Anais do Conic-Semesp. Volume 1, 2013 - Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN 2357-8904
TÍTULO: PESQUISA DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM AMOSTRAS DE PESCADO RESFRIADO DESTINADO AO CONSUMO HUMANO, COLHIDAS NAS FEIRAS LIVRES DE SÃO BERNARDO DO CAMPO, SP
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: MEDICINA VETERINÁRIA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE BANDEIRANTE ANHANGUERA
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): VANESSA BRISS SANTOS, JÉSSICA LOPES SHIGEMURA
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): ERCILIA MARIA BORGHERESI CALIL
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): CLAUDIA SIAN BRAZÃO
RESUMO
O pescado é um alimento de extrema importância na dieta dos seres humanos, possui alto valor nutricional, contribuindo na preservação da saúde humana. Porém, as falhas observadas na distribuição do pescado com deficiência na cadeia de frio e o grande número de indivíduos que se alimentam de pescado cru podem contribuir como via de transmissão de agentes infecciosos. Listeria monocytogenes é um microrganismo patogênico, considerado como agente etiológico das toxinfecções alimentares representando um risco potencial para a saúde dos consumidores, principalmente de mulheres gestantes e imunodeprimidos. Embora L. monocytogenes seja amplamente estudada, os dados da literatura são bastante escassos quanto a sua ocorrência em pescado resfriados. Com base nisso, esse estudo teve como objetivo pesquisar a presença de L. monocytogenes em salmão resfriado, destinado ao consumo humano e comercializado em feiras livres na cidade de São Bernardo do Campo utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Até o momento foram estudadas 10 amostras, as quais se apresentaram negativa para L.
monocytogenes. INTRODUÇÃO
Entre os produtos de origem animal, o pescado é um alimento de extrema importância na dieta dos seres humanos, possui um alto valor nutricional, rico em proteínas, vitaminas e sais minerais contribuindo na preservação e manutenção da saúde humana. Porém em algumas situações podem servir como importante via de transmissão de agentes infecciosos. Sabe-se que aproximadamente 43% das zoonoses descritas como de interesse em Saúde Pública, são de origem alimentar o que define a importância do estudo destas enfermidades. (OMS, 2009).
No Brasil, apesar da crescente preocupação com segurança dos alimentos e do aperfeiçoamento dos métodos de diagnósticos, muitas doenças transmitidas por alimentos (DTA) permanecem ainda subdiagnosticadas e subnotificadas, entre elas pode-se citar a listeriose.
O gênero Listeria compreende as espécies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L.
innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. grayi, sendo a L. monocytogenes a espécie
A L. monocytogenes representa uma preocupação constante para as indústrias de alimentos e órgãos oficiais de regulamentação, pois além de sua característica ubiquitária, esta espécie possui habilidade de sobreviver em condições adversas e tem capacidade para crescer em temperaturas de refrigeração, resistir ao congelamento e aos diversos antimicrobianos, tornando um dos microrganismos de grande importância entre os patógenos de veiculação alimentar. (GANDHI & CHIKINDAS, 2007; LOGUERCIO, 2001)
A listeriose apresenta um risco potencial principalmente em mulheres gestantes, neonatos e indivíduos imunodeprimidos. (JAY, 2005). Por ser um patógeno intracelular facultativo, a L. monocytogenes pode atingir diversos órgãos como o sistema nervoso central e a placenta ocasionando meningites, encefalites e abortos listéricos. (GERMANO, 2008). Outros danos podem ocorrer como endocardite, abscessos, lesões granulomatosas no fígado e outros órgãos. (DOGANAY, 2003). Esta doença é caracterizada não só pela gravidade dos sintomas, mas também por sua alta taxa de mortalidade. (GERMANO, 2008).
Surtos e casos esporádicos de listeriose têm sido relacionados à ingestão de água e diferentes tipos de alimentos como: vegetais, leite, queijos, carne bovina, suína e de aves, peixes, inclusive defumados e frutos do mar. (FORSYTHE, 2002; MURRAY et. al., 2000; GARRIDO et al., 2010)
Embora L. monocytogenes seja amplamente estudada, os dados da literatura são bastante escassos quanto a sua ocorrência em pescados resfriados, o que motivou a realização deste trabalho, cujos objetivos consistiram na detecção de L.
monocytogenes, pela técnica PCR, que consiste na multiplicação de um trecho
específico de DNA através de ciclos de alteração de temperatura e de maneira rápida e eficiente a detecção do patógeno em consideração.
OBJETIVOS
Devido à importância de L. monocytogenes para a saúde pública e para a indústria de alimentos, este projeto visa pesquisar a ocorrência do agente em pescado resfriado, destinado ao consumo humano e comercializado na cidade de São Bernardo do Campo utilizando a técnica de PCR.
Até a presente data coletou-se aleatoriamente 10 amostras de salmão resfriado em três feiras livres da cidade São Bernardo do Campo – SP. As amostras foram encaminhadas ao laboratório para análise e realização da técnica de PCR e isolamento da L. monocytogenes.
DESENVOLVIMENTO
Foram coletadas 10 amostras de salmão provenientes de feiras livres nos meses de maio e junho, em coletores universais estéreis, transportadas sob refrigeração em caixas isotérmicas com gelo reciclável para o Laboratório de Bacteriologia Geral no Instituto Biológico de São Paulo.
Uma porção de 25 gramas de cada amostra, foi transferida assepticamente para 225 ml de água peptonada, homogeneizada por 30 segundos em Stomacher e transferido 1,5 ml da amostra em micro-tubos, que foram armazenados à temperatura de -20°C até o momento da extração do DNA.
As amostras foram submetidas à extração de DNA com o reagente comercial DNAzol (Invitrogen®), adaptado de CHOMCZYNSKI (1993).
Para a técnica da PCR foram utilizados primers descritos por (BLAIS et al.,1995) com amplificação de um fragmento de 730 pares de bases (pb) do gene hly da L.
monocitogenes. A amplificação das amostras foi realizada com a utilização de 10 µL de
DNA acrescido de 40 µL da mistura de reagentes da PCR contendo 1,25 U Taq DNA polimerase (Invitrogen ®), 200 µM de cada desoxinucleotídeo, tampão (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 50mM KCl); 2 mM MgCl2 e 0,5µM de cada primer. Para a amplificação do DNA alvo foi empregado o seguinte ciclo de temperaturas: desnaturação inicial a 94ºC por 5 min., seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1min., hibridização a 55ºC por 1 min., e extensão a 72ºC por 1 min., com uma extensão final de 72ºC por 1 min. Como controle positivo, utilizou-se cepa ATCC de L. monocytogenes, e água deionizada estéril como controle negativo. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,0% acrescido de Gel Red (Uniscience ®) a 0,5
µg/mL. A visualização das bandas foi realizada em transluminador de luz ultra-violeta. RESULTADOS PRELIMINARES
Até a presente data os resultados das 10 amostras submetidas à pesquisa de L.
Figura 1 – Resultados da amplificação. Coluna 1: Marcador de peso molecular (100 pb). Colunas 2-11: DNA das amostras de salmão. Coluna 12: Controle positivo (L.
monocytogenes ATCC). Coluna 13: Controle negativo. FONTES CONSULTADAS
BLAIS, B. W.; PHILLIPPE, L. M. Identification of Presumptive Positive Listeria
monocytogenes from Foods by the Polymerase Chain Reaction (PCR). Polyscience Publications, Quebec, 1995.
DOGANAY, M. Listeriosis: clinical presentation. Immunology and Medical Microbiology, v.35, p.173-175, 2003.
FORSYTHE, S.J. Microbiologia da Segurança Alimentar. Porto Alegre: Artmed, 2002. 424p
GANDHI, M.; CHIKINDAS, M.L. Listeria: A foodborne pathogen that knows how to survive. Int. Journal. Food Microbiology, v.113, p.1-15, 2007.
GARRIDO, V; VITAS, A.I; GARCIA, J. I. Survey of Listeria monocytogenes in ready-to-eat products: Prevalence by brands and retail establishments for exposure assessment of listeriosis in Northern Spain. Food Control, p. 986-991, 2009
GERMANO, P. M. L.; GERMANO, M. I. S. Higiene e Vigilância Sanitária de Alimentos. Barueri: Manole, 2008. 986p.
JAY, J.M. Microbiologia de Alimentos. 6ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
LOGUERCIO, A.P.; SILVA, W.P.; ALEIXO, J.A.G.; COSTA, M.M.; VARGAS, A.C.D.E.
Listeria monocytogenes: um importante patógeno de origem alimentar. Rev. Higiene Alimentar, v.15, n. 80/81, p.39-48, 2001.
MURRAY, P.R. et al. Listeria, Erysipelothrix e outros bacilos Gram-positivos. Microbiologia Médica. 3 ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.181p.
OMS. Organização Mundial de Saúde. Zoonoses and veterinary public health/ Fact sheets. Programmes and projects, 2009. Disponível em: < http://www.who.int/entity/en/ >. Acesso em: maio de 2013
