UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
JOÃO PAULO VAZ FLORIANO TOLEDO
REAÇÕES REDOX EM CASCATA COM ÁLCOOIS ALÍLICOS POR PROCESSOS BIOCATALÍTICOS
CAMPINAS 2017
JOÃO PAULO VAZ FLORIANO TOLEDO
REAÇÕES REDOX EM CASCATA COM ÁLCOOIS ALÍLICOS POR PROCESSOS BIOCATALÍTICOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química, na área de Química Orgânica.
Orientador: Prof. Dr. José Augusto Rosário Rodrigues
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JOÃO PAULO VAZ FLORIANO TOLEDO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ AUGUSTO ROSÁRIO RODRIGUES.
CAMPINAS 2017
"Cada experiência é um degrau para o progresso da alma. Não fique preso ao passado. Você está, agora, diante de uma nova experiência. Dedique-se a ela de corpo e alma, e verá surgir o próximo degrau de evolução."
Agradecimentos
Agradeço a CAPES, FAPESP, CNPq e ao Instituto de Química da Unicamp por terem proporcionado todo apoio financeiro e de infraestrutura para a realização deste trabalho.
Ao professor Dr. José Augusto Rosário Rodrigues pela orientação, dedicação e seus ensinamentos que foram de grande importância para a realização deste trabalho.
A Deus pela sabedoria para tomar as decisões certas e força para alcançar os meus objetivos.
Aos meus pais Paulo e Amélia pelo incentivo, suporte e dedicação para que eu pudesse estudar e ir em busca da realização dos meus sonhos. Serei eternamente grato aos ensinamentos, a liberdade e ao amor que recebi dos senhores por toda a minha vida.
Aos meus irmãos Douglas e Marina, e em especial ao meu irmão Robson pelo amor e pelo apoio em todos os sentidos.
À minha afilhada Laura pelas horas de descontração, pelas histórias intermináveis, pelo sorriso sincero e o abraço apertado.
A todos os meus tios, tias, primos e primas pela torcida a cada vitória. Aos amigos da Seicho-No-Ie pelo companheirismo na Fé me ajudando a lutar sempre um dia por vez.
Ao Carlos por me acompanhar de perto nessa jornada, me confortando nas horas sombrias e dividindo comigo as horas alegres. Obrigado por ser o meu melhor amigo e também o meu amor.
Aos amigos do laboratório, pela amizade, ensinamentos compartilhados e pelos bons momentos, e a todos os outros amigos que fizeram e fazem parte do meu cotidiano, pela amizade e companheirismo. Em especial ao meu grande amigo Fábio, que se passou de um amigo de bancada para um irmão para a vida.
Por último, porém não menos importante, agradeço aos membros da banca examinadora, Wanda Almeida e Humberto Milagre, por terem aceitado o convite gentilmente.
Resumo
O presente trabalho inclui um estudo do comportamento de álcoois alílicos em reações de biocatálise empregando-se células de leveduras e de uma bactéria disponíveis na coleção de microrganismos da Fundação André Tosello. A biorredução da ligação C=C de álcoois alílicos é um método de hidrogenação sem o emprego de hidrogênio molecular e livre de metais. Inicialmente, estudando a biocatálise de geraniol e do seu diasteroisômero nerol, ambos adsorvidos em resina Amberlite® XAD-7HP, catalisada por células livres de Candida albicans CCT 0776 observou-se a formação dos ácidos (R)-citronélico e gerânico. O uso de resina foi necessário devido a efeitos inibitórios do substrato às células de leveduras. Em busca de compreender o mecanismo que leva a formação do mesmo produto para os dois diasteroisômeros, os intermediários foram preparados e submetidos a biocatálise com células de C. albicans. Os resultados da biocatálise dos aldeídos geranial e neral mostraram que estes isomerizam entre si durante o processo e isso influencia na enantiosseletividade da reação. Observou-se também que após a oxidação do álcool a aldeído e hidrogenação da ligação dupla C=C, a oxidação do enantiômero (S) é mais rápida, no entanto há preferência em formar o enantiômero (R). Obteve-se (R)-citronelal e (S)-citronelal utilizando-se uma mesma enerredutase comercial apenas mudando a estereoquímica do material de partida aldeído insaturado (E) e (Z), respectivamente. Após a otimização da condição reacional foi possível obter a partir da biocatálise de geraniol com células de C. albicans diferentes produtos interessantes como blocos construtores por meio das reações em cascata. São eles o (R)-citronelol (54% de rendimento isolado e 74% ee) com 24 horas de reação e uma mistura (55 e 45%, respectivamente) dos ácidos (R)-citronélico (66% ee) e gerânico com rendimento de 36 % após 7 dias. Dentre os outros microrganismos estudados para a oxirredução do geraniol a levedura Pichia stipitis CCT 2617 apresentou a melhor químio e enantiosseletividade para a obtenção do ácido (R)-citronélico, enquanto que a
Pichia kluyveri CCT 3365 e Pseudomonas sp CCT 6389 se mostraram mais seletivas
para a formação do ácido gerânico. Os resultados são promissores, visto que na literatura não há relatos da obtenção desses produtos por biocatálise, além de ser um método intrinsecamente mais seguro de realizar hidrogenação e oxidação.
Abstract
This work includes a study of the biotransformation of allylic alcohols in reactions with resting cells of yeasts and a bacterium from a collection of microorganisms available at André Tosello Foundation. The enantioselective reduction of C=C bond of allylic alcohols by ene-reductases present in resting cells of microorganisms is a biocatalytic approach for the hydrogenation without molecular hydrogen and metals. Initially, the study of the biocatalysis of geraniol and its diasteroisomer nerol, both absorbed in Amberlite® XAD-7HP resin, by resting cells of Candida albicans CCT 0776 curiously resulted in the formation of the acids (R)-citronellic and geranic. The use of resin was necessary due to inhibitory effects of the substrate to yeast cells. In order to understand the mechanism of the formation of the same products starting from both diasteroisomers, the intermediates were prepared and their biocatalysis with cells of C. albicans was performed. The results of the biocatalysis of the intermediates indicated isomerization between the two diasteroisomers during biocatalysis and it affected the enantioselectivity of this reaction. We also observed that after oxidation of the alcohol to aldehyde and hydrogenation of the double bond, the oxidation of the (S) enantiomer is faster, however the enantiomer (R) is preferentially formed. (R) and (S)-citronellal were obtained using the same commercially available ene-reductase only by changing the stereochemistry (E) and (Z) of the substrate, respectively. After optimization of reaction conditions, some interesting building-block products were obtained from the biocatalysis of geraniol with cells of C.
albicans. They are (R)-citronellol (54% isolated yield and 74% ee) after 24 hours of
reaction and a mixture (55 e 45%, respectively) of (R)-citronellic (66% ee) and geranic acid with 36% of yield after 7 days. Among other microorganisms studied for the oxidation-reduction cascade reaction of geraniol, the yeast Pichia stipitis CCT 2617 showed better chemo and enantioselectivity towards formation of (R)-citronellic, while the yeast Pichia kluyveri CCT 3365 and the bacteria Pseudomonas sp CCT 6389 showed more selective towards straight oxidation of the alcohol to produce geranic acid. These results seem to be very interesting since, to our knowledge, there is no record of the production of this acids by biocatalytic processes, and it is an intrinsically safer way to perform hydrogenation and oxidation.
Lista de Iustrações
Figura 1. Representação de uma biocatálise empregando matriz adsorvente funcionando como um reservatório e remoção in situ do produto (adaptado).20 ... 24
Figura 2. Biorredução do 2-etil-1-fenil-prop-2-en-1-ona adsorvido em resina XAD-7PH catalisada por células de Pichia stipitis (adaptado).21 ... 24
Figura 3. Estrutura química da resina Amberlite® XAD-7PH (adaptado).23 ... 25
Figura 4.Seleção de produtos da BASF obtidos por biorredução enantiosseletiva catalisada por Old Yellow Enzimes (OYE) (adaptado).6 ... 30
Figura 5. Biorredução assimétrica de cetona α,β-insaturada catalisada por enerredutase da família das Old Yellow Enzymes (OYM) mostrando a semi-reação de redução (dependente de NAD(P)H) e a semi-reação de oxidação (dependente do alceno ativado)(adaptado).57 ... 31
Figura 6. Mecanismo de redução catalisada por enerredutases da família das OYE mostrando a ligação no sítio ativo da enzima seja pela forma (a) clássica ou (b) invertida (flipped)(adaptado).60 ... 32
Figura 7. Biorredução enzimática para formação de derivados do propeno 15 catalisada pela YqjM, uma enerredutase isolada da bactéria Bacillus subtilis utilizando a oxidação de glicose por meio de uma glicose desidrogenase (GDH) como sistema de regeneração de cofator (adaptado). 63 ... 33
Figura 8. Biorredução enzimática de 25 catalisada pela enzima YqjM, uma enerredutase isolada da bactéria Bacillus subtilis para formação do profeno 26, intermediário chave na síntese do (R)-fluribiprofeno (24) (adaptado). 63 ... 33
Figura 9. Produção de nitrilas enantiomericamente puras catalisadas por enerredutases (ERs) comerciais (adaptado).5 ... 34
Figura 10. Hidrogenação enantiosseletiva do geraniol ((E)-31) catalisada por complexo de rutênio.68 ... 35
Figura 11. Reação em cascata de redução do álcool alílico 33 por ação de uma álcool desidrogenase e uma enerredutase presentes nas células de S. cerevisiae. . 35 Figura 12. Reação bienzimática one pot em cascata para redução do geraniol ((E)-31) por ação de uma álcool desidrogenase e uma enerredutase.52 ... 36
Figura 14. Formação da carvona 46, intermediário chave na síntese total assimétrica do ácido 47, por biorredução catalisada por uma enerredutase. ... 38 Figura 15. Semelhança entre as estruturas de geraniol, (E)-15 e o pirofosfato de geranilo (49). ... 41 Figura 16. Biocatálise de 50 mg de geraniol ((E)-31) adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com células de C. albicans após 7 dias. ... 45 Figura 17. Feromônios e piperidinas sintetizados a partir do ácido (R)-citronélico (30). ... 46 Figura 18. Biocatálise de 50 mg de nerol ((Z)-31) adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com células de C. albicans após 7 dias. ... 47 Figura 19. Cromatograma obtido por CG-EM da Biocatálise de geraniol, (E)-31, com células de C. albicans usando hexano como co-solvente (50% v/v) após 7 dias. Os compostos observados são os intermediários reacionais da biocatálise... 48 Figura 20. Perfil de conversão da biocatálise de 50 mg de geranial, (E)-37, adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com 3 g de células de C. albicans. ... 51 Figura 21. Perfil de conversão da biocatálise de 50 mg de neral, (Z)-37, adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com 3 g de células de C. albicans. ... 52 Figura 22. Biocatálise de 50 mg aldeído geranial, (E)-37, adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com 3g de células de Candida albicans. ... 53 Figura 23. Biocatálise de 50 mg do aldeído neral, (Z)-37, adsorvido em 300 mg de resina XAD-7HP com células de Candida albicans. ... 54 Figura 24. Bio-oxidação de 50 mg de citronelol (32) adsorvido em resina XAD-7HP para ácido (R,S)-citronélico (51) catalisada por 3 g de células de C. albicans após 7 dias de reação. ... 55 Figura 25. Conversão de citronelol (32) para ácido (R,S)-citronélico (51) catalisada por células de C. albicans em função do tempo. ... 55 Figura 26. Conversão de citronelal (16) para ácido (R,S)-citronélico (51) catalisada por células de C. albicans em função do tempo. ... 56 Figura 27. Processo de Biocatálise de citronelal (16) catalisado por células de C. albicans. ... 57 Figura 28. Cromatograma obtido por CG-EM indicando isomerização e redução da carbonila do geranial, (E)-37, no meio reacional (DMSO, glicose desidrogenase (GDH), D-glicose e tampão fosfato pH 7 sem enerredutase. ... 59
Figura 29. Biorredução de (E)-37 e (Z)-37 por enerredutase 112 para obtenção dos aldeídos insaturados enantiomericamente enriquecidos. ... 60 Figura 30. Mecanismo proposto para a biocatálise de geraniol ((E)-31) adsorvido em resina XAD-7HP catalisada por células de Candida albicans. Os produtos da reação são o ácido (R)-citronélico em maior quantidade e o ácido gerânico em menor quantidade. ... 61 Figura 31. Foto do cartucho preenchido com resina DAX-8 utilizado para extração em fase sólida dos ácidos carboxílicos em meio aquoso. ... 68
Lista de Tabelas
Tabela 1. Alguns exemplos de compostos sintetizados por meio de processos biocatalíticos de redução catalisado por células de microrganismos (adaptado).13 .. 21
Tabela 2. Sistemas de regeneração de cofatores NADH e NAD(P)H (adaptado).6 .. 23
Tabela 3. Classificação das enzimas utilizadas em reações de biocatálise (adaptado).7 ... 27
Tabela 4. Construção do sistema EC de classificação de enzimas com quatro dígitos (adaptado).46 ... 28
Tabela 5. Conversões obtidas por CG-EM para alíquotas de 1 mL da biocatálise de 50 mg de geraniol, (E)-31, com 300, 400 e 500 mg de resina XAD-7HP e 3 g de células de C. albicans após 7 dias. ... 43 Tabela 6. Hidrogenação enantiosseletiva de geranial, (E)-37, catalisada por enerredutases (ERs) comerciais dependentes de cofator NAD(P)H com sistema de regeneração de cofator utilizando glicose e glicose desidrogenase (GDH). ... 58 Tabela 7. Biocatálise de diferentes massas de geraniol, (E)-31, adsorvido em resina XAD-7HP após 7 dias com 3 g de células de P. stipitis para otimização da massa do substrato... 63 Tabela 8. Estudo da biorredução e bio-oxidação de geraniol, (E)-31, adsorvido em resina XAD-7HP catalisada por células livres de Candida albicans, Pichia stipitis, Pichia kluyveri e Pseudomonas sp. ... 64 Tabela 9. Biocatálise de geraniol, (E)-31, adsorvido em resina XAD-7HP com células de S. cerevisiae para gerar (R)-citronelol (32). ... 66
Lista de Abreviaturas e Siglas
ADH – álcool desidrogenase
CCD – cromatografia em camada delgada CCT – Coleção de Cultura Tropical
CG – cromatografia em fase gasosa DIC- detector por ionização em chama DMSO – dimetilsulfóxido
EC - sistema internacional de classificação de enzimas ee – excesso enantiomérico
EM- espectrometria de massas ER- enerredutase
FMN- mononucleotídeo de flavina GDH- glicose desidrogenase GRE – grupo retirador de elétrons m/z – coeficiente entre massa e carga
NADH – dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NAD(P)H- fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina OYE – Old Yellow Enzime
rac- racêmico
RMN – ressonância magnética nuclear TMS - tetrametilsilano
Lista de Esquemas
Esquema 1. Esterificação com diazometano. ... 45 Esquema 2. Conversão de 50 mg de geranial ((E)-37) adsorvido em 300mg de resina XAD-7HP em água após 7 dias. ... 49 Esquema 3. Conversão de 50 mg de neral ((Z)-37) adsorvido em 300mg de resina XAD-7HP em água após 7 dias. ... 50 Esquema 4. Interconversão entre os aldeídos geranial ((E)-37) e neral ((Z)-37), bio-oxidação a ácido gerânico e a não ocorrência da conversão para ácido nerólico catalisada por Candida albicans. ... 53 Esquema 5. Reações biocatalíticas em cascata com geraniol, (E)-31, para gerar (R)-citronelol (32). ... 65
Sumário 1. Introdução ... 19 2. Revisão bibliográfica ... 20 2.1 Biocatálise ... 20 2.2 Microrganismos e enzimas ... 25 2.3 Biorredução ... 29 2.4 Terpenos ... 36 3. Objetivos ... 40 3.1 Objetivo geral ... 40 3.2 Objetivos específicos ... 40 4. Resultados e discussão ... 41
4.1 Estudo preliminar na presença e ausência de resina XAD-7PH ... 41
4.2 Biocatálise dos álcoois alílicos terpenóides ... 44
4.3 Biocatálise dos intermediários reacionais ... 48
4.3.1 Biocatálise do geranial e neral ... 49
4.3.2 Biocatálise do citronelol ... 54
4.3.4 Biocatálise do citronelal ... 56
4.4 Biorredução de geranial e neral com enerredutases comerciais ... 57
4.5 Biocatálise do ácido gerânico ... 61
4.6 Mecanismo proposto ... 61
4.7 Estudo da biocatálise de (E)-31com outros microrganismos e otimização da concentração de substrato ... 62
4.8 Biocatálise para obtenção do citronelol ... 65
4.9 Extração em fase sólida com resina DAX-8 (Sigma–Aldrich®) ... 67
5. Conclusões ... 71
6. Considerações finais ... 73
7. Parte experimental ... 74
7.1 Aspectos gerais ... 74
7.2 Aspectos Instrumentais ... 74
7.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ... 74
7.2.2 Purificação por cromatografia de adsorção em coluna ... 74
7.2.3 Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) 74 7.2.4 Cromatografia Gasosa acoplada ao Detector por Ionização de Chama (CG-DIC) ... 75
7.2.5 Rotação Ótica ... 75
7.3 Preparação dos padrões ... 75
7.3.1 – geranial ... 76
7.3.2 -neral ... 76
7.3.3 -citronelal ... 77
7.3.4 -acido citronélico ... 77
7.4 Crescimento dos microrganismos ... 78
7.5 Biocatálise com células de microrganismos ... 78
7.6 Biorredução de aldeídos α,β-insaturados com enerredutases comerciais ... 79
7.7 Ativação da resina DAX-8 para extração em fase sólida ... 79
7.8 Produtos obtidos por processos biocatáliticos ... 80
7.8.1 (R)-citronelal... 80 7.8.2 (S)-citronelal ... 80 7.8.3 (R)-citronelol... 81 7.8.4 geraniato de metila ... 81 7.8.5 (R)-citronelato de metila ... 81 8. Referências ... 83
9. Anexos I. Espectros de RMN e Massas ... 89
Espectro 2. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de citronelal (16). ... 89
Espectro 3. Espectro de RMN de 13C (100 MHz) de citronelal (16). ... 90
Espectro 4. Espectro de massas (EI, 70 eV) de geranial ((E)-37). ... 90
Espectro 5. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de geranial ((E)-37). ... 91
Espectro 6. Espectro de RMN de 13C (125 MHz) de geranial ((E)-37). ... 91
Espectro 7. Espectro de massas (EI, 70 eV) de neral ((Z)-37). ... 92
Espectro 8. Espectro de RMN de 1H (500 MHz) de neral ((Z)-37). ... 92
Espectro 9. Espectro de RMN de 13C (125 MHz) de neral ((Z)-37). ... 93
Espectro 10. Espectro de massas (EI, 70 eV) de citronelato de metila (52). ... 93
Espectro 11. Espectro de RMN de 1H (400 MHz) de ácido citronélico (51). ... 94
Espectro 12. Espectro de RMN de 13C (100 MHz) de ácido citronélico (51). ... 94
10. Anexos II. Cromatogramas 95 Cromatograma 1. Separação de rac-16 por CG-DIC (Método 2). ... 95
Cromatograma 2. Análise de (R)-16 por CG-DIC (Método 2) após biocatálise de (E)-37 com enerredutase ER-112 da Codexis. ... 95
Cromatograma 3. Análise de (S)-16 por CG-DIC (Método 2) após biocatálise de (Z)-37 com enerredutase ER-112 da Codexis. ... 95
Cromatograma 4. Separação de rac-32 por CG-DIC (Método 3). ... 96
Cromatograma 5. Análise de (R)-32 por CG-DIC (Método 3) após biocatálise de (E)-31 com células de C. albicans. ... 96
Cromatograma 6. Separação de rac-52 por CG-DIC (Método1). ... 96
Cromatograma 7. Análise de (R)-52 por CG-DIC (Método1) após biocatálise de (E)-31 com células de P. stipitis. ... 96
1. Introdução
Os processos biocatalíticos tem se tornado cada vez mais atrativos para os químicos devido à alta quimio, diastereo e enantiosseletividade dos biocatalisadores aliada a processos ambientalmente compatíveis e seguros. Atualmente, vários trabalhos tem demonstrado avanços no uso de enzimas, células de microrganismos e plantas em processos industriais e na síntese de compostos importantes, em especial compostos quirais que funcionam como blocos construtores de fármacos e, portanto, são estudos relevantes para a indústria química/farmacêutica e para a sociedade.1–5
A demanda por processos com menores impactos para o indivíduo, o meio ambiente e a sociedade faz da biocatálise uma alternativa comparada as reações clássicas. O uso de células de microrganismos como biocatalisadores ao invés da síntese orgânica clássica pode levar a processos com menor uso de solventes, menores gastos energéticos, menores riscos à saúde do químico, dentre outros. Contudo, cada caso deve ser analisado separadamente, pois também deve-se obdeve-servar que há a necessidade de um conhecimento específico a cerca do manuseio correto dos microrganismos e da seletividade de acordo com a reação desejada.
O desenvolvimento de novas técnicas de purificação de proteínas promoveu uma popularização das reações catalisadas por enzimas isoladas devido a maior seletividade em relação as reações com células de microrganismos. Entretanto, em processos enzimáticos há a necessidade de se adicionar cofatores como NADH e NAD(P)H em reações com oxidases e enerredutases, por exemplo, que possuem um custo proibitivo em quantidades equimolares.6,7
O presente trabalho apresenta um estudo de reações redox em cascata de álcoois alílicos com células de microrganismos. Uma alternativa intrinsecamente mais segura e ecológica do que a utilização de metais para a hidrogenação da ligação dupla e também aos métodos clássicos de oxidação de álcoois primários. O uso das células é vantajoso também sobre o ponto de vista econômico em relação as enzimas e seus cofatores. Foi utilizado como substrato modelo o geraniol adsorvido em resina Amberlite® XAD-7HP em biocatálise com células de Candida albicans em meio aquoso, além de outras células de leveduras e uma bactéria, todos disponíveis na coleção de microrganismos da Fundação André Tosello.
2. Revisão bibliográfica 2.1 Biocatálise
A biocatálise é uma ferramenta sintética capaz de realizar um amplo espectro de transformações químicas.6 O principal atrativo dos processos
biocatalíticos é aliar alta quimio, diastereo e enantiosseletividade com processos ambientalmente compatíveis e seguros.7,8 Atualmente, vários trabalhos destacam
avanços no uso de enzimas, células de microrganismos e plantas em processos industriais e na síntese de compostos quirais que funcionam como blocos construtores de fármacos.1–5
O uso de células de microrganismos como biocatalisadores em síntese orgânica têm a vantagem de o microrganismo realizar a síntese e a reciclagem dos cofatores a partir das enzimas que o constitui.9 Isso contribui bastante com a
redução do custo do processo. Contudo, algumas desvantagens do uso de células incluem a presença de um sistema multienzimático intra e extracelular o que pode muitas vezes diminuir a seletividade devido a reações paralelas, e a existência de diferentes cepas, o que pode interferir na reprodutividade.7,10,11 O isolamento do
produto também é dificultado devido a presença de biomassa. Além disso, utiliza-se grandes volumes na reação para a biomassa transformar pequenas quantidades de material.12
Recentemente, Solano e colaboradores (2012) compilaram processos biocatalíticos com células de microrganismos em escala industrial ou preparativa para a síntese de blocos de construção biologicamente ativos.13 Na Tabela 1,
observa-se alguns compostos precursores quirais de fármacos importantes no cenário atual que foram sintetizados a partir de biorredução catalisada por células de microrganismos.
Por exemplo, Patel e colaboradores sintetizaram o composto 1, a partir de processo de biorredução de cetonas utilizando células de Rhodococcus erythropolis SC13854 (Tabela 1). Esse composto é um importante intermediário para a síntese do Atazanavir, um medicamento antirretroviral (inibidor da HIV protease) produzido pela biofarmacêutica global Bristol-Myers Squibb.14
Tabela 1. Alguns exemplos de compostos sintetizados por meio de processos biocatalíticos de redução catalisado por células de microrganismos (adaptado).13
Produto Biocatalisador Fármaco Produtor
(2S,3R)-1 Rhodococcus erythropolis
Atazanavir (inibidor da HIV protease) Bristol-Myers Squibb (S)-2 Zygosaccharomyces rouxii Talampanel TM
(benzodiazepínicos) Eli-Lilly and Company (R)-3 Saccharomyces
cerevisiae Derivados do anti-tumoral taxano
Johanson y cols. (S)-4 Microbacterium
campoquemadoensis Montelukast (anti-asmático)
Merck & Co. Inc.
(S)-5 Rhodotorula
pilimanae
Inibidor da fosfodiesterase (tratamento de asma)
Merck & Co. Inc. (R)-6 Aureobasidium
pullulans SC 13849
Moduladores dos receptores do ácido retinóico Bristol-Myers Squibb (2S,3R)-7 Rec. E. coli expressando enzima de P. finlandica
Fármacos para o tratamento do
colesterol Lonza
(S)-8 Geotrichum candidum
SC 5469 Atorvastatina (cadeia lateral)
Bristol-Myers Squibb (S)-9 Escherichia coli Atorvastatina (cadeia lateral) Kaneka Co
(R)-10
Rec. E. coli expressando enzima
de C. macedoniensi
Carotenóides e vitaminas Hoffmann-LaRoche
(S)-11
Rec. E. coli expressando enzima
de Sporosarcina sp.
Omapatrilat (anti-hipertensivo) Bristol-Myers Squibb
(S)-12
Rec. E. coli expressando enzima
de T. intermedius
Agentes anti-tumorais e inibidores
Os processos biocatalíticos também apresentam algumas limitações como, por exemplo, a restrita margem para a variação de parâmetros reacionais como pressão, temperatura e pH. Outro fator limitante é a máxima atividade dos biocatalisadores em água, que por outro lado é um solvente pouco adequado para reações de síntese orgânica devido ao seu elevado ponto de ebulição, calor de vaporização e baixa solubilidade da maioria dos substratos orgânicos. No entanto, há um grande empenho no desenvolvimento e aperfeiçoamento de diversas técnicas de reações catalisadas por microrganismos e enzimas. Algumas das modificações mais comuns são o uso de co-solventes orgânicos, a adição de inibidores enzimáticos e técnicas de imobilização e de reciclagem de cofatores.6,7
As reações catalisadas por enzimas isoladas tem se tornado bastante popular devido a maior seletividade em relação as reações com células de microrganismos; além da possibilidade de realizar reações mais concentradas, extração facilitada e melhor adaptação ao uso de solventes orgânicos.6 Contudo, em
processos enzimáticos há a necessidade de se adicionar cofatores como NADH e NAD(P)H em reações com oxidases e enerredutases, por exemplo, que possuem um custo proibitivo em quantidades equimolares. Nos últimos anos diversas técnicas de reciclagem de cofatores contribuíram para diminuir os custos em reações com enzimas.6,7
A Tabela 2 representa uma seleção de alguns sistemas de regeneração dos cofatores NADH e NAD(P)H in situ mais utilizados. Cada sistema apresenta vantagens e desvantagens, sendo assim difícil determinar qual o melhor sistema. O sistema mais adequado deve ser avaliado caso a caso.
Tabela 2. Sistemas de regeneração de cofatores NADH e NAD(P)H (adaptado).6
Enzima de regeneração Cofator Cosubstrato Coproduto Formato desidrogenase (FDH) NADH Ácido fórmico (sais) CO2 Glicose desidrogenase (GDH) NADPH/NADH Glicose D-Glucono-1,5-lactona Álcool desidrogenase
(ADH) NADH/NADPH Álcool Aldeído/Cetona
Álcool desidrogenase
(ADH) NADH/NADPH Diol Lactona
Fosfito desidrogenase
(PDH) NADH
Ácido fosforoso
(sais) Fosfato
Hidrogenase (Hase) NADPH H2 -
Alguns substratos também podem apresentar efeito inibitório ou até mesmo tóxico às células dos microrganismos quando disponibilizados em determinada concentração ao meio reacional. Dentre as estratégias mais utilizadas para contornar esses efeitos destacam-se o uso de sistemas bifásicos15 e matrizes
adsorventes16,17. O uso de resinas adsorventes contribui também na dispersão de
substratos com baixa solubilidade em água.
Os polímeros hidrofóbicos (Figura 1) podem ser utilizados para adsorver o material de partida, dessa forma, estes atuam como um reservatório liberando baixas quantidades do substrato ao meio reacional e adsorvendo o produto formado evitando problemas como inibição enzimática e toxidez dos compostos químicos que poderiam levar a morte celular, e a resina ainda pode ser reutilizada em outra reação.18,19
Figura 1. Representação de uma biocatálise empregando matriz adsorvente funcionando como um reservatório e remoção in situ do produto (adaptado). S = Substrato; P = Produto20
Um exemplo bem sucedido do emprego de resina em biocatálise foi obtido por Conceição e colaboradores (2003).21 Buscando melhorar a quimio e
enantiosseletividade na preparação do (S)-2-etil-1-fenil-prop-2-em-1-ol (13) utilizando células da levedura Pichia stipitis, a estratégia utilizada foi adsorver o material de partida (14) em resina Amberlite® XAD-7HP (Sigma–Aldrich®) (Figura
2). Inicialmente os autores observaram baixa quimiosseletividade uma vez que havia formação de uma mistura de compostos. Além disso, o material de partida apresentava toxidez ás células do microrganismo. A estratégia utilizada foi então adsorver a enona 14 na matriz adsorvente, liberando pequenas quantidades da mesma ao meio reacional e assim obtendo-se somente o produto da redução da carbonila 13 enantiomericamente puro (>99% ee).
Figura 2. Biorredução do 2-etil-1-fenil-prop-2-en-1-ona adsorvido em resina XAD-7PH catalisada por células de Pichia stipitis (adaptado).21
As resinas da marca Amberlite® XAD são polímeros porosos brancos, as vezes, levemente amarelados e são amplamente utilizadas como adsorventes. Há diversos tipos dessas resinas, tais como, 2, 4, 16, 1180, XAD-7, dentre outras. A diferença entre esses polímeros é de acordo com sua natureza química, grau de polaridade, momento dipolo, tamanho do poro e área superficial.22
A resina XAD-7PH é um polímero de éster acrílico, alifático, insolúvel e não iônico de polaridade intermediária (Figura 3).22
Figura 3. Estrutura química da resina Amberlite® XAD-7PH (adaptado).23
A capacidade de adsorção da resina XAD-7PH é resultado da sua composição química alifática, estrutura macrorreticular e grande área superficial (450 m2/g) juntamente com a alta estabilidade física e térmica resultante da sua
estrutura.22 A sua natureza alifática permite a resina adsorver tanto compostos não
polares de sistemas aquosos como também compostos relativamente polares de solventes apolares.22,23
2.2 Microrganismos e enzimas
Diversos organismos podem ser utilizados como biocatalisadores incluindo fungos, bactérias e algas. Todos são de fácil acesso. As leveduras, por exemplo, são vendidas em supermercados e outros microrganismos podem ser adquiridos a baixos custos ou por doações a partir de coleções de culturas de fundações e laboratórios de pesquisa. Porém, deve-se ter cuidado ao manusear esses microrganismos, pois alguns são patogênicos.24,25
As leveduras são microrganismos unicelulares que pertencem ao reino Fungi.26 Os fungos, em geral, são de grande importância comercial e social, e
podem estar relacionados a benefícios ou efeitos nocivos. Muitas leveduras estão relacionadas a processos fermentativos industriais como, por exemplo, a produção de pão e bebidas fermentadas, enquanto que outros fungos são essenciais ao
processo de produção de queijos. Em contrapartida, há uma série de doenças, principalmente de pele, causadas por fungos.27
A levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) também conhecida como fermento de pão é um exemplo de um microrganismo capaz de catalisar diversas reações de síntese para preparação de compostos opticamente ativos.7,17,28
Esse microrganismo é bastante versátil e capaz de performar diferentes reações tais como redução, ciclização, condensação e resolução cinética, além de ser de fácil aquisição, baixo custo, não ser patogênico ou tóxico e de fácil manipulação.24 O que
mostra um grande potencial na utilização de células desse e de outros microrganismos como biocatalisadores.
A levedura Candida albicans (C. albicans) é a espécie de Candida mais conhecida. Ela é um microrganismo classificado como nível de biossegurança 2, e está relacionada como a maior causadora de candidíase em humanos.29 Essa
levedura já foi reportada como tendo uma proteína ligante ao estrogênio (EBP1) com algumas semelhanças as enzimas pertencentes as OYE (Old Yellow Enzymes) e, portanto, teria potencial em realizar a redução da ligação dupla C=C.30 Outros
trabalhos também já mostraram o potencial de catalisar reações de desracemização de álcoois secundários através de reações de oxidação e redução.31,32
A levedura Picchia stipitis é um microrganismo de nível de biossegurança 1 e está relacionada com a produção de etanol.29 Sabe-se que esta levedura é
capaz de produzir etanol a partir de glicose, galactose, manose e xilose.33–35 Outros estudos também mostram que esse microrganismo contém uma Old Yellow Enzime 2.6 (OYE 2.6) 36 capaz de catalisar a redução da ligação dupla de alcenos
ativados.21,37
A levedura Picchia kluyveri é um microrganismo de nível de biossegurança 1.29 Atualmente alguns estudos mostraram o potencial dessa
levedura no processo fermentativo de bebidas como tequila38 e vinho39. Milagre e
colaboradores (2010) mostraram o potencial desse microrganismo em catalisar biorredução de compostos carbonilados.40
As bactérias são microrganismos pertencentes ao reino Monera. Elas são organismos unicelulares e são bastante temidos, uma vez que muitas espécies são causadoras de doenças bem conhecidas como pneumonia, disenteria e sífilis, por exemplo.27 Contudo, outras espécies são extremamente úteis tanto para os
processos na indústria, principalmente alimentícia. As bactérias são importantes na fermentação de leite e na produção de diversos alimentos lácteos, como é o caso do Lactobacillus bulgaricus e do Streptococcus thermophilus, ambos utilizados na fabricação de iogurte.41
Diversas bactérias do gene Pseudomonas foram relatadas como capazes de bioconverter estireno (vinilbenzeno) em fenilacetaldeído.42–44 Esses microrganismos são bastante efetivos na Biocatálise de compostos orgânicos e vários membros desse gênero são reconhecidos como sistemas biológicos eficientes na decomposição de compostos tóxicos.45
Cada microrganismo contém um número variado de enzimas e cada uma dessas enzimas possue estrutura característica que permite com que a mesma catalise uma reação específica. As enzimas podem ser classificadas dentro de seis classes principais. Para esta classificação, a Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) organizou as enzimas de acordo com os tipos de reações que catalisam conforme pode ser observado na Tabela 3.7
Tabela 3. Classificação das enzimas utilizadas em reações de biocatálise (adaptado).7
Classe de enzima Tipo de Reação
1. Oxidorredutases Redução das ligações C=O e C=C; aminação redutiva da ligação C=O; oxidação da ligação C-H, C-N, C-O; redução/oxidação de cofatores
2. Transferases Transferência de grupo funcional como amina, aldeído, fosforil, metil, glicosil, acil e grupos contendo enxofre
3. Hidrolases Hidrólises ou reação de formação de ésteres, amidas, lactonas, lactamas, epóxidos, anidridos, glicosídeos, nitrilas entre outros
4. Liases (Sintases) Adição-eliminação de pequenas moléculas a ligações C=C, C=N, C=O
5. Isomerases Transformação de isômeros (isomerização), racemização, epimerização e reações de rearranjo
6. Ligases Formação de compostos complexos (em analogia às liases) mas enzimaticamente ativas somente quando combinadas com a clivagem do ATP
Como o nome sistemático das enzimas pode ser muito grande e difícil de pronunciar, a EC, do inglês Enzyme Comission (Comissão de Enzima), criou um sistema numérico que pode ser utilizado juntamente com o nome recomendado para especificar uma enzima em particular. De acordo com esse sistema, cada enzima tem um número denominado EC de quatro dígitos (Tabela 4).
Tabela 4. Construção do sistema EC de classificação de enzimas com quatro dígitos (adaptado).46
Sistema EC de classificação de enzimas: EC (i).(ii).(iii).(iiii)
(i) Classe principal. Determina o tipo de reação que a enzima catalisa (ii) Subclasse. Indica o tipo de substrato, o tipo de grupo funcional transferido ou
a natureza de uma ligação específica envolvida na reação (iii) Segunda subclasse. Expressa a natureza do substrato ou cosubstrato
(iiii) Numero arbitrário em série
O primeiro digito é dado de acordo com a classe principal observada anteriormente na Tabela 3 e determina o tipo de reação que a enzima catalisa. Essas reações são divididas em subclasses (segundo número), de acordo com a natureza do substrato, o tipo de grupo funcional transferido ou a natureza da ligação envolvida na reação. Essas subclasses são separadas de acordo com uma segunda subclasse envolvendo o substrato ou cosubstrato. O quarto e último número é dado para completar a identificação da enzima por uma ordem numérica.46
As enzimas podem ser altamente específicas para alguns substratos, como é o caso de enzimas envolvidas em mecanismos anabólicos. Essas enzimas geralmente convertem um composto específico ou uma quantidade bem limitada de compostos similares. Isso dificulta a utilização dessas enzimas em reações com substratos diferentes do seu substrato natural. Por outro lado, as enzimas envolvidas no metabolismo e mecanismos de desintoxicação são, em sua maior parte, promiscuas. Dessa forma, essas enzimas costumam aceitar uma variedade de substratos.6
A reatividade de uma enzima é diretamente influenciada pelas condições de reação. Portanto, o controle do pH é muito importante para atividade máxima da enzima e essas podem se degradar com o tempo e a forma de armazenamento.6,47
2.3 Biorredução
A biorredução da ligação dupla C=C tem sido bastante explorada recentemente como uma alternativa dentro dos princípios da química verde para a síntese assimétrica comparada ao uso de metais de transição ou organometálicos.48–52 As enzimas responsáveis por catalisar essas reações são as enerredutases (ERs) dependentes do cofator NAD(P)H, as quais podem ser encontradas em diversos microrganismos, incluindo o fermento de pão.6,7
As enerredutases fazem parte da classe das oxidoredutasses (ver Tabela 3 no item 2.2) e existem pelo menos quatro classes dessas enzimas que já tiveram suas aplicabilidades biocatalíticas exploradas. São elas as ERs da família das Old Yellow Enzymes (OYE), enoato redutases, oxidorredutases desidrogenases/redutases de cadeia média (MDR), e desidrogenases/redutases de cadeia curta de plantas (SDRs). No entanto, dentre as ERs, a classe mais estudada compreende as enerredutases da família das OYE (EC 1.6.99.1). As diferenças entre essas enzimas vão da sua estrutura, mecanismo de reação, reatividade frente a diferentes substratos e estéreo e enantiosseletividade. 9,53
O processo de hidrogenação assimétrica é bastante importante na síntese orgânica e geralmente uma etapa crítica em uma síntese total. Contudo, em se tratando de biorredução por enerredutases, é necessário que a dupla ligação seja ativada por um grupo retirador de elétrons (GRE). A capacidade de o fermento de pão realizar a redução assimétrica de alcenos ativados foi descoberta em 1934.7,54
Desde então, pode-se compreender muitas particularidades dessa reação que aparentemente é aplicável a outros microrganismos, como por exemplo Candida parapsilosis.55 Com o aperfeiçoamento de técnicas de isolamento de proteínas e
estudos de reciclagem de cofatores, foi possível também coletar dados com ERs isoladas, em especial as enerredutases da família das OYE.
A Figura 4 apresenta alguns compostos produzidos pela BASF que puderam ser obtidos por meio de hidrogenação enantiosseletiva de ligações duplas C=C ativadas catalisada por OYE. Nota-se que diferentes sistemas de reciclagem de cofatores são aplicáveis.56
Figura 4.Seleção de produtos da BASF obtidos por biorredução enantiosseletiva catalisada por Old Yellow Enzimes (OYE) (adaptado).6
Sabe-se que as OYEs contêm um mononucleotídeo da flavina (FMN) que catalisa a redução assimétrica de alcenos α,β-ativados em um mecanismo ping-pong (Figura 5).53,57 A redução da ligação dupla ocorre em uma etapa de oxidação da
flavina com a adição anti do hidreto do cofator FMN para o carbono β e a transferência de um próton de um resíduo de tirosina ou do solvente para o carbono α. Para completar o ciclo ocorre a redução do FMN pelo cofator NAD(P)H.57
Portanto, essa redução é estritamente trans especifica e se assemelha a uma adição de Michael assimétrica do hidreto para a enona e, como consequência, ligações duplas não ativadas não são reativas.58
Figura 5. Biorredução assimétrica de cetona α,β-insaturada catalisada por enerredutase da família das Old Yellow Enzymes (OYM) mostrando a semi-reação de redução (dependente de NAD(P)H) e a semi-reação de oxidação (dependente do alceno ativado)(adaptado).57
A seletividade da hidrogenação da ligação dupla C=C por meio das ERs está relacionada com a forma em que o substrato se liga a enzima.59 Nesse caso, a
estereoquímica da reação é determinada pela estereoespecificidade da adição do hidreto ocorrer num mecanismo anti, e o modo de ligação da enzima com o substrato. Em se tratando de aldeídos e cetonas α,β-insaturados, o grupo retirador de elétrons, necessário para ativar a ligação dupla, se liga a enzima através de ligações de hidrogênio com resíduos de histidina/asparagina (His191 e Asn194 para OYE1-3) 59 de duas maneira possíveis. São elas a forma clássica ou invertida
(flipped) (Figura 6).60 Os dois modos de ligação se diferenciam pela inversão da
face do alceno exposta ao hidreto da porção FMN e a adição anti do próton, portanto, as diferentes formas de ligação proporcionam diferentes configurações do centro assimétrico.9,60,61 A obtenção de enantiômeros diferentes a partir dos
diastereoisômeros E/Z e baixos ees quando não há racemização é devido a possibilidade de haver mais de uma forma do substrato se ligar as enzimas.62
Figura 6. Mecanismo de redução catalisada por enerredutases da família das OYE mostrando a ligação no sítio ativo da enzima seja pela forma (a) clássica ou (b) invertida (flipped)(adaptado).60
Vários grupos funcionais podem funcionar como grupos ativantes (GRE). São eles os ácidos carboxílicos, ésteres, lactonas, aldeídos, cetonas e até nitrocompostos, todos α,β-insaturados. Os ésteres, em alguns casos de reações com células de microrganismos, sofrem primeiro uma hidrólise por uma hidrolase, formando o ácido correspondente, e posteriormente a redução da ligação dupla.7
Pietruszka e colaboradores (2012) conseguiram obter derivados do (R)-profeno (22) enantiomericamente puro por meio de hidrogenação enantiosseletiva de alguns ésteres metílicos α,β-insaturados (23) utilizando a enzima YqjM, uma enerredutase isolada da bactéria Bacillus subtilis (Figura 7).63 Uma vez que eles
utilizaram a enzima isolada, os autores optaram como sistema de regeneração de cofator a oxidação de glicose por meio de uma GDH. Após otimizar as condições reacionais, essa etapa biocatalítica foi utilizada na preparação do (R)- fluribiprofeno (24) por meio da hidrogenação enantiosseletiva de 25, levando a formação do profeno 26, intermediário chave na síntese desse composto que é utilizado em sprays para o alívio sintomático a curto prazo da dor de garganta em adultos (Figura 8).
Figura 7. Biorredução enzimática para formação de derivados do propeno 15 catalisada pela YqjM, uma enerredutase isolada da bactéria Bacillus subtilis utilizando a oxidação de glicose por meio de uma glicose desidrogenase (GDH) como sistema de regeneração de cofator (adaptado). 63
Figura 8. Biorredução enzimática de 25 catalisada pela enzima YqjM, uma enerredutase isolada da bactéria Bacillus subtilis para formação do profeno 26, intermediário chave na síntese do (R)-fluribiprofeno (24) (adaptado). 63
Como foi menciona anteriormente, compostos com funções nitrogenadas também podem ser utilizados como substrato para redução da ligação dupla C=C ativada. As nitrilas enantiomericamente puras são blocos construtores quirais interessantes devido a sua reatividade química podendo posteriormente serem
convertidas em diferentes grupos funcionais (como ácidos carboxílicos, aminas ou aldeídos). A nitrila 27, por exemplo contém um esqueleto da espiropiperidina, um composto relevante atualmente na pesquisa farmacêutica para fins de tratamento de malária e do vírus Influenza A.64,65 Em um estudo com enerredutases comerciais,
Kosjek e colaboradores (2008) realizaram a hidrogenação enantiosseletiva de uma série de nitrilas α,β-insaturadas com altos rendimentos e estereosseletividade e posteriormente prepararam a nitrila 27 por meio de biorredução da nitrila 28 (Figura 9).66 Para os derivados do composto 29 as enzimas apresentaram seletividade para
formação do enantiômero (R), os autores não determinaram a configuração absoluta do composto 27.
Figura 9. Produção de nitrilas enantiomericamente puras catalisadas por enerredutases (ERs) comerciais (adaptado).5
Nota-se também que os aldeídos e cetonas podem sofrer redução de suas respectivas carbonilas por uma álcool desidrogenase (ADH), formando os seus respectivos álcoois quirais. Da mesma forma, é possível utilizar um álcool alílico (álcool α,β-insaturado) como substrato passando por uma etapa de oxidação da hidroxila, formando então o aldeído correspondente capaz de sofrer uma redução assimétrica na ligação dupla na posição α,β em relação a carbonila.7
Álcoois alílicos, como o monoterpenóide geraniol, (E)-31, são abundantes em produtos naturais como óleos essenciais e são largamente empregados como materiais de partida e/ou componentes majoritários de indústrias alimentícias, de
fragrâncias e farmacêutica.67 Wu e colaboradores. (2012) estudaram a hidrogenação
enantiosseletiva de (E)-31 para gerar o (R)-citronelol (32) (Figura 10) empregando catalisador de rutênio e obtiveram excelentes resultados, contudo a metodologia emprega o uso de metais e condições que se afastam dos princípios da química verde.68
Figura 10. Hidrogenação enantiosseletiva do geraniol ((E)-31) catalisada por complexo de rutênio.68
Como alternativa para essa metodologia utilizando catalisador de rutênio, o álcool 32 poderia ser preparado de forma seletiva por meio de biocatálise com células de microrganismos. A ligação dupla α,β em relação a hidroxila do álcool alílico 31 poderia ser realizada por meio de uma reação em cascata. Gramatica e colaboradores em (1981) mostraram que era possível partindo de derivados do álcool alílico 33 obter-se o álcool hidrogenado 34 por meio de uma oxidação do álcool para aldeído 35 catalisada por uma ADH presente nas células de S. cerevisiae (Figura 11). 69 Uma vez oxidado a aldeído, as ERs poderiam hidrogenar a
ligação dupla, agora ativada pela carbonila, formando o aldeído saturado 36. Em seguida, ocorria a redução da carbonila formando o álcool saturado 34. Nesse trabalho, os autores também observaram seletividade quanto aos diasteroisômeros E/Z e também a substituintes nas posições α e β
Figura 11. Reação em cascata de redução do álcool alílico 33 por ação de uma álcool desidrogenase e uma enerredutase presentes nas células de S. cerevisiae.
Da mesma forma Reich e colaboradores (2016) propuseram uma reação de biorredução de álcoois alílicos em cascata, porém utilizando um acoplamento one pot de uma álcool desidrogenase (ADH) com uma enerredutase (Figura 12). Os autores observaram que algumas enzimas mostraram de boas a excelentes atividades na conversão do (E)-31 (>99% de conversão com OYE1), para o álcool 32, porém os autores não relatam a enantiosseletividade alcançada. O estudo ressalta ainda a importância da verificação da influência da quantidade dos cofatores, uma vez que para fazer a redução da carbonila, as enzimas ADH dependem do cofator reduzido, no caso NADH, assim como as enerredutases, o que leva a um acúmulo de cofator oxidado, NAD+, o que, consequentemente, pode
causar uma diminuição da atividade das enerredutases devido a ausência do cofator reduzido.52
Figura 12. Reação bienzimática one pot em cascata para redução do geraniol ((E)-31) por ação de uma álcool desidrogenase e uma enerredutase.52
Portanto, a combinação de reações de oxidação e redução em cascata, pode como nos casos mostrados acima levar a transformações interessantes tanto do ponto de vista econômico quanto sintético. O desafio, no caso é controlar as reações paralelas em reações com células de microrganismos e em reações com enzimas isoladas one pot para evitar isolamento dos intermediários.
2.4 Terpenos
Os óleos essenciais são compostos por uma complexa mistura de substâncias, contudo, sempre há a predominância de alguns componentes que caracterizaram a espécie vegetal em questão, por exemplo lhe conferindo um aroma característico. Em sua grande maioria, essas substâncias pertencem à classe dos
terpenos.70 Os terpenos formam um grupo de hidrocarbonetos encontrados em óleos
essenciais com estrutura baseada na molécula de isopreno (38), fórmula molecular C5H8 , e são classificados de acordo com o número de unidades de isopreno, ou
unidades C5, presentes na molécula (Figura 13). Os hemiterpenos são compostos
por uma unidade de isopreno (C5), seguido pelos monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30),
tetraterpenos (C40) e politerpenos (unidades maiores que C40).
Alguns metabólitos secundários de origem vegetal derivados dos terpenos são chamados de terpenóides (Figura 13). Esses compostos, além da estrutura baseada na molécula de isopreno, contém um grupo funcional ligado a cadeia carbônica, podendo esse ser um álcool OH), éter OR), aldeído COH), ácido (-COOH), entre outros. Uma característica desses compostos é o, geralmente, agradável odor que, consequentemente, os torna atrativo para indústrias de alimentos e fragrâncias. Principalmente os mono e sesquiterpenóides que, devido a sua alta qualidade sensorial, são os principais compostos utilizados como flavorizantes na indústria em geral. 71,72
Figura 13. Estrutura do Isopreno e de alguns terpenos e terpenóides.
O sesquiterpenóide bisbasol (43), por exemplo, é um componente do óleo de camomila alemã e tem propriedades anti-inflamatórias. Já o álcool fitol (45) é um
diterpenóide. Esse composto é um álcool acíclico de cadeia longa e ramificada constituinte da molécula da clorofila, estando a ela ligado por uma ligação éster. Seus ésteres estão presentes nos fosfolipídios bacterianos, derivados de glicerol, ésteres de mamíferos e vitamina K.73
Os terpenóides formam uma classe variada de compostos biologicamente ativos e blocos construtores de moléculas quirais, consequentemente são bastante atrativos para síntese orgânica. Diversos processos de síntese utilizam terpenos e seus derivados como material de partida em processos puramente químicos.74 No
entanto, na atualidade, os consumidores estão cada vez mais exigentes e em busca de produtos obtidos de fontes naturais, portanto, as tecnologias biocatalíticas se tornam uma alternativa mais atraente em relação aos métodos sintéticos tradicionais para a preparação de compostos químicos de fontes naturais.
Os enantiômeros da dihidrocarvona 46, por exemplo, são componentes minoritários de alguns óleos essenciais de plantas e tem sido bastante utilizados como bloco construtor quiral na síntese de produtos naturais, como o ácido e 47
75,76, além de drogas contra malária.77 Fryszkowska e colaboradores (2009)
utilizaram a PETN redutase para a obtenção da biorredução seletiva da carvona 48 formando os dois diasteroisômeros da cavona 46 com a mesma configuração absoluta no centro quiral formado no carbono C2 com 95% e 88% de ee para (2R,5R)-45 e (2R,5S)-45, respectivamente (Figura 14).
Figura 14. Formação da carvona 46, intermediário chave na síntese total assimétrica do ácido 47, por biorredução catalisada por uma enerredutase.
Sendo assim, novos estudos biocatalíticos utilizando terpenóides como substratos para obtenção de blocos construtores, em especial de moléculas quirais, são altamente viáveis também do ponto de vista químico. Vale notar também um grande potencial para as reações de biorredução desses compostos por meio de células de microrganismos ou enzimas isoladas, uma vez que há uma enorme variedade de terpenóides que contém uma ligação dupla α,β ativada, além dos
compostos como álcoois alílicos terpenóides que podem ser utilizados como substrato para biorredução por meio de reações em cascata, como já foi mencionado anteriormente.
3. Objetivos 3.1 Objetivo geral
Objetiva-se a redução enantiosseletiva da ligação C=C ativada contendo substituintes alquilas na insaturação utilizando células de microrganismos, especialmente cepas de leveduras e fungos. Este seria um método de biorredução sem o emprego de hidrogênio molecular e livre de metais.
3.2 Objetivos específicos
Obter a redução enantiosseletiva da ligação dupla de álcoois alílicos por células de microrganismos aplicando geraniol como substrato modelo;
Verificar a ocorrência (ou não) da oxidação do álcool alílico durante o transcorrer da reação, num processo tandem seguido de redução da ligação dupla.
Verificar influência da estereoquímica (Z) e (E) no processo biocatalítico e compreender a estereoseletividade da hidrogenação
Compreender a reatividade dos intermediários e comparar os resultados com a literatura.
4. Resultados e discussão
4.1 Estudo preliminar na presença e ausência de resina XAD-7PH
Inicialmente fez-se a biocatálise de 50 mg ( aproximadamente 0,30 mmol) de geraniol ((E)-31) com Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (Sigma–Aldrich®,
tipo II) e Candida albicans (C. albicans) CCT 0776 seguindo a metodologia descrita no item 7.5 com o substrato livre e não foi observada nenhuma reação, devido a efeitos inibitórios do substrato na concentração empregada.
O geraniol ((E)-31) tem estrutura muito parecida com a do pirofosfato de geranilo (49), um intermediário importante na biosíntese do ergosterol (Figura 15).78
Por esse motivo, achava-se que o geraniol pudesse inibir a ação das enzimas na formação de ergosterol na etapa de síntese de 49. Esse esterol é um componente fundamental para manter a estrutura e a função da membrana celular dos fungos e alguns protozoários, exercendo funções semelhantes às do colesterol em células animais.79 Como o ergosterol é necessário para a manutenção da estrutura e da
função da membrana plasmática, um composto capaz de inibir sua síntese suprime o crescimento das células na maioria das circunstâncias (efeito fungistático), embora possa, em alguns casos, provocar morte da célula (efeito fungicida). Alguns antifúngicos tem como estratégia inibir uma etapa específica na biossíntese do ergosterol, como por exemplo os imidazólicos e triazólicos que inibem a ação da enzima do citocromo P450 específica dos fungos, a 14-esterol desmetilase, que media a conversão do lanosterol a ergosterol.80,81
Figura 15. Semelhança entre as estruturas de geraniol, (E)-15 e o pirofosfato de geranilo (49).
No entanto, Bard e colaboradores (1988) testando o potencial antifúngico de (E)-31 observaram que o efeito inibitório do geraniol em células de C. albicans e S. cerevisiae não está relacionado com inibição da síntese do ergosterol, mas sim
com mudanças na dinâmica da membrana plasmática.78 Nesse estudo, os
pesquisadores mostraram que o (E)-31 ao difundir na membrana causa alterações nas propriedades da bicamada lipídica, como o aumento da permeabilidade e lixiviação de potássio. Já Leite e colaboradores (2015), em um estudo recente, sugeriram que o efeito inibitório de geraniol em células de C. albicans está relacionado com o sistema de disseminação dos fungos por inibição da formação de pseudo-hifas e clamidoconídios.82
Para o estudo do presente trabalho, foi optado como alternativa para contornar os efeitos inibitórios do substrato (E)-31 para as células de levedura, adsorver ver o mesmo em hidrofóbica Amberlite® XAD-7HP (Sigma–Aldrich®) para
adsorver o substrato e liberá-lo lentamente no meio reacional. Essa resina já havia sido utilizada em estudos anteriores do grupo e estava prontamente disponível. O uso da resina XAD-7HP permitiu com que as células de C. albicans fossem capazes de realizar biotransformações com (E)-31. Para se chegar a uma quantidade ideal de resina adsorvente a fim de se obter melhores conversões aos produtos desejados em um tempo viável, foram feitos experimentos com 100, 200, 300, 400 e 500 mg de resina, para 50 mg (0,3 mmol) de (E)-31(Tabela 5) seguindo a medotodologia descrita no item 7.5, porém retirando-se alíquotas de 1 mL do meio reacional para determinação dos produtos formados.
Tabela 5. Conversões obtidas por CG-EM para alíquotas de 1 mL da biocatálise de 50 mg de geraniol, (E)-31, com 300, 400 e 500 mg de resina XAD-7HP e 3 g de células de C. albicans após 7 dias.
XAD-7HP (mg) Tempo (h) 32 (%) (E)-50 (%) (Z)-50 (%) 51 (%) 300 29 1 48 n.d. 51 48 n.d. 27 n.d. 73 168 n.d. 23 n.d. 77 400 29 n.d. 66 4 30 48 n.d. 47 n.d. 53 168 n.d. 45 n.d. 55 500 29 n.d. 87 n.d. 13 48 n.d. 74 n.d. 26 168 n.d. 60 n.d. 40 n.d.: não detectado.
Com as quantidades de 100 e 200 mg de resina XAD-7PH, a reação não se completou e observou-se uma pequena formação do álcool insaturado 32, já que a reação se processa de forma lenta até o momento em que as células são mortas por conta da toxicidade do substrato e não ocorre mais reação. Com as quantidades de 400 e 500 mg de resina, observou-se predominantemente ácido gerânico ((E)-50), ou seja, sem reduzir a ligação dupla. Portanto, a quantidade considerada ideal de resina foi 300 mg, com a qual se observa uma conversão de 77 % de 51, após 7 dias de reação (Tabela 5).
Os resultados da Tabela 5 representam a quantidade de substrato e produtos extraídos de alíquotas de cerca de 1 mL da reação, retiradas cuidadosamente, levando em consideração a necessidade de coletar uma certa quantidade de resina, uma vez que o produto poderia estar adsorvido na mesma. No entanto, os ácidos formados, mostraram um coeficiente de partição água/resina maior que o substrato ou o álcool intermediário 32 (devido a maior solubilidade dos ácidos em água) que não foi observado nesse experimento, pois estava
majoritariamente retido na resina. Portanto, os valores de conversão dessa tabela não representam a composição real da reação biocatalítica, entretanto exibem uma tendência da formação desses ácidos.
Esse experimento foi utilizado como um teste preliminar para identificação dos produtos formados na biocatálise do álcool alílico (E)-31 adsorvido em resina XAD-7HP com células de C. albicans, portanto, consideramos como a melhor condição de resina aquela que favoreceu a formação da maior quantidade de um dos produtos, no caso o ácido citronélico 51, para o qual ocorre não só a formação de um centro assimétrico, mas também a oxidação da função álcool a ácido carboxílico, resultado que se diferenciou das nossas expectativas, porém, se mostrou também interessante.
Uma vez observada essa discrepância na composição das amostras de biocatálise retirando-se uma alíquota de 1 mL do meio reacional, optou-se como procedimento realizar varias reações similares simultaneamente e ao invés de retirar alíquotas, fe-zea extração de todo o conteúdo reacionaldos produtos foi realizada com os 10 mL de meio aquoso e biomassa para todas as biocatálises feitas posteriormente, cujos resultados estão apresentados na sequência.
4.2 Biocatálise dos álcoois alílicos terpenóides
O estudo da biocatálise com os terpenóides tem por finalidade entender a quimiosseletividade e enantiosseletividade das enzimas presentes nos microrganismos para esses compostos. Esperava-se que as enzimas presentes no microrganismo, como por exemplo uma álcool desidrogenase (ADH), promovesse a oxidação do álcool a aldeído, de forma que permitisse a hidrogenação enantiosseletiva da ligação dupla α à carbonila por uma enerredutase (ER) e, posteriormente ou comitantemente, ocorresse a redução da carbonila formando o álcool quiral como já foi observado por diversos autores em estudos com células de S. cerevisiae.51,55,83 Contudo, embora ocorreu conversão para o álcool quiral nas
primeiras 24h horas de reação, o álcool formado tendeu a ser oxidado à ácido carboxílico pelas enzimas presentes nas células de C. albicans, formando após 7 dias o ácido gerânico ((E)-50) com 34% de conversão e o ácido (R)-citronélico (51) (66% conversão) com excesso enantiomérico apreciável (63% ee), resultado esse que até o momento não foi observado na literatura (Figura 16).
