Kennya Addam Gomes Silva
Mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial para Oreochromis niloticus
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção de grau de mestre em Aquicultura
Orientador: José Luiz Pedreira Mouriño
Florianópolis 2018
Dedico este trabalho a minha mãe Mary Cristina e à minha irmã Andressa Marques.
AGRDECIMENTOS A Deus,
À minha mãe, pela oportunidade que me deu de crescer em uma família estruturada, com todo amor, e apoio aos meus estudos e principalmente entender que muitas vezes é preciso estar distante para crescer.
À minha irmã, que jamais me deixou desistir e por acreditar que sou capaz de lutar pelos meus sonhos.
Ao meu irmão, que sempre torceu por mim e acreditou nas minhas escolhas.
À minha querida amiga Márcia de Andrade, que sempre mesmo de longe me apoiou nas minhas decisões mais importantes. Sou grata por tudo que tu tens feito por mim.
À CAPES pela concessão da bolsa para execução desta pesquisa. Ao orientador, Prof. José Luiz Pedreira Mouriño, pela oportunidade e principalmente pela confiança atribuída. Por sempre mostrar que somos capazes de mais do que imaginamos, por inspirar a ser um profissional cada vez melhor. Obrigada pelas conversas sobre esportes, pela parceria formada e pelos conselhos dados. Sou extremamente grata.
Ao professor Prof. Maurício Laterça Martins, por todos os auxílios, explicações e sugestões, no decorrer do meu mestrado.
À Scheila Pereira (Sche), por todos os motivos imagináveis durante esses dois anos juntas. Obrigada por todas as analises, auxílios e principalmente por me deixa te incomodar nos teus dias de “folga”, finais de semana a qualquer horário, acho até que tu não tinhas muitas escolhas né “kkkkkk”. Obrigada por provar que paciência é uma virtude, SIM, ela é uma virtude e que através dela podemos ser pessoas melhores todos os dias. Sou grata, por tudo que aprendi contigo e mais ainda por ter tido o trabalho de me ensinar novamente, motivo pelo qual tu bem sabe.
À Marcela Yamashita (MáH), por ser meu Yin e Yang. Obrigada por tudo que tu me proporcionaste em termos científicos, de vida e de como devemos aproveitar o momento que estamos vivendo e as pessoas ao nosso redor. Obrigada estar ao meu lado em um momento bem complicado que tu bem sabes, provando que amizade de verdade é algo que vai muito mais além de nós e que é possível reconquistar algo que se perdeu por um momento em nossos pensamentos.
Ao meu querido amigo Lucas Cardoso, pelas incontáveis manhãs na saga da histologia, pelos melhores “bom dia” que alguém pode receber, e principalmente por sua amizade e carinho.
Ao Gabriel Jesus pela grande parceria feita antes, durante e pós experimento. Por toda essa saga vivida nesses dois anos.
A minha equipe de trabalho que tenho o carinho enorme, o sincronismo não poderia ter sido melhor: Gab’s, Gauchon e meu querido estagiário Nicow por aguentar toda minha chatice e principalmente ouvir aquela frase que você jamais esquecera: “está atrasado”. Obrigada vocês são demais.
Aos amigos do laboratório AQUOS/UFSC pela ajuda e paciência (grande foi a paciência), por todos os ensinamentos de procedimentos no qual eu nunca havia realizado, pelas conversas “tantas conversas”, risadas que foram muitas e papos sem pé nem cabeça. Obrigada!
Em especial aminha querida Teacher (Karen) e o meu querido friend Will’s por todo carinho e amizade construída ao longo desse dois anos.
Aos amigos que fiz durante esses dois anos em especial: Leyci Souza e Marina Calinowski por estar sempre presentes nos momentos de desespero e também de felicidades.
À minha querida amiga Angelita Maiorka Sassi, que me salvou no início dessa minha jornada e tendo estado comigo até o final.
Obrigada a todos os professores do Programa de Pós-graduação em Aquicultura.
Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram com a realização deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
O trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da suplementação dietética de uma mistura de ácidos orgânicos e/ou óleo essencial de alecrim-pimenta (Lippia origanoides) para tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) alimentada com dietas suplementadas por 30 dias. As dietas experimentais foram divididas em controle (C), mistura de ácidos orgânicos (formiato de amônio, ácido fórmico, ácidos graxos vegetais, ácido propiônico e ácido acético) (A-0,5%) e mistura de ácido orgânico com óleo essencial de Lippia origanoides (AO-0,125%). O pH das dietas foi verificado antes do início do experimento. Ao término foram realizadas coletas para análise hematológica e imunológica, histológica e microbiológica. O pH das dietas experimentais foi reduzido com a adição do óleo e do ácido orgânico. O pH diminuiu de 5,45 (C) para 5,40 (A) e 5,39 (AO). Os animais que receberam a dieta experimental mistura de ácidos orgânicos obtiveram maior sobrevivência em relação aos demais tratamentos; quanto ao ganho de peso, os peixes que receberam a suplementação AO apresentaram valores absolutos maiores que os dos demais tratamentos e uma conversão alimentar menor. Contudo, nesse experimento não foi possível detectar diferença estatística. A concentração de bactérias heterotróficas totais e de Pseudomonas sp. no trato intestinal foi reduzido quando suplementado com dieta A, diferindo estatisticamente. Houve acréscimo expressivo da glicose e monócitos circulantes quando comparados ao grupo não suplementado. Na porção anterior do intestino dos animais suplementados verificou-se um maior número de células caliciformes e aumento de altura dos vilos. Ainda, registrou-se redução dos infiltrados linfocitários no fígado e nas concentrações de bactérias totais heterotróficas e Pseudomonas sp, quando comparados ao tratamento não suplementado (C). Fica claro que as suplementações trouxeram melhorias na saúde do animal apresentando resultados positivos quando comparados àqueles alimentados com o tratamento C. No entanto, sugere-se outros estudos para testar diferentes doses verificar os seus efeitos nos parâmetros zootécnicos, moleculares e histológicos da microbiota.
Palavra-chave: Aquicultura, tilápia-do-nilo, alecrim-pimenta, histomorfometria intestinal, hematoimunológico.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effects of dietary supplementation of a mixture of organic acids and / or rosemary essential oil (Lippia origanoides) for Nile tilapia (Oreochromis niloticus) fed diets supplemented for 30 days. Experimental diets were divided into control (C), mixture of organic acids (ammonium formate, formic acid, vegetable fatty acids, propionic acid and acetic acid) at the concentration of 0.5% (A) and organic acid mixture and essential oil of Lippia origanoides at concentrations of 0.5% and 0.125 μl, respectively (AO) The pH of the diets was verified before the beginning of the experiment. At the end, samples were collected for hematological and immunological, histological and microbiological analyzes. The pH of the experimental diets was reduced with addition of A and AO. The pH decreased from 5.45 (C) to 5.40 (A) and 5.39 (AO). The animals that received the experimental diet mixture of organic acids obtained a greater survival in relation to the other treatments, in relation to the weight gain of the fish that received the AO supplementation presented absolute values higher than the other treatments and a lower feed conversion. However, in this experiment it was not possible to detect statistical difference. The concentration of total heterotrophic bacteria and Pseudomonas sp. in the intestinal tract was reduced when supplemented with diet A differentially statistically. There was an expressive increase of glucose and circulating monocytes when compared to the non-supplemented group. In the anterior portion of the intestine of the supplemented animals a greater number of goblet cells and increase of villi height were observed. Also, there was a reduction of lymphocyte infiltrates in the liver and concentrations of total heterotrophic bacteria and Pseudomonas sp. when compared to the non-supplemented treatment (C). It is clear that supplementation has brought about improvements in the health of the animal presenting positive results when compared to those fed with treatment C. However, other studies to test different doses are suggested to verify their effects on the zootechnical, molecular and histological parameters of the microbiota.
Keywords: Aquaculture, Nile tilapia, rosemary pepper, intestinal histomorphometry, hematoimmunological.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Análise dos pH’s das dietas experimentais dos grupos sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO)... 40 Figura 2: Análise dos pH’s dos tratos intestinais de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias... 41 Figura 3: Contagem de bactérias (Log 10) por grama do trato intestinal
de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias... 42 Figura 4: Análise imunológica do plasma de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias. A) Concentração de proteínas totais (mg·ml-1) e concentração de imunoglobulinas totais (mg·ml-1). B)
Título aglutinante (Log10) e título antimicrobiano (Log10)... 43
Figura 5: A. Aumento na altura dos vilos na porção anterior e aumento no número de células caliciformes (cabeça de seta) de tilápia-do-nilo suplementada com mistura de ácido orgânico e óleo essencial; B. vilos dos animais não suplementados; C. Redução dos infiltrados linfocitários no fígado de tilápia-do-nilo suplementada com mistura de ácidos orgânicos; D. Aumento dos infiltrados linfocitários (asterisco) no fígado de animais com dieta não suplementada... 46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Parâmetros zootécnicos (média ± desvio padrão) de tilápia-do-nilo Oreochromis niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias.. ... 40 Tabela 2: Parâmetros hematológicos (média ± desvio padrão) de tilápias-do-nilo Oreochromis niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias.. ... 42 Tabela 3: Morfometria intestinal anterior e posterior de juvenis de tilápia-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias.. ... 44 Tabela 4: Intensidade de alteração histológica no intestino de tilápia-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (A) por 30 dias. ... 44 Tabela 5: Intensidade de alteração histológica no fígado de tilápia-do-nilo O. tilápia-do-niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias.. ... 45 Tabela 6: Intensidade de alteração histológica no baço de tilápia-do-nilo O. tilápia-do-niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias. ... 46
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 19
Tilapicultura Mundial e brasileira ... 19
Principais doenças no cultivo de tilápias ... 20
Prevenção e manejo profilático ... 21
Tratamentos alternativos ... 21 JUSTIFICATIVA ... 25 OBJETIVOS ... 25 Objetivo Geral ... 25 Objetivos específico ... 25 FORMATAÇÃO ... 26 RESUMO ... 29 ABSTRACT ... 30 INTRODUÇÃO ... 31 MATERIAIS E MÉTODOS ... 32 Material biológico ... 32 Óleo essencial ... 32
Mistura de ácido orgânico ... 33
Preparo das dietas experimentais ... 33
Análises dos pH’s das dietas ... 34
Delineamento experimental ... 34
Índices zootécnico ... 35
Análise do pH do trato intestinal ... 35
Análises microbiológicas ... 36
Análises hematológicas ... 36
Análises histológicas ... 38
Análise estatística ... 39
RESULTADOS ... 39
Analises dos pH’s das dietas ... 39
Índices zootécnicos ... 40
Análise do pH ao longo do trato intestinal ... 41
Análises microbiológicas ... 41 Análises hematológicas ... 42 Análises imunológicas ... 43 Análises histológicas ... 43 DISCUSSÃO ... 46 AGRADECIMENTOS ... 51 REFERÊNCIAS ... 51 REFERÊNCIA DA INTRODUÇÃO ... 55
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INTRODUÇÃO GERAL
Tilapicultura Mundial e brasileira
As tilápias pertencem à família Cichlidae, que foi introduzida no Brasil por volta de 1950 e corresponde a cerca de 75 espécies válidas. São nativas do continente africano, sendo utilizadas na piscicultura desde 2000 a.C (FITZSIMMONS, 2000). Quatro espécies têm destaque atualmente, sendo elas a tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus Linnaeus 1758), tilápia-de-moçambique (Oreochromis mossambicus Peters 1852), tilápia-azul (Oreochromis aureus Steindachner 1864) e tilápia-de-zanzibar (Oreochromis urolepis Norman 1922). A tilápia nilótica tem relevância na produção aquícola, pois é a segunda espécie mais produzida no mundo e em 2015 atingiu 3,1 bilhões de toneladas (FAO, 2017). A espécie habita ambiente tropical de água rasas, adaptando-se a clima onde a temperatura tenha variações entre 11 e 42 °C, suportando uma ampla faixa de pH e pouco exigente em relação ao oxigênio (FAO, 2005). É onívora e filtradora dando preferência ao fitoplâncton, perifíton, plantas aquáticas e animais bentônicos (LUND; FIGUEIRA, 1989).
O cultivo desta espécie vem sendo uma grande alternativa de produção mundial devido as suas características biológicas, rusticidade, facilidade em adaptar-se às condições de criação intensiva (FITZSIMMONS, 2000; FAO, 2012). Além dessas características, vale ressaltar que a tilápia nilótica dispõe de crescimento rápido, tolera baixa qualidade de água, aceitando uma variedade de alimentos (FITZSIMMONS, 2000).
O Brasil tem potencial para produção de tilápias por possuir um vasto território, com condições climáticas favoráveis (CASTAGNOLLI, 1995). Em 2015, atingiu o quinto lugar no ranking dos maiores produtores de tilápia no mundo, com 219,33 mil toneladas despescadas, representando 45,4% da produção total da piscicultura nacional (IBGE, 2015). Segundo Barroso et al. (2017), a produção de tilápia é voltada para o mercado interno, sendo 99% da produção consumida em território nacional e 1%, que corresponde a menos de 200 t, voltada para exportação.
Dentre as formas de criação aplicadas no Brasil destaca-se a criação semi-intensiva, caracterizada por viveiros escavados, com renovações pontuais de água e densidades medianas, e o intensivo, onde os peixes são estocados em altas densidades, com troca de água constante (ZIMMERMANN, 2001). No entanto, esses modelos acarretaram alterações na cadeia produtiva uma vez que é necessário a inclusão de
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insumos adequados para cada tipo de sistema, como por exemplo manejos alimentares específicos (SCORVO FILHO et al., 2010). Em decorrência das altas densidades de estocagem e más práticas de manejo sanitário, tem ocorrido o desenvolvimento de inúmeras doenças das mais diversas etiologias (CONROY, 2001; AMAL; ZAMRI-SAAD, 2011).
Principais doenças no cultivo de tilápias
Com o incremento na produção aquícola continental, principalmente no setor da tilapicultura, maior atenção tem sido dada aos aspectos sanitários associados a essa atividade, resultando no aumento de informações acerca das enfermidades que podem ocorrer nos animais destinados à produção comercial. Dessa forma, já é sabido que surtos de doenças infecciosas causam perdas significativas nos cultivos de tilápias em todo o mundo. A ocorrência de doenças não é restrita à produção de O. niloticus, mas sim um problema frequente em populações de animais aquáticos. Condições de estresse impostas aos animais, relacionadas especificamente a má qualidade de água, altas densidades, manejo inapropriado, dietas inadequadas. Estes são fatores capazes de provocar o desequilíbrio do cultivo, comprometendo o sistema imunológico dos animais (MARTINS, MORAES 2004). Entre os principias patógenos bacterianos que podem acometer tilápias em cultivos, destacam–se: Streptococcus agalactie, Flavobacterium columnare, Francisella sp., Edwardsiella spp., Aeromonas spp., capazes de causar grandes prejuízos na produção (AMAL E ZAMRI-SAAD, 2011; LEAL et al., 2014).
Dentre as doenças infecciosas que acometem peixes em cultivo, infecções causadas por bactérias do gênero Streptococcus estão entre as principais causas de enfermidade, especialmente em criações de tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) (EVANS et al., 2002). A espécie Streptococcus agalactiae tem sido responsável por surtos de mortalidade em organismos dulcícolas e marinhos, em ambiente natural e em pisciculturas de diversas regiões do mundo (AL-HARBI, 2016). Os sinais clínicos típicos da infecção incluem melanose, exoftalmia, natação errática, septicemia, opacidade na córnea, aumento de volume e hemorragia nos órgãos internos (CHEN et al., 2012; LI et al., 2014). A prevenção contra bacterioses causadas por a S. agalactie, está relacionada a boas práticas de manejo e higiene utilizadas (CONROY, 2001; EVANS et al., 2002; KOMAR, 2008).
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Prevenção e manejo profilático
Após a instauração de doenças, principalmente bacterianas nas unidades de cultivo piscícolas, o seu tratamento é difícil e oneroso. A maioria das enfermidades bacterianas são tratadas posteriormente ao seu desenvolvimento, de maneira remediativa, acarretando grandes mortalidades e a utilização irracional de antibióticos. Além desses fatores, poluição ambiental é ainda o pior estresse oxidativo dos tecidos dos animais tratados, o que acarreta em abrir uma porta de entrada de patógenos (PEREIRA et l., 2015).
Depois de instaladas na piscicultura, as bacterioses e parasitoses provocam perdas e, para que sejam eliminadas dos sistemas de cultivos, devem ser investidos grandes esforços financeiros e de manejo, que envolvem alto custo com produtos e com mão-de-obra especializada (TAVECHIO et al 2008).
A prevenção contra diversas bacterioses está relacionada com boas práticas de manejo e higiene dos sistemas de cultivo, manter os animais bem nutridos em condições ambientais favoráveis, observar a qualidade de alevinos e retirar animais mortos são medidas essenciais (CONROY, 2001; KOMAR, 2008; BHUJEL, 2014).
A busca por manejos profiláticos e tratamentos alternativos tem ganho cada vez mais espaço, com estudos utilizando produtos que contenham microrganismos e seus derivados, denominados probióticos e prebióticos, extratos de plantas, por exemplo, são conhecidos como imunoestimulantes (SAKAI, 1999). Aditivos como esses têm propriedades capazes de estimular o sistema imune por conferirem um aumento na atividade das células fagocitárias, na produção de lisossomos e anticorpos, diminuírem o estresse do manejo reduzindo assim, as perdas causadas pelas doenças (CHITMANAT, 2002).
Tratamentos alternativos
Levando em consideração as desvantagens como seleção de cepas resistentes, resíduos na carne e poluição ambiental ao uso de antibióticos existe um maior interesse na busca de alternativas para substituí-los, a fim de evitar efeitos prejudiciais causados pelo seu uso (SHAKYA et al., 2015; AWAAD, 2017). Portanto, há uma necessidade do estudo sobre aditivos alimentares alternativos como promotores de crescimento e de saúde. Dentre os mais estudados no presente, encontram-se os probióticos, prebióticos, enzimas exógenas, extratos vegetais, alimentos funcionais e os fitoterápicos. Os possíveis substitutos promotores de
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saúde devem preservar ações benéficas dos antibióticos e suprimir as indesejáveis, como a resistência bacteriana (LODDI et al., 2000).
Os aditivos alimentares adicionados às rações com fins zootécnicos são definidos como substâncias utilizadas para influir positivamente na melhoria do desempenho animal, sendo estes divididos em três grupos: a) os equilibradores da flora do trato intestinal digestório: são os microrganismos que têm um efeito positivo sobre esta flora; b) os melhoradores de desempenho, que são substâncias que favorecem os parâmetros de produtividade; c) os digestivos, aqueles que facilitam a digestão (BRASIL, 2004).
Além desses aditivos, existem também os ácidos orgânicos, que anteriormente tinham a função de conservantes, evitando a deterioração dos alimentos e aumentando a vida útil de ingredientes perecíveis. Atualmente, são utilizados para reduzir a contaminação microbiana e a disseminação de doenças veiculadas por alimentos (RICKE, 2003). São compostos naturais de diversos alimentos e produto do metabolismo dos animais (RODRIGUES, 2015). Os ácidos orgânicos são classificados em: a) ácidos orgânicos de cadeia curta, que atuam na redução do pH da dieta e também como fonte de energia, além de estar associados à atividade antimicrobiana (propiônico, fórmico, acético, cítrico, lático, benzoico fumárico e butírico), agindo na primeira porção do trato intestinal; b) os de cadeia média, que demonstram eficácia antimicrobiana (ácidos cáprico, caprílico, caproico e láurico), são mais difíceis de serem degradados, agindo na porção mediana do trato; c) os protegidos, que têm o intuito de proteger e permitir a liberação controlada do princípio ativo, sem dissociar-se (DIERICK et al, 2002, LEHNINGER; NELSON; COX, 2007). Diversas empresas vêm optando pela utilização de mistura de ácidos orgânicos de cadeias médias, curtas e protegidos, objetivando que o aditivo seja absorvido em todo o trato intestinal do animal. Langhout (2005) afirma que os ácidos na sua forma não ionizada penetram através da parede das bactérias liberando prótons no citoplasma promovendo diminuição do pH interno e elevando o gasto de energia para eliminar o excesso de H+ e manter seu equilíbrio intracelular. Esse gasto
de energia tem como consequência uma diminuição de energia celular e posteriormente a morte das bactérias (LÜCKSTÄDTS, 2008, DEFOIRDT et al., 2009).
Os ácidos orgânicos ainda auxiliam na digestão e limitam a proliferação de microrganismos patogênicos (CAVALHEIRO et al., 2014). A redução de pH estimula a atividade das enzimas digestivas nas microvilosidades intestinais, contribuindo na criação de um ambiente intestinal favorável e na colonização de microrganismos salutíferos (EWING e COLE, 1994), trazendo benefícios ao trato e consequentemente ajudando na digestão, aumentando a digestibilidade proteica (MOROZ et al., 2000).
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Kowalski et al (2015), ao suplementarem ração com 1% de mistura de ácidos orgânicos (ACIDAL®CAL), obtiveram resultados satisfatórios
em relação ao peso corporal no desempenho de leitões recém desmamados. Viola et al (2008), ofertando dieta suplementada com mix de ácidos orgânicos (ácidos lático, fórmico, acético e fosfórico) para frangos, obtiveram ganho de peso maior, quando comparado ao tratamento não suplementado. Já Sunkara et al. (2011) demostraram que a suplementação de butirato de sódio para frango é um potente indutor de vários peptídeos antimicrobianos e consequentemente proporciona melhoria da resposta imune inata.
Outros aditivos que vêm sendo estudados são os fitoterápicos, provenientes de produtos naturais (plantas), utilizados para tratamentos de enfermidades na aquicultura, sendo uma opção para mitigar também o uso de antibióticos e ainda atuando na manipulação microbiana, garantindo uma segurança alimentar (SHAKYA et al, 2015; AWAD; AWAAD, 2017). Os fitoterápicos, em específico os óleos essências, vêm ganhando cada vez mais espaço nas indústrias. Os óleos essenciais são extraídos de plantas por processo de destilação a vapor, incluindo componentes como os aldeídos, ésteres cíclicos, terpenoides, álcoois, dentre outros (TOLEDO et al., 2007). Segundo a Resolução - RDC nº2, de 15 de janeiro de 2007–ANVISA, são encontrados de forma isolada ou misturados entre si, retificados, desterpenados ou concentrados. Diversos estudos relataram a ação antimicrobiana (MITSCH et al., 2004), antioxidante (RACANICCI et al., 2004; 2008) e digestiva (KAMEL, 2000) dos óleos essenciais, caracterizando-os como substitutos dos aditivos sintéticos, melhorando o desempenho do animal (WEBER, et al., 2012).
A ação dos óleos essenciais para atuar nos mecanismos que favorecem o desempenho dos animais ainda não é muito clara. Entretanto, os óleos estimulam a secreção de enzimas endógenas, facilitando a digestão, estimulando a circulação sanguínea, exercendo propriedades antioxidantes, além de alterar a microflora intestinal e possuir atividade antimicrobiana, anti-helmíntica, imunomoduladora capaz de ativar a defesa imunológica específica e inespecífica dos animais frente a um desafio (SAKAI, et al., 1999; GARCIA et al., 2006; BONATO et al., 2008; CHAKRABORTYet al., 2011). Segundo Harikrishnan et al. (2011), esses compostos podem ativar ou inibir componentes do sistema imunológico, auxiliando na fagocitose, na atividade bactericida, estimulando a atividade dos linfócitos, da lisozima e de anticorpos, resultando numa maior proteção contra infecções.
Kamel (2000) afirma que os componentes em maior quantidade nas plantas são os princípios ativos, no entanto, pesquisas demonstram
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que os componentes secundários, aqueles presentes em menor quantidade, exercem função de potencializar o efeito do princípio ativo. Além de limitar o crescimento de bactérias patogênicas, os óleos essenciais melhoram a digestibilidade da matéria seca, do amido e da proteína. Dentre os princípios ativos dos óleos essenciais, o carvacrol vem ganhando destaque como princípio ativo primário, atuando como bactericida e antioxidante. Carvacrol é o princípio ativo majoritário, com 40% de concentração, da Lippia origanoides, conhecida popularmente como alecrim-pimenta; diversos estudos já demonstram seus efeitos benéficos quando utilizado conjuntamente com princípios secundários (PERIAGO, et al., 2001).
Langhout (2000) acredita que a administração combinada de óleos essenciais de plantas na dieta dos animais proporciona melhor resultado no desempenho em comparação aos produtos utilizados isoladamente. No estudo realizado por Zhou et al. (2007), ao testar in vitro a ação antimicrobiana de carvacrol e thymol conjuntamente nas proporções 0% 50%, 100%, 200%, 400% e 500% por 40 dias verificaram um efeito sinérgico entre os princípios ativos. Ambos os princípios ativos agem contra microrganismos através de uma ação lipofílica da membrana celular das bactérias. Suzuki et al. (2008), ao utilizar 2% de carvacrol e thymol adicionados à ração para leitões nas fases iniciais, durante 70 dias, observou que a digestibilidade da matéria seca e ganho de peso foi significativamente maior, quando comparado ao grupo não suplementado. Outros estudos relatam também efeitos benéficos com adição de óleos essenciais e seus princípios ativos, como no estudo de Kassie (2009), onde a suplementação da ração para frangos com óleo essencial de tomilho, obteve resultados positivos em relação a ganho de peso e conversão alimentar. Como exemplo da atividade antiparasitária, o extrato de alho Alllium sativum reduziu em 95% o parasitismo por Monogenea em Piaractus mesopotamicus (MARTINS et al., 2002). Já em estudos realizados por Talpur et al. (2012), ao suplementarem dieta com A. sativum constataram que houve um aumento do total de leucócitos circulantes em Lates calcarifer. Em tilápia-do-nilo foi observado o aumento do número de leucócitos e monócitos circulantes suplementadas por 15 dias com extrato de própolis a 0,5% (DOTTA et al., 2014 e 2015). Langhout (2005) sugere a associação entre ácidos orgânicos e óleos essenciais, onde ambos os aditivos causam injúrias na parede celular das bactérias, aumentando o pH interno e elevando o gasto de energia, limitando o crescimento e multiplicação bacteriana, além disso, melhoram a dieta o trato gastrointestinal e consequentemente as enzimas digestivas trabalham mais eficientemente em condições ácidas.
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JUSTIFICATIVA
Devido à necessidade de acompanhar os avanços relacionados à aquicultura, novas formas de tratamentos vêm sendo estudadas, sejam elas profiláticas ou remediadoras para evitar grandes perdas econômicas causadas por doenças de cunho bacteriano. Diante desse cenário, onde se utilizam antibióticos para o controle de bacterioses - e seu uso inapropriado vem trazendo cepas resistentes - é importante outras vias de tratamentos, com capacidade de preservar as ações benéficas dos antibióticos e suprimir as indesejadas tal como, a resistência bacteriana.
Existem poucos estudos com ácidos para peixes, principalmente a utilização de mistura de ácidos orgânicos caracterizados por possuir cadeias médias, curta e também na sua forma protegida, fazendo com que os ácidos sejam absorvidos em todo o trato intestinal do animal.
Outro aditivo importante é o óleo essencial utilizado como medidas profiláticas, demostrando efeitos antimicrobianos e antioxidantes, atuando como permeabilizador de membrana.
Diante do exposto em busca de novas ferramentas para o controle de enfermidades é importante o estudo sobre a ação conjunta de mistura de ácidos orgânicos e óleos essenciais em relação as respostas imunológicas e desempenho zootécnico de tilápia-do-nilo.
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Contribuir com informações no progresso da tilapicultura acerca dos efeitos da suplementação dietética de mistura de ácido orgânicos e óleo essencial conjuntamente, sobre os parâmetros de saúde e desempenho zootécnico.
Objetivos específico
Verificar a influência da suplementação com mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides sobre os parâmetros zootécnicos, hematoimunológicos e alterações histológicas em tilapias-do-nilo.
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FORMATAÇÃO
O capítulo 1 está formatado nas normas da ABNT. O Capítulo 2 será formatado segundo as normas da revista Aquaculture Nutrition.
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Mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial para Oreochromis niloticus
Mixture of organic acids and essential oil for Oreochromis niloticus
Kennya Addam Gomes Silva*1, Scheila Anelise Pereira1, Gabriel
Fernandes Alves Jesus1, Lucas Cardoso1, Nicholas Syracuse1, Gustavo
Ruschel Lopes1, Bruno Correa da Silva2, Maurício Laterça Martins1 &
José Luiz Pedreira Mouriño1
1Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Departamento de
Aquicultura, Laboratório de Patologia e Sanidade de Organismos Aquáticos (AQUOS), Rod. Admar Gonzada 1346, CEP: 88040-900, Florianópolis/SC, Brasil;
2Centro de Desenvolvimento 1em Aquicultura e Pesca (Cedap)
Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (Epagri)
Rod. Antônio Heil, 6800. Bairro: Itaipava, Itajaí-SC. 88318112.
*Corresponding author. Tel: +55 81 999620734 E-mail addres: kennyaaddamg@gmail.com
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RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação dietética de uma mistura de ácidos orgânicos e/ou óleo essencial de alecrim-pimenta (Lippia origanoides) para tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) alimentada com dietas suplementadas por 30 dias. As dietas experimentais foram divididas em controle (C), mistura de ácidos orgânicos (formiato de amônio, ácido fórmico, ácidos graxos vegetais, ácido propiônico e ácido acético) na concentração de 0,5% (A) e mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides nas concentrações de 0,5% e 0,125 µl, respectivamente (AO). O pH das dietas foi verificado antes do início do experimento. Ao término do experimento foram realizadas coletas para análise hematológica e imunológica, histológica e microbiológica. O pH de todas as dietas suplementadas sofreu redução significativa de 0,92 e 0,19 respectivamente, para as dietas A e AO em relação ao controle. A biomassa final e o ganho de peso dos peixes que receberam o tratamento A apresentaram valores absolutos maiores em relação aos demais tratamentos. Contudo, nesse experimento não foi possível detectar diferença estatística. A conversão alimentar foi menor no tratamento AO seguido pelo tratamento A quando comparados ao tratamento não suplementado C. A concentração de bactérias heterotróficas totais e de Pseudomonas sp. no trato intestinal foi reduzida quando suplementado com dieta A, diferindo estatisticamente. Houve um acréscimo expressivo da glicose no tratamento A e monócitos circulantes no tratamento AO ambos quando comparados ao grupo não suplementado. Na porção anterior do intestino dos animais suplementados com AO verificou-se um maior número de células caliciformes e aumento de altura dos vilos. Ainda, registrou-se uma redução dos infiltrados linfocitários no fígado e nas concentrações de bactérias totais heterotróficas e Pseudomonas sp, quando comparados ao tratamento C. Fica claro que as suplementações trouxeram melhorias na saúde do animal apresentando resultados positivos quando comparados àqueles alimentados com o tratamento C. No entanto, sugere-se outros estudos para testar diferentes doses de ambos aditivos conjuntamente para verificar os seus efeitos nos parâmetros zootécnicos, moleculares e histológicos da microbiota.
Palavra-chave: tilápia-do-nilo, alecrim-pimenta, crescimento, histomorfometria intestinal, hematoimunológico.
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ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the effects of dietary supplementation of a mixture of organic acids and / or rosemary essential oil (Lippia origanoides) for Nile tilapia (Oreochromis niloticus) fed diets supplemented for 30 days. Experimental diets were divided into control (C), mixture of organic acids (ammonium formate, formic acid, vegetable fatty acids, propionic acid, and acetic acid) at the concentration of 0.5% (A) and organic acid mixture and essential oil of Lippia origanoides at concentrations of 0.5% and 0.125 μl, respectively (AO). The pH of the diets was verified before the beginning of the experiment. At the end of the experiment, samples were collected for hematological and immunological, histological and microbiological analyzes. The pH of all the supplemented diets suffered a significant reduction of 0.92 and 0.19, respectively, for the diets A and AO in relation to the control. The final biomass and the weight gain of the fish that received treatment A presented higher absolute values in relation to the other treatments. However, in this experiment it was not possible to detect statistical difference. The feed conversion was lower in the AO treatment followed by treatment A when compared to the non-supplemented treatment C. The concentration of total heterotrophic bacteria and Pseudomonas sp. in the intestinal tract was reduced when supplemented with diet A, differentially statistically. There was an expressive increase of glucose in treatment A and circulating monocytes in the AO treatment both when compared to the non-supplemented group. In the anterior portion of the intestine of animals supplemented with AO, a larger number of goblet cells and increased villous height were found. Also, there was a reduction in lymphocyte infiltrates in the liver and concentrations of total heterotrophic bacteria and Pseudomonas sp when compared to treatment C. It is clear that the supplements brought improvements in the health of the animal presenting positive results when compared to those fed the treatment C. However, other studies are suggested to test different doses of both additives together to verify their effects on the zootechnical, molecular and histological parameters of the microbiota.
Keywords: Nile tilapia, rosemary pepper, growth, intestinal histomorphometry, hematoimmunological.
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INTRODUÇÃO
O uso preventivo de antibióticos no controle de bacterioses na aquicultura está levando ao desenvolvimento de bactérias resistentes e, consequentemente, à redução da eficácia destes para o tratamento de bacterioses (Defoirdt et al., 2011). O uso de aditivos para controle de enfermidades, como sais de ácidos orgânicos e óleos essenciais, tem sido amplamente estudado nos últimos anos para reduzir o uso profilático de antibióticos na aquicultura (Koh et al., 2016 e Rahman et al., 2017). Além disso, há evidências que indicam uma possível transferência de genes de resistência a antibióticos de bactérias de ocorrência no ambiente de criação para patógenos humanos (Olson et al., 2005; Poirel et al., 2005;
Tomova et al., 2015), além do risco ambiental (Rico et al., 2017).
Os ácidos orgânicos são compostos com um ou mais grupo carboxílico (- COOH) em sua estrutura (Koh et al., 2016). Existem três classes de ácidos orgânicos. Os ácidos orgânicos de cadeia curta, que atuam na redução do pH da dieta e também como fonte de energia, também estão associados à atividade antimicrobiana, são eles: propiônico, fórmico, acético, cítrico, lático, benzoico fumárico e butírico. Os de cadeia média, que demonstram eficácia antimicrobiana, tais como ácidos cáprico, caprílico, caproico e láurico e ainda os ácidos orgânicos protegidos, que tem o intuito de proteger e permitir a liberação controlada do princípio ativo sem dissociar-se (Dierick et al, 2002, Lehninger; Nelson; Cox, 2007). Os ácidos orgânicos são utilizados como aditivos alimentares em dietas com intuito de melhor a saúde e o desempenho zootécnico do animal, através da modulação da microflora intestinal, ativação da pepsina, secreção pancreática, aumento da digestibilidade proteica (Mroz et al., 2000).
Outra alternativa para reduzir o uso de antibióticos na aquicultura, seria a utilização de óleos essenciais, os quais possuem ação antimicrobiana (Mitsch et al., 2004), antioxidante (Racanicci et al., 2004; 2008) e digestiva (Kamel, 2000), melhorando o desempenho e a saúde do animal (Weber, et al., 2012). Possuem ainda atividade anti-helmíntica, imunomoduladora da defesa imunológica específica e inespecífica dos peixes (Sakai, 1999; Chakraborty; Hancz, 2011). Os óleos essenciais possuem diversos princípios ativos. No alecrim-pimenta (Lippia origanoides), o princípio ativo que mais se destaca é o carvacrol, que compõe aproximadamente 40% da sua composição, sendo utilizado como bactericida, antifúngico, anti-inflamatório e antioxidante (Periago et al., 2001, EMBRAPA, 2016).
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Estudos realizados por Flemming (2010) sugerem que a associação de ácidos orgânicos com óleos essenciais acarretaram injúrias na membrana celular dos microrganismos patogênicos, aumentando o gasto de energia, limitando o crescimento e a multiplicação bacteriana. Langhout (2005) ressalva que essa associação apresenta ações complementares sobre as células bacterianas, já que os ácidos atuam principalmente na dieta e no trato intestinal, enquanto os óleos essenciais trabalham na porção posterior do intestino. Essa combinação pode potencializar seus efeitos relacionados às ações antimicrobianas, pois os óleos são capazes de aumentar a permeabilidade da membrana bacteriana, facilitando assim a ação dos ácidos orgânicos, contendo a multiplicação de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, resultando em melhorias na saúde animal (Flemming, 2010).
O cultivo de tilápia nilótica tem grande representação na produção mundial aquícola de água doce, sendo cultivada em mais de 135 países e a mais criada no Brasil, que hoje produz 390 mil toneladas ao ano (FAO, 2014; EMBRAPA 2016). Entretanto, infecções causadas por bactérias do gênero Streptococcus representada principalmente por Streptococcus agalactiae têm causado mortalidades massivas na tilapicultura.
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da suplementação dietética de mistura de ácidos orgânicos (cadeia média e curta), além do óleo essencial do alecrim-pimenta (Lippia origanoides) sobre os parâmetros de saúde e desempenho zootécnico da tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus).
MATERIAIS E MÉTODOS
Material biológico
Foram utilizados 90 juvenis de tilápia (Oreochromis niloticus), com peso médio 1,1 ± 0,04 g provenientes da piscicultura comercial Piscicultura Pomerode, localizada na Mesorregião do Vale do Itajaí/SC. Os peixes foram transportados, em sacos plásticos até o Laboratório Aquos, vinculado ao Departamento de Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina (Florianópolis, SC). Inicialmente os animais foram aclimatados em caixas com volume útil de 27 L, com aeração constante.
Óleo essencial
O óleo essencial utilizado no estudo foi obtido a partir de folhas de Lippia origanoides, popularmente conhecida como alecrim-pimenta, cultivada na Seção de Plantas Medicinais da Empresa Brasileira de
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Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), que tem como principal componente o Carvacrol (49,7%). A extração do óleo foi feita pelo método de hidrodestilação, com aparelho de Clevenger modificado. Um total de 500 g de folhas frescas de L. origanoides foi colocado em um frasco com volume de 1200 mL, adicionou-se água até cobrir o material e a manta aquecedora foi ativada. Após duas horas de extração, o óleo essencial foi coletado, acondicionado em frascos de vidro âmbar e estocado a -18 ºC. Para a análise de composição química do extrato, utilizou- se cromatógrafo a gás Agilent 7890A (Palo Alto, EUA), equipado com coluna capilar HP-5 de 5%-difenil-95%-dimetil silicone (30 m × 0,32 mm × 0,25 μm). A temperatura foi programada de 60 a 240 ºC, a 3 ºC por minuto, utilizando hidrogênio como gás carreador (1,5 mL min-1). Uma solução contendo 1% de óleo essencial em diclorometano
(Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) com divisão de fluxo (1:100, injetor a 250 ºC) foi injetada. O espectro de massas foi operado pelo sistema Agilent 5973N em modo de impacto de elétrons a 70 eV e acoplado a cromatógrafo Agilent 6890, utilizando os mesmos procedimentos de injeção e temperatura anteriormente descritos. Os índices de retenção foram calculados a partir dos tempos de retenção dos compostos e de uma série de n-alcanos (C7-C26). A identificação dos componentes foi feita por comparação do espectro de massa obtido com os dados de uma biblioteca espectral (Mclafferty; Stauffer, 1994) e pelos índices de retenção calculados e comparados com valores já publicados (Adams, 2007).
Mistura de ácido orgânico
Foi utilizada uma mistura de ácidos orgânicos comercial (Nutrifarma by nuscience®) que apresenta em sua composição os
seguintes ácidos e sais orgânicos: formiato de amônio (126,5 g kg-1),
ácido fórmico (115,5 g kg-1), ácidos graxos vegetais (82,5 g kg-1), ácido
propiônico (66,0 g kg-1) e ácido acético (55,0 g kg-1). A dosagem foi
selecionada através de teste in vitro. Preparo das dietas experimentais
Utilizou-se ração comercial (Supra®, Brasil) com 1,7 mm durante todo o experimento. No período de aclimatação a ração foi macerada e ofertada aos animais, após essa fase ração foi suplementada com adição dos aditivos com a granulometria indicada pelo fabricante para fase do animal. A ração apresenta a seguinte composição centesimal: umidade
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(máx) 120 g/kg (12%), proteína bruta (mín) 460 g/kg (46%), extrato etéreo (mín) 80 g/kg (8%), matéria fibrosa (máx) 40 g/kg (4%), seguindo informações do fabricante. Foram confeccionadas três dietas: 1) uma sem a mistura de ácido orgânico ou óleo essencial, denominada como controle (C); 2) outra suplementada com misturas de ácido orgânico na concentração de 0,5% (Castilho et al., 2012) (A) e 3) suplementada com mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides, nas concentrações de 0,5% e 0,125%, respectivamente (AO) (Talpur et al. 2013; Antache et al. 2014; e Brum et al. 2017). A inclusão do óleo essencial nas dietas seguiu as instruções Dairiki et al. (2013). A título de padronização, todas as rações, inclusive a controle, receberam o álcool de cereais para diluição da mistura de ácidos orgânicos e do óleo essencial, na concentração de 100 mL kg-1 de ração. As secagens das rações foram
feitas a 25ºC durante 24 h, seguida de embalagem e armazenamento a -18ºC.
Análises dos pH’s das dietas
As alterações dos pH’s das dietas com a adição da mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial, foram monitoradas. Três amostras de 0,5 g de cada uma das dietas foram maceradas e diluídas em 4,5 ml de água destilada para realização de análise de pH (Chang et al., 2006). Os pH´s foram mensurados usando um phmetro de bancada (AT 350, Alfakit Ltda, Florianópolis, Brasil).
Delineamento experimental
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas e procedimentos de manutenção de animais da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA – n° 5427100816). Os peixes foram aclimatados no sistema durante sete dias e, nesse período, os animais foram alimentados até a saciedade aparente, com dieta comercial caracterizada anteriormente (Supra®, Brasil), a qual possuía granulometria de 1,7 mm.
Após a aclimatação e biometria inicial, noventa juvenis de tilápia-do-nilo com peso médio inicial 5,38±0,65 g, foram aleatoriamente distribuídos em nove caixas circulares de 27 L, com sistema de aeração e aquecimento controlados, totalizando 10 peixes por unidade experimental em triplicata. As unidades estavam acopladas a um sistema de recirculação com filtragem mecânica, biológica e ultravioleta. O
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fotoperíodo durante o experimento foi controlado (12 h claro:12 h escuro).
Os parâmetros de qualidade da água foram monitorados diariamente no período da manhã com o uso de sonda multiparâmetro (modelo HI 9828 – Hanna Instruments) e kit colorimétrico (Labcon Test). Os parâmetros mantiveram-se em: oxigênio dissolvido 6,04 ± 0,01 mg.L -1; pH 6,84 ± 0,37; temperatura 27,92 ± 1,12 °C; amônia total 0,23± 0,06
mg.L-1; amônia tóxica 0,00 ± 0,00 mg.L-1; nitrito 0,24 ± 0,04 mg.L-1 e
alcalinidade 29,47 ± 6,17 mg CaCO3L-1.
Após o período de aclimatação, os animais receberam as dietas experimentais específicas, as quais foram ofertadas quatro vezes ao dia. A ração foi fornecida inicialmente na proporção de 10% de biomassa viva, quantidade recomendada pelo fabricante para esta fase de cultivo, sendo adaptada ao longo do experimento de acordo com consumo diário dos animais. Para isso eram verificadas as sobras das quatro refeições diárias. Caso não houvesse sobras, era aumentado 10% da quantidade total da ração no dia seguinte. Por outro lado, caso houvesse sobras em pelo menos três refeições, a oferta era diminuída em 10%. O período de suplementação foi de 30 dias. As biometrias foram realizadas no início e final do experimento.
Índices zootécnicos
Foram determinadas as taxas de sobrevivência (S), ganho de peso médio (g), conversão alimentar (C.A) e ganho em biomassa (G.B.), calculadas pelas seguintes fórmulas:
𝑆 (%) = [𝑝𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 − 𝑝𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑝𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 ] 𝑥 100 𝐺. 𝑃. 𝑀 (𝑔) = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝐶. 𝐴 =𝑟𝑎çã𝑜 𝑜𝑓𝑒𝑟𝑡𝑎𝑑𝑎 𝑔𝑎𝑛ℎ𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝐺𝐵 = 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 Análise do pH do trato intestinal
Após o período de suplementação de 30 dias, três peixes por unidade experimental (UE) foram deixados em jejum por 16 h,
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posteriormente anestesiados e coletadas assepticamente as diferentes porções intestinais (anterior, média, posterior). Seguindo o protocolo de Chang, Soel, Bang, Park, Kang & Kim (2006), uma amostra de 0,5 g da porção anterior, média e posterior do intestino foram adicionados diretamente em 4,5 ml de água destilada e rapidamente seus respectivos pH foram medidos usando um medidor de pH de bancada, em triplicata (AT 350, Alfakit Ltda, Florianópolis, Brasil).
Análises microbiológicas
Para análise bacteriana da microbiota presente no trato gastrointestinal dos grupos não suplementados e suplementados, porções do trato intestinal de quatro animais de unidade experimental foram coletados, formando um “pool”. Estas porções foram maceradas juntas, em gral de porcelana com 1 mL de solução salina estéril 0,65% e posteriormente diluídas serialmente quatro vezes, em tubos de ensaio, em fator 1:10. As diluições de 10-1 a 10-4 foram semeadas em placas de Petri
contendo os seguintes meios de cultura: Man Rogosa Sharpe Agar (MRS) para bactérias produtoras de ácido-lático, Ágar Triptona de Soja (TSA) para bactérias heterotróficas totais, Ágar Tiossulfato-Citrato-Bile-Sacarose (TCBS) para o crescimento de vibrionáceas e Ágar Cetrimid para Pseudomonas sp. As placas de MRS foram incubadas a 35ºC por 48 h; as demais, 30ºC por 24 h.
Análises hematológicas
Amostras de sangue foram coletadas ao final do experimento onde cinco peixes de cada UE foram coletados, totalizando 15 peixes por tratamento. Após biometria (peso), os peixes foram anestesiados em solução de eugenol (75 mg·L-1) e o sangue foi coletado por punção do
vaso caudal, em seringas de 3 mL contendo EDTA 10% (ácido etilenodiamino tetra-acético) como anticoagulante.
A concentração de glicose plasmática foi determinada de forma individual, imediatamente após a coleta de sangue, com glicosímetro portátil Accu-Chek® Advantage (Roche Diagnóstica, Brasil). Extensões
sanguíneas foram feitas em duplicata e coradas com May-Grünwald-Giemsa-Wright, de acordo com Ranzani-Paiva et al. (2013), para contagem de trombócitos e leucócitos totais pelo método indireto (ISHIKAWA et al., 2008) e contagem diferencial de leucócitos. Uma alíquota do sangue foi utilizada para determinação do hematócrito pelo método do micro-hematócrito (GOLDENFARB et al., 1971).
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Outra alíquota de sangue (5 µL) foi destinada à contagem total de eritrócitos em câmara de Neubauer, após diluição (1:200) em fluido de Dacie modificado de acordo com Blaxhall e Daisley (1973). A concentração de hemoglobina foi determinada pelo método da cianometahemoglobina (Ranzani-paiva et al., 2013).
Análises imunológicas
Para obtenção do plasma sanguíneo, o sangue de 5 animais por unidade experimental foi coletado por punção do vaso caudal, em seringas de 3 mL contendo EDTA 10% (ácido etilenodiamino tetra-acético), formando um “pool”. Posteriormente, o sangue foi centrifugado a 1400 g por 10 min para separação do plasma, o qual foi coletado e armazenado a -20°C para análise posterior realização das análises imunológicas.
A proteína total do plasma sanguíneo foi mensurada com o kit Proteína Total (Lab Test®). A concentração de imunoglobulina total foi
medida de acordo com o método descrito por Amar et al. (2000), onde misturou-se 100 μL do soro com 100 μL de solução de polyethylene glycol (PEG) (Sigma-Aldrich) à 12% e a mistura incubada à temperatura ambiente por duas horas, a fim de precipitar as moléculas de imunoglobulina. O precipitado foi removido por centrifugação a 5000 g a 6º C por 10 min. Após remoção do sobrenadante foi mensurada a quantidade de proteína total com auxílio do kit Proteína Total (Lab Test®),
utilizando-se albumina bovina para confecção da curva padrão. A concentração de imunoglobulina total está expressa em mg·mL-1, sendo
calculada pela fórmula: Imunoglobulina total =
(proteína total do soro - proteína total tratada com PEG) Volume (mLl)
O título da atividade aglutinante do plasma foi realizado em microplaca de 96 poços de fundo U, onde o plasma diluído na proporção de 1:3 em solução tampão fosfato salino (PBS) no 1° poço (50 μL de plasma: 150 μL de solução PBS), sendo diluído serialmente em fator 1:2 para os demais poços até o 12°. Depois disso, foram adicionados 50 μL de bactéria inativada Streptococcus agalactiae (GRS 2035) na concentração de 5·108 UFC·mL-1 em todos os poços. A microplaca foi
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confirmada com a observação de um bottom no fundo do poço a olho nu. O título aglutinante é considerado recíproco a última diluição que apresentou aglutinação (Silva et al. 2009).
O título antimicrobiano do plasma foi realizado contra S. agalactiae, em microplaca de 96 poços com fundo chato, segundo metodologia utilizada por Silva et al. (2009). O inóculo da S. agalactiae foi cultivado em BHI a 28 °C por 24 h, preparado na concentração de 0,2 na escala de Macfarland, e diluído em meio de cultura Poor broth (PB) a 1·105 UFC·mL-1. O plasma foi diluído na proporção de 1:3 em Poor Broth
(PB) no 1° poço (50 μL de plasma: 150 μL de solução PB), diluído serialmente em fator 1:2 para os demais poços, até o 12°. Para controle positivo e o branco, solução salina foi diluída em PB, da mesma forma que o plasma. Finalmente, 20 μL da S. agalactiae foram adicionados aos poços do plasma diluído e do controle positivo. As microplacas foram incubadas a 28 °C por 24 h. O crescimento do microrganismo determinado em leitora de microplaca, no comprimento de onda de 550 ηm. O título antimicrobiano do plasma foi recíproco a última diluição que apresentou atividade bactericida, ou seja, onde houve inibição total do crescimento microbiano.
Análises histológicas
Decorridos 30 dias de ensaio foram coletados fígado, baço e uma porção do intestino (anterior e posterior) de quatro peixes por UE para realização das análises histológicas. Os órgãos foram fixados em formalina tamponada 10%. Após 24 h de fixação, as amostras foram desidratadas serialmente em álcool etílico e preparadas para as técnicas histológicas de rotina, com a inclusão de parafina a 60°C. Cortes de 3 µm de espessura (micrótomo PAT- MR10) foram corados com hematoxilina de Harris e eosina (HHE). Posteriormente à coloração, as lâminas foram montadas em meio Entellan® e analisadas em microscópio de contraste de
interferência de fase (DIC) Axio Imager A.2 (Zeiss, Gottingen, Alemanha).
Com relação à morfologia intestinal, foram medidos o comprimento, largura, perímetro e área dos vilos, além das contagens das células caliciformes por vilos, com o auxílio do software Zen Pro. Foi atribuído para todos os órgãos valores às alterações histológicas, conforme o grau de intensidade: 0 (ausência de alteração), 1 (alteração leve, correspondendo a menos de 25% da área do órgão), 2 (alteração moderada, 25% a 50% da área do órgão) e 3 (alteração severa, mais de
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50% da área do órgão), de acordo com o método descrito por Schwaiger et al. (1997) adaptados por Brum et al. (2017).
No baço foi considerado congestão, infiltrados eosinofílico e linfocitário, integridade das polpas brancas e vermelhas, centros de melanomacrófagos, melanomacrófagos isolados e congestão. No intestino, infiltrado eosinofílico, linfocitário e necrose. Em relação ao fígado, considerou-se como alterações a congestão nos grandes vasos, nos sinusoides e no pâncreas, dilatação dos sinusoides, hipertrofia dos hepatócitos, infiltrado eosinofílico e linfocitário, macroesteatose, microesteatose e necrose.
Análise estatística
Os dados foram submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Levene para verificar a normalidade e homocedasticidade, respectivamente. Posteriormente, foi realizada análise de variância unifatorial; apresentando diferença significativa, os dados foram submetidos ao teste de Tukey para separação de médias. Todos os testes foram realizados ao nível de significância de 5% com o auxílio do software Statistica 13.3. Quando necessário, os dados foram transformados em logaritmo na base 10. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão.
RESULTADOS
Análises dos pH’s das dietas
Os tratamentos suplementados com mistura de ácidos orgânicos (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) apresentaram redução do pH, respectivamente 5,40±0,05 e 5,39±0,05 em comparação ao grupo C (5,45±0,02) (Figura 1)
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Figura 1: Análise dos pH das dietas experimentais dos grupos sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia origanoides (AO). *Dados são apresentados em média ± desvio padrão. Letras diferentes representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (p<0,05).
Índices zootécnicos
Após 30 dias de suplementação com mistura de ácidos orgânicos foi possível verificar diferença significativa na sobrevivência dos animais (Tabela 1).
Tabela 1: Parâmetros zootécnicos (média ± desvio padrão) de tilápia-do-nilo Oreochromis niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias. Dados são apresentados em média ± desvio padrão.
Parâmetros C A AO Valor p Peso inicial (g) 1,10±0,10 1,10±0,00 1,00±0,04 0,315 Peso final (g) 10,06±3,37 12,16±1,61 13,19±2,06 0,321 Ganho de peso (g) 9,01±3,28 11,01±1,57 12,15±2,14 0,420 Conversão Alimentar 0,93±0,20 0,74±0,08 0,68±0,02 0,104 Sobrevivência (%) 68,88±6,84b 86,66±4,71a 76,66±9,42ab 0,021
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Análise do pH ao longo do trato intestinal
Ao final do período de suplementação não foi possível verificar alteração no pH ao longo do trato intestinal de juvenis de O. niloticus (Figura 2).
Figura 2: Análise do pH dos tratos intestinais de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias. Dados são apresentados em média ± desvio padrão.
Análises microbiológicas
A concentração de bactérias heterotróficas totais e de Pseudomonas sp. no trato intestino de juvenis de O. niloticus foi significativamente reduzida no grupo suplementado com mistura de ácidos orgânicos (A) em relação ao demais grupos (Figura 3). Não foi observada diferença significativa nos demais grupos bacterianos analisados.
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Figura 3: Contagem de bactérias (Log 10) por grama do trato intestinal de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias. Dados são apresentados em média ± desvio padrão. *Letras diferentes representam diferenças significativas pelo teste de Tukey (p<0,05)
Análises hematológicas
Decorridos os 30 dias de suplementação, observou-se um aumento no número de monócitos circulantes nos grupos A e AO em relação ao controle. Já a glicose sofreu um incremento apenas no grupo A (Tabela 2).
Tabela 2: Parâmetros hematológicos (média ± desvio padrão) de tilápias-do-nilo Oreochromis niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de Lippia origanoides (AO) por 30 dias. Dados representam média ± desvio padrão. *Letras diferentes representam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05).
Parâmetros C A AO Valor p Eritrócitos (x106·μL-1) 1,76±0,56 1,70±0,30 1,55±0,26 0,745 Leucócitos (x103·μL-1) 8,95±0,26 8,52±0,32 7,54±0,39 0,850 Hematócrito (%) 23,08±7,05 27,83±7,14 24,08±1,58 0,685 Hemoglobina (g·dL-1) 9,01±2,38 6,34±0,95 6,84±0,82 0,160 Glicose (g·dL-1) 50,83±8,95b 61,91±4,73a 49,87±0,88b 0,010 Trombóticos (x103·μL-1) 1,03±0,29 1,18±0,73 7,02±0,48 0,110 Linfócitos (x103·μL-1) 6,65±0,24 5,96±0,29 5,90±0,24 0,455 Monócito (x103·μL-1) 1,44±0,56a 7,90±0,33b 9,19±0,60b 0,003 Neutrófilo (x103·μL-1) 8,64±0,71 9,33±0,66 7,21±0,60 0,840
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Análises imunológicas
Após o período de 30 dias de não foi possível verificar alterações nos parâmetros imunológicos analisados (Figura 4).
Figura 4: Análise imunológica do plasma de tilápias-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias. A) Concentração de proteínas totais (mg·ml-1) e concentração de imunoglobulinas totais (mg·ml-1). B) Título aglutinante (Log10) e título antimicrobiano (Log10). Dados são apresentados em média ±desvio padrão. *Letras diferentes representam diferença significativas pelo teste de Tukey (p<0,05).
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Análises histológicas
Em relação à morfometria do intestino, após os 30 dias de suplementação, foi possível verificar diferença significativa na porção anterior referente à altura dos vilos e número de células caliciformes nos tratamentos mistura de ácidos orgânicos (A) e mistura de ácidos orgânicos e óleo essencial de Lippia organoides (AO), quando comparado com o grupo controle (C) (Tabela 3). Não foi possível observar diferença significativa nos infiltrados eosinofílicos nas porções anterior e posterior do intestino (Tabela 4).
Tabela 3: Morfometria intestinal anterior e posterior de juvenis de tilápia-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias. Dados são apresentados em média ±desvio padrão *Letras diferentes representam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05).
Porção anterior
Parâmetros C A AO Valor p
N° de vilos (µm) 8,57±5,23 8,66±4,91 8,39±4,69 0,760 Altura dos vilos (µm) 151,94±61,77b 165,34±53,19ab 193,39±61,80a 0,003 Largura dos vilos (µm) 67,01±14,93 74,04±22,29 67,65±16,79 0,088 Perímetro total (µm) 11933±2447 88153±4083 85204±2027 0,056 N° de células caliciformes 8,28±5,40b 8,62±4,55a 8,67±4,34a 0,003 Área total dos vilos (µm) 377465±6031 367744±8354 595803±4303 0,158
Porção posterior
Parâmetros C A AO Valor p
N° de vilos (µm) 7,05±4,09 6,57±3,77 6,02±3,33 0,516 Altura dos vilos (µm) 129,59±54,34 138,41±62,30 139,72±59,18 0,954 Largura dos vilos (µm) 72,43±23,38 75,49±29,78 80,28±33,32 0,458 Perímetro total (µm) 11185±4597 10737±3904 10968±5213 0,797 N° de células caliciformes 8,24±4,60 6,19±3,91 9,57±6,82 0,236 Área total dos vilos (µm) 71998±1021 88117±1323 71381±7942 0,943 Tabela 4: Intensidade de alteração histológica no intestino de tilápia-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (A) por 30 dias. Dados são apresentados em média ±desvio padrão.
Porção anterior
Parâmetro C A AO Valor p
Infiltrado eosinofílico 0,40±0,70 0,44±0,73 0,57±0,79 0,829 Porção posterior
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No fígado (Tabela 5), após os 30 dias de oferta das dietas experimentais, foi possível verificar uma redução dos infiltrados linfocitários no tratamento A (0,64±0,50) diferindo estatisticamente do grupo controle (0,64±0,50). Em relação às alterações histológicas no baço, a suplementação não alterou nenhuma estrutura relacionada a este órgão (Tabela 6).
Tabela 5: Intensidade de alteração histológica no fígado de tilápia-do-nilo O. niloticus sem suplementação (C), suplementadas com mistura de ácido orgânico (A) ou mistura de ácido orgânico e óleo essencial de L. origanoides (AO) por 30 dias. Dados são apresentados em média ±desvio padrão. *Letras diferentes representam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05).
Alterações C A AO Valor p
Aspecto cordonal 1,33±0,87 1,45±1,13 2,00±1,20 0,409 Congestão dos grandes vasos 1,78±1,09 2,18±1,08 1,50±1,31 0,442 Congestão no pâncreas 1,44±1,33 1,36±1,31 0,75±0.89 0,422 Congestão nos sinusoides 2,11±0,93 1,73±1,10 1,38±0,74 0,302 Dilatação dos sinusoides 1,67±0,71 1,45±1,04 1,00±0,76 0,289 Hipertrofia dos hepatócitos 1,67±1,12 1,45±1,04 2,00±0,52 0,577 Infiltrado eosinofilico 0,44±1,01 0,18±0,40 0,63±0,35 0,379 Infiltrado linfocitário 1,56±0,88b 0,64±0,50a 0,88±1,20ab 0,009 Macroesteatose 0,00±0,00 0,18±0,60 0,63±1,06 0,172 Microesteatose 1,22±1,09 1,00±1,00 1,50±1,41 0,654 Necrose 0,44±0,73 0,00±0,00 0,25±0,71 0,220 Pâncreas com ácinos íntegros e
grânulos de zimogênio 0,78±0,67 0,27±0,47 0,63±0,92 0,220 Uniformidade no tamanho das
células e núcleos 0,56±0,53 0,27±0,47 0,75±0,71 0,197
