Avaliação da união resina-dentina utilizando diferentes abordagens de condicionamento dentinário

MAICON SEBOLD

AVALIAÇÃO DA UNIÃO RESINA-DENTINA

UTILIZANDO DIFERENTES ABORDAGENS

DE CONDICIONAMENTO DENTINÁRIO

Piracicaba 2017

AVALIAÇÃO DA UNIÃO RESINA-DENTINA

UTILIZANDO DIFERENTES ABORDAGENS

DE CONDICIONAMENTO DENTINÁRIO

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título

de Mestre em Clínica Odontológica, na Área

de Dentística.

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Giannini

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Piracicaba

2017

que durante toda sua vida lutou para que eu pudesse alcançar meus

sonhos.

Primeiramente à Deus, que iluminou meu caminho durante esta jornada.

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da qual orgulhosamente faço parte há seis anos, agradeço por ter fornecido todas as condições necessárias para que eu alcançasse meus objetivos.

Ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Odontológica da FOP/UNICAMP e, em especial, aos professores da Área de Dentística, por terem contribuído para minha formação acadêmica.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão de bolsa de mestrado e auxílio financeiro para a execução deste projeto (processo 2015/03927-3).

Ao Prof. Dr. Marcelo Giannini, pela dedicação e paciência na orientação desta pesquisa, pelos conhecimentos transmitidos e oportunidades concedidas. Ao Prof. Dr. Ricardo Marins Carvalho (University of British Columbia – UBC), pela contribuição na concepção deste trabalho.

À Profa. Dra. Cínthia P. M. Tabchoury e ao técnico de laboratório Waldomiro Vieira Filho (Área de Bioquímica – FOP/UNICAMP), pelo auxílio no preparo das soluções experimentais.

À minha mãe, Antônia R. P. Sebold, pelo amor, carinho e apoio incondicionais, sempre me incentivando a seguir em frente e nunca me deixar abater pelos obstáculos encontrados.

Aos meus irmãos, Leandro, Matheus e Larissa, pelos momentos de alegria compartilhados, tornando minha rotina mais leve e divertida.

À Carolina Bosso André, agradeço pela amizade, companheirismo e disposição constante em ajudar e, especificamente, pelo auxílio na obtenção das imagens de microscopia confocal e execução das análises estatísticas presentes nesta dissertação.

À Bruna Marin Fronza, obrigado por ter me acolhido em nosso grupo de trabalho e por toda a ajuda nas atividades acadêmicas, desde casos clínicos e montagem de aulas até sugestões na realização desta pesquisa.

de dificuldades.

Aos amigos de pós-graduação, Caroline Mathias, Eduardo Castro, Gabriel Abuna, Gabriel Nima e Laura Ferraz, e a todos que contribuíram direta ou indiretamente no decorrer deste trabalho.

fosfórico 37%; solução 10:3; oxalato férrico e ácido nítrico) na resistência de união por microtração de dois adesivos, na resistência à flexão e módulo de elasticidade da dentina e na morfologia da área de união resina-dentina. Dois adesivos foram testados: XP Bond (Dentsply) e One-Step (Bisco). Os agentes de união foram aplicados sobre dentina umedecida (controle positivo) e seca (controle negativo) após condicionamento com ácido fosfórico. Os grupos experimentais consistiram na aplicação dos adesivos sobre superfície seca após condicionamento dentinário com solução 10:3, oxalato férrico 6,8% ou ácido nítrico 1,4%. Oitenta terceiros molares humanos foram divididos em 10 grupos para o teste de microtração (n=8). Para o teste de resistência à flexão e módulo de elasticidade, foram utilizados 25 incisivos bovinos, dos quais foram obtidas barras de dentina com dimensões de 0,5 mm x 1,7 mm x 7 mm. A área de união foi analisada sob microscópio confocal de varredura a laser, preparando-se 30 dentes para os mesmos grupos do teste de resistência de união (n=3). Os dados de resistência de união foram analisados por ANOVA dois fatores (tratamento dentinário e tipo de adesivo), enquanto que os resultados do teste de flexão foram analisados por ANOVA um fator (tratamento dentinário). Ambos os ensaios foram submetidos ao Teste de Tukey. As estruturas observadas na avaliação microscópica foram descritas e comparadas entre os grupos. A aplicação de XP Bond após tratamento dentinário com solução 10:3 apresentou resistência de união menor que o grupo controle positivo e nenhuma diferença estatística em relação ao grupo controle negativo do mesmo adesivo. A solução 10:3 associada com One-Step resultou em resistência de união semelhante ao controle positivo e maior que o controle negativo do mesmo adesivo. O condicionamento com ácido nítrico, acompanhado pela aplicação de XP Bond produziu resistência de união menor que ambos os grupos controle deste adesivo. Os valores de resistência de união encontrados para a associação entre ácido nítrico e One-Step foram maiores que o controle negativo e similares ao controle positivo do One-Step. Formação de camada híbrida e tags resinosos ocorreu em todos os dentes tratados com solução 10:3 ou ácido nítrico. O oxalato férrico não foi capaz de promover hibridização, resultando na menor resistência de união para o adesivo XP Bond. A resistência de união obtida pelo uso de One-Step em dentina tratada com oxalato férrico não apresentou diferença comparado com o controle negativo do One-Step. O módulo de elasticidade da dentina não foi afetado por nenhum dos agentes utilizados. Redução na resistência à flexão da dentina foi observada somente para o oxalato férrico. Conclui-se que: para o adesivo One-Step, união resina-dentina similar ao grupo no qual o sistema de união foi aplicado sobre dentina umedecida previamente condicionada com ácido fosfórico pode ser obtida pelo uso da solução 10:3 ou do ácido nítrico; os condicionadores dentinários testados não foram capazes de afetar a rigidez da dentina; a resistência à flexão da dentina foi prejudicada pelo tratamento da superfície com oxalato férrico.

Palavras-chave: Dentina. Compostos de Ferro. Ácido Nítrico. Ataque Ácido Dentário. Resistência à Tração. Fenômenos Mecânicos. Microscopia Confocal.

acid; 10-3 solution; ferric oxalate, and nitric acid) on the microtensile bond strength of two adhesive systems, flexural strength and elastic modulus of dentin and the morphology of the resin-dentin interface. Two bonding systems were tested: XP Bond (Dentsply) and One-Step (Bisco). The adhesives were applied on wet (positive control group) and dry (negative control group) dentin after phosphoric acid-etching. The experimental groups consisted in the application of adhesives on dry surfaces after dentin conditioning with 10-3 solution, 6.8% ferric oxalate or 1.4% nitric acid. Eighty human third molars were divided into 10 experimental groups for the bond strength test (n=8). The flexural strength and elastic modulus test required the use of 25 bovine incisors, which were reduced to dentin bars with dimensions of 0.5 mm x 1.7 mm x 7 mm. Adhesive interface analysis was performed under laser scanning confocal microscopy by preparing 30 teeth for the same groups from the bond strength test (n=3). Bond strength data were analyzed by two-way ANOVA (dentin treatment and type of adhesive), whereas results from the flexural strength test were analyzed by one-way ANOVA (dentin treatment). Both strength assays were subjected to the Tukey test. The structures observed in the microscopic evaluation were described and compared amongst groups. Application of XP Bond after dentin treatment with 10-3 solution showed lower bond strength than the positive control group and no statistical difference was detected compared to the negative control group within the same adhesive. Ten-three solution associated with One-Step resulted in bond strength statistically similar to the positive control group and higher than the negative control group of the same bonding system. Nitric acid-conditioning followed by the application of XP Bond produced lower bond strength in comparison to both control groups of XP Bond. Bond strength values found for the association between nitric acid and One-Step were higher than the negative control group and statistically similar to the positive control group of One-Step. Hybrid layer and resin tags formation occurred in all teeth treated with 10-3 solution or nitric acid. Ferric oxalate was not capable to promote hybridization and resulted in the lowest bond strength for XP Bond. Bond strength obtained by the use of One-Step on ferric oxalate-treated dentin presented no statistical differences compared to the negative control group. Dentin elastic modulus was not affected by any of the conditioning agents used. A reduction in dentin flexural strength was observed only for the ferric oxalate group. In conclusion: for the adhesive One-Step, resin-dentin bonds similar to the group where the bonding agent was applied on wet, phosphoric acid-etched dentin can be achieved by the use of 10-3 solution or nitric acid; the conditioning agents tested were not able to affect dentin stiffness; flexural strength was jeopardized by surface treatment with ferric oxalate.

Key Words: Dentin. Iron Compounds. Nitric Acid. Acid Etching, Dental. Tensile Strength. Mechanical Phenomena. Microscopy, Confocal.

1 INTRODUÇÃO ...11

2 REVISÃO DA LITERATURA ...15

2.1 Histórico da adesão ...15

2.2 Degradação da união resina-dentina ...24

2.3 Soluções alternativas de condicionamento ...28

3 PROPOSIÇÃO ...32

4 MATERIAL E MÉTODOS ...33

4.1 Obtenção e preparo dos dentes utilizados ...33

4.2 Preparo das soluções experimentais ...33

4.3 Resistência de união à dentina por microtração ...34

4.4 Análise do padrão de fratura dos espécimes testados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) ...40

4.5 Teste de flexão de três pontos ...41

4.6 Análise da área de união dentina-sistema adesivo em microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) ...46

4.7 Análise Estatística ...47

5 RESULTADOS ...48

5.1 Resistência de união por microtração ...48

5.2 Padrão de fratura dos espécimes testados (em MEV) ...49

5.3 Teste de flexão de três pontos ...52

5.4 Morfologia da área de união dentina-sistema adesivo (em MCVL) ...53

6 DISCUSSÃO ...55

7 CONCLUSÃO ...67

REFERÊNCIAS ...69

1 INTRODUÇÃO

A adesão ao tecido dentinário tem sido alvo de numerosas investigações nos últimos anos, visto que a obtenção de sistemas adesivos capazes de interagir eficientemente com este substrato delicado é um desafio (Lopes et al., 2002). Buonocore, em 1955, relatou que o tratamento com ácido fosfórico era capaz de produzir microporosidades na superfície do esmalte que a tornavam mais receptiva à penetração da resina (Buonocore, 1955). Seguindo essa abordagem pioneira, os pesquisadores e fabricantes melhoraram as capacidades de adesão e de selamento dos adesivos dentários (Breschi et al., 2008).

Do aperfeiçoamento daquela técnica derivou-se o condicionamento simultâneo do esmalte e da dentina, também chamada de “técnica do condicionamento total” (Bertolotti, 1991; Fusayama, 1992). A introdução desta técnica foi um grande avanço para a odontologia adesiva, visto que o primeiro protocolo de adesão que apresentou resultado clinicamente aceitável envolvia a remoção completa da smear layer pelo condicionamento total (Cardoso et al., 2011; Van Meerbeek et al., 2003). O condicionamento ácido da dentina é indispensável para os sistemas adesivos convencionais e possui a função de remover a smear layer e a porção inorgânica da dentina, expondo a matriz colágena dentinária, que serve de substrato para a adesão, permitindo a infiltração dos monômeros adesivos por entre as fibrilas colágenas (Nakabayashi et al, 1982).

A adesão à dentina é mediada por um processo conhecido como hibridização (Nakabayashi e Pashley, 2000), que resulta na criação de uma camada ácido-resistente de dentina reforçada por resina (camada híbrida), a qual é responsável pela adesão do material restaurador ao substrato dentinário (Martins et al., 2008). Para que o processo de hibridização ocorra de forma adequada, a superfície dentinária desmineralizada deve ser mantida levemente úmida antes da aplicação de sistemas adesivos do tipo etch-and-rinse (Gwinnett, 1992; Kanca, 1992b). Caso o substrato dentinário seja seco com jato de ar após o condicionamento ácido, as fibrilas de colágeno rapidamente formam pontes de hidrogênio entre si, o que leva ao encolhimento da rede de colágeno, dificultando a difusão dos monômeros e a formação da camada híbrida (Manso et al., 2008).

Limitações relacionadas a durabilidade da união resina-dentina têm sido demonstradas, tanto in vivo (Mjör e Gordan, 2002; Hashimoto et al., 2000; Armstrong et al., 2004; Koshiro et al., 2004), quanto in vitro (Kim et al., 2011; Loguércio et al.,

2016; Sangwichit et al., 2016). Sabe-se que a camada híbrida passa por processo de degradação ao longo do tempo, basicamente por meio de dois padrões: perda de resina dos espaços interfibrilares e desorganização das fibrilas colágenas (Hashimoto et al., 2003). A deterioração da área de união ocorre devido a discrepância entre a profundidade de desmineralização promovida pelo condicionamento ácido e a profundidade de infiltração do adesivo (Breschi et al., 2008), o que facilita a formação de espaços vazios ou zonas de microporosidades abaixo e dentro da camada híbrida (Tay et al., 2002; Pioch et al., 2001), fenômeno conhecido como nanoinfiltração (Vaidyanathan TK e Vaidyanathan J, 2009).

A nanoinfiltração que ocorre na camada híbrida é causada por alterações de fase nas moléculas dos monômeros adesivos decorrentes do contato destas com a água residual mantida entre as fibrilas de colágeno durante o procedimento adesivo (Spencer e Wang, 2002; Ye et al., 2009). Dessa forma, a difusão da resina adesiva é prejudicada, deixando fibrilas colágenas desprotegidas na base da camada híbrida (Tay et al., 2002; Breschi et al., 2008; Brackett et al., 2011). A presença de umidade excessiva na dentina desmineralizada também pode afetar a polimerização do adesivo, o que resulta em um polímero mecanicamente fraco (Reis et al., 2012). Além disso, a técnica de adesão à dentina úmida deixa muita água incorporada na união resina-dentina, desencadeando a hidrólise das ligações éster dos monômeros que constituem o polímero adesivo (Santerre et al., 2001).

Caso as fibrilas colágenas não sejam protegidas pela camada de resina hidrofóbica do adesivo, elas se tornam vulneráveis a degradação por enzimas colagenolíticas, tanto secretadas por bactérias do biofilme quanto pela ativação de metaloproteinases endógenas da matriz dentinária (MMPs) (Mazzoni et al., 2006; Nishitani et al., 2006; Pashley et al., 2004; Breschi et al., 2009). As MMPs são proteases zinco- e cálcio-dependentes responsáveis pela degradação de praticamente todos os componentes da matriz extracelular dos tecidos conjuntivos (Pashley et al., 2011; Breschi et al., 2009). Foi relatado que o ácido fosfórico provoca aumento na atividade das MMPs da dentina (Breschi et al., 2010; De Munck et al., 2009), assim como modificações no arranjo molecular do colágeno que favorecem a ação dessas proteases (Bertassoni et al., 2012).

Quando a dentina é condicionada com ácido fosfórico, as metaloproteinases latentes são ativadas e, consequentemente, as fibrilas colágenas expostas se tornam suscetíveis a degradação hidrolítica ao longo do tempo, reduzindo

a resistência de união (Stape et al., 2012). Agentes de condicionamento mais brandos, como os ácidos cítrico, maléico, nítrico e oxálico em várias concentrações já foram propostos como substitutos para o condicionamento tradicional com gel de ácido fosfórico 35-40% (Vaidyanathan TK e Vaidyanathan J, 2009). Alguns sistemas adesivos inclusive chegaram a preconizar o uso de agentes alternativos para o tratamento da dentina, como, por exemplo, o sistema Gluma 2000 (Bayer/Miles Dental), que utilizava uma solução contendo ácido oxálico, nitrato de alumínio, glicina e água para condicionar simultaneamente esmalte e dentina (van Dijken et al., 1999). Soluções ácidas de oxalato férrico (Fe2(C2O4)3·6H2O) já foram sugeridas como agente de condicionamento dentinário (Bowen et al., 1982; Asmussen e Bowen, 1987; Ishioca e Caputo, 1989). Bowen, em 1982, demonstrou que uma solução ácida de oxalato férrico 6,8% foi efetiva na união adesiva à dentina, obtendo-se resistência de união semelhante ao ácido fosfórico com a aplicação de um sistema adesivo experimental (Bowen et al., 1982). Em um estudo posterior, Asmussen e Bowen (1987) obtiveram valores satisfatórios, levando-se em conta os sistemas adesivos disponíveis para a época (Asmussen e Bowen, 1987).

Também na década de 1980, uma mistura de cloreto férrico 3% dissolvido em ácido cítrico 10% (solução 10:3) foi sugerida como condicionador dentinário (Nakabayashi et al., 1982). Resistência de união satisfatória, com formação de zona de hibridização característica foi relatada em decorrência do tratamento da dentina com solução 10:3 (Takagaki et al., 2009; Nurrohman et al., 2011; Nurrohman et al., 2012). Curiosamente, os valores de resistência de união não foram reduzidos mesmo quando a superfície condicionada com este agente era seca com jato de ar previamente à aplicação do adesivo (Nakabayashi e Hiranuma, 2000).

Já foi demonstrado que os íons ferro presentes nas soluções supracitadas possuem um efeito de estabilização da rede de colágeno, o que possibilitaria a realização do procedimento adesivo sobre superfície seca (Piemjai et al., 2003). Isso poderia ser uma vantagem, pois a manutenção de uma quantidade ideal de umidade durante a aplicação do sistema adesivo depende de vários fatores (Loguércio et al., 2015), o que torna o procedimento de adesão complexo (Lopes et al., 2016), permitindo que a área de união seja infiltrada por água, a qual serve de combustível para a ação das MMPs (Pashley et al., 2011).

Outra possível vantagem do uso de soluções de condicionamento contendo ferro seria uma possível ação protetora destes íons metálicos sobre o colágeno, já

que estudos na área de paleontologia tem demonstrado o envolvimento dos íons ferro na preservação de colágeno e elastina em fósseis (Schweitzer et al., 2009; San Antonio et al., 2011). Os pesquisadores têm sugerido que ligações cruzadas intermoleculares não-enzimáticas na rede de supermoléculas de fibrilas colágenas nos vasos sanguíneos desses fósseis seriam possíveis contribuintes para a longevidade do tecido. Além disso, Schweitzer et al. (2013) também levantou a hipótese de que o ferro poderia inibir a ação das MMPs (Schweitzer et al., 2013).

Outro agente de condicionamento que pode ser encontrado em estudos das décadas de 1980/1990 é o ácido nítrico. O uso deste ácido foi sugerido após o mesmo ter sido descoberto na formulação da solução de oxalato férrico como um contaminante do processo de síntese do sal (Blosser e Bowen, 1988). Yoshioka et al. (2002), demonstraram que a interação de ácidos não carboxílicos, como os ácidos nítrico e hidroclorídrico, também ocorre seguindo o conceito de adesão-desmineralização, que é observado no condicionamento com ácido fosfórico (Yoshioka et al., 2002). Contudo, o ácido nítrico foi testado em poucos estudos (Asmussen e Bowen, 1987; Weiger et al., 1995) e as informações a respeito da sua interação com o tecido dentinário e seu real potencial em promover adesão à dentina são escassas.

Tendo em vista a problemática de degradação da área de união adesiva associada ao uso do ácido fosfórico com a técnica de adesão à dentina úmida, este estudo buscou avaliar os efeitos de agentes alternativos de condicionamento dentinário na união resina-dentina obtida sobre substrato desmineralizado seco e nas propriedades mecânicas da dentina bovina. Com este intuito, foram realizados testes mecânicos de resistência de união por microtração, resistência à flexão e análises microscópicas de padrão de fratura e morfologia da área de união. A presente investigação teve como hipóteses nulas:

(1) Nenhuma diferença na resistência de união seria observada entre os diferentes agentes de condicionamento dentinário;

(2) Nenhuma diferença na resistência de união seria observada entre os adesivos utilizados;

(3) O módulo de elasticidade da dentina bovina não seria afetado pelos agentes de condicionamento;

(4) A resistência à flexão da dentina bovina não seria afetada pelos agentes de condicionamento;

(5) A morfologia da área de união resina-dentina não apresentaria diferenças entre os grupos testados.

2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Histórico da adesão

No final dos anos 1940, Oskar Hagger, um químico suíço que trabalhava para a empresa DeTrey/Amalgamated Dental Company, desenvolveu o primeiro produto adesivo chamado Sevriton Cavity Seal (McLean, 1999). Esse agente de união era composto por dimetacrilato de ácido glicerofosfórico e seu mecanismo de ação tinha como base a abordagem revolucionária de união química a estrutura dental (Söderholm, 2007). Além disso, em 1952, um estudo publicado por Kramer e McLean sugeria que o dimetacrilato de ácido glicerofosfórico do Sevriton Cavity Seal aumentava a adesão à dentina por meio da penetração na superfície (Kramer e McLean, 1952). Contudo, esse produto pioneiro não apresentou bons resultados clínicos, principalmente devido as altas tensão interfacial e expansão térmica causadas pelas resinas de metacrilatos disponíveis até o momento (Anusavice et al., 2013).

Em 1955, Buonocore publicou um artigo intitulado “A simple method of increasing the adhesion of acrylic filling materials to enamel surfaces”, no qual relatava um aumento na resistência de união entre resina acrílica e esmalte após o tratamento do esmalte com ácido fosfórico 85% (Buonocore, 1955). A ideia do ataque ácido do esmalte surgiu após Buonocore observar que o ácido fosfórico e preparações contendo o mesmo eram utilizados na indústria para o tratamento de superfícies metálicas, com o intuito de se obter melhor adesão da tinta ou da cobertura resinosa à superfície (von Fischer W e Bobalek EG, 1953). O autor atribuiu a melhora na adesão à retenção micromecânica causada pelo aumento na rugosidade e a uma possível alteração química na superfície do esmalte decorrentes do tratamento ácido, tornando-a mais reativa à resina (Buonocore, 1963).

O condicionamento ácido do esmalte só se tornaria amplamente aceito no final dos anos 1970, após a realização de um Simpósio Internacional sobre Condicionamento do Esmalte (1974), onde pesquisadores e clínicos com experiência em adesão ao esmalte mostraram suas descobertas. As informações apresentadas no evento foram publicadas e distribuídas às instituições acadêmicas, ajudando a difundir o conceito de adesão ao esmalte (Silverstone e Dogon, 1975).

Levando em consideração o produto desenvolvido por Hagger na década de 1940, Brudevold et al. desenvolveram, em 1956, um adesivo dentinário primitivo, composto por resina a base de metilmetacrilato contendo dimetacrilato de ácido fosfórico (Brudevold et al., 1956). Acreditava-se que esse adesivo seria capaz de promover adesão por meio da interação de suas moléculas bifuncionais com os íons cálcio da hidroxiapatita (Kugel e Ferrari, 2000). Entretanto, os valores máximos de resistência de união obtidos com o agente em questão eram, aproximadamente, 2,6 MPa quando o adesivo era aplicado em dentina não tratada e 5,4 MPa quando ácido clorídrico 7% era utilizado previamente a aplicação do mesmo. Além disso, a resistência de união era drasticamente reduzida sob imersão em água (Brudevold et al., 1956).

Ainda na década de 1950, Bowen publicou um trabalho no qual descrevia a síntese do monômero Bis-GMA (bisfenol glicidil metacrilato), que se tornaria a base dos compósitos atuais (Bowen, 1956). Como consequência dessa descoberta, no decorrer dos anos 1960, Bowen passou a focar seus esforços no estudo dos adesivos dentinários, com o objetivo de desenvolver um sistema resinoso capaz de aderir à dentina (Bowen, 1965a; 1965b; 1965c; 1965d; 1967).

Entretanto, a obtenção de uma união eficaz ao substrato dentinário se mostraria muito mais desafiadora quando comparada ao esmalte (Singh et al., 2015), pois a dentina possui algumas características e problemas inerentes à ela: (1) a dentina mineralizada possui poucos poros que permitem a penetração de monômeros, exceto pelos túbulos dentinários; (2) há oxigênio e água no fluido dentinário, e sua completa eliminação é impossível, o que interfere na polimerização dos sistemas adesivos; (3) devido à possibilidade de danos pulpares, as reações de polimerização precisam ocorrer a temperatura corpórea, o que prejudica as propriedades físicas dos polímeros e copolímeros; (4) ocorre a formação de lama dentinária (smear layer) resultante do preparo dental, o que reduz a permeabilidade dentinária (Nakabayashi e Pashley, 2000).

Em 1965, como resultado de suas pesquisas, Bowen desenvolveu um comonômero de superfície ativa a partir da reação entre N-fenil-glicina e glicidil metacrilato (Bowen, 1965e). Esse composto, batizado de NPG-GMA (N-fenil-glicina e glicidil metacrilato), foi apresentado como um possível agente de união para a dentina (Bowen, 1965b). O NPG-GMA agia pela reação com os tecidos dentais duros, o que levava à formação de um novo composto, o qual se unia ao cálcio dos cristais de

hidroxiapatita do esmalte e da dentina em uma de suas extremidades, por meio de ligações iônica e de quelação, e se unia por copolimerização ao material restaurador na outra extremidade (Alexieva, 1979a; 1979b).

A introdução do mecanismo de ligação química do NPG-GMA deu origem à primeira geração de adesivos odontológicos. O principal produto comercial dessa geração foi o sistema Cervident (SS White), uma resina composta que utilizava, previamente à sua aplicação, um primer a base de NPG-GMA (Jendresen, 1978). Entretanto, esses materiais apresentavam resistências de união baixas (1,5 a 4,5 MPa) em estudos de laboratório (Bowen, 1965b) e performance clínica insatisfatória (Flynn, 1979).

Consequentemente, no final dos anos 1970, novos materiais foram desenvolvidos na tentativa de melhorar o desempenho dos adesivos da primeira geração. A maioria dos produtos da segunda geração era composta por uma resina a base de Bis-GMA ou HEMA (hidroxietil metacrilato), sem partículas de carga, misturada com ésteres halofosforosos (Kugel e Ferrari, 2000). Acreditava-se que esses adesivos eram capazes de unir os compósitos à dentina pela formação de ligações iônicas entre os grupos halofosforosos e o cálcio da hidroxiapatita e pela copolimerização das ligações duplas carbono-carbono com a matriz das resinas restauradoras (Eliades et al., 1985). Os produtos da segunda geração, assim como os da primeira, resultaram em baixos valores de resistência de união em estudos laboratoriais (Causton, 1984; Chan et al., 1985) e em porcentagens bastante altas de falhas de retenção em estudos clínicos (Heymann et al., 1988; Tyas, 1991).

Concomitante ao desenvolvimento das primeiras gerações de adesivos odontológicos, começou a surgir interesse nos possíveis efeitos dos instrumentos rotatórios de corte/desgaste nas características morfológicas dos substratos dentais (Lammie e Draycott, 1952; Street, 1953). Com o advento da microscopia eletrônica, em 1961, Scott e O’Neil observaram algo curioso na superfície de réplicas de esmalte e dentina cortados: enquanto a estrutura prismática do esmalte podia ser identificada, a dentina se mostrava irregular e sem nenhuma evidência da sua natureza tubular (Scott e O’Neil, 1961). Posteriormente, a presença de uma camada orgânica contendo partículas de apatita sobre a superfície do esmalte desgastado foi descrita por Boyde e colaboradores, os quais a denominaram de smear layer (Boyde et al., 1963). Mais tarde, essa camada também seria identificada na superfície da dentina (Eick et al., 1970).

A smear layer pode ser definida como uma camada amorfa fina composta principalmente por colágeno degradado, bactérias e debris inorgânicos do esmalte e da dentina (Gwinnett, 1984). Essa camada é deixada sobre as superfícies dentais como consequência do corte ou desgaste com instrumentos manuais ou rotatórios (Pashley, 1984). Os adesivos da primeira e da segunda gerações eram aplicados sobre smear layers e não conseguiam penetrar através delas, resultando em baixas resistências de união (Tay e Pashley, 2003). Isso ocorria porque os agentes de união não interagiam diretamente com o substrato dentinário, mas sim com uma camada de debris que apresentava baixa resistência coesiva e pouca adesão à dentina, o que limitava sua performance (Pashley, 1992). Logo, se tornou claro que a smear layer precisava ser removida ou modificada e ultrapassada de alguma forma para que os primers adesivos e resinas pudessem interagir diretamente com a dentina (Alex, 2012).

Em 1979, Fusayama et al. demonstraram que o tratamento da dentina com ácido fosfórico 40% durante 60 segundos resultava em aumento na resistência de união dente-restauração (Fusayama et al., 1979). Os resultados deste estudo foram recebidos com grande ceticismo pela comunidade científica, pois acreditava-se que o uso de agentes ácidos na dentina poderia causar inflamação ou até mesmo necrose pulpar (Retief et al., 1974; Stanley et al., 1975; Eriksen e Leidal, 1979). Entretanto, investigações prévias já haviam sugerido que a possibilidade de um efeito tóxico a polpa resultante do pré-tratamento ácido da dentina era mínima (Jennings e Ranly, 1972; Lee et al., 1973) e, em 1986, Chan e Jensen demonstraram que curtas exposições (de até um minuto) ao ácido fosfórico 37% levavam a pouca penetração de íons hidrogênio através de uma espessura de 0,4 mm de dentina (Chan e Jensen, 1986). Mais tarde, se chegaria a conclusão de que as reações pulpares observadas em estudos prévios não eram decorrentes do ataque ácido da dentina em si, mas dos produtos bacterianos citotóxicos que infiltravam ao redor das restaurações (Pashley, 1992), visto que os adesivos disponíveis até então não haviam sido projetados para aderir à dentina condicionada, conferindo baixa qualidade de união ao complexo dente-restauração (Torney, 1978; Tao e Pashley, 1988).

Em 1982, Nakabayashi et al. apresentaram uma importante descoberta que ajudou a consolidar a ideia do condicionamento ácido da dentina. Os pesquisadores avaliaram a área de união formada pela aplicação de um adesivo à base de 4-META (4-metacriloxietil trimelitato anidro) sobre a dentina previamente condicionada com

diferentes concentrações de uma solução contendo ácido cítrico e cloreto férrico. Observou-se, por meio de microscopia eletrônica de varredura, que os monômeros do adesivo penetravam nas dentinas intra e intertubular, formando, após a polimerização, uma camada ácido-resistente subjacente a interface adesiva (Nakabayashi et al., 1982).

O condicionamento ácido é capaz de remover o conteúdo mineral das camadas superficiais da dentina, expondo as fibrilas de colágeno da matriz dentinária (Pashley DH et al., 1993). Os monômeros do adesivo penetram por entre as fibrilas e, uma vez polimerizados, formam uma zona de dentina impregnada por resina, denominada camada híbrida (Van Meerbeek et al., 1993b), a mesma descrita por Nakabayashi no início dos anos 1980. O embricamento mecânico promovido por essa camada é responsável por unir a restauração ao dente e selar a dentina, prevenindo a hipersensibilidade e o desenvolvimento de cáries secundárias (Nakabayashi et al., 1991).

Apesar dos achados de Fusayama et al. (1979) e Nakabayashi et al. (1982) argumentarem a favor do condicionamento dentinário, ainda havia relutância em se condicionar a dentina com ácido fosfórico (Gwinnett, 1989). Sendo assim, a partir da metade dos anos 1980, foram introduzidos no mercado os adesivos dentinários de terceira geração. O mecanismo de adesão associado a esses sistemas se baseava na remoção parcial, total ou na modificação da smear layer, o que resultava em melhores molhamento de superfície e penetração do adesivo (Scherer et al., 1990). Durante esse período, diversas soluções ácidas fracas foram utilizadas para remover ou modificar a camada de debris deixada pelo preparo cavitário. Como exemplos, podemos citar: soluções contendo HEMA e ácidos orgânicos (Scotchbond 2 – 3M; All Bond – Bisco), oxalato de alumínio misturado com ácido nítrico (Tenure – Den-Mat), EDTA ou ácido etilenodiamino tetracético (Gluma - Bayer) e primers compostos por misturas de dipentaeritritol pentacrilato (PENTA), HEMA e álcool (Prisma Universal Bond 3 – Dentsply) (Asmussen et al., 1988; Chappell et al., 1994; Camps et al., 1995; Fanchi e Breschi, 1995).

Os adesivos de terceira geração aumentaram consideravelmente a complexidade dos procedimentos restauradores adesivos (Erickson, 1989). Cada um desses sistemas possui um primer dentinário composto por monômeros hidrofílicos, o qual auxilia no molhamento da superfície da dentina e promove a formação de união entre o adesivo hidrofóbico e o substrato (Dickinson et al., 1991). Portanto, o

procedimento clínico passou a ser dividido em dois ou três passos: condicionamento da dentina, aplicação do primer (dependendo do sistema, essa etapa era combinada em um mesmo frasco com o condicionador dentinário) e colocação da resina adesiva sem carga (Anusavice et al., 2013).

A terceira geração de adesivos dentinários representou um avanço em relação aos produtos das gerações anteriores (Oilo e Olsson, 1990), porém sua performance in vitro ainda era imprevisível, apresentando grande variação nos valores de resistência de união (Barkmeier e Cooley, 1989; Fasbinder et al., 1989; Chappell et al., 1990; Dickinson et al., 1991; Prati et al., 1991; Triolo e Swift, 1992; Eick et al., 1993) e resultados insatisfatórios em estudos de micro-infiltração (Barkmeier e Cooley, 1989; Kanca, 1989b; Scherer et al., 1990). Os estudos clínicos, no entanto, demonstravam taxas de retenção acima de 90% após 6 meses e acima de 80% após 2 anos para restaurações executadas com os referidos produtos (Bastos et al., 1989; Jordan et al., 1989; Van Meerbeek et al., 1993a).

A próxima geração de sistemas adesivos, introduzida no início dos anos 1990, teria como principal característica a incorporação da técnica do condicionamento ácido total ou total-etch (Swift, 1998). Descrita por Kanca em 1989, esta técnica preconizava a aplicação simultânea de ácido fosfórico ao esmalte e à dentina durante vinte segundos com a finalidade de remover completamente a smear

layer antes da aplicação do agente de união (Kanca, 1989a). A remoção total da smear layer permite a interação direta do adesivo com o substrato dentinário desmineralizado

(Koibuchi et al., 2001). Por meio desse procedimento, o adesivo penetra na superfície da dentina intertubular condicionada e substitui os cristais de apatita previamente desmineralizados e removidos pelo ácido, produzindo uma camada de dentina impregnada por resina (Fusayama, 1992).

Em 1992, Kanca e Gwinnett relataram, em duas publicações independentes, que a resistência de união à dentina poderia ser melhorada caso a superfície dentinária fosse mantida visivelmente úmida durante o procedimento adesivo (Gwinnett, 1992; Kanca, 1992b). A secagem do substrato dentinário após o condicionamento ácido causa o colapso da dentina desmineralizada e a consequente perda dos espaços entre as fibrilas de colágeno expostas (Pashley DH et al., 1993). Sem estes espaços, a difusão dos monômeros adesivos por entre as fibrilas colágenas é prejudicada, o que resulta em pobre hibridização e baixa resistência de união (Pashley et al., 2011). A manutenção da dentina levemente úmida preserva os

nanoespaços interfibrilares da rede de colágeno exposta, permitindo uma melhor difusão dos monômeros do primer e do adesivo para dentro do substrato e, assim, favorece o processo de hibridização (Tay et al., 1998; Pereira et al. 2001)

Os sistemas adesivos da quarta geração consolidaram a abordagem de três passos adotada na geração anterior: (1) condicionamento ácido, (2) aplicação do

primer e (3) aplicação da resina adesiva (Milia et al., 2012). O primer, composto por

monômeros hidrofílicos misturados a um solvente orgânico, tem como função deslocar a água da dentina desmineralizada e, consequentemente, diminuir a umidade e aumentar a energia de superfície do substrato dentinário (Lopes et al., 2002). Esse processo favorece a infiltração dos monômeros resinosos do adesivo por entre as fibrilas de colágeno expostas pelo condicionamento ácido (Pereira et al., 2001). A resina adesiva, também denominada de bond, é o último componente a ser aplicado sobre a superfície dentinária durante o procedimento de adesão (Ozer e Blatz, 2013). Constituído por monômeros hidrofóbicos de alto peso molecular associados a monômeros diluentes de menor peso molecular, o bond tem a capacidade de copolimerizar com o primer, formando a camada híbrida (Reis e Loguércio, 2007).

Em 1984, Davidson et al. demonstraram que a tensão de contração resultante da polimerização de um compósito resinoso em uma cavidade classe V era de aproximadamente 20 MPa (Davidson et al., 1984). Dois anos mais tarde, corroborando os achados de Davidson et al., Komatsu e Finger sugeriram que adesivos dentinários capazes de promover valores de resistência de união ao cisalhamento por volta de 20 MPa seriam eficazes em prevenir a formação de fendas marginais decorrentes da contração de polimerização do compósito restaurador (Komatsu e Finger, 1986). Ainda na mesma década, Munksgaard et al., propuseram uma correlação entre resistência de união e largura de fendas marginais. Os autores estabeleceram que para se obter restaurações livres de fendas, devidamente adaptadas às paredes dos preparos cavitários, os sistemas adesivos deveriam conferir valores de aproximadamente 23 MPa para os testes de resistência de união por tração e de 17 MPa para os ensaios de resistência de união por cisalhamento (Munksgaard et al., 1985).

Durante o decênio de 1990, diversos estudos relataram valores de resistência de união ao cisalhamento que se aproximavam ou ultrapassavam a faixa de 17-20 MPa, demonstrando que os adesivos da quarta geração seriam capazes de promover união adequada à dentina (Gwinnett e Shuan, 1994; May et al., 1997; Wilder

et al., 1998). De fato, os sistemas adesivos dessa geração apresentam excelentes resultados de resistência de união, mesmo em estudos laboratoriais que utilizam metodologias mais modernas (Inoue et al., 2001; De Munck et al., 2003; Loguércio et al., 2014; Freitas et al., 2016). Além disso, as taxas relativamente altas de retenção de restaurações encontradas em pesquisas clínicas longitudinais com acompanhamentos de mais de dez anos comprovam a boa performance desses sistemas (van Dijken e Pallesen, 2008; Wilder et al., 2009; Peumans et al., 2012).

Em 2014, Loguércio et al. avaliaram as propriedades mecânicas e de adesão de quatro sistemas adesivos de três passos que requerem condicionamento ácido da dentina. O adesivo Optibond FL (Kerr), principal representante dos produtos da quarta geração, apresentou os melhores resultados para todas as propriedades analisadas quando comparado aos demais sistemas, incluindo: maior resistência de união por microtração, menor nanoinfiltração, maiores grau de conversão e grau de conversão in situ, maior resistência máxima à tração e menores sorção e solubilidade. Isso confirma o consenso que se tem na literatura de que o sistema Optibond FL é o padrão ouro dos adesivos odontológicos (Loguércio et al., 2014).

Por conta dos sistemas de união de três passos serem vistos por alguns como muito complicados e dispendiosos, os fabricantes tentaram simplificar seus produtos combinando certos passos de aplicação (Al-Ehaideb e Mohammed, 2000). Para facilitar o uso clínico, sistemas de “frasco único” que combinavam primer e adesivo na mesma solução para ser aplicada após o condicionamento simultâneo do esmalte e da dentina foram lançados (Miyazaki et al., 2014). A abordagem de simplificação dos sistemas adesivos constitui a quinta geração de produtos.

Ao misturar primer e bond em um único passo de aplicação, concentrações maiores de componentes hidrofílicos foram adicionadas às formulações adesivas para melhorar sua habilidade de penetrar a rede de colágeno desmineralizado da dentina (Ye et al., 2012). O monômero HEMA é utilizado com frequência na composição de sistemas adesivos simplificados, pois sua hidrofilia o torna um excelente promotor de adesão, capaz de aumentar o molhamento da dentina e melhorar significativamente a resistência de união (Miyazaki et al., 2014). Solventes à base de água, etanol e/ou acetona também são adicionados a essas formulações com o objetivo de dissolver os monômeros, o que auxilia na redução da viscosidade e melhora o molhamento da resina adesiva, facilitando sua difusão na superfície dental (Van Landuyt et al., 2007).

Existem relatos conflitantes na literatura em relação ao desempenho in vitro dos primers adesivos de quinta geração. Enquanto alguns estudos reportam valores de resistência de união à dentina equiparáveis aos sistemas de três passos da quarta geração (Moll et al., 2002; Gallusi et al., 2010; Oliveira et al., 2012), outros demonstram resultados inferiores (Sarr et al., 2010; Perdigão et al., 2013b; Jang et al., 2016). É importante ressaltar que mesmo nos estudos que demonstram menor resistência de união para os sistemas simplificados ao compará-los com sistemas mais complexos da geração anterior, estes valores ainda assim ultrapassam o patamar de 20 MPa, o qual, como explicado anteriormente, é considerado o valor mínimo necessário para se obter resistência à contração de polimerização do material restaurador. As pesquisas clínicas, por sua vez, relatam desempenho desfavorável dos adesivos de quinta geração a longo prazo (Peumans et al., 2005; Ritter et al., 2009; Boushell et al., 2016). Estudos laboratoriais atribuem esses resultados a maior hidrofilia e ao reduzido potencial de hibridização dos adesivos simplificados (Cardoso et al., 2011).

As gerações subsequentes de agentes de união são identificadas pela introdução de sistemas que não necessitam de um passo separado de condicionamento. Estes produtos contêm monômeros ácidos capazes de condicionar e penetrar no substrato dentinário simultaneamente (Van Meerbeek, 2011). Sendo assim, a partir da sexta geração de sistemas de união, os adesivos odontológicos podem ser classificados em duas categorias: aqueles que removem a smear layer por meio do condicionamento ácido da superfície dentária previamente à sua aplicação (adesivos convencionais) e aqueles que modificam a smear layer, sem removê-la (adesivos autocondicionantes) (Van Meerbeek et al., 1998). As duas categorias principais de adesivos são também subdivididas segundo o número de passos clínicos de aplicação. Portanto, tem-se os adesivos convencionais de três (quarta geração) ou dois passos (quinta geração) e adesivos autocondicionantes de dois passos ou de passo/frasco único (Masarwa et al., 2016).

Existem ainda adesivos classificados como “universais” ou multi-mode, os quais podem ser aplicados tanto pela técnica de condicionamento ácido, quanto pela técnica autocondicionante (Marchesi et al., 2014). Os sistemas posteriores à quinta geração de adesivos não envolvem nenhum tratamento dentinário prévio à aplicação dos monômeros adesivos e, portanto, não serão abordados com detalhes nesta

revisão da literatura, visto que sua proposta não se encaixa ao escopo do presente trabalho.

2.2 Degradação da união resina-dentina

Com o objetivo de criar microporosidades na dentina que permitam a infiltração dos monômeros adesivos, os cristais de hidroxiapatita da matriz mineralizada são removidos por meio do condicionamento ácido da superfície. Este procedimento dissolve os minerais da dentina a uma profundidade de 10 µm (Pashley et al., 2011). Após o condicionamento ácido, é realizada a lavagem do substrato com a finalidade de remover resíduos de ácido e cristais solubilizados (Pashley et al., 2007). Terminada a lavagem, indica-se que a superfície onde será realizada a adesão seja mantida úmida antes da aplicação do sistema adesivo (Gwinnett, 1992; Kanca, 1992b), pois na ausência de água ocorre o encolhimento/colapso da rede de colágeno desmineralizada, o que causa a obstrução das vias de difusão dos monômeros adesivos, resultando em pobre hibridização e baixa resistência de união (Manso et al., 2008).

O efeito prejudicial da remoção de umidade na integridade do substrato desmineralizado se deve à tendência intrínseca que os peptídeos das moléculas de colágeno possuem de formar pontes de hidrogênio entre si (Pashley et al., 2007). As moléculas de água são capazes de solvatar os grupos carboxila e os grupos amida envolvidos nas ligações peptídicas, o que impede a formação de pontes de hidrogênio entre fibrilas de colágeno adjacentes (Zhou et al., 2016). É por essa razão que a água se faz necessária durante o procedimento adesivo, pois a mesma mantém os espaços interfibrilares para que os monômeros da resina adesiva possam penetrar por entre as fibrilas, formando a camada híbrida (Carvalho et al., 1996).

Embora os sistemas adesivos convencionais promovam adequada resistência de união imediata (Inoue et al., 2001; Sarr et al., 2010; Nagpal et al., 2015), durabilidade limitada da união resina-dentina tem sido demonstrada, tanto in vivo (Mjör e Gordan, 2002; Hashimoto et al., 2000; Armstrong et al., 2004; Koshiro et al., 2004), quanto sob condições artificiais de envelhecimento in vitro (Kim et al., 2011; Loguércio et al., 2016; Sangwichit et al., 2016). Segundo Hashimoto et al. (2003), dentro da camada híbrida, dois padrões de degradação podem ser observados: (1) perda de resina dos espaços interfibrilares e (2) desorganização das fibrilas colágenas (Hashimoto et al., 2003). Outros investigadores ainda relatam a participação de um

terceiro mecanismo de degradação (3), caracterizado pela hidrólise das moléculas de silano (Si–O–Si), o que provoca a perda das partículas de carga da matriz polimérica (Abuna et al., 2016).

A água presente no substrato dentinário pode ser classificada em dois tipos: água adsorvida ou de solvatação e não solvatada ou livre (Chiba et al., 2016). A água adsorvida é definida como a água estrutural que circunda a maioria das proteínas (Kramer et al., 2001; Fullerton e Amurao, 2006) e corresponde a apenas 21-25% do total de água nas matrizes dentinárias desmineralizadas (Agee et al., 2015). A água adsorvida presente junto ao colágeno é resistente à remoção por secagem ou pelo uso de solventes polares como acetona ou etanol (Agee et al., 2015). A água livre é aquela encontrada nos túbulos da dentina mineralizada, assim como a água adicionada ao substrato desmineralizado durante o procedimento de lavagem (Marshall et al., 1997; Grégoire et al., 2013). A maior parte do conteúdo aquoso da matriz dentinária desmineralizada é composta por água não solvatada (75-79%) (Agee et al., 2015). Esta é a água que deve ser deslocada pelo solvente da formulação adesiva e, em situação ideal, substituída completamente pelos monômeros do adesivo (Liu et al., 2011).

Embora a técnica de adesão à dentina úmida seja recomendada há mais de vinte anos, um consenso ainda não foi estabelecido a respeito do grau ideal de umidade a ser mantido, tornando o procedimento adesivo um desafio para clínicos e pesquisadores (Loguércio et al., 2015). O conteúdo ideal de água depende de vários fatores, como a habilidade do operador (Sano et al., 1998), a interpretação das instruções do fabricante (Hashimoto et al., 2006) e o tipo de solvente na composição do adesivo (Reis et al., 2003). Portanto, a manutenção de uma superfície úmida aumenta consideravelmente a complexidade do procedimento de adesão à dentina (Lopes et al., 2016), possibilitando que água em excesso seja deixada sobre o substrato desmineralizado (Brackett et al., 2011). Este excesso de água não pode ser totalmente removido pelo primer e acaba sendo incorporado à área de união durante a hibridização, onde resulta na degradação química (hidrólise) das moléculas de resina da camada híbrida (Boushell, 2013).

Perdigão et al. (2013) demonstraram a presença de água/solvente retidos dentro da camada de adesivo logo após o procedimento de adesão, o que contribui para a formação de canais característicos na superfície da camada híbrida que se estendem para dentro da camada de adesivo, chamados de water-trees (Perdigão et

al., 2013a). O conteúdo aquoso livre deixado dentro do polímero está contido nestes canais de difusão preenchidos por água (Duarte et al., 2009).

A hidrólise corresponde ao processo de cisão ou quebra de ligações de condensação pela reação com água. Como exemplos de ligações de condensação, podem-se citar aquelas por meio de grupos éster, éter, amida, uretano etc. Praticamente todos os monômeros resinosos presentes em produtos odontológicos se baseiam na união de componentes químicos via ligações éster, as quais são altamente suscetíveis à hidrólise (Santerre et al., 2001). Sendo assim, o polímero resinoso do adesivo sofre degradação decorrente da retenção de água dentro da camada adesiva. Além disso, a presença de monômeros hidrofílicos na composição dos sistemas de união simplificados resulta em sorção de água, o que intensifica o processo de hidrólise (Kong et al., 2015). A presença de água em excesso também inibe a polimerização do adesivo, resultando em um polímero com baixas propriedades mecânicas (Reis et al., 2012).

Como citado anteriormente, outro mecanismo de degradação da união resina-dentina consiste na deterioração das fibrilas de colágeno da camada híbrida. Os dimetacrilatos que compõem os sistemas adesivos são praticamente insolúveis em água, o que significa que alterações de fase dos monômeros podem ocorrer em substratos excessivamente úmidos (Spencer e Wang, 2002). Estas alterações se manifestam pela formação de glóbulos de resina suspensos em água (Ye et al., 2009), os quais são muito grandes para permear os espaços interfibrilares (Brackett et al., 2011). Isso resulta em uma discrepância entre a profundidade de desmineralização causada pelo condicionamento ácido e a profundidade de infiltração do adesivo, o que deixa fibrilas colágenas expostas nas regiões mais profundas da camada híbrida (Tay et al., 2002; Breschi et al., 2008). Assim, quantidades significativas de fibrilas colágenas acabam sendo circundadas por água ao invés de serem envolvidas e protegidas por resina polimerizada, fenômeno ao qual é dado o nome de nanoinfiltração (Pioch et al., 2001).

A dentina humana contém várias enzimas que juntas podem degradar proteínas da matriz colágena dentinária, incluindo o colágeno tipo I. Estas enzimas pertencem às famílias das metaloproteinases (MMPs) e cisteína catepsinas da matriz (Tjäderhane et al., 2013). As MMPs são uma classe de endopeptidases zinco- e cálcio-dependentes que ficam encapsuladas dentro da matriz dentinária durante o desenvolvimento do dente (Mazzoni et al., 2006; Longhi et al., 2014). As MMPs foram

descritas pela primeira vez em 1962 por Gross e Lapière (Gross e Lapière, 1962) e a primeira evidência de atividade colagenolítica na dentina foi relatada no início dos anos 1980, tanto em tecido cariado como intacto (Dayan et al., 1983).

Estudos prévios demonstraram que na dentina humana podem ser encontrados diferentes tipos de MMPs endógenas, como colagenase (MMP-8), gelatinases (MMP-2 e -9), e enamelisina (MMP-20) (Sulkala et al., 2002; Mazzoni et al., 2007; Breschi et al., 2009). As MMPs são necessárias durante a etapa organizacional da formação e mineralização da dentina, onde atuam degradando o colágeno tipo III durante a organização da matriz dentinária e participando da “modelação” do colágeno tipo I, na formação de dentina peritubular e terciária e na liberação de fatores de crescimento dentinários (Sambandam e Neelakantan, 2014). Desde que mineralizadas, as MMPs contidas nas fibrilas de colágeno da dentina se apresentam inativas (Thompson et al., 2012). Contudo, a dentina humana pode apresentar atividades colagenolítica e gelatinolítica após tratamento com ácido fosfórico (Nishitani et al., 2006; Breschi et al., 2009). Proteinases são liberadas e ativadas durante os procedimentos adesivos e, consequentemente, degradam as fibrilas de colágeno desprotegidas na camada híbrida, contribuindo para a deterioração e a perda do selamento dentinário promovido pela aplicação do adesivo (De Munck et al., 2009; Mazzoni et al., 2013; Longhi et al., 2015).

O sítio de união ao substrato das colagenases se localiza em uma fenda profunda com largura de apenas 0,5 nm (Tjäderhane et al., 2013). Este espaço não é suficiente para acomodar a tripla hélice do colágeno, que possui diâmetro três vezes maior do que o sítio ativo da enzima (Nagase e Fushimi, 2008), o que torna as fibrilas de colágeno na sua configuração nativa de tripla hélice resistentes a maioria das enzimas proteolíticas dos vertebrados (Tjäderhane et al., 2013). Sendo assim, acredita-se que o mecanismo de degradação do colágeno pelas MMPs envolva primeiramente a união da enzima com a tripla hélice do colágeno e o desenrolamento local da estrutura helicoidal, de forma que cada peptídeo possa se encaixar ao sítio ativo da enzima (Chung et al., 2004). Por fim, as MMPs clivam as cadeias α que compõem a tripla hélice do colágeno por meio da hidrólise sucessiva de ligações interpeptídicas (Strobel e Hellwig, 2015).

Estudos indicam que o ácido fosfórico é capaz de aumentar a atividade das MMPs dentinárias (De Munck et al., 2009; Breschi et al., 2010), além de danificar as fibrilas de colágeno, o que acarreta em mudanças no arranjo molecular destas,

facilitando a interação das cadeias de polipeptídeos com o sítio catalítico das MMPs (Bertassoni et al., 2012). O uso do ácido fosfórico associado à técnica de adesão úmida deixa muita água residual na área de união resina-dentina (Abedin et al., 2015) e fornece combustível hidrolítico para as proteases endógenas da matriz dentinária, as quais hidrolisam lentamente as fibrilas de colágeno, resultando em pobre durabilidade da união entre dente e restauração (Pashley et al., 2011).

Claramente, a abordagem atual de adesão à dentina precisa ser modificada para facilitar a remoção da água não adsorvida e permitir que mais monômeros adesivos possam envelopar as fibrilas de colágeno (Agee et al., 2015). É possível remover praticamente toda a água adicionada à dentina pelo procedimento de secagem utilizando-se um jato de ar forte e contínuo durante 30 segundos. A remoção da maioria da água livre reduz o risco de alterações de fase que ocorrem quando dimetacrilatos são misturados à dentina saturada com água. Adicionalmente, na ausência de água livre, não haveria porções de camada híbrida infiltradas com água residual e, portanto, as hidrolases endógenas da matriz dentinária (MMPs e catepsinas) não seriam capazes de clivar o colágeno (Zhou et al., 2016). A adesão realizada na ausência de água pode ser vantajosa para a durabilidade da união resina-dentina, desde que o colapso da matriz desmineralizada após a secagem seja evitado.

2.3 Soluções alternativas de condicionamento

Bowen et al., em 1982 publicaram um artigo no qual descreviam a síntese de um sistema adesivo dentinário experimental de três passos. O primeiro passo consistia na utilização de uma solução ácida de oxalato férrico hexahidratado (Fe2(C2O4)3·6H2O) dissolvido em água destilada na concentração de 6,8% como agente de “limpeza/fixação”. As outras duas etapas correspondiam a aplicação de um comonômero de superfície ativa (NPG-GMA ou NTG-GMA – N-tolil-glicina glicidil metacrilato), seguida pela aplicação de um agente de união (PMDM – dianidrido piromelítico e HEMA – ou 4-META). No mesmo estudo, foi relatada resistência de união de 13,1 MPa (± 2,3) para a combinação da solução de oxalato férrico 6,8% com NTG-GMA, acetona e PMDM. Apesar deste valor parecer consideravelmente baixo para os padrões atuais, os autores se mostraram confiantes no sistema adesivo proposto, pois o resultado obtido se equiparava à resistência de união ao esmalte promovida pelo ataque da superfície com uma solução de ácido ortofosfórico 30% (Bowen et al., 1982).

Mais tarde, Bowen e Asmussen (1987) também testariam o uso da solução de oxalato férrico associada a um adesivo a base de glutaraldeído e HEMA (GLUMA, Aldrich Chemical Company), obtendo resistência de união inferior àquela da publicação de 1982 – 7,9 MPa (± 3,5). Os pesquisadores atribuíram os baixos resultados obtidos à metodologia aplicada, que não incluía o pré-tratamento da superfície com EDTA, passo preconizado pelo fabricante do sistema GLUMA (Asmussen e Bowen, 1987). Posteriormente, em 1989, Ishioca e Caputo relataram que o tratamento com oxalato férrico comprometeu a união entre adesivo e dentina (Ishioca e Caputo, 1989), porém os autores não deram nenhuma explicação para isso. Ao comparar a metodologia utilizada neste último estudo com as investigações prévias, percebe-se que a solução de oxalato férrico possuía pH acima de 2,0, sendo menos ácida do que a utilizada por Bowen et al.

A solução ácida de oxalato férrico primeiro dissolve os cristais de fosfato de cálcio da smear layer superficial com o concomitante aumento no pH da solução aquosa na superfície (Bowen, 1982). O aumento no pH ocorre provavelmente devido a um efeito de neutralização da dentina pela dissolução de minerais (Iwasa et al., 2011). Forma-se então uma solução aquosa (instável) contendo íons ferro, cálcio, oxalato e fosfato. Alguns destes íons interagem e se unem por grupos polares aos componentes orgânicos, promovendo a condensação, o enrijecimento, a reticulação e a diminuição da solubilidade do substrato desmineralizado. Ao mesmo tempo, é muito provável que ocorra a co-precipitação de oxalato de cálcio insolúvel e fosfato férrico praticamente insolúvel sobre a superfície tratada (Bowen, 1982).

Chohayeb (1992), em um estudo de micro-infiltração, mostrou que o uso da solução de oxalato férrico resultou em melhores resultados quando comparado ao grupo controle com cimento de ionômero de vidro. Contudo, a aplicação desta solução levava a formação de manchas de coloração marrom em muitas amostras em estudos

in vitro (Dragolich et al., 1993) e casos de descoloração também foram observados

em estudos clínicos (Venz e Dickens, 1993), o que poderia ser desfavorável do ponto de vista estético para uma possível aplicação clínica. Para contornar essa desvantagem, ao introduzir os produtos no mercado no decorrer da década de 1990, os íons ferro foram substituídos pelo alumínio (Van Dijken et al, 1999) e pesquisas objetivando o uso de soluções contendo oxalato férrico como agente de condicionamento deixaram de ser realizadas.

Apesar do aparente insucesso do oxalato férrico como condicionador dentinário, outra solução contendo íons ferro passaria a ser utilizada a partir de 1982. Neste ano, Nakabayashi et al., publicaram um estudo no qual introduziam o conceito de formação da camada híbrida, como já mencionado na seção 2.1. A metodologia utilizada pelos autores incluía o uso de uma solução composta pela dissolução de cloreto férrico em ácido cítrico nas proporções de 3% e 10%, respectivamente (Nakabayashi et al., 1982). A referida solução, chamada de solução 10:3, está presente em um sistema de cimentação comercializado no Japão (Super Bond C&B, Sun Medical Co.), no qual é usada para condicionar a dentina previamente a aplicação de um cimento resinoso a base de 4-META/MMA. O condicionamento dentinário com a solução 10:3 é capaz de promover união dentina-resina superior àquela obtida com o ácido fosfórico (Takagaki et al., 2009), e a resistência de união se mantém após armazenamento (Nurrohman et al., 2011) ou termociclagem (Nurrohman et al., 2012). Tem sido sugerido que o uso da solução 10:3 teria uma vantagem em relação ao condicionamento tradicional com ácido fosfórico, pois a permeabilidade da dentina condicionada com a mistura de ácido cítrico 10% e cloreto férrico 3% se manteria alta mesmo com a secagem da matriz desmineralizada (Nakabayashi et al., 2000). As fibrilas de colágeno são cobertas com proteoglicanas, estruturas compostas por um núcleo de proteína ao qual uma ou mais cadeias de glicosaminoglicanas se unem (Goldberg e Takagi, 1993). As fosfoproteínas, proteoglicanas e glicosaminoglicanas (polieletrólitos dentinários) são altamente solúveis em água e polianiônicas devido aos seus grupos carboxila e sulfato (Wight e Mecham, 1987; Breschi et al., 2002). Na presença de cloreto férrico, os polieletrólitos se agregam aos íons ferro, tornando-se insolúveis. Assim, a permeabilidade da dentina à água e ao ácido cítrico é aumentada, o que, consequentemente, aumenta as taxas de desmineralização e desidratação da dentina. Além disso, a presença desses agregados insolúveis ajuda a manter os espaços entre as fibrilas colágenas mesmo após a secagem com ar, permitindo que os monômeros possam penetrar e formar camada híbrida após a polimerização (Piemjai et al., 2003).

Ambas as soluções discutidas acima possuem em comum a presença de íons ferro na sua composição. Nos últimos anos, alguns estudos na área de paleontologia relataram a presença de proteínas de colágeno e elastina preservadas em uma variedade de espécimes de fósseis (Schweitzer et al., 2009; San Antonio et al., 2011). Os pesquisadores têm sugerido que ligações cruzadas intermoleculares

não-enzimáticas na rede de supermoléculas de fibrilas colágenas nos vasos sanguíneos desses fósseis seriam possíveis contribuintes para a longevidade do tecido. Dois dos mecanismos de formação de ligações cruzadas intermoleculares não-enzimáticos (reação de Fenton e glicação) dependem do potencial de oxidação do ferro e da formação de agentes altamente redutores (Schweitzer et al., 2014).

Schweitzer et al. (2014) sugerem que o ferro pode proteger diretamente proteínas por meio do bloqueio de sítios ativos reconhecidos por enzimas de degradação, ou também pode promover essa proteção indiretamente unindo-se ao oxigênio e, assim, prevenindo os danos causados aos tecidos pela oxidação. Portanto, pode ser que os íons ferro contidos na solução de oxalato férrico e na solução 10:3 possuam uma ação protetora no tecido dentinário desmineralizado, impedindo a ação das MMPs.

Ao sintetizar soluções de oxalato férrico para seus estudos, Blosser e Bowen (1988) detectaram que a matéria prima (Fe2(C2O4)3·6H2O) proveniente de um dos fabricantes apresentava quantidades variáveis (1-10% em peso) de ácido nítrico em sua composição, o qual era um contaminante deixado pelo processo de síntese do oxalato (Blosser e Bowen, 1988). A partir desta observação, os autores avaliaram a resistência de união, os efeitos sobre a superfície dentinária e a formação de tags de resina de soluções contendo quantidades variáveis de oxalato férrico e ácido nítrico e compararam os resultados com soluções purificadas contendo somente uma das duas substâncias. Com isso, descobriu-se que a omissão do oxalato férrico da solução de condicionamento, deixando apenas o ácido nítrico, não influenciava a resistência de união e que a remoção da smear layer ocorria provavelmente pela ação do ácido nítrico. Contudo, os autores se mostraram receosos em sugerir o uso exclusivamente do ácido, visto que na ausência de oxalato férrico não ocorria a obliteração dos túbulos dentinários e não se sabia dos possíveis efeitos do ácido nítrico sobre a polpa (Blosser e Bowen, 1988).

Dois anos mais tarde, Blosser publicou um estudo no qual analisou o efeito da aplicação de uma solução de ácido nítrico 2,5% durante diferentes períodos de tempo (10-60 s) sobre as superfícies dentais. O autor concluiu que o ácido nítrico aplicado por um período de 10 segundos era capaz de remover a smear layer e que remoção adicional de parte da dentina peritubular na embocadura dos túbulos dentinários ocorria a partir de 30 segundos de condicionamento, permitindo profunda penetração do agente de união e consequente formação de tags de resina (Blosser,

1990). Posteriormente, Marshall et al. (1993) demonstraram resultados semelhantes por meio de microscopia de força atômica.

Asmussen e Bowen (1987) obtiveram resistência de união de 13,8 MPa com o uso de uma mistura de ácido nítrico 2,4% e N-fenilglicina 5,7%, o qual foi o maior valor obtido no referido estudo, comparável à resistência entre resina e esmalte relatada para a época. Schumacher et al. (1997) relataram resistência de união a tração por volta de 9,8 MPa (± 3,5) ao utilizar um sistema adesivo a base de N-fenilglicina e p-PMDM sobre dentina previamente condicionada com uma solução de ácido nítrico 2,5%. Apesar destes resultados terem sido descritos como promissores pelos autores, estudos avaliando a união resina-dentina criada pelo uso do ácido nítrico são extremamente escassos e até o momento a real natureza da interação entre ácido nítrico e dentina ainda não foi elucidada.

3 PROPOSIÇÃO

O objetivo geral deste estudo foi avaliar o desempenho de soluções alternativas de condicionamento dentinário na união resina-dentina utilizando-se diferentes sistemas adesivos convencionais simplificados em dentina condicionada e seca com jato de ar.

Os objetivos específicos foram:

(1) Determinar a resistência de união dentina-compósito quando utilizados diferentes agentes de condicionamento;

(2) Avaliar os tipos de falhas ocorridos entre as superfícies envolvidas na fratura dos espécimes durante o teste de resistência de união por microtração (em microscópio eletrônico de varredura – MEV);

(3) Avaliar a ação de diferentes agentes de condicionamento sobre a rigidez (módulo de elasticidade) e a resistência à flexão da dentina bovina por meio de teste microflexural de três pontos;

(4) Analisar a morfologia da área de união resina-dentina criada pelo uso de diferentes agentes de condicionamento em microscopia confocal de varredura a laser (MCVL).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção e preparo dos dentes utilizados

Para o estudo em questão, foi utilizado um total de 110 terceiros molares humanos hígidos e 25 incisivos bovinos. Os dentes humanos haviam sido extraídos previamente em consultório particular, por indicações clínicas independentes do projeto de pesquisa, e foram doados pela cirurgiã-dentista responsável em frascos não identificados. A obtenção e utilização dos dentes humanos foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP (CEP – FOP/UNICAMP) sob o número de protocolo 091/2015 (vide Anexo 1). Todos os dentes, humanos e bovinos, foram submetidos à raspagem manual com cureta periodontal (Duflex, SS White) para remoção de debris orgânicos e polidos com taça de borracha (KG Sorensen) e pasta de pedra-pomes (SS White) e água (Figura 1). Em seguida, os mesmos foram armazenados em solução de timol (Labsynth) a 4 °C por um período máximo de três meses, até o momento da realização dos experimentos.

Figura 1 – Terceiros molares humanos e incisivos bovinos após remoção de debris e polimento

4.2 Preparo das soluções experimentais

Para o tratamento da dentina, foram utilizados quatro agentes de condicionamento: gel de ácido fosfórico 37% (Etch-37, Bisco Inc.); solução de ácido cítrico 10% e cloreto férrico 3% (solução 10:3); solução de oxalato férrico 6,8% e solução de ácido nítrico 1,4%. As soluções experimentais foram preparadas seguindo-se as metodologias descritas em estudos prévios (referenciados nas seguindo-seções 1 e 2.3), com o auxílio de um técnico do Laboratório de Bioquímica da FOP/UNICAMP. Na Tabela 1 estão listados os reagentes utilizados para o preparo das soluções experimentais de condicionamento.