Universidade Estadual de Campinas
Instituto de Biologia
BÁRBARA MATIELLO MONGELLI SABINO
"MODULAÇÃO IN VITRO DA BARREIRA EPITELIAL TUBULAR
RENAL MEDIADA PELAS JUNÇÕES DE OCLUSÃO: EFEITO DA
EXPOSIÇÃO À GLICOSE E ÁCIDO PALMÍTICO."
Campinas, 07 de agosto de 2015.
Profa. Dra Carla Beatriz Collares Buzato
Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente
Profa. Dra. Patrícia Aline Boer
Profa. Dra. Elisa Mauro Peixoto Prado
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, minha força e porto seguro, por guiar sempre minha vida e me ajudar a chegar até aqui.
Agradeço aos meus pais por me apoiarem e me darem animo sempre, cuidado e me ajudarem em tudo. Aos meus irmãos, e minhas avós também, pelo apoio, conversas, companheirismo. Ao Eder, meu atual esposo, por estar ao meu lado todo o tempo do desenvolvimento deste projeto, sem você teria sido no mínimo mais complicado! Amo vocês todos.
Agradeço a Prof. Carla, por abrir as portas do seu Laboratório, e confiar em mim, pela orientação e por toda a atenção prestada todo o tempo que precisei.
Agradeço ao programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Estrutural e a agencia financiadora CAPES por terem possibilitado o desenvolvimento deste projeto e apoiado financeiramente.
Agradeço aos amigos do laboratório, Dani, Leandro, Valquíria, Mari, Ricardo, Célia, Cíntia por toda a ajuda, conhecimentos compartilhados, paciência e amizade. Aos bolsistas Victor, Vinícius, Luís e Vitor por toda ajuda!
Às minhas amigas do Grupo de discussão Bíblica, Solange, Klenia e Evódia, por todo o apoio, conselhos e animo que me passaram!
Aos professores do departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual, por toda ajuda, e conhecimento que me transmitiram nas disciplinas e durante o projeto.
RESUMO
A nefropatia diabética (ND) é uma doença que acomete 20 a 40% dos pacientes diabéticos, sendo que a maioria dos casos está relacionada à diabetes melito tipo 2 (DMT2). A patogênese da ND envolve hipertrofia glomerular, proteinúria, redução na taxa de filtração glomerular e fibrose túbulo-intersticial. Acredita-se que essas alterações estejam associadas, pelo menos em parte, ao quadro de hiperglicemia e dislipidemia (com aumento dos níveis plasmáticos de ácidos graxos) observado na DMT2. Estudos sobre alterações no epitélio dos túbulos renais na ND são escassos, e ainda, não há trabalhos investigando possível repercussão da barreira epitelial paracelular dos túbulos renais, mediada pelas junções de oclusão, nessa condição. O objetivo geral dessa Dissertação de Mestrado foi investigar os efeitos "in vitro" de concentrações elevadas de glicose (180 e 360 mg/dL) e de ácido palmítico (200 e 400 μM) sobre a função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em linhagem estabelecida de células epiteliais tubulares renais (células MDCK). Para tal, foram analisados parâmetros funcionais (Resistência elétrica transepitelial - Rt e Fluxo transepitelial - Ft) e bioquímicos/morfológicos (imunofluorescência e Western Blotting). Observou-se que, após 72h de exposição à concentração de 180 mg/dL de glicose, as células apresentaram redução significativa na Rt, enquanto a concentração de 360 mg/dL de glicose induziu uma tendência, não estatisticamente significativa, de redução dessa medida. Não foram observadas alterações significativas no parâmetro de Ft, tendo sido detectada apenas uma pequena tendência de aumento do fluxo em células tratadas, em relação ao controle. Como revelada por imunocitoquímica, a concentração de 180 mg/dL induziu redução no conteúdo juncional das proteínas da JO, a saber as claudinas-1,-3 e ZO-1, associada com aumento significativo de claudina-2. A exposição à concentração de 360 mg/dL similarmente resultou em redução significativa no conteúdo juncional de claudinas-1,-3, ocludina e ZO-1 mas sem modificação de claudina 2. Entretanto, as células expostas a ambas as concentrações de glicose não apresentaram diferença quanto ao nível proteico total dessas proteínas juncionais em relação às do grupo controle, como avaliado por Western Blotting em homogenizados de células. As monocamadas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico não apresentaram alterações significativas da Rt. Entretanto, células expostas à concentração de 400 μM exibiram uma tendência de aumento no Ft (P=0,06). As concentrações elevadas de ácido palmítico induziram redução significativa na localização juncional de claudinas-1,-3 ocludina e ZO-1, enquanto o conteúdo juncional de claudina-2 só apresentou redução em células expostas à concentração de 200 μM. Não houve alterações no nível proteico total dessas proteínas juncionais nas células expostas às duas concentrações de ácido palmítico. Em conclusão, a glicose e o ácido palmítico, em concentrações compatíveis com os níveis séricos verificados em pacientes diabéticos, podem induzir alterações estruturais na barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em células tubulares renais in vitro; tal efeito pode ter repercussão no desenvolvimento da ND.
ABSTRACT
Diabetic nephropathy (DN) is a disease that affects 20 to 40% of diabetic patients, where the majority of the cases are associated with the type 2 Diabetes Mellitus (T2DM). The pathogenesis of DN involves glomerular hypertrophy, proteinuria, impaired glomerular filtration barrier and tubulointerstitial fibrosis. These alterations are partly related to the occurrence of hyperglycemia and dyslipidemia (including increased blood level of free fatty acid) observed in diabetic state. There are few studies on the role of the renal tubular epithelial barrier mediated by tight junction (TJ) in the development of DN. The general objective of this Master's Thesis was to investigate the
in vitro effects of elevated concentrations of glucose (180 and 360 mg/dL) and palmitic
acid (200 and 400 μM) in the structure and function of the TJ-mediated epithelial barrier in a renal tubular epithelial cells, the MDCK cell line. The integrity of the epithelial barrier function was assessed by functional (transepithelial electrical resistance – Rt, and transepithelial flux of paracellular marker - Ft) and biochemical/morphological means (immunofluorescence and Western blotting for TJ proteins). We observed that, after 72h of exposure to glucose concentration of 180 mg/dL, MDCK monolayers displayed significant reduction of Rt, while the glucose concentration of 360 mg/dL induced a tendency of decrease in this parameter associated with a tendency of increase in Ft of phenol red. As revealed by immunocytochemistry, both concentrations of glucose (180 and 360 mg/dL) induced significant reduction in the junctional content of proteins such as claudins-1, and -3 and ZO-1. Meanwhile, the claudin-2 content increased only in MDCK cells exposed to 180 mg/mL of glucose in comparison with controls. However, as analyzed by immunoblotting of cell homogenates, no differences in total cell content of TJ-associated proteins were observed among the experimental groups. Monolayers exposed to palmitic acid at concentrations of 200 or 400 μM showed no significant changes in Rt; however MDCK cells exposed to 400 μM exhibited a subtle increase of Ft of
phenol red (P=0,06). Both concentrations of palmitic acid induced significant decrease
in junctional content of claudinas-1,-3, occludin and ZO-1 in relation to control cells. However, only MDCK cells exposed to 200 μM presented significant reduction of the junctional content of claudin-2. No significant alterations to the total cell content of the junctional proteins studied were observed after high palmitic acid exposure as compared to control MDCK cells. In conclusion, exposure to high glucose and palmitic acid concentrations induces structural disruption of the TJ-mediated renal tubular epithelial barrier. These findings may have relevance for the pathogenesis of DN.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Estrutura molecular da junção de oclusão. Esquema modificado a partir de Fasano, 2008. ... 16 Figura 2: Esquema do rim em secção longitudinal, e detalhe do néfron.. ... 21 Figura 3: Caracterização inicial da linhagem de células MDCK. (a) Fotomicrografia das células cultivadas em frascos após 1 dia (a)(subconfluentes) ou 3 dias do repique (b)(confluentes) ... 40 Figura 4: Exposição à solução sem cálcio contendo 2mM de EGTA induz redução da função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em monocamadas de MDCK.. ... 41 Figura 5: Imunofluorescência para claudina-1 em monocamadas de MDCK controle e as expostas à solução sem cálcio contendo 2mM de EGTA durante 1h.. ... 42 Figura 6: Imunofluorescência para claudina-2 em monocamadas de MDCK controle e expostas à solução sem cálcio contendo 2mM de EGTA durante 1h.. ... 43 Figura 7: Exposição de monocamadas de MDCK a elevadas concentrações de glicose (180 e 360 mg/dL) por 3 dias sobre a resistência elétrica transepitelial (Rt) (a) e fluxo transepitelial do marcador extracelular, Phenol red (b) ... 46 Figura 8: Distribuição e conteúdo celular de claudina-1 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose por 3 dias.. ... 47 Figura 9: Distribuição e conteúdo celular de claudina-2 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose por 3 dias.. ... 48 Figura 10: Distribuição e conteúdo celular de claudina-3 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose.. ... 49 Figura 11: Distribuição e conteúdo celular de ocludina em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose ... 50 Figura 12: Distribuição e conteúdo celular de ZO-1 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose. ... 51 Figura 13: Exposição de monocamadas de MDCK a concentrações elevadas de ácido palmítico (200 e 400 μM) durante 3 dias sobre a resistência elétrica transepitelial (Rt) (a) e fluxo transepitelial, do marcador Phenol red (b).. ... 54 Figura 14: Distribuição e conteúdo celular de claudina-1 em monocamadas de células MDCK controle e expostas àsconcentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias.. ... 55
Figura 15: Distribuição e conteúdo celular de claudina-2 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias.. ... 56 Figura 16: Distribuição e conteúdo celular de claudina-3 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. ... 57 Figura 17: Distribuição e conteúdo celular de ocludina em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. ... 58 Figura 18: Distribuição e conteúdo celular de ZO-1 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. ... 59
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Exemplos de regulação experimental e fisiopatológica da função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão...12 Tabela II: Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais e anticorpos secundários policlonais utilizados para a detecção das proteínas por meio da técnica de imunofluorêscencia indireta...24 Tabela III: Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais e anticorpos secundários policlonais utilizados para a detecção das proteínas por meio da técnica de Western Blot...25
LISTA DE ABREVIATURAS Rt – Resistência elétrica transepitelial
Ft – Fluxo transepitelial
DMT2 – Diabetes Melito tipo 2 Ct – Controle
JO – Junções de oclusão
JAM- A – Junctional Adhesion Molecule TCP – Túbulo contorcido proximal TCD – Túbulo contorcido distal RI – Resistência à insulina
TGF-β – Transforming growth factor-beta PP2A – Protein phosphatase 2A
PP1 – Protein phosphatase 1
PKA - cAMP-dependent protein kinase PKC – Protein kinase C
SUMÁRIO
1. Introdução ... 13
1.1 Barreira Epitelial e Junções Celulares ... 13
1.2 Função Renal e Barreira Epitelial mediada pelas junções de oclusão ... 19
1.3 Diabetes Melito tipo 2 e a Nefropatia Diabética ... 24
2. Objetivos e Relevância ... 29
3. Material e Métodos ... 30
3.1. Cultura Celular ... 30
3.1.1. Tratamento das membranas Millicell com colágeno ... 30
3.2. Tratamentos ... 31
3.2.1. Exposição a Glicose e Ácido Palmítico ... 31
3.3. Integridade elétrica da barreira epitelial ... 32
3.4. Fluxo transepitelial com marcadores extracelulares ... 33
3.5. Avaliação da distribuição celular de proteínas constituintes da junção de oclusão ... 33
3.6. Western Blot para as proteínas juncionais ... 35
3.7. Análise de viabilidade celular ... 37
3.8. Análise estatística ... 37
4. Resultados ... 38
4.1 Caracterização inicial da linhagem MDCK ... 38
4.2 Glicose ... 44 4.3 Ácido Palmítico ... 52 5. Discussão ... 60 6. Conclusões ... 68 7. Referências Bibliográficas ... 69 Anexo 1 ... 81 Anexo 2 ... 82 Anexo 3 ... 83
1. INTRODUÇÃO
1.1 Barreira Epitelial e Junções Celulares
No tecido epitelial de revestimento, as células estão aderidas entre si, e interagem com componentes da matriz extracelular levando à formação de barreiras de separação entre o lúmen de um órgão e os outros tecidos subjacentes (González-Mariscal et al., 2003; 2005; García-Ponce et al., 2014). A formação e manutenção da arquitetura dos tecidos epiteliais são promovidas, em grande parte, pelas junções celulares (Niessen, 2007; Santos-Silva et al., 2012; Collares-Buzato, 2013).
Junções celulares constituem especializações da membrana plasmática, e são didaticamente subdivididas em junções intercelulares e junções célula-matriz, responsáveis pelo contato/adesão entre células, e destas com os componentes extracelulares, respectivamente (Collares-Buzato et al., 1998a; Luther et al., 2005; Collares-Buzato, 2013). Além disso, possibilitam a ocorrência de processos como: reconhecimento, diferenciação, proliferação, bem como morte celular (Collares-Buzato
et al., 1998b; Santos-Silva et al., 2012; Collares-Buzato, 2013; Capaldo et al., 2014).
Dentre as junções intercelulares, tem-se as junções de oclusão (ou tight junction), a de adesão (ou aderente), desmossomos e junções comunicantes (ou gap junctions) (Collares-Buzato, 2013; Citi et al., 2014). A formação da estrutura juncional assim como sua função no epitélio dependem da interação entre suas proteínas transmembranas e as de ancoragem, que medeiam a interação com o citoesqueleto, além da presença de moléculas intracelulares sinalizadoras (Luther et al., 2005; Ebnet 2008; Collares-Buzato, 2013).
As junções intercelulares que atuam principalmente na função de adesão celular são as junções de oclusão, que “selam” o espaço intercelular seguidas, na sequência apical-basolateral, pelas junções de adesão e uma fileira de desmossomos; estes três formam o complexo juncional (Niessen, 2007; Collares-Buzato, 2013; Stahley et al., 2014; Waschke & Spindler, 2014). A adesão, mediada tanto por interações célula-célula ou célula-matriz, é fundamental para o estabelecimento da arquitetura tecidual e polaridade celular em epitélios (Bissell & Bilder 2003; Assimakopoulos et al., 2011). As junções comunicantes, por sua vez, permitem a troca de íons e pequenas moléculas entre células vizinhas, atuando assim, no processo de comunicação celular (Ebnet, 2008;
Carvalho et al., 2012), que indiretamente interfere na adesão intercelular (Elias et al., 2007; Goodenough & Paul, 2009).
As junções de adesão circundam toda a periferia celular, na região do ápice de células epiteliais, podendo ser encontradas também em células não epiteliais (Citi et al., 2014). São estruturas formadas por proteínas da superfamília das caderinas ancoradas a proteínas citoplasmáticas que podem apresentar-se como placas, que incluem as: α- and β-cateninas, proteínas p120 e p0071, e também a ZO-1, entre outras (Capaldo et al., 2014; Domke et al., 2014). As junções de adesão são imprescindíveis na homeostasia tecidual, proporcionando a adesão célula-célula, além disso, são as primeiras junções a se formarem, desempenhando papel crítico durante o início do desenvolvimento dos tecidos, permitindo assim, posteriormente a formação das outras junções (Harris & Tepass, 2010; Le Shen, 2012).
Os desmossomos medeiam a forte adesão, e ancoram os filamentos intermediários do citoesqueleto à membrana plasmática em sítios de contato entre células. Estas interações adesivas são mediadas pelas moléculas de adesão desmogleínas e desmocolinas, membros da superfamília das caderinas (Stahley et al., 2014; Waschke & Spindler, 2014). Tais moléculas também são centrais na formação dos desmossomos, as quais interagem com o citoesqueleto por intermédio da placoglobina e desmoplaquina, dentre outras proteínas (Yamada et al., 2005; Ebnet, 2008; Harris & Tepass, 2010). Os desmossomos são estruturas imprescindíveis na fisiologia do epitélio que reveste a epiderme, devido ao estresse mecânico a que este epitélio está exposto (Sumigray et al., 2014).
A junção de oclusão (JO) é a junção mais apical da membrana lateral, que demarca a borda entre os domínios apical e basolateral, de forma que o espaço intercelular é quase completamente fechado nessa região (Niessen 2007; Furuse, 2010). Por meio de microscopia eletrônica em criofratura, é possível observar detalhadamente a ultraestrutura das JO, as quais se apresentam como cordões anastomosados na face citoplasmática, e sulcos complementares na face extracelular. Sabe-se que estes cordões constituem arranjos contínuos de pequenas partículas com diâmetros de 5 a 10 nm (Washiyama et al., 2014). Ainda, por meio de cortes ultrafinos de microscopia eletrônica, as JO ocorrem em regiões nas quais as membranas plasmáticas adjacentes estão próximas, circundando a célula como um cinturão (Furuse, 2010). Tal morfologia permite vislumbrar a função das junções como uma barreira paracelular à difusão de íons, água e moléculas até 4 kDa (Furuse, 2010; Hu et al., 2013); possuindo, assim a
capacidade de regular seletivamente a difusão de solutos, de acordo com tamanho e carga, (Furuse, 2010; Le Shen et al., 2011) e permitindo inclusive a passagem de células (Hordijk et al., 1999; Nusrat et al., 2000).
As JO são constituídas por proteínas integrais tais como a ocludina (Furuse et al., 1993) e a tricelulina (Ikenouchi et al., 2005), as quais estão associadas ou muito próximas às claudinas (Furuse et al., 1998). As claudinas compreendem uma família de 24 membros de proteínas com peso molecular variando de 21 a 28 kDa, cuja estrutura molecular geral consiste em quatro domínios transmembrana (Van Itallie & Anderson 2006; Furuse, 2010), formando duas alças extracelulares e uma intracelular (Figura 1). O primeiro loop extracelular contém aminoácidos carregados, cujos elementos estruturais determinam a seletividade de carga no transporte paracelular (Angelow et
al., 2008). O segundo loop extracelular está relacionado com a formação dos cordões
das JO, além disso, sabe-se que a enterotoxina de Clostridium perfringens pode ligar-se a esta região, induzindo uma desestruturação dessa junção intercelular. A cauda COOH-terminal apresenta grande heterogeneidade entre as isoformas de claudinas, indicando uma relação com a variação na seletividade paracelular entre as isoformas. Esta região possui motif (sequência) PDZ que permite a interação com outras proteínas juncionais (Angelow et al., 2008; Furuse, 2010; Tsukita & Furuse, 2000).
A ocludina é uma proteína de 65 kDa que, à semelhança das claudinas, possui quatro domínios transmembranas, delimitando dois loops extracelulares, um intracelular e os domínios carboxi- e amino-terminais citoplasmáticos (Furuse, 2010). Apesar da semelhança estrutural, a ocludina e claudinas não apresentam homologia bioquímica (Furuse, 2010). A região citoplasmática carboxi-terminal da ocludina interage com as proteínas citoplasmáticas ZO-1, ZO-2 e ZO-3 (Furuse, 2010). Sua função, ainda pouco elucidada, está relacionada a formação estrutural das JO, além de estar associada às claudinas, auxiliando na formação dos cordões de vedação (Mitic et al., 2000).
Além disso, há também as proteínas de membrana da superfamília das imunoglobulinas, contendo dois domínios extracelulares tipo Ig, tais como a JAM-A, JAM4, entre outras (Furuse, 2010). Na face citoplasmática, a família de proteínas
Zonula Occludens - ZOs (ZO-1, ZO-2 e ZO-3) (com 220, 160, 130 kDa,
respectivamente) (Kimura et al., 1997; Collares-Buzato 2013), a cingulina (Citi et al., 1988; Mariscal et al., 2003), o antígeno 7H6 (Mitic et al., 2000; González-Mariscal et al., 2003) e a simplequina, dentre outras, formam um complexo proteico que interliga o domínio C-terminal das proteínas transmembranas da JO com filamentos de
actina do citoesqueleto (Anderson, 2001; Ebnet, 2008; Guillemot et al., 2008; Furuse, 2010) (Figura 1). As células epiteliais apresentam uma organização específica dos filamentos de actina do citoesqueleto que forma um anel perijuncional, o qual circunda a célula na região em que se localizam as junções de adesão e de oclusão (Shen et al., 2006).
Figura 1: Estrutura molecular da junção de oclusão. Esquema modificado a partir de Fasano, 2008.
Embora inicialmente descritas como complexos proteicos estáveis e não reguláveis, estudos posteriores relataram que a organização estrutural e funcional das JO pode ser modulada por estímulos fisiológicos e fisiopatológicos que ativam determinadas vias de sinalização (Le Shen, 2011; Hu et al., 2013). Ainda, intervenções experimentais são capazes de induzir alterações na permeabilidade paracelular, bem como modificar o padrão de distribuição celular, expressão e estado de fosforilação de diversas proteínas juncionais (Le Shen et al., 2006; Le Shen, 2012). Tais condições experimentais e fisiopatológicas podem potencialmente induzir fortalecimento ou ruptura da barreira epitelial mediada pela JO (Bai & Ouyang, 2005; Le Shen, 2012). A Tabela I sumariza os efeitos de algumas dessas condições sobre a JO em epitélios.
Tabela I: Exemplos de regulação experimental e fisiopatológica da função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão.
Regulação experimental
Tratamento/Condições Célula/tecido Efeito Referência
Remoção de Ca2+ (EGTA 2 mM) MDCK I e II Rt Ft E-caderina, ZO-1 reorganização F-actina Collares- Buzato et al., (1994). Protamina (molécula policatiônica) MDCK I eII Rt Ft claudina 1 e ocludina reorganização F-actina Peixoto & Collares- Buzato (2005). pH 2,5 (apical) pH < 2,5 (apical) Cultura primária de células oxínticas da mucosa canina Rt Ft Rt Ft Chen et al., (1994). Depleção de ATP (2 mM 2-deoxy-D-glicose e 10 μM antimicina A) MDCK II e JTC Rt
ZO-1, ZO-2 e Cingulina reorganização F-actina Tsukamoto & Nigam (1999); Bacallao et al., (1994). Dexametasona e Prolactina MDCK Rt Ft
claudina 1, ocludina, ZO-1 (monocamadas subconfluentes) Peixoto & Collares- Buzato (2006). Vanadato e H2O2 MDCK II Rt Ft ZO-1 e ocludina Collares-Buzato et al., (1998) Regulação fisiopatológica Glicose1 Modelo in vivo (epitélio intestinal) Rt Contração do anel perijuncional de actina. Le Shen, (2012); Wong & Gumbiner, (1997); Hu et al., (2013). Fatores inflamatórios (IFN- γ) Células T84 Rt Ft claudina-1,claudina-4 e ocludina Bruewer et al., (2003); Le Shen (2012). Bactérias 1- Enterotoxina de Clostridium perfringens 2- Salmonella enterica serovar Typhimurium MDCK Rt Ft 1- claudinas 3 e 4 2- reorganização F-actina Jepson et al., (2000); Veshnyakova et al., (2012) 1
Ativação de cascata de sinalização (SGLT-1/NHE3/MLCK) induzindo contração do anel perijuncional com redução da função juncional e aumento de permeabilidade paracelular. 2 Efeito agudo e crônico da dexametasona e prolactina. Rt: Resistência elétrica transepitelial; Ft: fluxo transepitelial.
Um exemplo de regulação da JO é a ativação ou inativação de cinases, por meio de moduladores como vanadato e H2O2. O tratamento com vanadato (100 M) em associação
com H2O2 (200 M) inibe a ação de tirosinas fosfatases intracelulares, levando a uma maior
fosforilação de proteínas juncionais nos resíduos de tirosina. Isto resulta em internalização dessas proteínas (tais como, a ocludina e ZO-1) na célula e consequente desestruturação da JO. Desta forma, ocorre redução da função de barreira juncional em células da linhagem MDCK, com redução de Rt e aumento da permeabilidade paracelular a marcadores extracelulares (Collares- Buzato et al., 1998).
Peixoto & Collares-Buzato (2005) testaram o efeito in vitro da protamina em células MDCK sob as junções de oclusão, com o intuito de verificar o efeito de proteínas catiônicas que podem ser fisiologicamente liberadas por leucócitos polimorfonucleares em condições inflamatórias. Observaram que as células epiteliais MDCK expostas à protamina apresentaram aumento da permeabilidade paracelular associada com reorganização dos microfilamentos de actina do citoesqueleto e redução no conteúdo juncional de ocludina e claudina-1.
A permeabilidade da JO pode ser também regulada fisiologicamente como, por exemplo, no processo de diapedese de leucócitos circulantes através da parede vascular (Nusrat et al., 2000; Winger et al., 2014), na transmigração de células germinativas no epitélio seminífero durante a espermatogênese (que ocorre através da JO das células de Sertoli) (Pelletier, 2001; Lie et al., 2013), no processo de absorção paracelular de glicose pelo epitélio intestinal (Le Shen, 2012; Hu et al., 2013), etc. Os mecanismos intracelulares envolvidos nesses processos de regulação da função/estrutura da JO ainda não estão totalmente esclarecidos, mas parece envolver simples ruptura mecânica da estrutura da JO como resultado, por exemplo da passagem das células através do epitélio (Nusrat et al., 2000) ou devido à contração do anel perijuncional de actina, mediada pela cinase da cadeia leve da miosina (MLCK), como no caso da absorção paracelular intestinal de glicose (Hu et al., 2013).
Sob condições fisiopatológicas, fatores pró-inflamatórios e citocinas também atuam na modulação das JO, como é o caso do Interferon-γ (IFN- γ), uma citocina pró-inflamatória que induz internalização da ocludina, claudina-1, claudina-4 e JAM1, reduzindo a função de
epitelial intestinal (Bruewer et al., 2003; Le Shen, 2012). Sabe-se também que a disfunção da barreira epitelial intestinal mediada pela JO está envolvida, direta ou indiretamente, na etiologia de várias doenças intestinais (Suzuki, 2013), tais como a doença celíaca (De Kort et al., 2011), a doença do intestino inflamado e Síndrome do Intestino Irritado (Suzuki, 2013), da doença de Crohn (Assimakopoulos et al., 2011), bem como o agravamento do quadro de diarreia induzida por bactérias patogênicas (Jepson et al., 2000; Veshnyakova et al, 2012). Um exemplo interessante de regulação da JO pela ação de bactérias e suas toxinas é aquele mediado pela enterotoxina de
Clostridium perfringens, cujo domínio C-terminal liga-se ao segundo loop extracelular
das claudinas -3 e -4 ocasionando desestabilização das JOs, com redução da função de barreira intestinal (Veshnyakova et al., 2012).
Nos rins, os processos de reabsorção e secreção ocorrem nos túbulos renais, sendo que a rota de transporte pode ocorrer tanto pela via transcelular como paracelular (Li et
al., 2011). Assim, as JO também se destacam na função de manutenção de uma barreira
seletiva ao longo dos néfrons, uma vez que as claudinas são as principais determinantes da permeabilidade e seletividade dos diferentes segmentos dos néfrons (Li et al., 2011; Yu, 2015). Portanto, disfunções nestas estruturas podem levar ao desenvolvimento de doenças renais, como é o caso da Hipomagnesemia Familiar associada à hipercalciúria e nefrocalcinose. Esta é uma rara doença renal autossômica recessiva, causada por mutações nos genes para as claudinas-16 e -19, caracterizada pela perda de magnésio, hipercalciúria e nefrocalcinose, com tendência a desenvolvimento de insuficiência renal (Arteaga et al., 2015).
1.2 Função Renal e Barreira Epitelial mediada pelas junções de oclusão
A principal função renal é filtrar o sangue, o qual é suprido pelas artérias renais, de forma que todo o volume sanguíneo corpóreo passa pelos rins a cada 5 minutos. Por meio deste processo, compostos nitrogenados e outros restos metabólicos são removidos do sangue. Além disso, o rim atua no equilíbrio da concentração de fluidos corpóreos e eletrólitos, e na reabsorção de pequenas moléculas (glicose, aminoácidos e peptídeos), íons e água do filtrado renal, mantendo assim a homeostasia hidro-eletrolítica corporal (Kierszembaum & Tres, 2012).
Anatomicamente, os rins apresentam-se em formato de feijão, sendo macroscopicamente divididos em duas regiões: córtex, a região mais externa, e a medula, que é a região central. A medula, por sua vez, é subdividida em medula externa
e interna, sendo que esta última se projeta em direção ao cálice renal formando a região da papila renal (Junqueira & Carneiro, 2008). O componente principal do parênquima renal é o néfron, o qual é considerado a unidade morfofuncional do rim. Os néfrons são subdividos nos seguintes segmentos: o corpúsculo renal, o túbulo contorcido proximal (TCP), a alça de Henle, e o túbulo contorcido distal (TCD) (Junqueira & Carneiro, 2008). Cada segmento do néfron desempenha um papel no processo de formação da urina. O segmento terminal do néfron, o TCD, desemboca no túbulo/ducto coletor que tem origem embrionária distinta da do néfron e é responsável exclusivamente pela concentração da urina recém-formada (Junqueira & Carneiro, 2008; Little & McMahon 2012).
A barreira epitelial é crítica na função renal, que envolve filtração do sangue, bem como na reabsorção de solutos filtrados e água, e na secreção de íons e moléculas, processos esses que culminam na formação da urina (Kiuchi-Saishin et al., 2002; Reyes
et al., 2013). Além das células propriamente ditas e de seus transportadores/carreadores
de membrana que controlam o transporte transcelular, as JOs são elementos importantes da barreira epitelial, determinando a permeabilidade paracelular. Sabe-se que as proteínas juncionais, tais como os subtipos de claudinas, são expressas em diferentes graus e combinações em cada segmento, portanto com uma distribuição específica e diferencial, levando a variações na permeabilidade paracelular entre as diferentes porções do néfron (Reyes et al., 2013; Wilmes et al., 2014). A seguir (Figura 2), tem-se a descrição da estrutura e funções de cada segmento do néfron e túbulo coletor bem como o papel da JO determinando a permeabilidade paracelular nesses segmentos.
Figura 2: Esquema do rim em secção longitudinal, e detalhe do néfron. A: observa-se a topografia geral do órgão com localização cortical e medular dos componentes renais; B: Detalhamento da estrutura do néfron, com os túbulos e o glomérulo. C: Secção histológica de rim de coelho corado em Hematoxilina e Eosina. Legenda: P: Túbulo contorcido proximal; D: túbulo contorcido distal; G: glomérulo. A e B- Adaptado de Junqueira & Carneiro (2008).
O corpúsculo renal é composto pelo glomérulo, um emaranhado de alças de capilares fenestrados, e pela cápsula de Bowman, a qual possui dois folhetos, um externo (o parietal) que delimita o corpúsculo renal, e o interno ou visceral. Entre estes folhetos, há o espaço capsular, que recolhe o ultrafiltrado glomerular (Junqueira & Carneiro, 2008). A rede capilar glomerular é formada a partir da capilarização da arteríola aferente, a qual penetra o corpúsculo renal através do seu pólo vascular. As células glomerulares endoteliais são fenestradas, apresentando poros de 50 a 80 nm, e, na superfície luminal, tais células são revestidas por um glicocálice constituído por proteoglicanos e glicosaminoglicanos, que mantém a carga negativa nesta superfície. Tais capilares são envoltos por células epiteliais altamente modificadas do folheto visceral, denominadas podócitos, cujo citoplasma emite prolongamentos primários e secundários que se apoiam sobre a lamina basal situada entre estes e a superfície externa dos capilares. Os prolongamentos de podócitos adjacentes são conectados por junções intercelulares modificadas (Maezawa et al., 2015). Durante a diferenciação dos
podócitos, complexos juncionais apicais inicialmente presentes desaparecem, sendo substituídos por uma estrutura denominada diafragma da fenda de filtração, o qual é composto por proteínas juncionais exclusivas, como a nefrina e a podocina, e por proteínas comuns às JA e JO de outros epitélios como a P-caderina, β-catenina e ZO-1 (Itoh et al., 2014). O conjunto das lâminas basais (membrana basal), o glicocálice endotelial e o diafragma constituem os componentes principais da barreira de filtração glomerular (Junqueira & Carneiro, 2008; Chen et al., 2014). Esta barreira determina quais constituintes plasmáticos serão filtrados para formar o ultrafiltrado glomerular (Kierszembaum & Tres, 2012).
O ultrafiltrado glomerular, uma vez formado, é escoado para os segmentos restantes do néfron onde será processado para a formação da urina. No túbulo contorcido proximal, ocorre a reabsorção de grande parte dos elementos do ultrafiltrado (Junqueira & Carneiro, 2008; Kierszembaum & Tres, 2012). Os túbulos são revestidos por células especializadas na reabsorção e secreção. A reabsorção nos túbulos renais obedece à diferença de concentração das substâncias entre o espaço intersticial peri-tubular e os vasos retos periperi-tubulares. Cada segmento do néfron, bem como as células epiteliais presentes nestes, apresentam diferentes funções, o que possibilita que nas diferentes regiões, solutos, íons e água sejam reabsorvidos distintamente (Costanzo, 2007; Szaszi & Amoozadeh, 2014).
Nos túbulos contorcidos proximais, o epitélio constitui-se de células epiteliais cubóides unidas por junções de oclusão ricas em claudinas formadoras de poro (claudinas-2 e -10), permitindo a reabsorção isosmótica de 70% da água, do bicarbonato, e do cloreto de sódio, e também de íons cálcio e fosfato. Glicose, aminoácidos e íons são absorvidos por transporte ativo, enquanto que a água difunde-se passivamente pela via paracelular (Bulger & Dobyan, 1982; Junqueira & Carneio, 2008; Kierszembaum & Tres, 2012).
No caso da glicose, embora ocorra o cotransporte com sódio, conforme a concentração luminal do nutriente aumenta, acima da capacidade do mecanismo de absorção transcelular, uma porcentagem crescente será transportada pela via paracelular, possivelmente por um mecanismo semelhante ao observado durante o processo de absorção paracelular da glicose pelo trato intestinal (Madara, 1989).
A alça de Henle, na sua porção descendente, é permeável à água e NaCl, sendo que o fluido intersticial, presente entre o espaço peri-tubular e os vasos peritubulares, é hiperosmótico em relação ao filtrado presente no túbulo. Desta forma origina-se um
gradiente de concentração que permite a entrada de NaCl e água de forma passiva na porção descendente. Quando o líquido filtrado chega na porção ascendente da alça de Henle, não ocorre reabsorção de água, uma vez que o epitélio é impermeável. Mas o epitélio dessa porção transporta ativamente NaCl para o interstício renal contribuindo para a hiperosmolaridade medular renal (Kierszembaum & Tres, 2012).
Na porção descendente delgada da alça de Henle, as JO permitem a passagem de cátions como o sódio (Na+), o magnésio (Mg2+) e o cálcio (Ca2+) (Kiuchi-Saishin et al., 2002; Li et al., 2011; Szaszi & Amoozadeh, 2014). A claudina-2 proporciona a formação de poros seletivos a cátions como o Na+, e acreditase que as claudinas16 e -19 sejam as principais responsáveis pelo transporte de Mg2+ e o Ca2 através do epitélio tubular da alça (Li et al., 2011). Embora também existam evidências do papel da claudina-14, interagindo com o complexo claudina-16/19, e regulando negativamente a reabsorção de cátions divalentes no ascendente espesso da alça de Henle (Hou et al., 2013).
Forma-se assim um fluido hiposmótico que chega ao túbulo contorcido distal, o qual ajusta a composição iônica da urina na porção final do néfron. No TCD, ocorre reabsorção de sódio pela via transcelular e secreção de potássio e H+, assim é formado o gradiente de concentração transtubular para estes íons. Nestes segmentos, a via paracelular é pouco permeável, uma vez que conta com claudinas que formam barreira a íons (claudinas-1, -3, -11 e 14) (Li et al., 2011; Kiuchi-Saishin et al., 2002; Szaszi & Amoozadeh., 2014; Yu, 2015). Quando a urina hiposmótica chega ao ducto coletor, que é moderadamente permeável à água (na presença do hormônio anti-diurético, ADH) e uréia, ocorre o processo de concentração da urina (Junqueira & Carneio, 2008; Kierszembaum & Tres, 2012).O ducto coletor apresenta junções ricas em claudinas formadoras de barreira (a saber, claudinas-1, -3, -4, -8, -7, -16 e -19), ou seja, que tornam o epitélio mais impermeável e com uma Rt mais alta, em relação a outras regiões dos túbulos renais.
Como relatado anteriormente, é notória a importância das junções de oclusão formando a barreira paracelular para a funcionalidade dos rins, de forma que alterações nesta barreira podem afetar a eficiência do processo de transporte tubular, levando a passagem do filtrado para a região basolateral ou absorção reduzida de íons específicos e solutos (Szaszi & Amoozadeh, 2014). O papel crucial das JOs na função renal é ainda mais evidente pelas recentes descobertas mostrando direta associação entre o
comprometimento das JOs e o desenvolvimento de doenças renais hereditárias ou não. Além da doença congênita anteriomente mencionada, a Hipomagnesemia Familiar associada a hipercalciúria e nefrocalcinose, tem sido descrito que a ocorrência de polimorfismos na claudina-14 estão associados ao maior risco de ocorrência de pedra nos rins (ou nefrolitíase). Adicionalmente, experimentos utilizando modelos animais
knockout ou transgênicos indicam que deficiências na função da claudina-7 levam a
perda renal de NaCl e desidratação crônica (Li et al., 2011; Tatum et al., 2010; Yu, 2015).
1.3 Diabetes Melito tipo 2 e a Nefropatia Diabética
Disfunções renais podem se desenvolver em casos de doenças metabólicas como é o caso da Nefropatia Diabética (resultante de um quadro descompensado de Diabetes Melito). A patogenia dessa doença renal não está totalmente elucidada (Siddiqi & Advani, 2013) e o possível papel da barreira epitelial, mediada pelas JOs, no seu desenvolvimento permanece ainda pouco explorado (Hou et al., 2013).
A Diabetes Melito é uma doença endócrina-metabólica, cujos sintomas são ocasionados pela completa ou parcial insuficiência de secreção de insulina, bem como da sua ação em tecidos/órgãos, tais como figado, rim, músculo esquelético e tecido adiposo (Tripathy & Chaves, 2010; Wu et al., 2014). Existem duas formas de diabetes, o tipo 1, conhecido como Diabetes Mellito dependente de insulina e o tipo 2. Estima-se que 90 a 95% dos pacientes diabéticos apresentem Diabetes do tipo 2 (Wu et al., 2014).
Dentre os fatores predisponentes da Diabetes Mellito tipo 2 (DMT2) estão os genéticos, e principalmente os ambientais, tais como obesidade e sedentarismo acompanhados de dietas com alto teor de gorduras e carboidratos, os quais podem ser críticos no desenvolvimento da doença (Tripathy & Chaves, 2010; Lee et al., 2013).
Sabe-se que a DMT2 é uma doença progressiva, cujo desenvolvimento depende muito do estado funcional das células β pancreáticas produtoras de insulina, de forma que durante o processo ocorre o contínuo declínio das funções destas células (Kahn et
al., 2006; Carvalho et al., 2012). Inicialmente, observa-se hiperglicemia associada à
resistência periférica a insulina, que são disfunções parcialmente compensadas pela hiperfunção secretora seguida de hiperplasia das células β. A DMT2 desenvolve-se apenas em indivíduos incapazes de manter a resposta compensatória da célula (e portanto a normoglicemia), de forma que em longo prazo, com a redução da
funcionalidade e da massa de células β, o indivíduo torna-se dependente de tratamento de insulina exógena (Prentki & Nolan, 2006; Carvalho et al., 2012). Uma vez que a hiperglicemia esteja estabelecida, processos como glicotoxicidade e inflamação das ilhotas, com consequentes danos celulares, resultam em apoptose das células β (Prentki & Nolan, 2006).
A resistência periférica à insulina (RI) é um dos principais sinais desencadeadores da DMT2, uma vez que a ação da insulina nos tecidos periféricos encontra-se comprometida, afetando assim a absorção de glicose pelo músculo, e ocorrendo também aumento da produção endógena de glicose pelo fígado (Castro et al., 2014; Tangvarasittichai, 2015). No caso de indivíduos obesos, além da hiperglicemia, o metabolismo alterado de ácidos graxos está relacionado ao desenvolvimento da RI. A concentração plasmática aumentada, bem como a redução no metabolismo intracelular dos ácidos graxos, ocasionam aumento do conteúdo intracelular de metabólitos destes componentes. Esses metabólitos, por sua vez, ativam cascatas de sinalização intracelular resultando em fosforilação de serina/treonina nos receptores de insulina em tecidos periféricos como o muscular e o hepático, o que reduz a funcionalidade destes receptores (Prentki & Nolan, 2006). Estudos in vitro indicam que ácidos graxos não esterificados podem alterar a função da célula β (Kahn et al., 2006). El-Assaad e colaboradores (2003) relataram que ácidos graxos saturados como o ácido palmítico, em concentrações fisiológicas altas (0,4 mM), mostraram toxicidade a células derivadas de ilhotas humanas. Sabe-se que o ácido palmítico é um dos ácidos graxos cujos níveis estão elevados em indivíduos obesos e com DMT2 (Manukyan et al., 2015).
Adicionalmente, os ácidos graxos também interferem no balanço da insulina plasmática. Sabe-se que a remoção da insulina ocorre por meio da absorção e degradação em órgãos como o fígado, no qual este processo é mediado por receptores. O aumento de ácidos graxos induz redução na função destes receptores, influenciando no processo de degradação do hormônio, agravando assim a hiperinsulinemia (Castro et
al., 2014).
O indivíduo diabético pode, ao longo da vida, apresentar várias doenças decorrentes da diabetes, destacando-se doenças cardiovasculares, doença retinal e disfunções renais (Persson et al., 2010; Kowalski et al., 2014). Dentre as complicações renais, o desenvolvimento da nefropatia diabética tem se destacado, sendo que em 38% dos casos esta é atribuída à DMT2 (Kowalski et al., 2014). A disfunção renal é uma complicação comum da diabetes tipo 2, que pode levar, em último grau, à doença
terminal renal, que geralmente exige realização de hemodiálise e, em última instância, o transplante renal (Kowalski et al., 2014).
A nefropatia diabética (ND) é caracterizada morfologicamente, principalmente em casos de diabetes tipo 1, pelo espessamento da membrana basal glomerular, acúmulo de matriz extracelular (colágeno, fibronectina) e expansão das células mesangiais acompanhados por mudanças morfológicas nos interstícios renais, o que pode configurar a ocorrência de fibrose glomerular. Porém, apenas uma minoria de indivíduos com diabetes tipo 2 apresenta aspectos histopatológicos similares às lesões típicas observadas em pacientes de diabetes tipo 1 (Zelmanovitz et al., 2009).
Linhagens celulares de podócitos cultivadas em altas concentrações de glicose apresentaram produção aumentada de espécies reativas de oxigênio (ROS), o que resulta em ativação de vias apoptóticas, podendo levar à redução do número de podócitos no glomérulo, como constatado em experimentos realizados em camundongos (Chen et al., 2014). Sabe-se que a ocorrência de apoptose de podócitos em modelos in vivo é um dos preditos na progressão da ND (Susztak et al., 2006).
Há relatos na literatura sobre o efeito da hiperglicemia na função da barreira de filtração glomerular, como um dos fatores que levam à ND em camundongos (Siddiqi & Advani, 2013). Sabe-se que eventos de hiperglicemia aguda podem estar relacionados ao desenvolvimento de microalbuminuria, que é a primeira evidência clínica da ND, previamente à ocorrência de alterações estruturais (Molitch et al., 2004; Swärd & Rippe, 2012). Axelsson e colaboradores (2010) demonstraram ocorrência de aumentos reversíveis na permeabilidade glomerular devido a hiperglicemia aguda em ratos não diabéticos, sendo isto relacionado a alterações no citoesqueleto contrátil de F- actina das células da barreira de filtração glomerular (podócitos e células endoteliais). Com base nestas evidências, sugere-se que, em indivíduos diabéticos cujas taxas glicêmicas não são controladas, a ocorrência de microalbúminuria possa ocorrer mesmo antes do aparecimento de alterações estruturais na barreira de filtração glomerular (Axelsson et
al., 2010).
A hiperglicemia pode também induzir a formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs, Advanced Glycation End-products); este processo ocorre devido a formação de compostos carbonila oriundos do metabolismo da glicose, os quais interagem com grupos amino de proteínas, dando origem às proteínas glicadas (D’Angelo et al., 2001; Miyata et al., 1998). Tais proteínas são instáveis, dando origem aos AGEs. A presença de AGEs induz modificações na estrutura e função de proteínas
teciduais, estimulando também respostas celulares, tais como a síntese de citocinas (Miyata et al., 1998; Hamada et al., 1996). Há evidências indicando que a formação de AGEs é um dos principais fatores relacionados a patogênese da ND; além disso foram detectados metabólitos de AGEs nos túbulos proximais, sendo que estes componentes tem um efeito apoptótico mais potente em relação concentrações elevadas de glicose (25 mM/L) (Franko et al., 2014).
De acordo com revisão de Gilbert & Cooper (1999), perturbações na via metabólica da glicose, podem também influenciar o comportamento das células tubulares renais. Ziyadeh e colaboradores (1990) relataram que células epiteliais dos túbulos proximais de camundongos expostas in vitro a alta concentração de glicose (450 mg/dl) tornaram-se levemente maiores, e apresentaram secreção proteica aumentada de precursores do colágeno tipo I e IV, o que pode explicar, pelo menos parcialmente, o espessamento da membrana basal nos interstícios, frequentemente observado em casos de modelos in vivo de diabetes (Gilbert & Cooper, 1999). Em ratos diabéticos, além do aumento de glicose no plasma e no fluido intersticial, o excesso de glicose no filtrado glomerular leva a maior reabsorção de glicose nos túbulos proximais, além disso, em ratos tratados com estreptozotocina, ocorre também aumento da atividade do transportador de glicose GLUT-5 (Gilbert & Cooper, 1999).
Outro fator de risco ao desenvolvimento da ND são as dislipidemias. Estudos têm demonstrado (Ravid et al., 1995; Nosadini & Tonolo, 2011) uma correlação entre aumento dos valores plasmáticos de colesterol e declínio da função renal (comprometimento da função glomerular, com resultante albuminúria) em pacientes diabéticos. Tem sido sugerido que dislipidemias, em conjunto com condições de hiperglicemia e hipertensão arterial, levam a danos severos nos podócitos, comprometendo a barreira de filtração e resultando em albuminúria (Nosadini & Tonolo, 2003). Lennon e colaboradores (2009) analisaram o efeito in vitro da exposição de podócitos ao ácido graxo palmitato durante 24h, e detectaram a ocorrência de redução na captação de glicose, caracterizando uma resistência à insulina também nestas células. Adicionalmente, Katsoulieris e colaboradores (2010) mostraram que a exposição in vitro a concentrações fisiológicas de ácido palmítico (50 a 300 µmol/L) induz estresse oxidativo e estresse do retículo endoplasmático em linhagem de células tubulares proximais (NRK- 52E).
Sabe-se também que lipoproteínas ricas em triglicerídeos podem levar à ativação da via do TGF-β, o que pode acarretar a produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) com dano glomerular. Tal fator também induz deposição de matriz no interstício tubular em diabéticos com dislipidemias (Chen & Tseng, 2013).
Portanto, conforme relatado anteriormente, a maioria dos trabalhos estudando os mecanismos celulares e teciduais envolvidos na nefropatia diabética enfocam o papel do comprometimento da barreira de filtração glomerular e a importância da hiperglicemia e dislipidemia nesse processo. Entretanto, estudos sobre a possível repercussão tubular renal nessa disfunção são raros. Ainda, de acordo com o nosso conhecimento, estudos
in vitro envolvendo a ação direta de altas concentrações de glicose e ácido graxos sobre
2. OBJETIVOS E RELEVÂNCIA
O objetivo geral da presente Dissertação de Mestrado foi investigar a possível modulação da barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão pela exposição in
vitro a altas concentrações de glicose e ácido palmítico em células epiteliais tubulares
renais. Com isto, objetivamos testar a hipótese desse trabalho de que componentes, que estão reconhecidamente alterados sistemicamente durante a pré-diabetes/DMT2, como o nível plasmático de glicose e ácidos graxos (Carvalho et al., 2012; Castro et al., 2014; Prentki & Nolan, 2006), podem interferir na barreira paracelular mediada pela JO no epitélio tubular renal, e tais alterações poderiam direta e/ou indiretamente repercutir na evolução da ND.
Para tanto, utilizamos a linhagem de células epiteliais Mardin Darbin Canine Kidney (MDCK), derivada de células do rim de cão. A linhagem MDCK tem sido amplamente utilizada em experimentos sobre barreira epitelial, por estabelecer monocamadas polarizadas e com junções intercelulares bem desenvolvidas, expressando claudinas-1, -2, -3, -4, ocludina e ZO-1 (Collares- Buzato et al., 1998; Peixoto & Collares- Buzato, 2005; Milatz et al., 2010; Dukes et al., 2011; Szaszi & Amoozadeh, 2014).
Para análise da função de barreira epitelial renal, foram empregados métodos eletrofisiológicos e bioquímicos. A medida de resistência elétrica transepitelial (Rt) é um método amplamente utilizado que permite a análise da integridade elétrica da barreira epitelial in vitro (Srinivasan et al., 2015). A integridade da barreira paracelular a moléculas foi avaliada através da medida do fluxo transepitelial de Phenol red (100 uM).
Para análise dos aspectos estruturais/bioquímicos das JO, foram realizadas técnicas de imunocitoquímica para localização celular de proteínas juncionais, e de biologia molecular (Western Blot) para determinar o grau de expressão proteica dessas proteínas. As proteínas analisadas foram as claudinas-1, -2, e -3, ocludina, e ZO-1. As claudinas-1 e -3, bem como a ocludina são proteínas estruturais das junções de oclusão que definem o grau de permeabilidade enquanto que a claudina-2 forma canais altamente seletivos a cátions (Furuse et al., 1998; Van Itallie et al., 2008; Chiba et al., 2008; Rossa et al., 2012).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Cultura Celular
A linhagem celular MDCK (Mardin Darbin Canine Kidney), derivada de células tubulares renais caninas, foi obtida do Instituto Adolfo Lutz (São Paulo, SP). As células foram cultivadas em frascos estéreis em Meio Essencial Mínimo (MEM, Cultilab, Campinas, São Paulo), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de solução de penicilina (1000 UI/mL) e estreptomicina (10 μg/L) (Cultilab, Campinas, São Paulo), a 37ºC em atmosfera úmida com 5% CO2 (Incubadora Incusafe Sanyo
MCO-17A, Sanyo Eletric Ltd., Japão). O meio de cultura foi trocado a cada 48h, e as células foram repicadas e as passagens de células feitas semanalmente.
Para experimentação, as células foram cultivadas em suportes com membrana permeável de Poliestireno (Millicell Culture Plate Inserts, 12 ou 30 mm de diâmetro), os quais foram colocados dentro dos poços de placas estéreis para cultura (Placa de 6 well Nest Biotech Co. Ltd, China) As células foram cultivadas em densidade média de 0,6 x 106 células por cm2 de substrato, por 3 a 4 dias, quando atingiam confluência.
3.1.1. Tratamento das membranas Millicell com colágeno
Para a completa adesão das células na membrana permeável (Millicell), tratou-se o substrato com colágeno extraído de caudas de ratos Wistar, os quais foram obtidos por doação (Quaroni et al., 1979). Para tal, realizou-se a extração das fibras de colágeno dos tendões da cauda com auxílio de material cirúrgico, previamente esterilizado em autoclave.
Em seguida, as fibras foram mantidas por 24h em fluxo laminar para secagem e esterilização sob luz UV (20 minutos). Posteriormente, as fibras foram dissolvidas em solução de ácido acético glacial 1% (P.A., Synth; em água deionizada estéril), na proporção de 3,3 mg fibras/mL de solução de ácido acético, sob agitação constante durante 48h, à temperatura de 4°C. Após centrifugação para obtenção de sobrenadante (5000 rpm, durante 30 minutos a 4°C), o mesmo foi mantido assepticamente sob refrigeração. Para o tratamento das membranas com tal solução, diluiu-se na proporção de 1:3 em etanol 60%, e adicionou-se 0,5 mL dessa solução diluída de colágeno aos suportes pequenos e 2,0 mL, aos insertos grandes. Para secagem e esterilização, manteve-se os filtros em placas de 6 poços no interior do fluxo laminar ligado, durante
24h, seguida de exposição à luz UV durante 20 minutos. Os filtros foram acondicionados em recipientes estéreis até o seu uso.
3.2. Tratamentos
As monocamadas celulares cultivadas nos suportes foram expostas aos tratamentos, descritos a seguir, em ambos os lados (apical e basolateralmente) durante 72h, com o objetivo de analisar a ação de tais componentes sobre a barreira epitelial tubular renal. As monocamadas em experimentação tiveram o meio de cultura (controle e os contendo os componentes testados) trocado a cada 24h.
3.2.1. Exposição à Glicose e Ácido Palmítico
As células da linhagem celular renal foram cultivadas em meio de cultura como descrito no item 3.1. Para o procedimento experimental, o meio foi retirado e as monocamadas foram expostas a diferentes concentrações de glicose diluída em MEM sem suplementação. Para obter as soluções de glicose, acrescentou-se este componente nas concentrações de 80 mg/dL e 260 mg/dL a fim de se obter as concentrações finais de 180 mg/dL (10 mmol/L) e 360 mg/dL (20 mmol/L), uma vez que este meio já contém glicose na concentração de 5,5 mmol/L (100 mg/dL). A concentração de glicose correspondente ao grupo controle (100 mg/dL) refere-se à condição de normoglicemia, enquanto a concentração intermediária corresponde ao estado de pré-diabetes, com hiperglicemia moderada, e a concentração mais elevada, representa uma condição de hiperglicemia em estado diabético descompensado (Matthews et al., 1985; OMS, 2006). Para a diluição da glicose na solução tampão Krebs-Bicarbonato (solução utilizada para realização do experimento de fluxo transepitelial, item 3.4), acrescentou-se o monossacarídeo nas concentrações de 100 mg/dL, 180 mg/dL e 360 mg/dL.
Para a exposição das células ao ácido palmítico nas concentrações de 200 μM e 400 μM (Allagnat et al., 2008; Duizer et al., 1998), preparou-se uma solução-estoque na concentração de 200 mmol/L em Dimetil Sulfóxido – DMSO (Amrisco). Em seguida, adicionou-se uma alíquota da solução-mãe do ácido graxo em meio de cultura MEM, não suplementado, para obtenção das diferentes concentrações (1:1000 - 200 μM e 1:500 - 400 μM), às quais as células foram expostas. Para a solução controle, o componente DMSO foi diluído na mesma proporção que o ácido palmítico foi diluído na maior concentração (1:500).
Para a diluição do ácido palmítico no meio de cultura, e obtenção das concentrações finais, visto que tal ácido graxo é insolúvel em água, o meio foi aquecido a 37°C, e a alíquota da solução-mãe foi adicionada, em seguida as soluções finais foram sonicadas (Sonicador Virsonic 60 Virtis, The Virtis Company, Inc. N.Y) e filtradas para posterior adição às células.
As concentrações e tempo de exposição dos ácidos graxos a serem testados estão abaixo das dosagens com reconhecida ação citotóxica (Nano et al., 2003; Zucco et al., 2005; Allagnat et al., 2008), mas estão dentro das concentrações plasmáticas reportadas para indivíduos obesos e/ou diabéticos (Dole et al., 1956; Trombetta et al., 2013).
Além disso, a fim de verificar a eficiência dos métodos utilizados nos experimentos, as monocamadas foram submetidas a um tratamento com EGTA (Ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetra acetic acid), substância que atua como quelante de cálcio e interfere na estrutura juncional resultando em comprometimento da barreira epitelial (Collares-Buzato et al., 1994).
3.3. Integridade elétrica da barreira epitelial
A medição da resistência elétrica transepitelial (Rt) foi efetuada para análise da integridade da barreira epitelial in vitro da linhagem celular, antes, durante (24h e 48h) e ao final do período (72h após o início) no qual as condições experimentais foram testadas. Para tal, as monocamadas foram cultivadas em suporte com 12 mm de diâmetro. A Rt foi medida utilizando-se um voltímetro acoplado a um sistema de corrente constante com dois eletrodos Ag/AgCl (EVOM, World Precision Instruments, Hemel Hempstead, UK) (Collares-Buzato et al., 1998). Tal equipamento tem sido amplamente utilizado em experimentos envolvendo integridade de barreira epitelial (Peixoto & Collares-Buzato, 2005; Peixoto & Collares-Buzato, 2006; Markowska et al., 2001; Tran et al., 2013). A Rt reflete a condutância iônica da via paracelular em monocamadas epiteliais. É um método não invasivo, permitindo assim monitorar células vivas durante seus vários estágios de crescimento e diferenciação (Srinivasan et
al., 2015).
A Rt foi inicialmente aferida com o eletrodo no suporte contendo a monocamada,
e também foi realizada uma medida em um suporte sem células. O valor obtido da medida das células foi subtraído do valor obtido do suporte sem células (Rt=(Rsc -
Os valores de Rt obtidos ao longo das 72h foram expressos como porcentagem a
partir do valor inicial (0h) de cada monocamada, ou seja a Rt coletada antes do início
dos tratamentos com as células. Esta porcentagem foi apresentada como gráfico, expressando o aumento ou diminuição da Rt que as células tiveram em relação ao valor
inicial.
3.4. Fluxo transepitelial com marcadores extracelulares
A análise do fluxo transepitelial foi efetuada para se avaliar o grau de permeabilidade da barreira epitelial paracelular a moléculas, utilizando-se o marcador extracelular Phenol red (357 KDa) (Sigma). O fluxo transepitelial de traçadores é um indício do fluxo paracelular de água e também do tamanho de poro das junções de oclusão (Srinivasan et al., 2015). Após o período de tratamento de 48h, o suporte (de 30mm de diâmetro) contendo a camada celular foi transferido para uma placa de 6 poços com solução de Krebs-bicarbonato estéril (composição em mM: NaCl 112, KCl 5, MgCl 1, CaCl 25, NaHCO3 1, HEPES 15; pH=7,4), com a adição ou não da
substância testada (glicose ou ácido graxo), e contendo Phenol red na concentração de 100 μM (na região basal da monocamada). O meio apical foi também substituído por uma solução de Krebs-bicarbonato idêntica àquela adicionada no lado basal, mas sem adição de Phenol red. Realizou-se uma incubação de até 24 horas a 37ºC, após a qual foram coletadas alíquotas da solução da região apical e basal da monocamada. A medida de absorbância foi feita com auxílio de um leitor de microplaca (Power Wave, Biotek Instruments, U.S.A) nos comprimentos de onda 494 para Phenol red. O fluxo do marcador foi expresso como porcentagem da média de absorbância do grupo controle (considerado como fluxo 100%). O Phenol red é um soluto hidrofílico de 357 KDa que atravessa o epitélio apenas pela via paracelular, seguindo um gradiente de concentração e que permite verificar o aumento ou redução da permeabilidade transepitelial, sugerindo o comprometimento funcional das JO (Clarke, 2009).
Os valores de fluxo transepitelial (Ft) foram calculados de acordo com a fórmula a seguir: Ft= (A/A+B)*100; sendo A, absorbância da solucão apical e B, absorbância da solucão basolateral obtidas ao final do experimento.
3.5. Avaliação da distribuição celular de proteínas constituintes da junção de oclusão
Para a avaliação dos possíveis efeitos dos tratamentos na distribuição de proteínas juncionais foram realizadas técnicas de imunocitoquímica nas monocamadas de MDCK.
Após período de tratamento, as monocamadas foram fixadas e permeabilizadas em metanol -20 °C para a técnica de imunocitoquímica, e desta forma mantidas a -20°C até o momento da realização da reação. Posteriormente, as monocamadas foram lavadas em PBS (Tampão fosfato-salino, pH 7,4 a 4°C), e para imunodetecção da proteína ZO-1 e ocludina, realizou-se um procedimento de permeabilização da monocamada previamente a realização da técnica de imunocitoquímica, para isto utilizou-se Triton 0,1% (diluído em PBS), que foi adicionado as monocamadas durante 10 minutos à TA. Em seguida as monocamadas foram incubadas com uma solução bloqueadora, consistindo de PBS contendo 3% de SFB, por 30 minutos à temperatura ambiente (TA), e posteriormente foram incubadas com um dos anticorpos primários listados na Tabela II (diluídos em PBS contendo 3% de SFB), durante aproximadamente 12h a 4°C em câmara úmida. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS e incubadas por 1h à TA com anticorpo secundário especifico conjugado com FITC (Tabela II, diluição em PBS+1% SFB contendo DAPI (Sigma)numa diluição 1:1500 ou TO-PRO (Invitrogen) - 1:1000). Após lavagem com PBS, as monocamadas foram montadas em lamínulas com meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) e mantidas a -20° C até o momento da análise em microscopia de varredura confocal a laser (Leica TCS SP5 II) junto ao LaCTAD/UNICAMP ou microscópio de fluorescência (Observer.Z1; Zeiss - Axio Cam MRC, Hamburg – Alemanha) do Laboratório de Genômica e Proteômica (IB- UNICAMP).
A distribuição celular e o grau de fluorescência (que dá indício do conteúdo celular) das proteínas juncionais foram analisados nas imagens obtidas por microscopia de fluorescência, com o auxílio do programa Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para tal, foram amostrados de 5 a 6 campos aleatórios por monocamada para cada proteína juncional analisada. Nessas imagens, foi feita a medida de densidade integrada (em pixels) de 60 pontos (posicionados na região de contato intercelular) em cada imagem, por meio da ferramenta “multi-point” do Image J. Para permitir comparação entre os grupos quanto ao grau de fluorescência, a imunocitoquímica, bem como a coleta de imagens. foram executadas em monocamadas de todos os grupos experimentais no mesmo dia e na mesma sessão de análise.
Tabela II: Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais e anticorpos secundários policlonais utilizados para a detecção das proteínas por meio da técnica de imunofluorêscencia indireta.
Primário Secundário
Anti-Claudina-1 (ABCam) 1:50 Anti-rabbit IgG FITC Sigma 1:100
Anti-Claudina-2 (ABCam) 1:50 Anti-rabbit IgG FITC Sigma 1:200
Anti-Claudina-3 (ABCam) 1:100 Anti-rabbit IgG FITC Sigma 1:200
Anti-Ocludina (Invitrogen) 1:50 Anti-mouse IgG FITC Sigma 1:100
Anti-ZO-1 (Invitrogen) 1:50 Anti-rabbit IgG FITC Sigma 1:100
3.6. Western Blot para as proteínas juncionais
A metodologia de Western Blot foi desenvolvida no presente estudo com o intuito de analisar o nível de conteúdo celular total das proteínas de interesse nas células da linhagem MDCK. Para obtenção das células, as mesmas (cultivadas em suporte de 30mm de diâmetro) foram lavadas com PBS gelado e coletadas com o auxílio de um cell scrapper, após período de experimentação, e lisadas com o auxílio de um sonicador em coquetel anti-protease (composição: 10 mM imidazol pH 7,4; 4 mM EDTA; 1 mM EGTA; 200 μM DTT; 0,5 μg/mL pepstatina; 200 KIU/mL aprotinina; 200 μM fenilmetilsufonilfluoreto; 2,5 μg/mL leupeptina e 30 μg/mL inibidor de tripsina). A quantificação de proteínas totais nos homogeneizados foi feita através do método de Bradford, utilizando o reagente da Bio-Rad (Hercules, CA - USA). Alíquotas contendo 20 μg de proteína total foram incubadas por 1h a 37°C com 30% em volume de tampão amostra Laemmli (5x concentrado, composição: Fosfato de sódio, água deionizada, Dodecilsulfato de Sódio, Azul de Bromofenol 0,1% em água deionizada e glicerol) (Peixoto & Collares-Buzato, 2006) e em seguida, aplicada em gel de acrilamida de 6,5% (para detecção de ZO-1), 10% ou 12% (para detecção das outras proteínas) (Peixoto & Collares-Buzato, 2005). Por meio de eletroforese, as proteínas foram, então, separadas e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). Em seguida, a membrana foi corada com solução Ponceau S (Sigma) para confirmação da adequada aplicação das amostras no gel e transferência das proteínas do gel para a membrana. Todas as membranas coradas foram fotografadas para registro.
Para detecção das proteínas juncionais de interesse, as membranas foram bloqueadas por 2h com TBS contendo 0,1% Tween 20 (TTBS) contendo 5% leite em pó desnatado e, em seguida, incubadas a 4°C por 12h com anticorpo primário (Tabela III) diluído em TTBS contendo 3% leite em pó desnatado (Molico). Após lavagens com
