FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
THAMIRIS DE ALMEIDA DE SOUZA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DO GÊNERO Alpinia EM Rhodnius nasutus E POTENCIAL
ALIMENTÍCIO ASSOCIADO
NITERÓI 2017
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DO GÊNERO Alpinia EM Rhodnius nasutus E POTENCIAL
ALIMENTÍCIO ASSOCIADO
Dissertação de mestrado apresentado ao Curso de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como, requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Área de Concentração: Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos para a Saúde.
Orientadora: Profª. Drª. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO Co-orientadora: Profª. Drª. ANA CLAUDIA FERNANDES AMARAL
Niterói 2017
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE ESPÉCIES DO GÊNERO Alpinia EM Rhodnius nasutus E POTENCIAL
ALIMENTÍCIO ASSOCIADO
Dissertação de mestrado apresentado ao Curso de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, como, requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Área de Concentração: Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos para a Saúde. BANCA EXAMINADORA _______________________________________________________________ Profª. Drª. KÁTIA GOMES DE LIMA ARAÚJO - Orientadora
Universidade Federal Fluminense – UFF
_______________________________________________________________ Profª. Drª. THELMA DE BARROS MACHADO
Universidade Federal Fluminense – UFF
_______________________________________________________________ Profª. Drª. CARLA DA SILVA CARNEIRO
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ
_______________________________________________________________ Dr. ANDRE MESQUITA MARQUES
Farmanguinhos/FIOCRUZ
Niterói 2017
Agradeço à Deus, que com seu infinito amor e bondade, me concedeu a graça de permanecer forte mesmo nos dias mais difíceis e não me deixou fraquejar e desistir.
À minha orientadora Kátia Gomes de Lima Araújo, por toda dedicação, carinho e ensinamento nesses anos.
À minha co-orientadora Ana Claudia Fernandes Amaral, por toda paciência, incentivo, conselhos e ajuda na execução de todo trabalho.
À minha família, minha vó e minha irmã, por entender cada momento de ausência física e sempre me encorajar, apoiar cada decisão e torcer por cada conquista.
À Maiara Accacio Machado, por ter me auxiliado e me fortalecido nesses anos e nos momentos mais difíceis ter ficado ao meu lado.
Aos meus amigos, por todo apoio, compreensão, amizade e companheirismo.
Às amigas do Laboratório de Biotecnologia de Alimentos (LABIOTEC), Nathália, Julia, por todo apoio, força, amizade e cumplicidade nessa jornada.
Aos amigos do Laboratório de Produtos Naturais (PN1), Arith, Jefferson, Viviane, Aline, Wilson, Rodrigo, por todo carinho, ajuda, por todas as risadas, conselhos e amizade sempre.
Ao Profº José Luiz Pinto Ferreira, por todo carinho, ensinamento e ajuda por todos esses anos.
À minha amiga Maria Athana Mpalantino, por todo ensinamento, dedicação e amizade, por todas as palavras de carinho e cuidado, por toda preocupação e ajuda por todos esses anos.
À Faculdade de Farmácia da Universidade Federal Fluminense, por toda estrutura e auxílio.
À Farmanguinho/FIOCRUZ, pela oportunidade e contribuição no desenvolvimento deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado.
Figura 1. Alpinia zerumbet ... 17 Figura 2. Alpinia vittata ... 18 Figura 3. Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi ... 22 Figura 4. Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Alpinia zerumbet. (a) 1,8 cineol, (b) 4-terpineol ... 34
Figura 5.Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de
Alpinia vittata. (a) β-pineno, (b) α-pineno ... 35
Figura 6. Curva de calibração com o padrão 1,8-cineol utilizado para
quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos. ... 38 Figura 7. Curva de calibração com o padrão α-pineno utilizado para
quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos. ... 39 Figura 8. Curva de calibração com o padrão β-pineno utilizado para
quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos. ... 39 Figura 9. Curva de calibração com o padrão 4-terpineol utilizado para
quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos. ... 39 Figura 10. Média de perda de peso (mg) de Rhodnius nasutus dos grupos controle (sem tratamento e tratados com DMSO) e tratados com OLALPVIT e OLALPZER por 6 semanas. ... 41 Figura 11. Dendrograma demonstrando a relação de mortalidade ninfal de
Rhodnius nasutus, entre os grupos controle (sem tratamento e tratado com
Tabela 1. Rendimentos dos óleos essenciais das folhas de Alpinia zerumbet e
Alpinia vittata coletadas em diferentes épocas do ano... 33
Tabela 2.Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia zerumbet provenientes de quatro coletas ... 35 Tabela 3. Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia vittata proveniente de quatro coletas ... 36 Tabela 4.Quantificação dos constituintes majoritários dos óleos essenciais das folhas de A. zerumbet e A. vittata (µg/mg±desvio padrão)... 38 Tabela 5. Diferença de massa (mg) de Rhodnius nasutus tratados com OLALPVIT e OLALPZER antes e após a alimentação (1ª a 6ª semana). ... 42 Tabela 6. Comparação dos estádios de desenvolvimento de Rhodnius nasutus (ninfa de 5º estádio / adulto), tratados com óleo essencial de OLALPVIT e OLALPZER. ... 43 Tabela 7. Longevidade de Rhodnius nasutus (ninfa de 5º estádio/adulto), tratados com óleo essencial de OLALPVIT e OLALPZER, em condições de laboratório. ... 44 Tabela 8. Mortalidade de ninfas de 5° estádio de Rhodnius nasutus durante o experimento, em até 10 minutos e em até 72 horas (% e número absoluto), tratados com OLALPVIT e OLALPZER, sob condições de laboratório. ... 45 Tabela 9. Composição centesimal das folhas de Alpinia zerumbet e Alpinia
vittata crua e cozida ... 48
Tabela 10. Análise dos constituintes fenólicos no extrato aquoso e na partição do extrato aquoso com acetato de etila nos tempos de cozimento 30, 20 e 10 minutos (mg/g de ácido gálico) ... 50
OMS – Organização Mundial da Saúde
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
RENISUS – Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS DPPH – 1,1-difenil-2-picrilidrazila
CG-MS – Cromatografia com fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas
CG-DIC – Cromatografia com fase Gasosa com Detector de Ionização de Chama
CLAE-DAD – Cromatografia de Alta Eficiência com Detector de Diodo DMSO – Dimetilsulfóxido
TR – Tempo de retenção
OLALPZER – Óleo essencial Alpinia zerumbet OLALPVIT – Óleo essencial Alpinia vittata DDK – Diidro-5,6-desidrokavaína
1. INTRODUÇÃO ... 12 2. OBJETIVO... 15 2.1. Objetivos específicos ... 15 3. REVISÂO DA LITERATURA ... 16 3.1. O gênero Alpinia ... 16 3.2. Alpinia zerumbet ... 16 3.3. Alpinia vittata ... 18
3.4. Atividades biológicas das espécies de Alpinia ... 19
3.5. Doença de Chagas ... 20
3.6. Potencial alimentício das plantas ... 25
4. METODOLOGIA ... 27
4.1. Coleta e identificação botânica ... 27
4.2. Obtenção dos óleos essenciais ... 27
4.3. Identificação dos constituintes dos óleos essenciais ... 27
4.3.1. Cromatografia com fase Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massa (CG-EM) ... 27
4.3.2. Cromatografia com fase Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG-DIC) ... 28
4.4. Ensaio de atividade biológica contra o vetor da doença de Chagas .... 28
4.5. Avaliação preliminar do potencial alimentício das espécies vegetais de Alpinia ... 29
4.5.1. Determinação de umidade e cinzas ... 30
4.5.2. Determinação de proteínas ... 30
4.5.3. Determinação de lipídeos e carboidratos ... 30
4.5.4. Determinação de fibras totais ... 30
4.5.5. Determinação do valor calórico ... 30
4.5.6. Preparo das amostras cozidas ... 31
4.5.7. CLAE/DAD ... 31
4.5.8. Determinação do conteúdo de fenóis totais ... 32
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 33
5.1. Extração dos óleos essenciais ... 33
5.2. Identificação e quantificação dos constituintes químicos dos óleos ... 34
6. CONCLUSÃO ... 51 7. ANEXOS ... 52
7.1. Anexo 1 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. zerumbet 30 MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 52 7.2. Anexo 2 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. zerumbet 20 MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 54 7.3. Anexo 3 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. zerumbet 10 MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 56 7.4. Anexo 4 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. vittata 30
MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 58 7.5. Anexo 5 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. vittata 20
MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 60 7.6. Anexo 6 – EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE A. vittata 10
MINUTOS - ANÁLISE HPLC/DAD ... 62 7.7. Anexo 7 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 30 MINUTOS DE A.
zerumbet - CG-EM ... 64
7.8. Anexo 8 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 20 MINUTOS DE A.
zerumbet - CG-EM ... 65
7.9. Anexo 9 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 10 MINUTOS DE A.
zerumbet - CG-EM ... 66
7.10. Anexo 10 – PARTIÇÃO DICLOROMETANO DO AQUOSO 30
MINUTOS DE A. zerumbet – CG-EM ... 67 7.11. Anexo 11 – PARTIÇÃO DICLOROMETANO DO AQUOSO 20
MINUTOS DE A. zerumbet ... 68 7.12. Anexo 12 – PARTIÇÃO DICLOROMETANO DO AQUOSO 10
MINUTOS DE A. zerumbet – CG-EM ... 69 7.13. Anexo 16 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 30 MINUTOS DE A.
vittata – CG-EM ... 70
7.14. Anexo 17 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 20 MINUTOS DE A.
vittata 71
7.15. Anexo 18 – PARTIÇÃO HEXANO DO AQUOSO 10 MINUTOS DE A.
MINUTOS DE A. vittata – CG-EM ... 73 7.17. Anexo 20 – PARTIÇÃO DICLOROMETANO DO AQUOSO 20
MINUTOS DE A. vittata – CG-EM ... 74 7.18. Anexo 18 – PARTIÇÃO DICLOROMETANO DO AQUOSO 10
MINUTOS DE A. vittata – CG-EM ... 75 7.19. Anexo 19 – PADRÃO RUTINA - ANÁLISE CLAE/DAD ... 76 7.20. Anexo 20 – PADRÃO KAVA – DIIDRO-5,6-DESIDROKAVAÍNA (DDK) - ANÁLISE CLAE/DAD ... 77 7.21. Anexo 21 – PADRÃO QUERCETINA - ANÁLISE CLAE/DAD ... 78 8. REFERÊNCIAS... 78
Desde o inicio da história, a humanidade já utilizava ervas para fins curativos. O uso de plantas para tratamento, cura e prevenção de doenças é uma das formas mais antigas de prática medicinal. Dentre as ervas conhecidas, o gênero Alpinia, da família Zingiberaceae é disseminado pelo mundo inteiro, seja do ponto de vista farmacológico, biológico ou alimentício. Em consequência de sua alta aplicabilidade, o gênero Alpinia possui grande valor sobre a economia. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade biológica dos óleos essencias das folhas de duas espécies do gênero Alpinia (Alpinia zerumbet e Alpinia vittata) em espécies de Rhodnius nasutus e realizar análises preliminares para definir o potencial alimentício. Os óleos essenciais das folhas foram obtidos por meio de uma aparelhagem do tipo Clevenger e os constituintes foram identificados por cromatografia com fase gasosa acoplada ao espectrometro de massas (CG-EM), e os componentes majoritários quantificados por cromatografia com fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). Os óleos essenciais das folhas das espécies de Alpinia foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO), sendo aplicado 1,0 µL em cada inseto. Na avaliação do potencial alimentício, as amostras foram analisadas na forma crua e cozida (formas possíveis para o consumo) assim como a água utilizada para o cozimento. Os insetos tratados com óleo essencial de Alpinia foram prejudicados no processo de alimentação, um efeito chamado de “anti feeding”, ocorrendo morte total dos insetos na concentração de 125µg/mL. Em relação ao potencial alimentício, observou-se a presença de flavonoides como a Rutina nas espécies de Alpinia em estudo, assim como um valor significante no que diz respeito ao teor de macronutrientes. Concluiu-se que o óleo essencial das folhas das espécies de Alpinia zerumbet e Alpinia vittata possuem capacidade para uso biológico como inseticida contra espécies de Rhodnius nasutus e os resultados apresentados neste trabalho são inéditos. Contudo, outros ensaios precisam ser realizados para comprovação do potencial alimentício.
Palavras chaves: Alpinia, folhas, óleo essencial, Alpinia zerumbet, Alpinia
From the beginning of history, mankind already used herbs for healing purposes. The use of plants for treatment, cure and prevention of diseases is one of the oldest forms of medicinal practice. Among the known herbs, the
Alpinia genus of the Zingiberaceae family is spread throughout the world, from a
pharmacological, biological or food point of view. As a consequence of its high applicability, Alpinia genus has great value on the economy. The objective of the present work was to evaluate the biological activity of leaf essential oils of two species of the genus Alpinia (Alpinia zerumbet and Alpinia vittata) in
Rhodnius nasutus species and to carry out preliminary analyzes to define the
food potential. The essential oils from the leaves were obtained by means of a Clevenger type apparatus and the constituents were identified by gas chromatography coupled to the mass spectrometer (CG-MS), and the major components quantified by gas chromatography with ionization detector of flame (CG / DIC). The leaf essential oils of Alpinia species were diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) and 1.0 μL was applied to each insect. In the evaluation of the food potential, the samples were analyzed in raw and cooked form (possible forms for consumption) as well as the water used for cooking. Insects treated with Alpinia essential oil were impaired in the feeding process, an effect called "anti-feeding", with total insect death at 125 μg / mL. In relation to the food potential, the presence of flavonoids such as Rutin in the Alpinia species under study was observed, as well as a significant value with respect to the macronutrient content. It was concluded that the essential oil of the leaves of Alpinia zerumbet and Alpinia vittata species have the capacity for biological use as an insecticide against Rhodnius nasutus species and the results presented in this work are unpublished. However, other tests need to be performed to prove food potential.
Key words: Alpinia, leaves, essential oil, Alpinia zerumbet, Alpinia vittata, insecticide, Rhodnius nasutus
1. INTRODUÇÃO
As plantas medicinais são utilizadas pelo homem desde o início de sua história e, muito antes do surgimento da escrita, a humanidade já utilizava ervas para fins medicinais. Hoje em dia, são utilizadas por grande parte da população mundial, como um recurso medicinal alternativo para o tratamento de diversas enfermidades (BEVILACQUA, 2010).
O acesso aos cuidados de saúde e o aprendizado sobre a utilização de plantas, em particular as de uso terapêutico, pode melhorar potencialmente a qualidade dos medicamentos, resultando em melhor qualidade de vida para a população. O uso de plantas sem conhecimento pode levar a riscos graves e perigosos para a população, dificultando o diagnóstico de doenças ou piorando o quadro já existente, especialmente quando associado a algum medicamento com efeito semelhante. Isso ressalta a importância de se estudar cada vez mais a fundo as plantas medicinais (HEINRICH, 2009; SILVA et al., 2008).
O Brasil possui uma farmacopéia popular diversa baseada em plantas medicinais com a introdução de espécies exóticas pelos colonizadores e escravos. Além disso, o país possui a maior diversidade vegetal do planeta, com aproximadamente 55 mil espécies de plantas (ELDIN & DUNFORD, 2001). Com o aumento na utilização das plantas medicinais, a produção de produtos à base de espécies vegetais, de diversas formas farmacêuticas, vem sendo comercializados em farmácias, supermercados e casas de produtos naturais. Não existe garantia quanto a eficácia, segurança e qualidade desses produtos em relação ao uso popular (MELO et al., 2007).
Planta Medicinal, segundo a ANVISA, é toda planta ou partes dela que contenham as substâncias ou classes de substâncias responsáveis por ação terapêutica (MINISTÉRlO DA SAÚDE, 2010). O uso dessas ervas é feito na maioria das vezes por adultos e idosos que buscam complementar o tratamento de uma doença crônica e geralmente acreditam que as plantas medicinais são uma alternativa isenta de efeitos colaterais adversos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). Estima-se que mais de 5.000 constituintes químicos foram identificados em alimentos e em plantas, classificados como fenólicos, carotenoides, vitaminas, alcaloides, etc (HAN et al., 2007).
O governo federal aprovou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos por meio do Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, a qual se constitui em parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente, desenvolvimento econômico e social como um dos elementos fundamentais na implementação de ações capazes de promover melhorias na qualidade de vida da população brasileira (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
O Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos teve seus conceitos fundamentados na Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Com a implantação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, a ANVISA lançou a lista da RENISUS com 78 plantas medicinais de interesse em promover estudos mais aprofundados que visem trazer mais segurança e eficácia na utilização destas plantas. Na lista da RENISUS encontra-se a Alpinia zerumbet, planta medicinal amplamente utilizada pela população principalmente para o tratamento de sintomas da pressão alta e ansiedade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).
Dentre as diversas doenças que infectam humanos e animais, muitas não podem ser controladas por fatores como meios de controle que estão disponíveis, mas são métodos caros ou um conhecimento insuficiente para permitir o controle dessas doenças. Algumas dessas doenças infecciosas têm sido introduzidas em diversas regiões através da expansão comercial e por meios de migração, como a doença de chagas (BRASIL, 2003).
A doença de Chagas se situa entre as entidades vinculadas ao sub-desenvolvimento sócio-cultural e econômico, correlacionada estreitamente as más condições de morada, ao sub-emprego, a falta de terra e de bens de produção. Em 2016, o número de casos comprovados no estado do Acre aumentou mais de 200% em relação ao ano de 2015 (SESACRE, 2016).
Além do olhar farmacológico, o potencial alimentício sobre plantas medicinais vem sendo explorado em vários aspectos por parte das grandes indústrias, como também pela população. Conceitualmente, plantas alimentícias são aquelas que possuem uma ou mais partes ou produtos que podem ser utilizados na alimentação humana, tais como: raízes, tubérculos, bulbos, rizomas, cormos, talos, folhas, brotos, flores, frutos e sementes ou ainda látex, resina e goma, ou que são usadas para obtenção de óleos e gorduras comestíveis. Inclui-se neste conceito também as especiarias,
espécies condimentares e aromáticas, assim como plantas que são utilizadas como substitutas do sal, como edulcorantes, amaciantes de carnes, corantes alimentares e na fabricação de bebidas, tonificantes e infusões (KINUPP et al., 2007).
Não existe uma lista com todas as plantas comestíveis no mundo. Em uma das mais completas, existem cerca de 12.500 espécies potencialmente alimentícias, dentre eles 3.100 gêneros e cerca de 400 famílias, em sua maioria pteridófitas e angiospermas (KINUPP et al., 2007). Alguns compêndios listam espécies nativas e cultivadas, assim como suas possibilidades de uso. O gênero Alpinia, facilmente propagado em canteiros e plantações, é disseminado pelo mundo inteiro, seja do ponto de vista medicinal ou alimentício. Em alguns lugares como Japão, por exemplo, a população utiliza as folhas e raízes desta planta extensivamente em sua cultura alimentar (YOSHIKAWA et al., 1976). Na literatura científica há vários relatos de estudos dos constituintes químicos do óleo essencial das folhas e raízes de espécies de
Alpinia (ZOGHBI et al., 1999). O aroma agradável das suas folhas pode ser
utilizado na indústria de alimentos para a produção de gomas e doces (ELZAAWELY et al., 2007), o que torna essa planta uma fonte alimentar promissora.
2. OBJETIVO
Avaliar a atividade biológica do óleo essencial de espécies de Alpinia (Alpinia zerumbet e Alpinia vittata) contra o inseto vetor da doença de Chagas,
Rhodnus nasutus, além de realizar análises preliminares para verificar o
potencial alimentício destas espécies botânicas.
2.1. Objetivos específicos
Analisar os constituintes químicos dos óleos essenciais de Alpinia
zerumbet e Alpinia vittata, e quantificar os principais constituintes químicos
desses óleos essenciais;
Realizar ensaio da atividade biológica contra o inseto vetor da doença de Chagas (Rhodnus nasutus) com os óleos essenciais de Alpinia spp. e substâncias alvos;
Quantificar os macronutrientes de interesse alimentar nas folhas das plantas na forma crua;
Identificar por CLAE/DAD e CG/EM os componentes químicos transferidos à água durante o cozimento das duas espécies vegetais;
Analisar as substâncias fenólicas presentes nos extratos aquosos das duas espécies.
3. REVISÂO DA LITERATURA
3.1. O gênero Alpinia
O gênero Alpinia pertence à família Zingiberaceae, que é constituída de 53 gêneros e mais de 1.200 espécies nativas de regiões tropicais, especialmente do sul e sudeste da Ásia, expandindo-se através da África tropical até a América do Sul e Central. É o maior gênero da família e suas espécies, principalmente da floresta primária, crescem em hábitats sombreados ou semi-sombreados, ricos em húmus (CASTRO et al., 2016). Esta família tem valor importante sobre a economia, pois atua fornecendo condimentos de propriedades aromáticas, alimentos (féculas dos rizomas), corantes, fibras e papel (NEGRELLE, 2015).
3.2. Alpinia zerumbet
Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt e Smith (figura 1) é muito cultivada pela
beleza de suas flores. O Jardim Botânico do Rio de Janeiro recebeu esta espécie no século XIX e deu-lhe o nome de flor-da-redenção e bastão-do-imperador (CORREA, 1975). Hoje é conhecida pelos nomes vulgares como colônia, paco-seroca, cuité-açu, pacová (ALMEIDA, 1993), gengibre-concha, cardamomo-mato, cardamomo-falso, cana-do-brejo, cana-domato e paco-seroso (MACHADO, 1996).
Essa espécie vegetal é herbácea, ligeiramente aromática, rizomatosa, robusta, perene, com colunas de 2 a 3 metros de altura, lisas, verdes claras, agrupadas em touceiras. As folhas são simples e lanceoladas, oblongas, pontudas, invaginantes (que abraçam o caule), dispostas disticamente, com larga bainha na base e lígula desenvolvida, verde-luzidias, com margens ciliadas com cerca de 50 a 70 cm de comprimento sobre 10 a 12 cm de largura e apresentam nervuras paralelas. As flores são ligeiramente aromáticas, dispostas em cachos grandes (figura 1), protegidas por brácteas vistosas, hermafroditas, zigomorfas, terminais pendentes, amarelo-róseas com três lobos e um grande lábio, característica da família Zingiberaceae (CAMARGO, 1998). Essas também são compostas de um único estame fértil com grande antera e
um número variável de estaminódios, em geral quatro, grandes e petalóides, que desempenham a função de atração da flor (CAMARGO, 1998) O fruto é uma cápsula globosa, com dois centímetros de diâmetro e abriga diversas sementes (ALBUQUERQUE & NEVES, 2004).
Figura 1. Alpinia zerumbet Fonte: Autor
A Alpinia zerumbet faz parte da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS elaborada pelo Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos do Ministério da Saúde que tem por objetivo orientar e desenvolver pesquisas com espécies vegetais, incentivando seu uso na assistência farmacêutica primária (RENISUS, 2009).
Testes de citotoxidez com o óleo essencial e com o extrato aquoso de A.
zerumbet foram realizados contra células tumorais de várias linhagens,
variando entre as mais resistentes e as mais sensíveis, como em linfócitos normais de humanos. Todos os resultados obtidos foram negativos para uma possível ação citotóxica. Ensaios sobre atividade hemolítica contra hemácias de camundongos com o extrato aquoso e óleo essencial demonstraram resultados negativos, confirmando que são substâncias com baixo poder tóxico, sendo assim seguros para ingestão humana, principalmente na forma popular como são utilizados (DI STASI, 2002).
A atividade citotóxica dos extratos clorofórmicos, hexânicos, hidroalcoólicos, acetônico e metanólicos foram analisados sobre espécies celulares Hep-2, NCI-H292, KB e HeLa e os resultados demonstraram ausência de citotoxidez para todos os extratos testados (COSTA et al., 2007;
CORREA et al., 2008). Posteriormente, foram testadas quatro frações do extrato metanólico do rizoma de A. zerumbet e foi verificada atividade citotóxica significativa para a fração hexânica frente a NCI-H292 e Hep-2, com CI50 de 21 µg/mL e 12µg/mL, respectivamente e para a fração diclorometano frente a linhagem celular NCI-H292, com CI50 de 29 µg/mL (CORREA et al., 2008).
3.3. Alpinia vittata
É uma espécie também pertencente à família Zingiberaceae, nativa da região do arquipélago de Bismarck, nas Ilhas Salomão. A Alpinia vittata, que pode ser encontrada com outros nomes (como Alpinia sanderae), é uma planta perene, tropical, que cresce em regiões quentes e úmidas por todo o ano. Está entre as espécies mais atraentes e comumente cultivadas deste gênero, principalmente por sua folhagem bonita e impressionante. As folhas são mais ou menos em forma de lança, disposta em duas fileiras nos pseudo-caules semelhantes a linguetas (LI et al., 2004; JIANGYUN et al., 2002).
A Alpinia vittata (figura 2) é muitas vezes confundida com as folhas de
Alpinia zerumbet cv. variegata. As duas diferem no tamanho e nas flores, assim
como a zona de resistência é diferente (a Alpinia zerumbet cv. variegata é muito mais difícil para se cultivar) (LI et al., 2004; JIANGYUN et al, 2002).
Figura 2. Alpinia vittata
Fonte:<http://tom-piergrossi.squarespace.com/gingers/alpinia-sanderae-a-vittata>
Pouco é descrito na literatura sobre as propriedades terapêuticas e medicinais da Alpinia vittata. Contudo, sabe-se que esta espécie apresenta capacidade de eliminar radicais livres e inibir a peroxidação lipídica, devido à
presença de fitoquímicos como limoneno, β-cariofileno, germacreno A e D, entre outros. A atividade de eliminação de radicais livres e a inibição da peroxidação lipídica pelo extrato metanólico da A. vittata sugerem uma possível capacidade antioxidante (JULIE et al., 2012).
3.4. Atividades biológicas das espécies de Alpinia
Dentre as atividades biológicas descritas para Alpinia zerumbet destacam-se os efeitos hipotensores e levemente diuréticos, obtidos através dos chás das folhas (MENDONÇA et al., 1991). Além de efeitos farmacológicos comprovados, esta espécie vem sendo utilizada para tratamento de úlcera, hipertensão cardiovascular e dores musculares (LORDELO et al., 2000; VICTORIO et al., 2009).
Estudos experimentais utilizando o óleo essencial da Alpinia zerumbet no sistema nervoso neuromuscular evidenciaram atividade miorrelaxante e antiespasmódica, atividade antinociceptiva, ação anticolinérgica, redução do potencial de ação no nervo ciático de ratos e atividade hipotensora da pressão arterial, com diminuição do tônus simpático. Os efeitos se devem à presença de terpenos na composição do óleo, terpen-4-ol (37,62%) e 1,8-cineol (17,58%), que podem alterar diretamente o sistema muscular, causando efeito miogênico, relaxante e anticolinérgico (SANTOS et al., 2011). A ação analgésica dos óleos essenciais evidencia um efeito positivo em todas as doses em um modelo de indução pelo ácido acético e latência dose-dependente para o modelo de placa quente, onde foi sugerido que o mecanismo de ação envolve receptores opioides (ARAUJO et al., 2009).
Dentre as diversas aplicações e estudos realizados, foi feito um estudo comparativo de cinco espécies de Alpinia usando 1,1-difenil-2-picrilidrazila (DPPH) em extratos de folhas e rizomas. Pesquisadores descobriram que espécies de Alpinia zerumbet apresentaram maior atividade na eliminação de radicais livres nas folhas do que em rizomas. Alta atividade antioxidante utilizando o ensaio DPPH foi associada com o maior teor de constituintes fenólicos naturais presentes nesses vegetais e com as mudanças de atividade de acordo com a estação de tratamento de secagem (WONG et al., 2006).
A análise da fração acetato de etila das folhas de A. zerumbet, rica em substâncias fenólicas, apresentou expressiva atividade antioxidante. Esse resultado, unido a outras análises como ensaios realizados com extratos hidroalcoólico, hexano e clorofórmio que foram testados contra nove microorganismos diferentes, apresentando resultados satisfatórios com o extrato clorofórmico do rizoma e com extrato hexano das folhas (ELZAAWELY et al., 2007; Costa et al., 2007).
Alguns estudos com outras espécies de Alpinia estão em desenvolvimento e demonstraram boa capacidade inseticida. Charneca de milho, Sitophilus zeamais Motsch. (Coleoptera: Curculionidae) é uma praga que causa grandes danos aos grãos em armazenamento. A análise do óleo essencial das folhas de Alpinia purpurata por cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG/MS) apresentou 30 constituintes voláteis, principalmente monoterpenos e sesquiterpenos. Os principais componentes químicos encontrados no óleo foram: β-pineno, α-pineno, trans-cariofileno. A ingestão do óleo de A. purpurata por adultos de S. zeamais não matou os insetos, mas interrompeu o ciclo de alimentação, devido à taxa de ganho de peso e eficiência na conversão de alimentos consumidos terem sido negativas ou quase zero. Não foi observado toxidez do óleo quando aplicado na cutícula de adultos de S. zeamais. Contudo, o óleo apresentou toxicidez por fumigação possivelmente pela presença de monoterpenos e monoterpenos oxigenados. Nesse estudo, os autores concluíram que o óleo de Alpinia
purpurata pode ser utilizado no controle de S. zeamais como inseticida ou para
alterar os efeitos nutricionais quando ingerido por insetos adultos (LIRA et al., 2015).
3.5. Doença de Chagas
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana é uma parasitose tecidual e hemática, endêmica em amplas regiões da América, cujo agente etiológico é o Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, um protozoário flagelado da super classe Mastigophora. Atualmente, sabe-se que o T. cruzi surgiu em grandes áreas silvestres do continente americano e posteriormente evoluiu para o ciclo doméstico, permanecendo em circulação entre homem, vetores e
mamíferos naturalmente infectados. A doença de Chagas situa-se entre as entidades vinculadas ao sub-desenvolvimento sócio-cultural e econômico de povos ou nações, correlacionada estreitamente às más condições de moradia, ao sub-emprego, e à falta de terra e de bens de produção (NAVARRO et al., 2012).
O Trypanosoma cruzi é um flagelado da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, caracterizado pela existência de um único flagelo e do cinetoplasto, uma organela contendo DNA localizada na mitocôndria. Ao ser ingerido pelo vetor (figura 3), o T.cruzi passa por uma sequência irreversível de transformações ao longo do tubo digestivo do inseto. Essa doença é transmitida por insetos da ordem Hemíptera, família Rediviidae, subfamília Triatominae, a qual possui aproximadamente 120 espécies descritas. Todos os triatomíneos (barbeiros) são suscetíveis à infecção pelo T.cruzi, em qualquer de seus estádios evolutivos, a partir da sucção de sangue do mamífero infectado. A infecção geralmente permanece no inseto e não lhe traz dano aparente. O parasita se instala no tubo digestivo e no sistema urinário (tubos de Malpighi) do vetor, sendo suas formas infectantes encontradas nas dejeções. Ocorre também, a infecção oral de alguns mamíferos silvestres, como marsupiais e macacos, através da ingestão de triatomíneos (SANTOS et al., 2011).
Figura 3. Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi Fonte: Centers for Disease Control and Prevention, 2010
Rhodnius nasutus é uma espécie de triatomíneo silvestre que tem
distribuição geográfica restrita ao nordeste semiárido do Brasil (DIAS, 2000). No Ceará, R. nasutus tem sido encontrado com frequência no peridomicílio e intradomicílio, demonstrando importância na transmissão da doença de Chagas. Em geral, tem tamanho de dois a três centímetros, apresentam a cabeça longa, os olhos salientes, rosto dobrado sob a cabeça, sendo curto e reto, não ultrapassando as antenas. A partir do seu tubérculo antenífero se diferencia o gênero Rhodnius dos demais, onde neste se apresentam próximo à extremidade anterior da cabeça (ARGOLO et al., 2008).
A forma aguda da doença ocorre por meio de uma lesão inicial com alterações anátomo-fisiopatológicas e inflamação na área onde houve a picada do inseto, devido à secreção salivar. A forma crônica da doença se manifesta de três maneiras, sendo elas: assintomática (indeterminada), oligossintomática e a forma crônica clássica (determinada). A principal forma de transmissão da doença de Chagas é a vetorial, sendo a maior parte das infecções dos humanos e de outros animais vertebrados, produzida através do contato da
pele ou de mucosas, com fezes ou urina dos vetores, insetos hematófagos contaminados com T. cruzi. Entretanto, as demais formas de transmissão não podem ser descartadas, como a via congênita (COURA, 2011), e os riscos ocasionais de transmissão: por acidentes de laboratório; manejo de animais infectados; transplante de órgãos, por intermédio do leite materno ou fissura mamilar e por via oral, ou seja, ingestão de alimentos contendo o triatomíneo contaminado. A transmissão por via oral ocorre principalmente na região amazônica pela ingestão do caldo de cana de açúcar e principalmente consumo do suco do açaí processado artesanalmente, sendo responsável por 80% dos casos de contaminação da doença por via oral no Brasil segundo a Secretária de Saúde Publica - SESPA (Diário do Pará, 2010).
Sob uma perspectiva de intervenção e controle, a ação efetiva contra os triatomíneos domiciliados é suficiente para interromper a curto e médio prazo a transmissão da doença de Chagas em áreas endêmicas, principalmente se acompanhada de bom controle das transfusões de sangue. Os barbeiros nascem livres de parasitas e podem se infectar em qualquer estádio evolutivo ao sugarem um reservatório infectado. As possibilidades de infecções dependem de fatores diversos como: o nível de parasitemia do reservatório, a quantidade de sangue ingerida, a cepa do parasito, espécie do vetor, etc. O diagnostico da doença de Chagas é feito por métodos parasitológicos, radiológicos e por testes sorológicos (STEINDEL et al., 2008).
No Brasil há um predomínio dos casos crônicos da Doença de Chagas com estimativa de aproximadamente três milhões de indivíduos infectados. Ultimamente, foi observado casos de fase aguda da doença com ocorrência nos estados da Amazônia e, casos isolados, em outros estados associados, principalmente a surtos familiares por meio da transmissão por via oral do T.
cruzi relacionados à ingestão de alimentos contaminados (PINTO et al., 2008).
Em regiões próximas da Amazônia como na cidade de Antioquia na Colômbia, casos da doença foram registrados devido ao consumo de alimentos contaminados com fezes de marsupiais, levando um paciente ao óbito (RIOS et al., 2011).
Atualmente o tratamento da Doença de Chagas consiste em dois fármacos, o benzonidazol e o nifurtimox (MACHADO et al., 2011). Ambos os medicamentos possuem maior efetividade para infecções agudas e pouca ação
para as formas crônicas (DIAS et al., 2009; JANNIN e VILLA, 2007). A diferença na ação destes dois fármacos para o tratamento da doença, pode estar associada com diferenças geográficas de susceptibilidade do T. cruzi em relação aos fármacos, devido a diversidade genética que o parasita apresenta (ANDRADE et al., 1985; REVOLLO et al., 1998; NEVES et al., 2011), além do surgimento de cepas mais resistentes e tipos diferentes de infecções (MARTINS et al., 2007).
A falta de eficiência apresentada pelos medicamentos usuais e além dos sérios efeitos colaterais, contribui ainda mais com a dificuldade no tratamento (MACHADO et al., 2011). O medicamento Nifurtimox, por exemplo, apresenta alterações psíquicas, anorexia, irritabilidade, sonolência, náuseas, vômitos e diarreia. O tratamento com Benzonidazol favorece reações como dermatite com erupções cutâneas, parestesias, polineurite dos nervos periféricos, depressão dos ossos e medula, consequentemente levando ao aparecimento de púrpura trombocitopênica e agranulocitose (OLIVEIRA et al., 2008; SOUZA et al., 2012). Sendo assim, a baixa adesão ao tratamento contribui bastante para o fracasso e/ou resistência dos fármacos. A toxidez, a baixa eficiência dos medicamentos, assim como a falta de interesse por parte das indústrias farmacêuticas em desenvolver produtos para o tratamento destas doenças, visto que é uma doença que afeta principalmente uma população menos favorecida, demonstra uma necessidade iminente em realizar novas pesquisas com a formulação de novos medicamentos com uma segurança e eficácia maior para o tratamento da Doença de Chagas (OLIVEIRA et al., 2008; DIAS et al., 2009; SOUZA et al., 2012).
Nesse contexto, os produtos naturais são fontes de substâncias bioativas com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de doenças negligenciadas, como a Doença de Chagas (ALVIANO et al., 2012) e muitos estudos foram realizados com o objetivo de descobrir novas alternativas evidenciando a presença de substâncias ativas contra esse parasita.
As substâncias presentes em plantas que apresentam ação inseticida, podem se tornar alternativas para o controle de insetos vetores de parasitas de doenças.
3.6. Potencial alimentício das plantas
Instituições de pesquisa em todo o mundo exploram a gigantesca biodiversidade natural. No entanto, os objetivos práticos de valorização e uso das riquezas biológicas ocorrem de maneira lenta. Em relação à diversidade de plantas com potencial alimentício, é pouco conhecido e pesquisado. Atualmente, existe um aumento pela procura de produtos saudáveis, de origens conhecidas e que de alguma maneira auxiliem na conservação ambiental, e estimulem o desenvolvimento de produtos inovadores (LORENZI et al., 2015). É importante ressaltar que muitos produtos alimentícios têm expressiva participação na economia do país, como o açaí, em que a maior parte é devido ao extrativismo (IBGE, 2015).
As plantas alimentícias não convencionais (PANC), com destaque na mídia nacional devido ao seu alto valor nutricional e facilidade de cultivo, atraem o interesse para desenvolvimento e pesquisa. São rústicas e resistentes às adversidades ambientais e com isso não necessitam de agrotóxicos e tão pouco de grandes tratos culturais. Dentre essas plantas podemos destacar taioba, araruta, mangarito, hibisco ou vinagreira, chicória-do-pará, capuchinha, jacatupé, cará, jurubeba, cubiu, bertalha, ora-pro-nóbis, caruru, beldroega, azedinha, serralha, peixinho, almeirão-de-árvore, capiçoba. Algumas espécies vegetais são nativas e outras introduzidas por colonizadores europeus ou por escravos africanos (BRASIL, 2010).
Plantas aromáticas também podem ser utilizadas como condimentos e o interesse pelas indústrias na utilização destas espécies botânicas cresce em relação a produção natural de condimentos que são vendidos usualmente, visto que podem proporcionar maior tempo de prateleira, manutenção do aroma e raramente sofrem contaminação microbiológica, garantindo a qualidade dos produtos processados (RAINFOREST, 2013).
Os óleos essenciais também possuem aplicações variadas, como em perfumaria, flavorizantes em alimentos e na medicina. Cada componente tem uma aplicação especifica. Por exemplo, o 1,8-cineol na medicina é utilizado como expectorante e desinfecção do nariz e garganta, além de ser usado em produtos para gripes e resfriados, desobstrução das vias respiratórias,
anti-sépticos em produtos de higiene pessoal e na área cosmética (WANG, 2005). O p-cimeno como aditivo na indústria de perfumaria; linalol na perfumaria e como flavorizante, entre outros. No Brasil, as folhas de Alpinia, além do seu uso medicinal, são utilizadas como alimento, por exemplo, em saladas. Relatos sobre o uso de plantas medicinais em entrevistas de campo realizadas no estado do Acre pelo grupo da Embrapa local associam esse hábito alimentar com a melhora de problemas estomacais, constipação, entre outros (WANG, 2005).
Algumas espécies alimentícias como o cambuci (Campomanesia phea
O. Berg Landrum) possuem alta versatilidade nos pratos culinários, além de
serem alimentos com altas concentrações de antioxidantes (KINUPP, 2007; LORENZI 2014). Folhas de ora-pro-nóbis (Pereskia aculeata), são ricas em ferro, cálcio, zinco, além de possuírem altos níveis proteicos (17 a 25 g de proteína a cada 100 g de peso seco), conhecida como “carne de pobre”, podendo ser utilizada em suplementação nutricional (KINUPP, 2007). Spondias
tuberosa, popurlamente conhecida como Umbuzeiro, é uma espécie bastante
citada entre as plantas medicinais, assim como também é muito mencionada para finalidades alimentícias em comunidades localizadas na Caatinga, devido a presença alta quantidade de vitamina C, sais minerais e nutrientes como cálcio, magnésio e potássio nos seus frutos (ALBUQUERQUE et al., 2010).
Sendo assim, a evolução na utilização de alimentos industrializados diminui o cultivo e o consumo de hortaliças, principamente aquelas não convencionais, tornando o padrão de alimentação mais pobre. Dessa maneira, são necessárias ações que promovam e estimulem o consumo de alimentos ricos em vitaminas e minerais, a inserção de plantas alimentícias não convencionais na alimentação (BRASIL, 2010). Estudos contínuos sobre novas espécies vegetais com potenciais alimentícios são importantes a fim de aumentar e aprimorar conhecimentos que contribuam com uma melhor qualidade de vida para a população (BRASIL, 2010).
4. METODOLOGIA
4.1. Coleta e identificação botânica
As espécies botânicas Alpinia zerumbet e Alpinia vittata foram coletadas em diferentes épocas do ano, nos canteiros experimentais da FIOCRUZ. A identificação foi realizada pelo Dr. Marcelo Neto Galvão de Farmanguinhos/FIOCRUZ. Os cupões foram depositados na Coleção Botânica de Farmanguinhos/FIOCRUZ, com números de identificação CBPM 672 e 675, respectivamente. O corte de folhas frescas foi medido usando um pachymeter. Fragmentos medidos com cerca de 78,9 ± 22,6 mm2.
4.2. Obtenção dos óleos essenciais
As folhas (900 g) de cada espécie vegetal foram rasuradas em pequenos pedaços e colocadas em um balão de destilação de 5 L com água destilada. O processo de hidrodestilação ocorreu por 2 horas, utilizando uma aparelhagem do tipo Clevenger, para a extração do óleo essencial. A fase aquosa, obtida após filtração, foi liofilizada e submetida à partição líquido-líquido utilizando solventes orgânicos de polaridade crescente (hexano, diclorometano e acetato de etila) para obtenção dos respectivos extratos.
4.3. Identificação dos constituintes dos óleos essenciais
4.3.1. Cromatografia com fase Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massa (CG-EM)
A análise dos extratos das espécies de Alpinia foram realizadas por meio de cromatografia com fase gasosa (Agilent 6890N) acoplada com um sistema de espectrômetro de massa quadripolar (Agilent 5973N), com ionização por impacto eletrônico (70 eV), onde a separação foi realizada utilizando uma coluna de DB-5MS capilar de sílica (30 m X 0,25 mm Dl x 0,25 µm de espessura de filme). As condições de funcionamento da coluna foram: a
temperatura do forno iniciou em 40°C durante 5 min até 300ºC (4ºC/min), onde permanece por 10 min. A temperatura do injetor foi mantida a250ºC. O volume da amostra injetada foi de 1 µL. A pressão foi de 0,54 psi, fluxo foi de 0,5 mL/min e velocidade média de 26 cm/sec.
4.3.2. Cromatografia com fase Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG-DIC)
As amostras foram analisadas e quantificadas por cromatografia com fase gasosa (Agilent 6890N) com detector de ionização de chama, onde a separação foirealizada utilizando uma coluna HP-6890N DB-5 capilar de sílica (30 m X 0,25 mm Dl x 0,25 µm de espessura de filme). As condições de funcionamento da coluna foram: gás portador hidrogênio; fluxo de 0,5 mL/min; injetor (série Agilent 7683); temperatura de forno 40°C, mantida durante 5 min, seguido de aquecimento a 4°C/min até 300°C, com um tempo de espera final de 10 min. Os padrões utilizados para as análises foram 1,8-cineol, 4-terpineol, β-pineno e α-pineno (todos marca Sigma-Aldrich).
Foram calculados e determinados os índices de retenção de acordo com os tempos de retenção dos constituintes dos óleos essenciais com aqueles de uma série de n-alcanos (C10-C40). Os índices de retenção foram determinados de acordo com bibliografias descritas e padronizadas na literatura (ADAMS, 2007; BIERI et al., 2006; LU et al., 2005).
4.4. Ensaio de atividade biológica contra o vetor da doença de Chagas
O ensaio de atividade biológica em triatomíneos (Rhodnius nasutus) foi realizado em parceria com o laboratório de Ecoepidemiologia da Doença de Chagas (Fundação Oswaldo Cruz). Os óleos de Alpinia zerumbet e Alpinia
vittata foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 75, 125
a 250 µg/mL, sendo aplicado 1,0 µL em cada inseto. O óleo foi aplicado topicamente na parte ventral do abdômen das ninfas de 5º estádio do inseto com auxílio de uma micropipeta automática.
Grupos de teste e grupos controle (tratados com DMSO), com 30 insetos para cada grupo, sendo divididos em três subgrupos de 10 individuos cada. Todos foram armazenados em tubo de ensaio com um papel de filtro no interior como suporte para locomoção do inseto. Tecido de náilon foi utilizado para cobrir a extremidade do tubo. Antes e após o tratamento com as amostras, os grupos teste e controle foram pesados individuamente, assim como antes e depois de se alimentarem, em balança analítica de precisão, uma vez por semana durante 6 semanas. Durante a semana inicial, todos os grupos foram observados com intervalo de 24, 48 e 72 horas após a aplicação das amostras. Nas semanas seguintes, o acompanhamento foi realizado a cada dois dias para análise do número de ecdises e a taxa de mortalidade. Camundongos albinos vivos foram utilizados para alimentação dos insetos, através da sucção do sangue. Durante o ensaio foi analisada a média de perda de peso, longevidade, duração e viabilidade do 5º estádio e mortalidade dos insetos. As etapas foram conservadas em condições laboratoriais com temperatura variando entre 24 a 30 ºC e umidade do ar em torno de 60–85%.
As substâncias majoritárias dos dois óleos essenciais foram testadas em
R. nasutus. Dessa forma, foram testados o 4-terpineol, β-pineno, 1,8-cineol e
α-pineno.
Os dados obtidos foram avaliados pela análise de Cluster para similaridade de índice conforme o Paleontological statistics (PAST) e pela análise de variância (ANOVA 1; P0,05). O erro padrão foi calculado por meio da média dos experimentos. As médias também foram comparadas pelo teste de Tuckey - Kramer (P 0,05), quando apresentada diferença significativa entre as médias.
4.5. Avaliação preliminar do potencial alimentício das espécies vegetais de
Alpinia
Folhas de Alpinia (300g) foram coletadas, cortadas e analisadas na forma crua.
4.5.1. Determinação de umidade e cinzas
As análises foram realizadas pelo método gravimétrico das normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
4.5.2. Determinação de proteínas
As amostras de cada espécie vegetal foram pesadas (0,05 g) em triplicata no papel de seda e colocadas em tubos de digestão da mistura catalítica desulfato de cobre e sulfato de potássio (0,05 g) foi pesada em papel de seda e adicionada aos tubos. Cuidadosamente, foram adicionados 3 mL de ácido sulfúrico concentrado. Os tubos foram levados para o bloco digestor dentro da capela de exaustão e a temperatura foi aumentando gradativamente de 80ºC até 450ºC. A análise foi realizada de acordo com as normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
4.5.3. Determinação de lipídeos e carboidratos
Os lipídeos foram obtidos por extração em aparelho de Soxhlet e os carboidratos foram analisados pelo método titulométrico Lane-Eynon utilizando o reagente de Fehling. As análises foram realizadas de acordo com as normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz (2008).
4.5.4. Determinação de fibras totais
O cálculo foi realizado utilizando a diferença entre as demais frações da composição centesimal (umidade, cinzas, lipídeos, proteínas e carboidratos).
4.5.5. Determinação do valor calórico
Para o cálculo do valor energético, foram usados fatores de conversão para carboidratos, gorduras e proteínas. Cada grama de carboidrato e proteína corresponde a 4 kcal e cada grama de lipídeo corresponde 9 kcal (RDC 359, 2003).
4.5.6. Preparo das amostras cozidas
Os tempos utilizados para o processo de cozimento foi de 30, 20 e 10 minutos (DAMODARAN et al., 2010; SANTOS et al., 2003).
A água de cozimento, foi submetida a partição liquido-liquido com solventes de diferentes polaridades (hexano, diclorometano e acetato de etila) para obtenção dos respectivos extratos. O extrato aquoso resultante foi extraído 5 vezes com cada solvente e a planta cozida foi extraída com etanol até o esgotamento.
4.5.7. CLAE/DAD
Os extratos aquosos e acetato de etila oriundos do cozimento das folhas por 30, 20 e 10 minutos das espécies de Alpinia zerumbet e A. vittata foram preparados na concentração de 1 mg/ml, centrifugados e analisados qualitativamente por CLAE com o, aparelho da marca Shimadzu (Tóquio, Japão) proeminence UFLCXR, equipado com detector de matriz de diodo SPDM20A (DAD), duas bombas LC10ADXR, injetor automático e interface CBM -20A. As amostras foram analisadas por coluna de fase reversa C-18 (hypersil ODS, 25 cm x 4,5 mm, 4,6 µm de tamanho de partícula). O sistema de solventes foi A (água + 0,1% de ácido fórmico) e o B (acetonitrila). O gradiente de eluição utilizado foi: condição inicial (5% B), 3,5 min (10% B), 13-18 min (15%), 20 min (20% B), 30min (25% B), 35min (60% B) e por fim, até 49 min (100% B). O fluxo foi de 1 mL/min e a temperatura da coluna foi mantida a 35ºC. O volume de injeção foi de 1μl. Os perfis cromatográficos foram avaliados a 254 nm e 360 nm. Os flavonóides e as kavapironas foram identificados por comparação de tempos de retenção com alguns padrões (diidro-5,6-desidrokavaína - DDK e rutina) e os espectros UV característicos dessas classes químicas. Os padrões químicos utilizados nas análises foram dissolvidos em metanol na concentração de 200 μg/mL.
4.5.8. Determinação do conteúdo de fenóis totais
O método de Folin-Ciocalteu foi utilizado para determinação dos fenólicos totais das duas espécies botânicas de Alpinia. As amostras (extrato aquoso e acetato de etila) proveniente do cozimento das plantas foram pesadas e diluídas com 1 mL de metanol e misturadas com 2,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu (diluído 10 vezes) e 2 mL de 7,5% (w/v) de carbonato de sódio. A amostra sem extrato (branco) foi estabelecida com o reagente Folin, carbonato de sódio e metanol. As misturas foram aquecidas por 5 minutos na temperatura de 50ºC, as quais após o resfriamento, foi submetida a leitura no espectrofotômetro a 760 nm. A curva de calibração foi realizada com o ácido gálico (intervalo de 10 a 250 µg/mL) como padrão e os resultados foram determinados a partir da equação da reta da curva de calibração, que foi expressa como equivalente de ácido gálico (GAE) em mg/100g de material.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os óleos essencias das espécies de Alpinia zerumbet e Alpinia vittata foram avaliados com objetivo de aplicação como inseticida, visando futura aplicação na área de prevenção de insetos de interesse na saúde pública. Nesse contexto, uma espécie de inseto vetor da doença de Chagas, Rhodnius
nasutus foi utilizado para os ensaios. Adicionalmente, a análise do potencial
alimentício foi avaliada levando em consideração seus diferentes usos, a facilidade de cultivo e a abrangência mundial.
5.1. Extração dos óleos essenciais
Os rendimentos dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação com as folhas de A. zerumbet e A. vittata estão apresentados na Tabela 1. Foram coletados igualmente 900 g de planta em cada coleta.
Tabela 1. Rendimentos dos óleos essenciais das folhas de Alpinia zerumbet e Alpinia vittata
coletadasem diferentes épocas do ano
Espécie vegetal Massa/col. Coleta 1 (%) Coleta 2 (%) Coleta 3 (%) Coleta 4 (%)
Alpinia zerumbet 900 g 0,32 0,30 0,45 0,33
Alpinia vittata 900 g 0,04 0,08 0,07 0,05
Coleta 1 = 09/2015; Coleta 2 = 02/2016; Coleta 3 = 05/2016; Coleta 4 = 09/2016.
Os dados da Tabela 1 demostram que a extração das folhas de Alpinia
zerumbet apresentou maiores rendimentos dos óleos essenciais em relação a Alpinia vittata, com teor médio de 0,35%, sendo o maior rendimento observado
na coleta 3 (maio/2016), com 0,45% de óleo. Na literatura é descrito cerca de 0,25% do rendimento em relação ao óleo essencial da Alpinia zerumbet (BARCELOS et al., 2010). Blanck e colaboradores (2005) relatam que mudanças sazonais podem induzir um efeito positivo ou não no rendimento de óleos essenciais e, segundo Burt (2004), algumas modificações podem ser oriundas de diferentes tipos de solo, época de coleta, clima, secagem e umidade relativa do ar. Com relação à espécie A. vittata, nota-se que seus
respectivos teores não se alteraram significativamente com as mudanças sazonais. Com relação ao óleo produzido por hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger, a quantidade obtida das folhas de A. vittata foi menor que a de A.
zerumbet, que produziu mais da fração volátil provavelmente devido a maior
número de estruturas secretoras do tipo células oleíferas em toda a folha de
Alpinia zerumbet(TOMLINSON, 1969).
5.2. Identificação e quantificação dos constituintes químicos dos óleos
Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia com fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Os resultados das análises dos cromatogramas estão apresentados nas Tabelas 2 e 3 onde estão listados os constituintes químicos com seus respectivos tempos de retenção (TR) e teores (%) relacionados à composição do óleo essencial de cada espécie de Alpinia nas quatro coletas realizadas. As análises dos cromatogramas dos óleos essenciais de A. zerumbet permitiram identificar 18 componentes químicos sendo os majoritários o 1,8-cineol (média das coletas 16,49%) e o 4-terpineol (média das coletas 23,99%) (Figura 4). Esses resultados corroboram com o descrito por Ali et al. (2002) para o óleo essencial de A. zerumbet. Os constituintes, β-pineno (média das coletas 28,40%) e α-pineno (média das coletas 7,37%) (Figura 5) foram identificados como os majoritários do óleo de A. vittata. Estes monoterpenos estão presentes no óleo de A. zerumbet como constituintes minoritários (média das coletas 3,17% e 1,76% respectivamente) como pode ser observado na tabela 2.
(a) (b)
Figura 4. Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de Alpinia zerumbet. (a) 1,8-cineol, (b) 4-terpineol
(a) (b)
Figura 5.Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de Alpinia vittata. (a) β-pineno, (b) α-pineno
Tabela 2.Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia zerumbet provenientes de quatro coletas
Constituintes Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4
TR (%) TR (%) TR (%) TR (%) α-tujeno 12,6 3,29 12,6 3,79 12,6 3,74 13,2 4,83 α-pineno 12,9 1,48 12,9 1,62 12,9 1,70 13,5 2,26 canfeno 13,6 0,18 13,6 0,16 13,6 0,21 14,3 0,23 sabineno 14,7 4,15 14,7 3,09 14,7 13,85 15,3 12,97 β-pineno 14,8 2,72 14,8 3,32 14,9 3,00 15,5 3,65 β-mirceno 15,4 0,64 15,4 0,69 15,4 1,10 16,1 0,95 felandreno 16,1 0,20 16,1 0,25 16,1 0,34 16,7 0,32 α-terpineno 16,6 1,78 16,6 2,93 16,6 3,99 17,2 4,22 ρ-cimeno 16,9 13,00 16,9 9,37 16,9 4,77 17,5 5,33 limoneno 17,1 1,82 17,1 1,92 17,1 1,78 17,7 1,70 1,8-cineol 17,2 18,50 17,2 17,08 17,2 15,32 17,8 15,08 α-terpinoleno --- --- 19,4 1,67 19,4 2,03 20,0 1,94 cis-hidrato de sabineno 20,0 1,12 20,3 1,78 20,0 2,19 20,7 1,62 4-terpineol 23,2 28,42 23,2 29,51 23,2 19,72 23,8 18,32 trans-cariofileno 31,5 1,19 31,5 1,50 31,5 3,17 32,1 4,76 α-humulene 32,6 0,17 32,6 0,23 --- --- 33,3 0,66 óxido de cariofileno 36,5 2,35 36,5 2,26 36,5 1,86 37,2 2,12 α-eudesmol --- --- --- --- --- --- 39,4 0,61 Outros 18,99 18,83 21,23 18,43
Tabela 3. Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia vittata proveniente de quatro coletas
Constituintes Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4
TR % TR % TR % TR % α- pineno 12,9 7,04 12,9 6,96 12,9 10,08 13,6 5,40 Sabineno 14,7 0,65 14,7 0,56 14,7 1,18 --- --- β - pineno 14,9 28,99 14,9 27,38 14,9 35,27 15,5 21,99 Limoneno 17,1 0,81 17,1 0,89 17,1 1,46 --- --- α-cubebeno 29,0 2,59 29,0 3,79 29,0 2,07 29,7 4,43 α-copaeno 30,0 3,03 30,0 4,67 30,0 2,44 30,7 5,10 β-cubebeno 30,4 2,58 30,4 3,12 30,4 2,44 31,1 3,78 t-cariofileno 31,5 1,20 31,5 1,50 31,5 0,97 32,1 1,94 Aromadendreno 32,8 0,88 32,8 1,19 32,8 0,67 33,4 1,43 δ-cadinol 34,5 13,55 34,5 13,13 34,5 13,06 35,2 14,76 Outros --- 38,68 --- 36,81 --- 30,36 --- 41,17
TR = tempo de retenção em minutos; % = percentagem do constituinte
De acordo com os dados apresentados, grande parte das substâncias identificadas são da classe de monoterpenos, confirmando os dados encontrados por Abdel-Mogib (2002), que relatou que a maior parte dos constituintes de óleos essenciais são monos e sesquiterpenos. No óleo essencial da Alpinia zerumbet, houve variação dos componentes em relação as coletas. A primeira coleta e a segunda coleta (81,01% e 81,17% de substâncias identificadas, respectivamente), apresentaram 77,3% e 77,1% de monoterpenos e 3,7% e 3,9% de sesquiterpenos, por essa ordem. Na terceira e quarta coleta (78,77% e 81,57% de substâncias identificadas, respectivamente), observaram-se valores de 73,7% e 73,4% de monoterpenos e um aumento no teor de sesquiterpenos, 5,0% e 8,1%, respectivamente. Para
Alpinia vittata, as coletas 1 e 2 (61,32% e 63,19% de substâncias identificadas,
respectivamente) apresentaram valores de 37,4% e 35,7% para monoterpenos e 23,8% e 27,4% para sesquiterpenos, por essa ordem. Já na coleta 3 (69,64% identificados) realizada em maio de 2016, houve um aumento significante nos teores de monoterpenos, 47,9%, e para sesquiterpenos, 21,6%. A coleta 4 (58,83% das substâncias identificadas) apresentou diminuição no teor de monoterpenos, 27,3% e um aumento de quase 10% para sesquiterpenos,
31,4%, em relação ao ano anterior (coleta 1, 09/2015). Essa diferença pode estar associada à mudanças climáticas e no solo.
Por meio das análises dos cromatogramas obtidos por CG/EM, foi possível analisar as composições químicas dos óleos essenciais dessas espécies e identificar a prevalência do 1,8-cineol e 4-terpineol no óleo essencial de A. zerumbet e que estão associados a algumas atividades biológicas comprovadas. O componente 1,8-cineol é relacionado a uma atividade anestésica local suave e também comoantimicrobiano, usado em infecções na boca e garganta (GHELARDINI et al., 1999). A variação nas proporções dos constituintes dos óleos essenciais pode depender da parte utilizada da planta, o nível do desenvolvimento ou o dia da coleta, cultivo da planta, quimiotipo e fatores ambientais. Essas alterações podem ocorrer durante as estações do ano. As coletas de Ocimum gratissimum realizadas na Índia, durante a estação úmida e quente, proporcionaram aumento nos teores dos óleos, quando comparadas com as coletas no período mais frio e seco (CHOUDHURY et al., 1986). No caso de Alpinia zerumbet, essas variações foram mais significantes em relação a coleta 2 (02/2016) e a coleta 3 (05/2016), onde foi possível observar uma queda nos teores quando ocorre a mudança do verão para o outono. Alpinia vittata apresentou variações, sendo a mais acentuada em (05/2016) com um valor bem maior do que nas demais coletas.
Para uma composição padronizada, as extrações devem ser realizadas sob as mesmas condições, do mesmo órgão da planta com crescimento no mesmo solo, sob o mesmo clima e mesma estação (SIMÕES et al, 2007). Os óleos essenciais podem apresentar uma ação semelhante aos agentes antioxidantes sintéticos, comumente utilizados pela indústria de alimentos para o controle de radicais livres e agentes oxidantes. Normalmente, esses óleos não produzem efeitos nocivos a saúde quando associados aos antioxidantes sintéticos. Nesse aspecto, a utilização de óleos essencias em alimentos com o objetivo de aumentar a sua vida útil durante armazenamento, pode minimizar a degradação dos constituintes essenciais, como vitaminas (RUBERTO, 2000).
Os componentes majoritários das duas espécies estudadas (1,8-cineol e 4-terpineol para A. zerumbet e β-pineno e α-pineno para A. vittata) foram quantificados por CG/DIC utilizando respectivos padrões. Os resultados estão listados na tabela 4.
Tabela 4.Quantificação dos constituintes majoritários dos óleos essenciais das folhas de A. zerumbet e A. vittata (µg/mg±desvio padrão)
Coleta 1,8-CINEOL 4-TERPINEOL α-PINENO β-PINENO
VITCL1 N.D.±--- N.D.±--- 53,148±0,340 314,737±2,150 VITCL2 N.D.±--- N.D.±--- 66,791±2,698 378,608±8,932 VITCL3 N.D.±--- N.D.±--- 55,678±1,404 318,944±7,871 VITCL4 N.D.±--- N.D.±--- 35,151±0,627 228,161±4,535 ZERCL1 142,453±0,448 238,737±1,334 10,715±0,068 21,356±0,067 ZERCL2 165,708±0,177 334,042±0,030 18,934±1,000 47,708±3,219 ZERCL3 184,802±4,919 296,245±8,161 17,578±0,388 37,993±1,055 ZERCL4 189,735±6,442 267,117±10,186 18,110±0,500 40,470±1,297
N.D. = Não Detectado; VITCL1 = Alpinia vittata coleta 1; VITCL2 = Alpinia vittata coleta 2; VITCL3 = Alpinia vittata coleta 3; VITCL4 = Alpinia vittata coleta 4; ZERCL1 = Alpinia zerumbet
coleta 1; ZERCL2 = Alpinia zerumbet coleta 2; ZERCL3 = Alpinia zerumbet coleta 3; ZERCL4 = Alpinia zerumbet coleta 4;
As concentrações de 1,8-cineol, α-pineno, β-pineno e 4-terpineol no óleo essencial das duas espécies de Alpinia foram determinadas pela equação da reta gerada pelas curvas analíticas construídas com padrões externos. As curvas analíticas apresentaram fator de correlação entre 0,9975 até 0,9997 (figuras 6 a 9).
Figura 6. Curva de calibração com o padrão 1,8-cineol utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.
Figura 7. Curva de calibração com o padrão α-pineno utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.
Figura 8. Curva de calibração com o padrão β-pineno utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.
Figura 9. Curva de calibração com o padrão 4-terpineol utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.
Para o óleo de A. vittata coletado em fevereiro de 2016 (verão), observou-se que componente β-pineno apresentou um teor de 378 µg/mg e o α-pineno de 66,79 µg/mg. Já no óleo de A. zerumbet, o constituinte majoritário, o 4-terpineol, apresentou 334 µg/mg na amostra também em fevereiro de 2016. A Alpinia zerumbet coletada em setembro de 2016 apresentou 189,7 µg/mg de 1,8-cineol. O óleo essencial de Alpinia vittata foi analisado pela primeira vez.
