Aula14-TecnicasdeBiologiaMolecularestudodeDNA

Técnicas de Biologia Molecular: estudo do

DNA (extração, Hibridação de

transferência de Southern, PCR,

Eletroforese, Sequênciamento)

Curso de Biomedicina

Disciplina Biologia Molecular Renata Canalle

Introdução

Extração e purificação de DNA

Amplificação de DNA por PCR

Eletroforese: análise de DNA em gel de agarose

Southern Blot: detecção de fragmentos de DNA

imobilizados

Técnicas de Biologia Molecular

1970- ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

corta a molécula de DNA em pontos específicos,

podendo isolar um gene

1975- TÉCNICA DE SOUTHERN BLOTTING

o uso da sonda identifica um gene específico (relacionado

a doença) no meio de tantos outros

ELETROFORESE DE DNA

método para separação de fragmentos de DNA em uma

matriz sólida que de acordo com o tamanho separa o

Técnicas de Biologia Molecular

1983- TÉCNICA DA PCR:

reação em cadeia da polimerase

“Polymerase Chain Reaction”

amplifica um gene específico, permitindo sua análise

1989-

revista Science elegeu a PCR como:

“maior desenvolvimento científico”

1977 - TÉCNICA DE SEQUÊNCIAMENTO

determina a seqüência nucleotídica de fragmentos de DNA;

permite que genomas inteiros sejam seqüenciados

Extração e purificação de DNA

Principal problema a ser resolvido no isolamento de DNA bacteriano ou

eucariótico é a remoção de proteínas (principalmente DNases) e de RNA

Células sem parede celular: uma combinação de proteinase K, detergente

e extração com fenol pode ser usada diretamente para romper as células e remover as proteínas

Extração e purificação de DNA

Coleta da amostra do paciente - 5 a 10 ml

(sangue, fluido aminótico, vilosidade coriônica, urina) - anticoagulante

Extração do DNA

Fenol/ clorofórmio

- Fenol/ clorofórmio, precipita as proteínas - clorofórmio/ álcool isoamílico, remove

qualquer traço de fenol remanescente - DNA retirado da fase aquosa

- Proteínas coletadas na interface das fases fenólica e aquosa

Extração e purificação de DNA

Fenol/ clorofórmio

1. Transferir o sangue para um tubo de falcon, centrifugar por 15’ e descartar o plasma

2. Transferir o coagulado para um tubo novo e suspender as células em

tampão de extração (Tris-HCl, EDTA, SDS - dodecil sulfato de sódio)

3. Adicionar proteinase K (100 µg/mL) – incubar 3 h 50O_C

4. Em um tubo falcon 15 ml, adicionar igual volume de Fenol equilibrado em tampão, misturar levemente

5. Centrifugar por 10’ a 3500 rpm

6. Passa fase aquosa p/ outro falcon 15 ml 7. Repete passos 1 a 3 com mesmo vol. Fenol

8. Adicionar mesmo vol. Clorofórmio/ álcool isoamílico (24:1), mistura na mão

9. Centrifugar por 10’ a 3500 rpm

10. Passa fase aquosa para outro tubo

11. Precipitação com 0,1 vol de acetado de Na 3M e 2,5 vol etanol gelado 12. Recolhe DNA com bastão de vidro, lavar o DNA com atanol 70%

13. Seca ao ar

14.Ressuspender em TE 7,5 (10 mM Tris pH 7,5 / 1 mM EDTA)

EDTA – impede ação das DNases (quelante de cátions positivos, Mg+2_, cofator de diversas nucleases) SDS – detergente Acetado de sódio e etanol gelado – retirar o DNA da solução (desidrata o DNA)

Extração e purificação de DNA

Fenol/ clorofórmio

Precipitação (sal e etanol absoluto): medusa de DNA viscosidade

Extração e purificação de DNA

Coleta da amostra do paciente - 5 a 10 ml

(sangue, fluido aminótico, vilosidade coriônica, urina)

Extração do DNA

Kit comercial

-solução de lise celular

(incubar; centrifugar)

- solução de lise de núcleo

-solução de precipitação de proteínas

(centrifugar)

- Isopropanol (medusa)

- etanol 70%

Extração e purificação de DNA

A Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

Uma curta região de uma molécula de DNA, um único gene, é copiada

muitas vezes por uma enzima DNA-polimerase, do Thermus aquaticus, in vitro

Qualquer região de uma molécula de DNA pode ser selecionada, desde

que sequências sejam conhecidas

2 pequenos oligonucleotídeos (primers), que atuam como iniciadores,

devem delimitar a região que será amplificada, hibridizando com a molécula de DNA, um com cada uma das fitas da dupla hélice

Após amplificação exponencial, o DNA amplificado pode ser visualizado

por meio de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio

A Reação em Cadeia da Polimerase - PCR

O princípio da PCR envolve três etapas básicas, que são repetidas por vários ciclos (30-40 ciclos):

1. Desnaturação térmica do DNA molde

2. Anelamento de oligonucleotídeos sintéticos (primers), que funcionam

como os iniciadores da reação de polimerização, a cada uma das fitas do DNA molde

3. Polimerização das novas fitas de DNA a partir de cada um dos iniciadores, utilizando cada um dos quatro dNTP (desoxirribonucleotídeos) como

substrato da reação de polimerização

“PRIMERS” delimitam a

seqüência a ser amplificada

Reação em cadeia da polimerase

amplificação enzimática de uma seqüência específica DNA

72ºC 55-65ºC

94ºC

REAÇÃO: DNA (molde), primers, taq polimerase,

nucleotídeos (dNTPs), tampão, cloreto de magnésio e água

Os primeiros 4 ciclos de um PCR em detalhes. No terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto são copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o tamanho são copiadas. Resultado final = acúmulo exponencial (2n_{) do fragmento}

específico de DNA, onde n é igual ao número de ciclos realizados

Definição das características

dos iniciadores (primer)

T_m = 2(A+T) + 4(G+C)ºC

Temperatura de anelamento ideal: 1-5ºC abaixo do valor de T_m 1. tamanho: entre 10 e 30 pb (417 _{= 17.179.869.184 pb)}

2. Composição de bases: conteúdo GC de aproximadamente 50%, visando maximizar a especificidade da reação

3. Não deve ter complementaridade dentro de uma mesma seq., nem entre as seq. dos iniciadores

Montagem da Reação de PCR

Volume final da reação de PCR = 42 µL

2,0 DNA 100 ng/ µL

200 ng

0,2 Taq polimerase 5U/µL

1U 1,0 Iniciador 2: 100ng/µL 100 ng 1,0 Iniciador 1: 100ng/µL 100 ng 0,4 dNTP 25 mM cada 200 µM 5,0 Tampão de reação 10X 1X 32,4 H₂O

µL/tubo

Reagente estoque

Concentração

final

Obs.: preparar um tubo de controle negativo (branco): todos os reagentes exceto o DNA. Todo o material envolvido deve estar o mais estéril possível para evitar contaminação por DNA exógeno: ponteiras, tubos tipo Eppendorf para PCR, micropipetas, luvas, soluções e água, reagentes, vidraria

Definições dos parâmetros de amplificação

•Etapa 1 – desnaturação: 92 a 95ºC por 15 s – 1 min

• Etapa 2 – anelamento: T_m -5ºC a T_m por 30 s – 2 min

•Etapa 3 – extensão: 72 a 75ºC por 30 s – 2 min (depende do tamanho de DNA a ser amplificado

•Etapa 4 – repetição das etapas 1 a 3 por cerca de 25-40 vezes

•Etapa 5 – extensão final: temperatura da etapa 3 por cerca de 5-10 min, garante que toda a população de DNA amplificada encontre-se como fita dupla e de tamanho completo

•Etapa 6 – incubação a 4ºC por um tempo indefinido

•Agarose diluída em tampão

(fundido microondas, 60ºC)

separação de fragmentos de DNA por tamanho (pb)

(gel de agarose ou poliacrilamida)

•Deixar a agarose solidificar

em uma forminha (molde)

pente

•Aplicação das amostras (produtos de

PCR) no gel polimerizado de agarose

poço

gel

tampão de corrida (TBE)

azul: tampão de amostra (azul de bromofenol, sacarose, TBE)

Moléculas de diferentes

tamanhos aparecem

como “bandas” no gel

GEL: funciona como uma

peneira retardando movimentos

de moléculas maiores

Quanto menor for a molécula

de DNA, mais rapidamente ela

pode migrar pelo gel, em

direção ao eletrodo +

Cuba de eletroforese - vertical

•Cuba de eletroforese ligada na

Fonte para separação dos

fragmentos

(campo elétrico)

●DNA:

carga

negativa

•Região de interesse é vista no gel na

forma de um fragmento de tamanho

específico, que pode ser excisado do

gel e purificado para manipulação

Observação do gel (corado com

brometo de etídeo, intercalante de

DNA) no transiluminador (UV)

Marcador de peso molecular

Eletroforese em gel de agarose 2% analisado sobre luz ultra violeta. Amplificação do DNA de formas de Leishmania mostrando formação de banda na altura de 120pb. 600 pb Corante de amostra: xileno cianol -corridas longas, fragmentos maiores

•Agarose: polímero linear extraído de algas marinhas

•Gel: formado por uma complexa rede desse polímero

•Corante de DNA: intercalante de DNA fluorescente em UV – brometo de etídeo (colocado no gel ou no tampão de corrida)

•Gel de agarose (rotina): possui poros grandes - indicado para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas centenas de pares de bases até cerca de 40-50 kb (indicado para fragmentos maiores)

•Fragmentos com tamanhos menores (1 a 300 pb), indicada a eletroforese em gel de poliacrilamida, poros extremamente pequenos (separa fragmentos com a diferença de apenas um nucleotídeo)

Parâmetros que afetam a migração do

DNA de fita dupla em gel de agarose

1. Tamanho da molécula de DNA, concentração de agarose e marcadores moleculares

- moléculas maiores migram mais lentamente

- concentração de agarose: determina o intervalo de tamanho das moléculas que podem ser adequadamente separadas (quanto mais concentrado, 2%, separa fragmentos com menor diferença em pb)

0,3% 5-60 kb 2,0% 0,1-2 kb

- uso de marcador de massa molecular (ladder) compatível com o material analisado

Parâmetros que afetam a migração do

DNA de fita dupla em gel de agarose

2. Conformação do DNA e agentes intercalantes

- circular, linear

- limite de detecção por agentes intercalantes – 10 ng

- intensidade de fluorescência é diretamente proporcional à massa molecular do fragmento de ácido nucléico

3. Voltagem aplicada

- moléculas de DNA migram através do gel com velocidade diretamente proporcional à voltagem aplicada – até 5V/cm 4. Tampão de corrida

- baixa força iônica, migração muito lenta - alta condutividade, desnatura DNA

Vantagens e desvantagens da PCR

Vantagens:

- Velocidade (rápida)

- Alta sensibilidade

- Requer pouco DNA inicial

- Extremamente específica

- DNA gravemente

degradado

Desvantagens:

- Informação sobre a seqüência

de DNA

- Tamanho pequeno do produto

- quantidades limitadas do

produto

- infidelidade na replicação do

DNA (1 erro a cada 300 pb)

Aplicações da PCR

Detecção de fragmentos cromossômicos

Detecção de mutações de ponto; análise forense (PCR-RFLP)
Detecção de deleções

Sequenciamento de DNA
Diagnóstico pré-natal

Diagnóstico por meio da detecção de sequências de DNA

específicas de um determinado patógeno, como, por exemplo: o gene da toxina da cólera; sequências de DNA específicas de T. cruzi (no diagnóstico da Doença de Chagas); detecção de seq. de DNA específicas do vírus HIV

Teste de paternidade, por meio de uma análise comparativa do

padrão de amplificação de sequências genômicas específicas entre filho, mãe e o provável pai

Aplicações da PCR

Diagnóstico

pré-natal

Diagnóstico pré-natal e detecção de portadores da distrofia muscular Duchenne envolvendo a triagem de deleções e duplicações usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex. O paciente 1 não tem as bandas e e f, deleção dos éxons 45-48. O paciente 2 não tem as bandas f e h e o paciente 3 não tem a banda d.

Aplicações da PCR

Taq (1U) Biotools

1,0 µL 10uM Primer P278 1,0 µL 10uM Primer P277 1,0 µL 5mM ou 1,25 mM cada dNTP 3,0 µL 50mM MgCl₂ 2,5 µL 10 X Tampão sem MgCl₂ 13,0 µL ----H₂O Volum e Concentração Mix Protocolo de amplificação

P278 5´ACC TTA GGG TTG CCC ATA AC 3´ P277 5´GGC AGA GCC ATC TAT TGC TTA 3´

Seqüências de Primers 1 X ∞ 4 ºC 10 `` 72 ºC 60 `` 72 ºC 30 `` 55 ºC 35 X 30 `` 94 ºC Ciclos

Aplicações da PCR

Mutação no códon 6 (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI (c/tnag); assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb

87 pb 201 pb 88 pb 288 pb 201 pb 87-88 pb AA AS SS Produtos de digestão Genótipos possíveis Fragmento amplificado, sem digestão: 382 pb

1975 - Método padrão para análise da estrutura

do DNA cortado por enzimas de restrição,

A técnica de Southern blot baseia-se na hibridação entre moléculas de DNA, fixas em um suporte (membrana de nitrocelulose), com sondas (moléculas de DNA ou RNA) marcadas, visando à localização de sequências específicas de DNA

Princípio básico: desnaturação do DNA e complementaridade de bases entre moléculas de diferentes origens

• Transferência do gel para a membrana de nitrocelulose: por capilaridade ou a vácuo • Desnaturação: formamida

Desnatura o DNA ainda no gel

Marcador de peso molecular radioativo

Hibridação com sonda fita única radioativa Lavagem para

retirar sonda não hibridizada

Transferência dos fragmentos separados por eletroforese no gel para uma membrana de nitrocelulose

Transferência

Southern

Metodologia para o teste de paternidade e prova forense

Procedimento padrão para

diagnóstico de doenças

genéticas, laboratórios de

diagnóstico molecular: identifica

a presença de um gene,

deleções de exons

Detecção de mutações

pontuais; mapeamento

de restrição e detecção

de RFLPs

ANÁLISE ESTRUTURAL

ATTGCGCTAGCTAG

CTTTTTAGCCCGCTA

CTATTAGCCCTTAG

CCCTGACATTAGCC

CCGCTAGCGCTAGT

AGCCCTTAGCCCTG

ACATTAGCCCCGCG

• Método baseado na terminação da cadeia

• DNA de fita única serve como molde para a síntese de uma

série de fitas complementares que terminam em nucleotídeos

específicos

 Sequenciamento didesoxi

 Sequenciamento automático

Sequenciamento de nucleotídeos pelo método do término do crescimento da cadeia (Sanger). Lehninger,

Principles of Biochemistry. Figura 10-36, p. 352.

Auto-radiografia

5’ 3’ dXTP:ddXTP 100:1 3’ 5’

O produto da reação de sequenciamento é submetido à eletroforese em uma raia de gel. À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos

são excitados e a luz emitida é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma

de sequência através de um computador.

Sequenciador automático