Identificação e quantificação dos constituintes químicos dos óleos

Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia com fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Os resultados das análises dos cromatogramas estão apresentados nas Tabelas 2 e 3 onde estão listados os constituintes químicos com seus respectivos tempos de retenção (TR) e teores (%) relacionados à composição do óleo essencial de cada espécie de Alpinia nas quatro coletas realizadas. As análises dos cromatogramas dos óleos essenciais de A. zerumbet permitiram identificar 18 componentes químicos sendo os majoritários o 1,8-cineol (média das coletas 16,49%) e o 4-terpineol (média das coletas 23,99%) (Figura 4). Esses resultados corroboram com o descrito por Ali et al. (2002) para o óleo essencial de A. zerumbet. Os constituintes, β-pineno (média das coletas 28,40%) e α- pineno (média das coletas 7,37%) (Figura 5) foram identificados como os majoritários do óleo de A. vittata. Estes monoterpenos estão presentes no óleo de A. zerumbet como constituintes minoritários (média das coletas 3,17% e 1,76% respectivamente) como pode ser observado na tabela 2.

(a) (b)

Figura 4. Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de Alpinia zerumbet. (a) 1,8-cineol, (b) 4-terpineol

(a) (b)

Figura 5.Estrutura química dos constituintes majoritários do óleo essencial de Alpinia vittata. (a) β-pineno, (b) α-pineno

Tabela 2.Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia zerumbet provenientes de quatro coletas

Constituintes Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4

TR (%) TR (%) TR (%) TR (%) α-tujeno 12,6 3,29 12,6 3,79 12,6 3,74 13,2 4,83 α-pineno 12,9 1,48 12,9 1,62 12,9 1,70 13,5 2,26 canfeno 13,6 0,18 13,6 0,16 13,6 0,21 14,3 0,23 sabineno 14,7 4,15 14,7 3,09 14,7 13,85 15,3 12,97 β-pineno 14,8 2,72 14,8 3,32 14,9 3,00 15,5 3,65 β-mirceno 15,4 0,64 15,4 0,69 15,4 1,10 16,1 0,95 felandreno 16,1 0,20 16,1 0,25 16,1 0,34 16,7 0,32 α-terpineno 16,6 1,78 16,6 2,93 16,6 3,99 17,2 4,22 ρ-cimeno 16,9 13,00 16,9 9,37 16,9 4,77 17,5 5,33 limoneno 17,1 1,82 17,1 1,92 17,1 1,78 17,7 1,70 1,8-cineol 17,2 18,50 17,2 17,08 17,2 15,32 17,8 15,08 α-terpinoleno --- --- 19,4 1,67 19,4 2,03 20,0 1,94 cis-hidrato de sabineno 20,0 1,12 20,3 1,78 20,0 2,19 20,7 1,62 4-terpineol 23,2 28,42 23,2 29,51 23,2 19,72 23,8 18,32 trans-cariofileno 31,5 1,19 31,5 1,50 31,5 3,17 32,1 4,76 α-humulene 32,6 0,17 32,6 0,23 --- --- 33,3 0,66 óxido de cariofileno 36,5 2,35 36,5 2,26 36,5 1,86 37,2 2,12 α-eudesmol --- --- --- --- --- --- 39,4 0,61 Outros 18,99 18,83 21,23 18,43

Tabela 3. Constituintes do óleo essencial das folhas de Alpinia vittata proveniente de quatro coletas

Constituintes Coleta 1 Coleta 2 Coleta 3 Coleta 4

TR % TR % TR % TR % α- pineno 12,9 7,04 12,9 6,96 12,9 10,08 13,6 5,40 Sabineno 14,7 0,65 14,7 0,56 14,7 1,18 --- --- β - pineno 14,9 28,99 14,9 27,38 14,9 35,27 15,5 21,99 Limoneno 17,1 0,81 17,1 0,89 17,1 1,46 --- --- α-cubebeno 29,0 2,59 29,0 3,79 29,0 2,07 29,7 4,43 α-copaeno 30,0 3,03 30,0 4,67 30,0 2,44 30,7 5,10 β-cubebeno 30,4 2,58 30,4 3,12 30,4 2,44 31,1 3,78 t-cariofileno 31,5 1,20 31,5 1,50 31,5 0,97 32,1 1,94 Aromadendreno 32,8 0,88 32,8 1,19 32,8 0,67 33,4 1,43 δ-cadinol 34,5 13,55 34,5 13,13 34,5 13,06 35,2 14,76 Outros --- 38,68 --- 36,81 --- 30,36 --- 41,17

TR = tempo de retenção em minutos; % = percentagem do constituinte

De acordo com os dados apresentados, grande parte das substâncias identificadas são da classe de monoterpenos, confirmando os dados encontrados por Abdel-Mogib (2002), que relatou que a maior parte dos constituintes de óleos essenciais são monos e sesquiterpenos. No óleo essencial da Alpinia zerumbet, houve variação dos componentes em relação as coletas. A primeira coleta e a segunda coleta (81,01% e 81,17% de substâncias identificadas, respectivamente), apresentaram 77,3% e 77,1% de monoterpenos e 3,7% e 3,9% de sesquiterpenos, por essa ordem. Na terceira e quarta coleta (78,77% e 81,57% de substâncias identificadas, respectivamente), observaram-se valores de 73,7% e 73,4% de monoterpenos e um aumento no teor de sesquiterpenos, 5,0% e 8,1%, respectivamente. Para

Alpinia vittata, as coletas 1 e 2 (61,32% e 63,19% de substâncias identificadas,

respectivamente) apresentaram valores de 37,4% e 35,7% para monoterpenos e 23,8% e 27,4% para sesquiterpenos, por essa ordem. Já na coleta 3 (69,64% identificados) realizada em maio de 2016, houve um aumento significante nos teores de monoterpenos, 47,9%, e para sesquiterpenos, 21,6%. A coleta 4 (58,83% das substâncias identificadas) apresentou diminuição no teor de monoterpenos, 27,3% e um aumento de quase 10% para sesquiterpenos,

31,4%, em relação ao ano anterior (coleta 1, 09/2015). Essa diferença pode estar associada à mudanças climáticas e no solo.

Por meio das análises dos cromatogramas obtidos por CG/EM, foi possível analisar as composições químicas dos óleos essenciais dessas espécies e identificar a prevalência do 1,8-cineol e 4-terpineol no óleo essencial de A. zerumbet e que estão associados a algumas atividades biológicas comprovadas. O componente 1,8-cineol é relacionado a uma atividade anestésica local suave e também comoantimicrobiano, usado em infecções na boca e garganta (GHELARDINI et al., 1999). A variação nas proporções dos constituintes dos óleos essenciais pode depender da parte utilizada da planta, o nível do desenvolvimento ou o dia da coleta, cultivo da planta, quimiotipo e fatores ambientais. Essas alterações podem ocorrer durante as estações do ano. As coletas de Ocimum gratissimum realizadas na Índia, durante a estação úmida e quente, proporcionaram aumento nos teores dos óleos, quando comparadas com as coletas no período mais frio e seco (CHOUDHURY et al., 1986). No caso de Alpinia zerumbet, essas variações foram mais significantes em relação a coleta 2 (02/2016) e a coleta 3 (05/2016), onde foi possível observar uma queda nos teores quando ocorre a mudança do verão para o outono. Alpinia vittata apresentou variações, sendo a mais acentuada em (05/2016) com um valor bem maior do que nas demais coletas.

Para uma composição padronizada, as extrações devem ser realizadas sob as mesmas condições, do mesmo órgão da planta com crescimento no mesmo solo, sob o mesmo clima e mesma estação (SIMÕES et al, 2007). Os óleos essenciais podem apresentar uma ação semelhante aos agentes antioxidantes sintéticos, comumente utilizados pela indústria de alimentos para o controle de radicais livres e agentes oxidantes. Normalmente, esses óleos não produzem efeitos nocivos a saúde quando associados aos antioxidantes sintéticos. Nesse aspecto, a utilização de óleos essencias em alimentos com o objetivo de aumentar a sua vida útil durante armazenamento, pode minimizar a degradação dos constituintes essenciais, como vitaminas (RUBERTO, 2000).

Os componentes majoritários das duas espécies estudadas (1,8-cineol e 4-terpineol para A. zerumbet e β-pineno e α-pineno para A. vittata) foram quantificados por CG/DIC utilizando respectivos padrões. Os resultados estão listados na tabela 4.

Tabela 4.Quantificação dos constituintes majoritários dos óleos essenciais das folhas de A. zerumbet e A. vittata (µg/mg±desvio padrão)

Coleta 1,8-CINEOL 4-TERPINEOL α-PINENO β-PINENO

VITCL1 N.D.±--- N.D.±--- 53,148±0,340 314,737±2,150 VITCL2 N.D.±--- N.D.±--- 66,791±2,698 378,608±8,932 VITCL3 N.D.±--- N.D.±--- 55,678±1,404 318,944±7,871 VITCL4 N.D.±--- N.D.±--- 35,151±0,627 228,161±4,535 ZERCL1 142,453±0,448 238,737±1,334 10,715±0,068 21,356±0,067 ZERCL2 165,708±0,177 334,042±0,030 18,934±1,000 47,708±3,219 ZERCL3 184,802±4,919 296,245±8,161 17,578±0,388 37,993±1,055 ZERCL4 189,735±6,442 267,117±10,186 18,110±0,500 40,470±1,297

N.D. = Não Detectado; VITCL1 = Alpinia vittata coleta 1; VITCL2 = Alpinia vittata coleta 2; VITCL3 = Alpinia vittata coleta 3; VITCL4 = Alpinia vittata coleta 4; ZERCL1 = Alpinia zerumbet

coleta 1; ZERCL2 = Alpinia zerumbet coleta 2; ZERCL3 = Alpinia zerumbet coleta 3; ZERCL4 = Alpinia zerumbet coleta 4;

As concentrações de 1,8-cineol, α-pineno, β-pineno e 4-terpineol no óleo essencial das duas espécies de Alpinia foram determinadas pela equação da reta gerada pelas curvas analíticas construídas com padrões externos. As curvas analíticas apresentaram fator de correlação entre 0,9975 até 0,9997 (figuras 6 a 9).

Figura 6. Curva de calibração com o padrão 1,8-cineol utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.

Figura 7. Curva de calibração com o padrão α-pineno utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.

Figura 8. Curva de calibração com o padrão β-pineno utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.

Figura 9. Curva de calibração com o padrão 4-terpineol utilizado para quantificação dos constituintes químicos dos dois óleos.

Para o óleo de A. vittata coletado em fevereiro de 2016 (verão), observou-se que componente β-pineno apresentou um teor de 378 µg/mg e o α-pineno de 66,79 µg/mg. Já no óleo de A. zerumbet, o constituinte majoritário, o 4-terpineol, apresentou 334 µg/mg na amostra também em fevereiro de 2016. A Alpinia zerumbet coletada em setembro de 2016 apresentou 189,7 µg/mg de 1,8-cineol. O óleo essencial de Alpinia vittata foi analisado pela primeira vez.

Foram identificados traços das substâncias que comumente são encontradas na Alpinia zerumbet, como o 1,8-cineol e 4-terpineol. Essa evidência pode estar associada ao gênero.

Alguns estudos demonstraram que terpenos voláteis sintetizados por espécies vegetais, podem ter propriedades biológicas significativas. O β-pineno apresentou CL50 de 42,5 ppm para larvas de terceiro estádio de Aedes

aegypti, indicando que possivelmente sua ligação dupla exocíclica pode ser

mais importante que a ligação dupla endocíclica presente no α-pineno que apresentou 74,3 ppm. A presença de uma carbonila com insaturação nos carbonos α e β, pode estar ligada a importante atividade biológica (SIMAS et al., 2004).