Alterações macroscópicas no crescimento femoral de ratos adultos submetidos à desnutrição no período de lactação

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF INSTITUTO BIOMÉDICO

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA - MMO CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA

EWERTON CASTRO BEZERRA

ALTERAÇÕES MACROSCÓPICAS NO CRESCIMENTO FEMORAL DE RATOS ADULTOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO

NITERÓI 2014

B574 Bezerra, Ewerton Castro

Alterações macroscópicas no crescimento femural de ratos adultos submetidos à desnutrição no período de lactação / Ewerton Castro Bezerra. - Niterói: [s.n.], 2013.

43 f. :il.

Trabalho de Conclusão de Curso ( graduação em Biomedicina) - Universidade Federal Fluminense, 2014. 1. Desnutrição. 2. Lactação. 3. Ratos. 4. Fêmur. I. Título

EWERTON CASTRO BEZERRA

ALTERAÇÕES MACROSCÓPICAS NO CRESCIMENTO FEMORAL DE RATOS ADULTOS SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO

Orientador:

Prof. Dr. Márcio Antonio Babinski

Niterói, RJ 2014

Monografia apresentada ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Federal Fluminense para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina com habilitação em pesquisa científica e ênfase em Morfologia.

ALTERAÇÕES MACROSCÓPICAS NO CRESCIMENTO FEMORAL DE RATOS ADULTOS CUJAS MÃES FORAM SUBMETIDAS À DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE

LACTAÇÃO

Monografia apresentada ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Federal Fluminense para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina com habilitação em pesquisa científica e ênfase em Morfologia.

Aprovada em ___ de ______________ de 20__.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________________________________ Prof. Dr. Márcio Antonio Babinski – UFF

Orientador

___________________________________________________________________________ Profª. Drª. Carla Ferreira Farias Lancetta – UFF

1º Examinador

___________________________________________________________________________ Profª. Drª. Viviane Alexandre Nunes Degani – UFF

2º Examinador Niterói

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho à toda minha família e à minha noiva por todo apoio e carinho a mim

A Deus, autor de todo conhecimento e de toda a vida, por todo amor e misericórdia destinados a mim. A Ele todo domínio e honra para sempre.

Aos meus pais que sempre estiveram do meu lado, me incentivando, corrigindo e aconselhando sempre com muito carinho. Agradeço por todo investimento feito em minha vida. “Lança teu pão sobre as águas, porque depois de muitos dias o acharás.” Eu sou fruto do árduo trabalho deles. Sinto-me honrado e eternamente grato a Deus por ter nascido nesta família.

Ao meu querido e amado irmão William. Sempre foi meu melhor amigo. Tivemos sim nossas desavenças, mas jamais deixamos o sol se pôr sob a nossa ira. É um exemplo de homem, servo, ministro, cristão e amigo para mim. Sou grato por todas as conversas que tivemos, por tudo que, juntos, passamos.

Ao amor da minha vida, minha princesa e futura esposa, minha noiva Leidiane Cristina Germano. Instrumento maravilhoso de Deus, responsável pela grande guinada na minha vida. À toda minha família, tios, primos e amigos por todas as orações, apoio, momentos de riso e momentos de choro compartilhados. Tem sido uma honra viver ao seu lado. Muito obrigado por tudo.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Márcio Antonio Babinski, por todos os ensinamentos e todo investimento dados a mim. Sou eternamente grato por tudo que aprendi com o senhor e por todas as oportunidades que tive através do senhor. Ao fim de tudo, temos nossos rumos separados sim, mas saiba que guardarei, carinhosamente, comigo toda a admiração, respeito e amizade que preservo pelo senhor. Muitíssimo grato por tudo, meu pai acadêmico!

Ao Prof. Rafael Cisne de Paula, com quem aprendi também valorosas lições dentro da anatomia e também fora dela. Muito obrigado por todo investimento e por todas as oportunidades dadas a mim. Muitíssimo obrigado!

Ao Prof. Dr. Mauro Roberto Rodrigues por todo apoio e investimento desde quando cheguei ao LAMEx. Muito obrigado pelos valiosos ensinamentos de vida ministrados. Espero ter herdado sua sinceridade e firmeza de posicionamento, atitudes e palavras. Também irei guardar carinhosamente toda admiração e respeito à sua pessoa.

ainda na Morfo V foi fundamental para que eu não desistisse de Biomedicina. Afinal, foi quem me apresentou ao Prof. Babinski. Apesar do distanciamento ao longo da faculdade, conservo comigo cada conversa e orientação no início conturbado e tortuoso da minha jornada acadêmica. Se cheguei até aqui, a senhora tem papel fundamental nesta conquista e futura carreira. Muitíssimo obrigado por tudo!

Ao Prof. Carlos Chagas por todo aprendizado técnico, pedagógico e até filosófico compartilhado ao longo dos anos. Ensinamentos que levarei como por toda minha trajetória. Ao amigo Rogério Araújo por todo conhecimento e experiência de vida compartilhados em tantos momentos. Muito obrigado por despertar em mim a paixão pela patologia e pelas oportunidades de aprender que tive me concedeu.

Ao amigo e Prof. Rafael Senos por todas as oportunidades concedidas a mim e pelo apoio incondicional oferecidos a mim em tantos momentos ímpares. Levarei comigo todas as valiosíssimas lições aprendidas consigo. Muito obrigado!

Aos meu colegas de turma pela amizade, apoio e carinho.

Aos técnicos do Depto. De Morfologia por todo carinho, amizade e apoio durante todos esses anos.

Ao querido Sr. Ribeiro por todos os cafés, gentilmente, levados a nós do LAMEx, e por todas as agradáveis conversas. Por todo apoio e torcida, muito obrigado.

À querida secretária Márcia Pinheiro de Souza Cruz por toda atenção e carinho durante todos esses anos.

A todos os monitores e colegas de laboratório com quem tive oportunidade de trabalhar durante meu tempo no anatômico, especialmente ao Raul, Marcelo, Laís, Angélica, Bruna, Henrique Laviano, Eduardo Botelho, Victor Vieira, Meg Rocha, Fernanda Boldrini, Caio e Cássio por tudo que aprendi e por desfrutar do privilégio de compartilhar o amor pela anatomia convosco.

Ao Prof. Rodrigo Mota Pacheco Fernandes, por todo apoio e conhecimento compartilhados. Levarei também comigo toda admiração, carinho e respeito ao senhor. A todos os alunos de biomedicina, farmácia, enfermagem, educação física, nutrição e medicina a quem ministrei aulas de anatomia. Muito obrigado por terem me ajudado a construir conhecimento.

Aos funcionários do instituto biomédico, em especial às secretárias da coordenação de biomedicina.

Aos professores Ronald Marques e Claudia Maria Uchôa, coordenadores do curso de Biomedicina, por toda paciência, compreensão e atenção.

EPÍGRAFE

“Porque assim como os céus são mais altos do que a terra, assim são os meus

caminhos mais altos do que os vossos caminhos, e os meus pensamentos mais altos do que os vossos pensamentos.”

A desnutrição é um problema recorrente nos países em desenvolvimento. Vários trabalhos clínicos e experimentais revelam a ação deletéria da desnutrição em diversos órgãos e sistemas. Porém, os estudos que avaliam o crescimento ósseo e alterações morfológicas relacionados a desnutrição no período de lactação são escassos. Com base nessas informações, o objetivo deste trabalho foi verificar as alterações quantitativas sobre a morfologia femoral de ratos adultos cujas mães foram desnutridas durante a lactação. Após o nascimento da ninhada as ratas foram divididas nos seguintes grupos: Controle (C): dieta com 23% de proteína; Restrição proteica (RP): dieta com 8% de proteína; Restrição calórica (RC): dieta com 23% de proteína, em quantidade restrita de acordo com a ingestão. Após o período de lactação (21 dias), os filhotes tiveram livre acesso à dieta normal (23% de proteína) até os 6 meses de idade. Os ratos foram sacrificados e pesados (peso corporal = PC). O fêmur direito foi excisado, dissecado e pesado (peso femoral = PF). Os parâmetros morfométricos macroscópicos analisados foram: comprimento total (CT), diâmetro da cabeça do fêmur (DCA) e diâmetro do colo (DCO). À exceção de CT, todos os parâmetros apresentam-se reduzidos nos grupos experimentais quando comparados ao grupo controle. Entre RPC e RC, não houve significância estatística. Os resultados mostram que a desnutrição materna durante a lactação exerce uma importante influência no desenvolvimento da prole, gerando danos persistentes na vida adulta.

ABSTRACT

Undernutrition is a recurring problem in developing countries. Several clinical and experimental studies have demonstrated the deleterious effects of undernutrition in several organs and systems. However, studies assessing bone growth and morphological changes related to undernutrition during lactation are scarce. Based on this information, the aim of this study was to evaluate the quantitative changes on the femoral morphology of adult rats whose mothers were malnourished during lactation. After the birth, the litter rats were divided into the following groups: Control (C): diet with 23% protein; Protein-Caloric Restriction (RPC): diet with 8% protein; Caloric Restriction (RC): diet with 23% protein in a restrict amount according to the intake. After the lactation period (21 days), the pups had free access to normal diet (23% protein) until 6 months of age. The rats were sacrificed and weighed (body weight = PC ) . The right femur was excised, dissected and weighed (femoral weight = PF ) . The macroscopic morphometric parameters analyzed were: total length (TL ) , diameter of the femoral head ( DCA ) and stem diameter ( DCO ). Except for CT, all parameters were reduced in the experimental groups, in comparison with control group. Between RPC and RC, there was no statistical significance. The results have showed that maternal undernutrition during lactation exerts an important influence on the development of offspring, inducing some persistent damages, even when grown up.

Keywords: Undernutrition – Rats – Macroscopic Changes – Femur

% D -GH - Porcentagem Dias Hormônio do Crescimento h - Hora C - Controle RPC - Restrição Proteico-calórica RC - Restrição Calórica PC PF DCA DCO -Peso Corporal Peso Femoral

Diâmetro da Cabeça do Fêmur Diâmetro do Colo do Fêmur FAO - Food Association Organization

ml - mililitro

g - Grama

p - Valor de p

1. INTRODUÇÃO, p. 14 1.1 MORFOFISIOLOGIA, p. 14

1.1.1 Histologia, p. 14

1.1.2 Anatomia do fêmur do rato, p.16 1.1.3 Fisiologia, p. 18

1.2 DESNUTRIÇÃO, p. 19

1.3 ALTERAÇÕES NO DESENVOLVIMENTO ÓSSEO, p. 20 1.4 RELEVÂNCIA SOCIAL, p. 21 2. OBJETIVOS, p. 22 3. METODOLOGIA, p. 23 3.1 ASPECTOS ÉTICOS, p. 23 3.2 ANIMAIS, p. 23 3.3 GRUPOS, p. 23 3.4 DIETA, p. 24

3.5 LINHA DE TEMPO DO EXPERIMENTO, p. 27 3.6 PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS, p. 28 3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 29 4. RESULTADOS, p. 30 5. DISCUSSÃO, p. 33 6. CONCLUSÃO, p. 36 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 37 8. ANEXOS, p. 43 1 INTRODUÇÃO 1.1 Morfofisiologia

1.1.1 Histologia

O tecido ósseo, principal constituinte do esqueleto, serve de suporte para os tecidos moles, protege órgãos vitais, aloja e protege a medula óssea, formadora de células sangíneas e juntamente com os músculos esqueléticos, forma um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contraçao muscular, além de transformá-las em movimentos úteis.

Composto essencialmente por um tipo especializado de tecido conjuntivo, os ossos caracterizam-se por sua matriz extracelular mineralizada e tipos celulares próprios, como os osteócitos, fundamentais para a manutenção da matriz óssea; os osteoblastos, sintetizadores da porção orgânica da matriz; e os osteoclastos, células gigantes e multinucleadas que reabsorvem o tecido ósseo, participando da remodelação óssea.

Figura 1: Fotomicrografia de tecido ósseo por descalcificação evidenciando os tipos celulares do osso. Coloração HE, aumento 40x.

Figura 2: Fotomicrografia de tecido ósseo por descalcificação evidenciando os tipos celulares do osso. Coloração HE, aumento 40x.

A porção inorgânica representa cerca de 50% do peso da matriz óssea. A deposição de minerais na mesma, sobretudo dos íons cálcio e fosfato, formam cristais de hidroxiapatita, fazendo com que seu estudo histológico seja dificultado, exigindo a utilização de técnicas especializadas. Já a porção organica e constituida de fibras colágenas do tipo I (cerca de 95%) e por pequena quantidade de proteoglicanos e glicoproteínas que podem desempenhar algum papel na mineralização da matriz. Hidroxiapatita e fibras colágenas associadas conferem dureza e resistência ao tecido ósseo.

Observando-se a olho nu a superfície de um osso serrado, verifica-se que ele é formado, macroscópicamente, por partes sem cavidades, o osso compacto, e por partes com muitas cavidades que se intercomunicam, o osso esponjoso. Nos ossos longos, as epífises são formadas por osso esponjoso com uma delgada camada compacta superficial.

Figura 3: Corte grosso de osso seco, ilustrando o osso cortical compacto e o osso esponjoso.

A diáfise, porém, é predominantemente constituída por osso compacto, com uma pequena quantidade de osso esponjoso, profundamente, delimitando o canal medular.

As cavidades do osso esponjoso e o canal medular da diáfise dos ossos longos são ocupados pela medula óssea – hematógena no neonato e amarela na vida adulta (JUNQUEIRA; CARNEIRO. 2008)

1.1.2 Anatomia do fêmur do rato

O fêmur do rato compõe o esqueleto apendicular posterior. Articula-se com o acetábulo pélvico e distalmente com a tíbia e patela. A nomenclatura relacionada aos acidentes anatômicos do fêmur do rato é semelhante a do homem, tendo como diferença a presença de um colo anatômico ligeiramente curto. Também é visível um trocânter robusto e bem definido, denominado terceiro trocânter (figura 1). Este último acidente se estende do trocânter maior (lateralmente) ao terço médio do osso, dando um aspecto alargado à epífise proximal do fêmur.

Figura 4: Desenho esquemático modificado de Greene (1963) mostrando os acidentes anatômicos da superfície extensora (face cranial) do fêmur direito do rato.

Outro aspecto importante é a presença de duas pequenas e bem definidas superfícies articulares para ossos sesamóides, a fabela (fabellae) lateral e a medial, situadas na epífise distal e posterior aos côndilos femorais. As fabelas desenvolvem-se conectadas com os tendões das cabeças proximais do tríceps da sura (figura 2). Na epífise distal observamos ainda que a fossa intercondilar é estreitada, bem como a superfície articular da patela.

Figura 5: Desenho esquemático modificado de Greene (1963) mostrando os acidentes anatômicos da superfície flexora (face caudal) do fêmur direito do rato.

1.1.3 Fisiologia

Há dois mecanismos principais de crescimento ósseo. Primeiro, em resposta ao hormônio do crescimento (GH), os ossos longos crescem em comprimento nas cartilagens epifisárias, onde as epífises, estão separadas das partes longas. Este crescimento provoca primeiramente a deposição de cartilagem nova, seguida por sua conversão em osso novo, aumentando a parte longa e, consequentemente, a distância entre as epífises. Concomitantemente, as cartilagens epifisárias sofrem um consumo progressivo, até que não haja mais cartilagem epifisária alguma que permita crescimento ósseo. Neste momento, então, ocorre a fusão das epífises em cada extremidade, impossibilitando o aumento do comprimento ósseo.

Em segundo lugar, os osteoblastos no periósteo ósseo e em algumas cavidades ósseas depositam osso novo nas superfícies do osso mais antigo. Ao mesmo tempo, os osteoclastos removem o osso antigo. Quanto a taxa de deposição for maior que a de reabsorção, ocorre o aumento da espessura do osso. Neste processo, o GH age como importante estimulador dos osteoblastos. Desta forma, os ossos podem continuar a aumentar de espessura durante toda a vida sob influência do GH; isso é especialmente verdadeiro em ossos membranosos (GUYTON; HALL, 2006).

1.2 Desnutrição

A desnutrição é o resultado final da privação nutricional por parte do indivíduo, que devido a falta de entendimento, pobreza ou outros problemas, são incapazes de prover a devida nutrição. (OMS, 1999)

A desnutrição é um problema de dimensões alarmantes em boa parte do mundo. Associada à pobreza e à desigualdade, é um expressivo fator de mortalidade de crianças nos países em desenvolvimento, apesar dos esforços realizados nas últimas décadas para reduzir esse índice. Segundo um relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS) publicado em 2000, 49% das mortes de crianças menores de 5 anos nos países em desenvolvimento estão relacionadas à

apresentar complicações de saúde na idade adulta. Por isso, a segurança alimentar e nutricional é uma questão básica da saúde para a infância. (UNICEF, 2006)

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), a desnutrição ocorre em 43% das crianças nos países em desenvolvimento (DE ONIS et al, 1993). Em função dessa alta prevalência de desnutrição nos países em desenvolvimento, é importante a realização de trabalhos experimentais a fim de avaliar suas consequências nos diversos sistemas orgânicos. Não há dúvida de que a desnutrição promove alterações estruturais, metabólicas, endócrinas e funcionais em todos os níveis do organismo. Esta afirmativa fundamenta-se em inúmeros trabalhos clínicos e experimentais, que, indiscutivelmente, demonstram a ação deletéria da desnutrição (CHASE, 1973; BECKER, 1983; MOURA et al, 1986).

Alguns trabalhos mostram que a desnutrição materna durante o período de aleitamento causa nos filhotes machos um menor ganho de peso (RAMOS et al, 1997; PASSOS et al, 2000). Esta alteração no ganho de peso permanece até a idade adulta, quando o grupo cujas mães foram submetidas à restrição proteica continua apresentando redução significativa do peso corporal, enquanto aquele cujas mães foram submetidas à restrição calórica apresentou um peso corporal 10% maior que o grupo controle (PASSOS et al, 2000).

A análise morfométrica e ultraestrutural das diferentes células hipofisárias de macacos adultos submetidos à dieta hipoprotéica (10% de proteína), revelou um declínio no número de somatotrofos, lactotrofos, gonadotrofos e tireotrofos (HERBERT, 1980a, b; HEINDEL et al, 1988; CONSOLE et al, 2001). A densidade volumétrica e a porcentagem de distribuição destas células também foram significativamente menores. Nenhuma alteração morfológica foi observada nos corticotrofos. A microscopia eletrônica revelou que todas essas células exibiram alterações sugestivas de hiperfunção compensatória.

Já foi demonstrado que a desnutrição tanto proteica quanto calórica altera o eixo hipotálamo-hipófise-gônada em ratos pré-púberes e adultos. Alguns trabalhos demonstram que a desnutrição na fase pré-puberal reduz as concentrações séricas hormonais de gonadotrofinas, testosterona (HERBERT, 1980a) e o conteúdo de testosterona testicular (GLASS et al, 1979; JEAN-FAUCHER et al, 1982; HERBERT, 1985). No entanto, Glass e colaboradores (1979) também demonstraram que a desnutrição nesta fase não altera as concentrações séricas de testosterona e LH.

No que se refere a experimentos que avaliam os efeitos da ingestão ou restrição alimentar, Medeiros e colaboradores (2002) documentaram que ratos alimentados com dietas deficientes em minerais (cálcio e ferro) apresentaram mudanças drásticas na densidade óssea. Para Chen e colaboradores (2002) ocorrem efeitos na morfologia de fêmur de ratos alimentados com dietas ricas e pobres em concentração de cálcio, revelando maior fragilidade óssea, bem como menor densidade do tecido ósseo.

Kawahara e colaboradores (2002) verificaram os efeitos da restrição calórica no desenvolvimento da placa de crescimento proximal, metafisiária e da cabeça femoral em ratos espontaneamente hipertensos.

Verhaeghe e colaboradores (2000) verificaram através de análises histomorfomométricas os efeitos dos exercícios e sedentarismo na remodelação da massa óssea diafisal de fêmures de ratas. Sato e colaboradores (2002) e Silva Junior e colaboradores (2002) avaliaram morfometricamente reparos ósseos após o uso de irradiação por laser em fêmures de ratos que foram lesados cirurgicamente.

Outros estudos envolvendo desnutrição materna durante a lactação revelaram alterações morfoquantitativas no desenvolvimento ósseo da prole. Os filhotes expostos à desnutrição, além de apresentarem um retardo no ganho de peso corporal, tiveram menor desenvolvimento na tíbia (FERNANDES, et al, 2007), nos ossos do crânio (FERNANDES, et al, 2008) e na mandíbula (DEGANI JUNIOR, et al, 2011).

1.4 Relevância social

Este estudo torna-se de grande importância devido à falta de informações na literatura sobre o crescimento ósseo e alterações morfológicas relacionadas à desnutrição no período de lactação da prole. É um assunto atual e de extrema importância para o ser humano, sobretudo para os coordenadores dos projetos governamentais contra fome e miséria; assuntos para os quais se dá grande ênfase no Brasil e no mundo.

2 OBJETIVOS Objetivo Geral

 Verificar as alterações quantitativas sobre a morfologia femoral de ratos adultos cujas mães foram desnutridas durante a lactação.

Objetivos Específicos

 Avaliar os efeitos da desnutrição materna no período de aleitamento sobre o peso corporal e peso do fêmur dos filhotes na idade adulta;

 Avaliar se a desnutrição materna no período de aleitamento acarreta alterações morfo-quantitativas macroscópicas sobre o crescimento ósseo do fêmur da prole.

 Avaliar se a desnutrição materna durante o período de lactação acarreta alterações morfo-quantitativas macroscópicas no diâmetro da cabeça e do colo anatômico dos femures da prole.

3 METODOLOGIA

3.1 Aspectos Éticos

Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para o cuidado e uso de animais experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro em 31/08/2010 sob o nº CEUA/036/2010) (Anexo 1) e compõe o protocolo de colaboração científica entre a UERJ e UFF (Anexo 2).

3.2 Animais

Foram utilizadas seis ratas Wistar fêmeas, nulíparas, mantidas em biotério com temperatura (25  10ºC) e ciclo claro-escuro (7:00-19:00 horas) controlados. Foram respeitados os princípios descritos em “The Guide for the Care and Use of Laboratory

Aos 3 meses de idade (90dias) estes animais foram acasalados na proporção de 2 fêmeas para 1 macho, recebendo ração comercial (23% de proteína) até o nascimento dos filhotes.

3.3 Grupos

As ratas e suas respectivas proles, então, foram divididas em 3 grupos de tratamento: Controle (C): com livre acesso à água e à dieta normal (ração comercial com 23% de proteína). Restrição proteico-calórica (RPC): com livre acesso à água e à dieta hipoprotéica (8% de proteína). Restrição calórica (RC): com livre acesso à água, porém submetido à dieta normal (ração comercial com 23% de proteína) restrita às mesmas quantidades ingeridas no dia anterior pelo grupo em dieta hipoprotéica. Cada grupo foi composto por duas fêmeas, mantidas em caixas individuais, acompanhadas por seus filhotes.

O grupo de animais em restrição calórica (“pair-feed”), pareados pela quantidade de ração ingerida pelo grupo em dieta hipoprotéica, foi estudado a fim de diferenciar os efeitos causados pela carência exclusiva de proteína daqueles causados pela restrição calórica, uma vez que já foi demonstrado que ratas lactantes submetidas à restrição proteica ingerem uma quantidade menor de ração em relação às ratas controles (PINE et al, 1994; RAMOS et al, 2000).

3.4 Dieta

A dieta hipoprotéica foi preparada manualmente e sua composição é mostrada na tabela 1. A fonte proteica (8%) desta dieta foi a ração comercial macerada (Labina - Purina Nutrimentos LTDA) e as calorias foram compensadas pelo acréscimo de amido de milho, a fim de se obter uma dieta hipoprotéica e isocalórica. As vitaminas e os minerais foram suplementados de maneira a se obter a mesma composição da ração comercial, mostrada nas tabelas 2 e 3, que é baseada nas recomendações do National Research Council e National Institute of Health-USA (REEVES et al, 1993).

Tabela 1- Composição das dietas normo e hipoprotéica Dieta

Kg/dieta

Energia Total – kcal 4070.4 4070.4

Proteína % 23.0 8.0 Hidratos de Carbono % 66.0 81.0 Lipídios % 11.0 11.0 Proteína g 230.0 80.0 Hidratos de Carbono g 676.0 826.0 Lipídios g 50.0 50.0 Mistura de Vitaminas g 4.0 4.0

Mistura de Sais Minerais g 40.0 40.0

*De acordo com as recomendações do American Institute of Nutrition Rodents Diets, AIN-93G (REEVES et al. 1993).

As vitaminas e os minerais foram suplementados de maneira a se obter a mesma composição da ração comercial, mostrada nas tabelas 2 e 3, que é baseada nas recomendações do National Research Council e National Institute of Health-USA (REEVES et al, 1993).

Tabela 2 - Composição da mistura de vitaminas

Vitaminas* g /kg de mistura Ácido Nicotínico 3.000 Ácido Pantotênico 1.600 Piridoxina - B6 0.700 Tiamina - B1 0.600 Riboflavina 0.600 Ácido Fólico 0.200 Biotina 0.020 Cianocobalamina - B12 2.500 Vitamina E (500 UI/g) 15.00 Vitamina A (500,000 UI/g) 0.800 Vitamina D (400,000 UI/g) 0.250 Vitamina K 0.075

*De acordo com as recomendações do American Institute of Nutrition Rodents Diets, AIN-93G (REEVES et al. 1993).

Tabela 3 - Composição da mistura de minerais Minerais * g /kg de mistura Carbonato de cálcio, 40,04% Ca 357.00 Fosfato de Potássio, 22,76% P; 28,73% K 196.00 Citrato de Potássio, 36,16% K 70.78

Cloreto de Sódio, 39,34% Na; 60,66% Cl 74.00 Sulfato de Potássio, 44,87% K; 18,39% S 46.60 Óxido de Magnésio, 60,32% Mg 24.00 Citrato de Ferro, 16,5% Fé 6.06 Carbonato de Zinco, 52,14% Zn 1.65 Carbonato de Manganês, 47,79% Mn 0.63 Carbonato de Cobre, 57,47% Cu 0.30 Iodeto de Potássio, 59,3% I 0.01 Selenato de Sódio, 41,79% Se 0.010 Paramolibidato de Amônio, 54,34% Mo 0.008

*De acordo com as recomendações do American Institute of Nutrition Rodents Diets, AIN-93G (Reeves et al. 1993).

A dieta hipoprotéica foi administrada no dia do nascimento dos filhotes. A ninhada foi ajustada em seis filhotes. Este número de filhotes foi escolhido, pois, segundo Fischbeck & Rasmussen (1987) parece ser este o número de animais que confere o maior potencial lactotófrico. Provavelmente, o tamanho da ninhada influencia muito mais na quantidade de leite produzida do que em sua composição (CRNIC & CHASE, 1978; YAGIL,1976).

Ao final da lactação os filhotes foram desmamados e receberam ração controle com 23% de proteína, sendo acompanhados até 180 dias de idade, quando foram sacrificados.

experimental. Foi realizado um controle diário da quantidade de ração administrada e consumida pelos animais, enquanto o peso corporal e o comprimento foram avaliados em intervalos de quatro dias.

Aos 180 dias de idade, os animais foram anestesiados com pentobarbital (0,15 ml/100g/peso corporal) e o fêmur direito foi dissecado e excisado, com o auxílio de uma lupa estereoscópica com 2,5x de aumento e material de microdissecção.

3.5 Linha de tempo do experimento

Figura 6 - Linha temporal com indicação dos principais eventos que compuseram o delineamento experimental do presente estudo

3.6 Parâmetros morfométricos

Foram analisados 10 ratos machos por grupo, em, cujos fêmures, foram observados os As medições dos diâmetros foram calculadas com o auxílio do software AutoCAD® observando-se os seguintes parâmetros (figura 7):

a) Peso total do rato (PC): foi a primeira medida a ser tomada, utilizando-se uma balança de precisão de 1.0 grama;

b) Peso femoral (PF): medida tomada do fêmur do rato, já dissecado, utilizando a mesma balança;

b) Medida do comprimento total (CT) do fêmur: obtida com o auxílio de paquímetro digital com 1 mm de precisão;

c) Medida do diâmetro da cabeça do fêmur (DCA)*: obtida com o auxílio de paquímetro digital com 1 mm de precisão;

d) Medida do diâmetro do colo do fêmur (DCO)*: obtida com o auxílio de paquímetro digital com 1 mm de precisão.

Figura 7 – Radiografia, obtida através do aparelho de radiografia FDMX200, representando os parâmetros histomorfométricos analisados. CT= comprimento total do fêmur; DCA= diâmetro da

Cabeça do fêmur (DCA)

Comprimento Total do Fêmur (CT)

Colo do Fêmur (DCO)

X

X

X

X

X

X

* As medições de DCA e DCO foram calculadas com o auxílio do software AutoCAD®

3.7 Análise estatística

Foi utilizado o software Graph Prism para a análise estatística dos resultados, que foram expressos em média e desvio padrão da média (SD) e submetidos ao teste Kolmogorov-Smirnov para verificar a distribuição de Gauss. Foi realizado o teste ANOVA para a análise de variância durante a comparação múltipla entre as médias considerando as diferenças entre os grupos com um p≤ 0,05 como significantes (ZAR, 1998; ARANGO, 2001).

4 RESULTADOS

A prole de ratas submetidas à restrição proteico-calórica e calórica durante a lactação apresentou na idade adulta alterações macroscópicas e quantitativas em relação ao grupo controle (tabela 4).

O peso corporal apresentou redução significativa em ambos os grupos RPC (11,3%, p<0,01) e RC (9,9%, p<0,01) em relação ao grupo controle (figura 8).

Figura 8 - Gráfico do peso corporal dos animais nos grupos controle (A), grupo restrição proteica (B) e grupo restrição calórica (C). Os valores são dados como média  desvio padrão de 10 animais.* p < 0,01 vs C.

peso total dos ratos Mean and Standard Deviation

Column A B C 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 P es o c o rp o ra l ( g ) C RP RC

*

*

Da mesma forma, o peso femoral mostrou-se significativamente reduzido nos grupos RPC (20%, p<0,01) e RC (21%, p<0,01) (figura 9).

Figura 9 - Peso dos fêmures nos grupos controle (C), grupo restrição proteico (RP) e grupo restrição calórica (RC). Os valores são dados como média  desvio padrão de 10 animais.* p < 0,001 vs C. O comprimento total do fêmur foi o único parâmetro que não apresentou diferenças estatisticamente significantes em relação ao grupo controle (tabela 4).

Semelhantemente, DCO revelou redução significativa nos grupos RPC (25,7%, p<0,01) e RC (26,4%, p<0,01), quando comparados ao grupo controle (tabela 4).

Por fim, DCA também apresentou alterações significativas em ralação ao grupo controle, com reduções nos grupos RPC (12,75%, p<0,01) e RC (11,11%, p<0,01) (tabela 4).

A comparação de dados entre os grupos experimentais (RPC e RC), não apresentou diferença estatísca em nenhum parâmetro (tabela 4).

Peso do fêmur (g) Mean and Standard Deviation

Column A B C 1 0 P es o d o f êm u r (g )

*

*

Parâmetro C RP RC PC (g) 459,4 ± 43,6 407,6 ± 45,28 (*) 414,04 ± 31,95 (**) PF (g) 1,40 ± 0,06 1,12 ± 0,16 (*) 1,11 ± 0,10 (**) CT (mm) 39,87 ± 1,12 38,95 ± 1,18 (ns) 38,81 ±1,17 (ns) DCO (mm) 2,88 ±0,09 2,14 ± 0,20 (*) 2,12 ± 0,12 (**) DCA (mm) 4,86 ±0,26 4,24 ± 0,28 (*) 4,32 ± 0,21 (**) * = C vs RP (p≤0,01) **= C vs RC (p≤0,01) ns= não significativo 5 DISCUSSÃO

Estudos prévios mostraram que a desnutrição materna durante o período de lactação causa alterações no peso corporal (RAMOS et al, 1997), composição do leite (PASSOS et al, 2000), função tireoidea (PASSOS et al, 2001a,b) e nas concentrações séricas de leptina de filhotes ao desmame (TEIXEIRA et al, 2002). Quando estes animais atingem a vida adulta, as alterações no peso corporal e na função tireoidea mostram-se persistentes (PASSOS et al, 2002). A restrição proteica e calórica durante a lactação também leva ao retardo de crescimento, redução do peso ovariano e uterino, atraso no início da puberdade da prole fêmea (FARIA et al, 2004).

Fernandes et al (2007), em um estudo realizado com tíbias de ratos submetidos à restrições proteica e calórica durante a lactação, observou que este osso apresentou reduções significativas, nos grupos experimentais, em todos os parâmetros analisados, quando comparados ao grupo controle. Tais alterações persistiram mesmo com a oferta de ração normal (23% de proteína) desde o desmame até o dia da eutanásia (180D), revelando que os danos causados no período de aleitamento são irreversíveis na vida adulta (FERNANDES et al, 2007).

Em estudos anteriores, a prole desmamada (21D) de ratas submetidas à restrição protéica e calórica durante a lactação, apresentou um baixo desenvolvimento em seus crânios, quando comparados aos animais do grupo controle. Não obstante, ainda foram constatadas alterações no peso corporal destes animais (FERNANDES et al, 2008). Um outro estudo sobre mandíbulas de ratas com 90 dias de vida, submetidas à mesma desnutrição materna durante a lactação, foi constatado que estes ossos também apresentaram retardo no desenvolvimento mandibular nos grupos experimentais (RPC e RC). As alterações foram persistentes mesmo depois da oferta de ração normal após o desmame. (DEGANI JUNIOR, et al, 2011).

Neste estudo, demonstramos que a restrição proteica e calórica materna durante a lactação, leva alterações macroscópicas quantitativas na prole dos grupos experimentais, ocorrendo alterações significativas em todos os parâmetros avaliados, exceto o comprimento total do fêmur (tabela 4). Tais alterações foram persistentes na vida adulta, mesmo após a normalização da dieta (23% proteína) para todos os grupos. Estes dados confimam o estudos anteriores que revelam os danos irreversíveis da desnutrição materna durante a lactação (FERNANDES et al, 2007).

descreveram que a privação alimentar diminuiu o número de células secretoras de GH e a marcação do hormônio liberador de GH (GHRH) em cortes da eminência média do hipotálamo e os níveis de RNAm para GHRH e GH (BROGAN et al, 1997; CONSOLE et al, 2001).

Observamos que o peso absoluto dos fêmures apresenta-se diminuídos nos animais do grupo RP e RC, sugerindo que o fêmur possa estar sendo afetado diretamente pela desnutrição materna. Os nossos resultados macroscópicos podem confirmar os achados sobre desnutrição de Brogan e colaboradores (1997) e Console e colaboradores (2001).

O retardo no ganho de peso corporal nos grupos RP e RC foi significativo (p≤0,01) (figura 4), no entanto o peso femoral (figura 5) apresenta um retardo ainda maior. Ao que parece, o sistema ósseo sofre drasticamente na desnutrição, assim como diversos órgãos envolvidos com o metabolismo (PASSOS et al, 2001a,b; PASSOS et al, 2002). O retardo no desenvolvimento ósseo observado nestes animais causado pela desnutrição materna,é provavelmente devido ao estado de amadurecimento incompleto do eixo hipotálamo-hipófise (GH)-órgão alvo (osso). Deste modo, o baixo estímulo hormonal poderia ser insuficiente para causar o desenvolvimento normal do sistema ósseo, além do que, o fêmur poderia não estar maduro suficientemente para responder ao estímulo hormonal, resultando na redução do crescimento.

Os resultados do presente estudo concordam e corroboram observações prévias de que a desnutrição durante a lactação promove um retardo no ganho de peso corporal (RAMOS et al, 1997; FERNANDES et al, 2008), e femoral (PASSOS et al, 2001a,b; PASSOS et al, 2002) da prole. Foram observadas também, importantes reduções em DCA e DCO nos grupos experimentais. Fazem-se necessários estudos posteriores para verificar se tais reduções poderiam afetar a competência da articulação fêmoro-acetabular dos animais. À exceção de todos os parâmetros avaliados, CT foi o único a não apresentar diferenças estatísticas significantes entre os três grupos. Apesar de apresentarem comprimentos semelhantes, os fêmures dos ratos sujeitos a RPC e RC apresentaram-se aparentemente curvos. São necessários maiores estudos para afirmar se a desnutrição materna no período de lactação também seria capaz de influenciar na curvatura de tais ossos.

6 CONCLUSÃO

Os resultados gerados neste trabalho mostram que a desnutrição materna durante o período de lactação pode acarretar em alterações macroscópicas esqueléticas da prole, comprometendo o ganho peso corporal e femoral e afetando a morfologia dos fêmures de ratos submetidos à desnutrição.

ARANGO, Héctor Gustavo. Bioestatística teórica e computacional. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

BANCROFT, John; STEVENS, Alan. Theory and practice of histological technique.4 ed. New York: Churchill Livingstone, 1996.

BAYNE, Kathryn. Revised Guide for the Care and Use of Laboratory Animals available. American Physiological Society. The Physiologist, v. 39, n. 4, p. 199, 208, 1996.

BECKER, Dorothy. The endocrine responses to protein calorie malnutrition. Annual review of

nutrition, v. 3, n. 1, p. 187-212, 1983.

BROGAN, Rebeca S.; FIFE, Kenneth S.; CONLEY, Lisa Kay; GIUSTINA, Andrea; WEHRENBERG, William B. Effects of food deprivation on the GH axis:

immunocytochemical and molecular analysis. Neuroendocrinology, v. 65, n. 2, p. 129-135, 1997.

CAMERON, Judy. Regulation of reproductive hormone secretion in primates by short-term changes in nutrition. Reviews of Reproduction, v. 1, n. 2, p. 117-126, 1996.

CHASE, Peter. The effects of intrauterine and postnatal undernutrition on normal brain development. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 205, n. 1, p. 231-244, 1973. CHEN, Huayue; HAYAKAWA, Daisuke; EMURA, Shoichi; OZAWA, Yosuke; OKUMURA, Toshihiko; SHOMURA, Shizuko. Effect of low or high dietary calcium on the morphology of the rat femur. Histology and histopathology, v. 17, n. 4, p. 1129-1135, 2002.

Cónsole, Gloria M.; JURADO, Susana; OYHENART, Evelia Edith; FERESE, Celia;

PUCCIARELLI, Héctor; GOMEZ DUMM, César. Morphometric and ultrastructural analysis of different pituitary cell populations in undernourished monkeys. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 34, n. 1, p. 65-74, 2001.

CRNIC, Linda; CHASE, Peter. Models of infantile undernutrition in rats: effects on milk. The

Journal of nutrition, v. 108, n. 11, p. 1755-1760, 1978.

DE ONIS, Mercedes; MONTEIRO, Carlos Augusto; AKRÉ, James; CLUGSTON, Graeme. The worldwide magnitude of protein-energy malnutrition: an overview from the WHO Global Database on child growth.Bulletin of the World health Organization, v. 71, n. 6, p. 703-712, 1993.

DEGANI JUNIOR, HUGO; NUNES, VIVIANE ALEXANDRE; BEZERRA, EWERTON; RAMOS, CRISTIANE FONTE; RODRIGUES, MAURO ROBERTO;

ABIDU-FIGUEREIDO, MARCELO; CARDOZO, GILBERTO PEREZ; BABINSKI, MARCIO ANTONIO. Maternal food restriction during lactation reduces mandible growth of the female offspring in adulthood: Experimental and morphometric analysis. Int. J. Morphol. ,v. 29, n. 2, p.598-603, 2011.

DELEMARRE-VAN DE WAAL, Henriette; VAN COEVERDEN, Silvia; ENGELBREGT, Mia. Factors affecting onset of puberty. Hormone Research in Paediatrics, v. 57, n. Suppl. 2, p. 15-18, 2004.

ENGELBREGT, Mia; HOUDIJK, Mieke; POPP-SNIJDERS, Corrie; DELEMARRE-VAN DE WAAL, Henriette. The effects of intra-uterine growth retardation and postnatal

undernutrition on onset of puberty in male and female rats. Pediatric research, v. 48, n. 6, p. 803-807, 2000a.

ENGELBREGT, Mia; VAN WEISSENBRUCH, Mirjam; POPP-SNIJDERS, Corrie; DELEMARRE-VAN DE WAAL, Henriette. Impaired ovarian development in intra-uterine growth-retarded rats at the onset of puberty. Horm Res, v. 53, p. OR5-OR44, 2000b.

ENGELBREGT, Mia; VAN WEISSENBRUCH, Mirjam; POPP-SNIJDERS, Corrie; LIPS, Paul; DELEMARRE-VAN DE WAAL, Henriette. Body mass index, body composition, and leptin at onset of puberty in male and female rats after intrauterine growth retardation and after early postnatal food restriction. Pediatric research, v. 50, n. 4, p. 474-478, 2001. ENGELBREGT, Mia; VAN WEISSENBRUCH, Mirjam; POPP-SNIJDERS, Corrie; DELEMARRE-VAN DE WAAL, Henriette. Delayed first cycle in intrauterine growth-retarded and postnatally undernourished female rats: follicular growth and ovulation after stimulation with pregnant mare serum gonadotropin at first cycle. Journal of endocrinology, v. 173, n. 2, p. 297-304, 2002.

FARIA, Tatiane da Silva; RAMOS, Cristiane da Fonte; SAMPAIO, Francisco José Barcelos. Puberty onset in the female offspring of rats submitted to protein or energy restricted diet during lactation. The Journal of nutritional biochemistry, v. 15, n. 2, p. 123-127, 2004. FERNANDES, RODRIGO M.; ABREU, A. V.; SILVA, R. B.; SILVA, D. F.;MARTINEZ, G.

Maternalmalnutrition during lactation reduces skull growth in weaned rat pups: Experimental and morphometric investigation. Anat. Sci. Int., v.83, n. 3, p.123-30, 2008.

FERNANDES, RODRIGO. M. P.; ABREU, A. V.; SCHANAIDER, A; SOARES JR.,E. R.; PEÇANHA, G. C. A.; BABINSKI, MARCIO. ANTONIO. & RAMOS, CRISTIANE da.FONTE. Effects of Protein and Energy Restricted Diet During Lactation Leads to

Persistent Morphological Changes on Tibia Growth in the Weaned Pups. Int. J. Morphol. ,v. 25, n.3, p.565-71, 2007.

FISCHBECK, Karen; RASMUSSEN, Kathleen. Effect of repeated reproductive cycles on maternal nutritional status, lactational performance and litter growth in ad libitum-fed and chronically food-restricted rats. The Journal of nutrition, v. 117, n. 11, p. 1967-1975, 1987. GLASS, Allan R; MELLITT, Richard; VIGERSKY, Robert A; SWERDLOFF, Ronald. Hypoandrogenism and Abnormal Regulation of Gonadotropin Secretion in Rats Fed a Low Protein Diet*. Endocrinology, v. 104, n. 2, p. 438-442, 1979.

GREENE, Eunice Chace. Anatomy of the Rat. London: Hafner Publishing Company, 1963. cap 2, p. 05-29.

GUYTON, ARTHUR; HALL, JOHN. Hormônios hipofisários e seu controle pelo hipotálamo. In:______. Tratado de Fisiologia Médica. 11 ed. São Paulo: Elsevier, 2006. 1115p. cap 75, p. 918-926.

HEINDEL, Jerrold J; BERKOWITZ, Albert S; GROTJAN, Edward; HERBERT, Damon; KLEMCKE, Harold; BARTKE, Andrzej. Pituitary and testicular function in the restricted (Hre_{) rat. International Journal of Andrology, v.11, p.313–326, 1988.}

HERBERT, Damon C. Morphology of the mammotrophs and gonadotrophs in the anterior pituitary gland of rats with protein‐calorie malnutrition. American Journal of Anatomy, v.158, n. 4, p. 521-531, 1980a.

HERBERT, Damon. Growth patterns and hormonal profile of male rats with protein‐calorie malnutrition. The Anatomical Record, v. 197, n. 3, p. 339-354, 1980b.

HERBERT, Damon. Testicular testosterone concentrations in protein-calorie malnourished rats. Systems Biology in Reproductive Medicine, v. 14, n. 1, p. 45-49, 1985.

JEAN-FAUCHER, C; BERGER, M; TURCKHEIM, M; VEYSSIERE, G; JEAN, C. Effect of preweaning undernutrition on testicular development in male mice. International journal of

JUNQUEIRA, LUIZ; CARNEIRO, JOSÉ. Tecido Ósseo. In:_____. Histologia Básica. 11 ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2008. 524 p. cap. 8, p. 135-149.

KAWAHARA, T; SHIMOKAWA, I; TOMITA, M; HIRANO, T; SHINDO, H. Effects of caloric restriction on development of the proximal growth plate and metaphysis of the caput femoris in spontaneously hypertensive rats: Microscopic and computer‐assisted image analyses. Microscopy research and technique, v. 59, n. 4, p. 306-312, 2002.

MEDEIROS, Denis; PLATTNER, Aaron; JENNINGS, Dianne; STOECKER, Barbara.Bone morphology, strength and density are compromised in iron-deficient rats and exacerbated by calcium restriction. The Journal of nutrition, v. 132, n. 10, p. 3135-3141, 2002.

MOROHASHI, Tomio; OHTA, Atsutane; YAMADA, Shoji. Dietary fructooligosaccharides prevent a reduction of cortical and trabecular bone following total gastrectomy in

rats. Japanese journal of pharmacology, v. 82, n. 1, p. 54-58, 2000.

MOURA, Aníbal Sanchez; CARPINELLI, Angelo; BARBOSA, Francisco; GRAVENA, Clarice; MATHIAS, Paulo Cezar Freitas de. Undernutrition during early lactation as an alternative model to study the onset of diabetes mellitus type II. Research communications in

molecular pathology and pharmacology, v. 92, n. 1, p. 73-84, 1996.

MOURA, Egberto Gaspar; RAMOS, Cristiane da Fonte; NASCIMENTO, Celly Cristina; ROSENTHAL, Doris; BREITENBACH, Marisa Maria Dreyer;. Thyroid function in fasting rats: variations in 131I uptake and transient decrease in peroxidase activity. Brazilian journal

of medical and biological research, v. 20, n. 3-4, p. 407-410, 1986.

PASSOS, Magna Cottini Fonseca; RAMOS, Cristiane da Fonte; DUTRA, Sheila Cristina Potente; MOURA, Egberto Gaspar. Transfer of iodine through the milk in protein-restricted lactating rats. The Journal of nutritional biochemistry, v. 12, n. 5, p. 300-303, 2001s.

PASSOS, Magna Cottini Fonseca; RAMOS, Cristiane da Fonte; DUTRA, Sheila Cristina Potente; BERNARDO-FILHO, Mario; MOURA, Egberto Gaspar. Biodistribution of 99mTc-O4Na changes in adult rats whose mothers were malnourished during lactation. Journal of

Nuclear Medicine, v. 43, n. 1, p. 89-91, 2002.

PASSOS, Magna Cottini Fonseca; RAMOS, Cristiane da Fonte; MOUÇO, Tanial; MOURA, Egberto Gaspar. Increase of T3 secreted through the milk in protein restricted lactating rats.

PASSOS, Magna Cottini Fonseca; RAMOS, Cristiane da Fonte; MOURA, Egberto Gaspar. Short and long term effects of malnutrition in rats during lactation on the body weight of offspring. Nutrition research, v. 20, n. 11, p. 1603-1612, 2000.

PINE, A. P.; JESSOP, N. S.; OLDHAM, J. D. Maternal protein reserves and their influence on lactational performance in rats 3. The effects of dietary protein restriction and stage of

lactation on milk composition. British Journal of Nutrition, v. 72, n. 06, p. 815-830, 1994. RAMOS, Cristiane da Fonte; LIMA, A. P. S.; TEIXEIRA, Cintia Vilanova, BRITO P. D., MOURA, Egberto Gaspar. Thyroid function in post-weaning rats whose dams were fed a low-protein diet during suckling. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 30, p. 133-137, 1997.

RAMOS, Cristiane da Fonte; TEIXEIRA, Cintia Vilanova; PASSOS, Magna Cottini Fonseca; PAZOS-MOURA, Carmen Cabanellas; LISBOA, Patricia Cristina; CURTY, Flavio Henrique; MOURA, Egberto Gaspar. Low‐Protein Diet Changes Thyroid Function in Lactating

Rats. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, v. 224, n. 4, p. 256-263, 2000.

REEVES, Philip; NIELSEN, Forrest; FAHEY, George Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J nutr, v. 123, n. 11, p. 1939-1951, 1993.

SATO, Masahiko; VAHLE, John; SCHMIDT, Allen; WESTMORE, Michael; SMITH, Shawn; ROWLEY, Ellen; MA, Yanfei Linda. Abnormal bone architecture and biomechanical properties with near-lifetime treatment of rats with PTH. Endocrinology, v. 143, n. 9, p. 3230-3242, 2002.

SILVA- JUNIOR, Aurelício; PINHEIRO, Antonio; OLIVEIRA, Marília: WEISMANN Ruben, RAMALHO Luciana Maria, NICOLAU Renata Amadei.Computerized morphometric assessment of the effect of low-level laser therapy on bone repair: an experimental animal study. Journal of clinical laser medicine & surgery, v. 20, n. 2, p. 83-87, 2002.

SLOB, Koos; GOY, Robert; VAN DER WERFF TEN BOSCH, Jacob. Sex differences in growth of guinea-pigs and their modification by neonatal gonadectomy and parentally administered androgen. Journal of Endocrinology, v. 58, p. 11 -19, 1973.

food intake and body weight in rats whose mothers were exposed to malnutrition during lactation. The Journal of nutritional biochemistry, v. 13, n. 8, p. 493-498, 2002.

UNICEF . Situação da Infância brasileira 2006. Educação Infantil. 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE. Apresentação de trabalhos monográficos. 10 ed. Niterói: EdUFF, 2012. 83 p.

VERHAEGHE, Jonah; THOMSEN, Jesper Skovhus; VAN BREE, Rita; VAN HERCK, Erik; BOUILLON, Roger; MOSEKILDE, Lis. Effects of exercise and disuse on bone remodeling, bone mass, and biomechanical competence in spontaneously diabetic female rats. Bone, v. 27, n. 2, p. 249-256, 2000.

WADE, George; LEMPICKI, Robin; PANICKER, Anitha; FRISBEE, Richard; BLAUSTEIN, Jeffrey. Leptin facilitates and inhibits sexual behavior in female hamsters. American Journal

of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, v. 272, n. 4, p.

R1354-R1358, 1997.

WIDDOWSON, ELSIE M.; MAVOR, W. O.; MCCANCE, R. A. The effect of undernutrition and rehabilitation on the development of the reproductive organs: Rats. Journal of

Endocrinology, v. 29, n. 2, p. 119-NP, 1964.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. Management of severe malnutrition: a manual for physicians and other senior health workers. 1999.

YAGIL, R.; ETZION, Z.; BERLYNE, G. M. Changes in rat milk quantity and quality due to variations in litter size and high ambient temperature.Laboratory animal science, v. 26, n. 1, p. 33-37, 1976.

Zar JH. Bioestatistical analysis. 4th. edition, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1998.

8 ANEXOS