos submetidos à aplicação de dexametasona subcutânea. Os animais com alimentação ad libitum foram submetidos da injeção subcutânea de dexametasona na dose de 200µg/kg realizado no ZT1 correspondente a 8h, a expressão do CRH foi mensurada após 2 horas de aplicação. Os dados representam a média±EPM com Teste T Student *P<0,05 vs. CTL.

Esse experimento mostra que há uma redução de 26% na expressão do CRH. Acreditamos que esta redução do CRH deva exercer um papel fundamental no mecanismo pelo qual a dexametasona estimula a ingestão alimentar.

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Em seguida realizamos experimentos para avaliar as mudanças temporais no conteúdo dos ATF6 hipotalâmico e, a associação CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2 após uma injeção de dexametasona subcutânea (Figura 22).

Figura 22. Expressão do ATF6 no hipotálamo de ratos submetidos a aplicação de dexametasona (SC). Os animais foram submetidos à injeção subcutânea de dexametasona 200µg/kg nos tempos 0, 15, 30, 60 e 120 minutos, em seguida o hipotálamo foi removido para mensuração do nível de ATF6. Os dados representam a média±EPM com Teste T Student *P<0,05 vs. CTL.

Os resultados obtidos nesse conjunto de experimentos demonstraram que a dexametasona estimula a expressão de ATF6. O aumento de 66% foi verificado 120 minutos após injeção do glicocorticóide.

Dando seguimento às análises, fazia-se necessária a avaliação do comportamento da associação entre CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2, após a injeção subcutânea de dexametasona na dose de 200µg/kg. Nas figuras a seguir (Figura 23) serão apresentados os resultados deste experimento.

47 (A)

(B)

Figura 23. Associação entre CREB1/CRTC2 e entre ATF6/CRTC2 em hipotálamo de ratos expostos a injeção subcutânea de dexametasona. Os animais com alimentação ad libitum após a aplicação de dexametasona foram eutanasiados nos tempos indicados na figura e seus hipotálamos foram removidos para ensaio de imunoprecipitação de CREB1 e ATF6. As membranas com os imunoprecipitados de CREB1 (A) e ATF6 (B) foram incubadas com anticorpos contra CRTC2 respectivamente. Os dados representam a média±EPM.

48

O resultado observado na figura 23 demonstra que houve uma tendência na modulação da associação CREB1/CRTC2 (figura 23A) e ATF6/CRTC2 (figura 23B) após injeção subcutânea com dexametasona. No caso da formação do complexo CREB1/CRTC2, houve tendência de redução após os 60 minutos já no caso do ATF6/CRTC2 houve tendência de aumento, decorridos 60 minutos da aplicação. No entanto, os dados não revelaram diferença estatística, o que pode ter sido ocasionado pelo tempo de exposição adotado de 60 minutos. Conforme apresentado na figura 22, o zenith do curso temporal do ATF6, induzido pela dexametasona ocorreu em 120 minutos. Esta descoberta foi posterior aos experimentos de imunoprecipitação realizadas a partir do hipotálamo de animais submetidos à aplicação dexametasona (figura 21). As associações CREB1/CRTC2 e ATF6/CRTC2 podem estar ocorrendo em um período posterior ao analisado, por exemplo, 120 minutos após a aplicação de dexametasona.

49 6 CONCLUSÃO

Permite-se concluir que a variação circadiana do ATF6 apresenta um Zenith noturno, tanto em animais submetidos a regime ad libtum quanto aos expostos a seis refeições diárias.

De maneira geral, nossos resultados apontam para uma participação dos glicocorticóides na geração da ritmicidade do ATF6 hipotalâmico, visto no regime de 6 refeições. Esta hipótese está de acordo com a descrição de que glicocorticóides sintéticos estimulam a expressão específica do ATF6, mas não de outras vias da UPR, em outros tipos celulares (66). Corroborando com esta hipótese, já foi descrito que o ritmo de produção de glicocorticóides está preservado em ratos expostos a seis refeições diárias (64), o que explica a manutenção do ritmo do ATF6 apresentado na figura de variação circadiana (Figura 12).

Para tanto, os animais foram submetidos à adrenalectomia (remoção da adrenal) que diminuiu a ingestão alimentar e aumentou a atividade transicional de CREB1, observado pela elevação da quantidade do complexo do CREB1/CRTC2 Esta observação sugere que possa haver atenuação do complexo ATF6/CRTC2, que se expressa de forma contrária à associação CREB1/CRTC2,

O aumento da associação CREB1/CRTC2 e o aumento da expressão do CRH explicam a redução na ingestão alimentar em animais adrenalectomizados.

Por outro lado, a administração de glicocorticoide exógeno (dexametasona) exerce efeitos opostos, já que suprime a expressão do CRH. Estes efeitos são consequência da característica anorexigência do CRH.

Nossos dados sugerem que os níveis fisiológicos de glicocorticoides podem reprimir a expressão do CRH e estimular a ingestão alimentar através de uma via dependente do ATF6 e do complexo CREB1/CRTC2.

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