Glicose

Como etapa integrante dos objetivos dessa dissertação, fomos investigar as possíveis alterações induzidas pelas concentrações elevadas de glicose (180 e 360 mg/dL) na função de barreira epitelial mediada pelas junções de oclusão em monocamadas de MDCK. Observou-se que, após 72h de exposição, a concentração de 180 mg/dL de glicose induziu redução (28%) significativa (P<0,05) na Rt, em relação ao controle, enquanto a concentração de 360 mg/dL induziu uma tendência de redução não estatisticamente significativa da Rt (22,4%) (P=0,2, teste t Student) (Figura 7a).

Em relação ao fluxo transepitelial de Phenol red (basalapical), não foi observada diferença significativa entre os grupos tratados e o controle (Figura 7b), embora a concentração de 360 mg/dL tenha induzido um aumento de 15,5% no Ft em relação às células controle (P=0,3, teste t Student).

Para analisar o efeito da glicose sobre a localização/distribuição e conteúdo

celular de proteínas juncionais, como claudina-1, -2, e -3, ocludina e ZO-1, realizou-se as técnicas de imunofluorescência indireta e Western blotting. A análise semi- quantitativa do grau de fluorescência das proteínas juncionais refere-se à análise em pontos (ver item 3.5) posicionados na região de contato intercelular apenas, sendo portanto, referente ao conteúdo juncional da proteína analisada.

A reação de imunofluorescência indireta para claudina-1 mostrou uma marcação em forma de linha contínua na região de contato intercelular (Figura 8a, b) tanto nas células do grupo controle como nas expostas a concentrações elevadas de glicose (180 e 360 mg/dL). Entretanto, a análise semi-quantitativa do grau de fluorescência da marcação revelou uma redução no conteúdo juncional de claudina-1 em células expostas a ambas as concentrações elevadas de glicose (Figura 8c, d, e, f), sendo tal redução estatisticamente significativa em relação ao controle (P<0,05) (Figura 8g). Porém, como mostra a Figura 8 (h e i), não foram detectadas alterações significativas do conteúdo celular total para essa proteína juncional após exposição à glicose em altas concentrações, como analisado por immunoblotting.

Em relação à imunofluorescência para claudina-2, observou-se similarmente à reação para claudina-1, uma marcação em forma de linha contínua na região de contato intercelular (Figura 9a e b) tanto nas células controle como naquelas do grupo tratado. Porém, por meio de análise semi-quantitativa do grau de fluorescência, detectou-se que a concentração de 180 mg/dL de glicose induziu aumento significativo no conteúdo

juncional desta proteína (P<0,05) (Figura 9c, d, g), enquanto células expostas a 360 mg/dL de glicose não apresentaram alteração significativa, em relação ao controle (Figura 9e, f, g). Por meio de Western blotting, não foi detectada alteração significativa de conteúdo celular de claudina-2 nas células expostas a concentrações elevadas de glicose, embora monocamadas expostas a 360 mg/dL tenham apresentado um aumento relativamente maior (P=0,09 teste t Student), porém não significativo(Figura 9h e i).

A reação para imunodetecção de claudina-3 revelou alterações similares às observadas com a claudina 1 após exposição das células MDCK às concentrações testadas de glicose. Pode-se observar tais alterações na (Figura 10b, d, f), sendo que estas foram estatisticamente significativas (P<0,05) (Figura 10g). A análise por

immunoblotting não revelou alterações significativas no conteúdo celular total de

claudina-3 nas células tratadas, em relação ao grupo controle (Figura 10h e i).

Em relação ao conteúdo juncional de ocludina detectado por imunofluorescência, não foram observadas diferenças significativas nas células MDCK expostas a 180 mg/dL de glicose (Figura 11c, d, g), enquanto foi observada uma redução estatisticamente significativa desse parâmetro (P< 0,05) nas células expostas por 3 dias a 360 mg/dL de glicose em relação ao controle (Figura 11b, f, g). Entretanto, não foram detectadas diferenças significativas no grau de expressão proteica de ocludina, nas células expostas a ambas as concentrações de glicose (Figura 11h e i).

A análise semi-quantitativa do grau de fluorescência da reação de imunofluorescência para ZO-1 indicou redução no conteúdo juncional de ZO-1 em monocamadas expostas a 180 mg/dL e 360 mg/dL de glicose (Figura 12b, d, e), sendo esta redução estatisticamente significativa (P<0,05) (Figura 12g). Já em relação ao conteúdo celular total de ZO-1, não foram detectadas alterações nas células expostas, relativamente ao grupo controle (Figura 12h e i).

Finalmente, a análise microscópica dos núcleos marcados com DAPI, nas células dos diferentes grupos experimentais, não mostrou alterações morfológicas indicativas de morte celular (como picnose ou corpos apoptóticos) após o tratamento crônico com altas concentrações de glicose.

Figura 7: Exposição de monocamadas de MDCK a elevadas concentrações de glicose (180 e 360 mg/dL) por 3 dias sobre a resistência elétrica transepitelial (Rt) (a) e fluxo transepitelial do marcador extracelular, Phenol red (b). Ambas as concentrações de glicose induziram uma diminuição da Rt, a qual foi estatisticamente significativa na concentração de 180 mg/dL (n=18/grupo de 5 experimentos independentes) (*P<0,05) (Teste Two Way ANOVA) (a). Valores de Rt foram expressos como média ± SEM da porcentagem em relação ao valor inicial (tempo 0). Nenhuma diferença significativa do Ft de Phenol red foi observada entre os grupos experimentais (b). Para o fluxo, os valores foram expressos como média ± SEM considerando-se como 100% a absorbância da solução inicialmente colocada na região basal das monocamadas, (contendo Phenol red). (n=14/grupo de 6 experimentos independentes).

Figura 8: Distribuição e conteúdo celular de claudina-1 em monocamadas de células MDCK controle e nasexpostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose por 3 dias. Foi realizada marcação com FITC (claudina-1 - verde) (a, c, e) e DAPI (azul - núcleo) (em b,d,f). É possível observar a localização intercelular dessa proteína nas monocamadas de células MDCK do grupo controle (Ct) (a) e nas dos grupos tratados (180 e 360 mg/dL glicose) ((c) e (e), respectivamente). Em g, tem-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-1 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores da densidade de pixels (fluorescência) para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Observou-se uma diminuição significativa no conteúdo juncional para claudina-1 em células MDCK após exposição à glicose (180 e 360 mg/dL) em comparação com o grupo controle (100mg/dL glicose) (n=4 monocamadas/grupo de 4 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para a análise de densidade de pixels, n=2100 (Ct) e n=2100 (Tratado). (***P<0,0001) (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni ). (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-1 em homogeneizados de células MDCK, revelada por Western Blot, não mostrou alterações marcantes deste parâmetro após exposição à glicose em relação ao grupo controle (h). A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- β-actina (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica das bandas, correspondentes à claudina-1, que foram normalizados considerando-se os valores da β-actina obtidos. Os resultados são representativos de 7 membranas de 6 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 9: Distribuição e conteúdo celular de claudina-2 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose por 3 dias. Foi realizada marcação com FITC (claudina-2 - verde) (a, c ,e), e DAPI (azul - núcleo) (em b,d,f). É possível observar a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a) e nas dos grupos tratados (180 e 360 mg/dL) ((c) e (e), respectivamente). Em g, tem-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-2 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores da densidade de pixels (fluorescência) para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos, sendo detectado aumento significativo do conteúdo juncional de claudina-2 em células expostas a 180 mg/dL de glicose, o que não foi observado em células expostas a 360 mg/dl de glicose (Figura g) (n=5 monocamadas/grupo de 4 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para a análise de densidade de pixels, n= 1860 (Ct) e n=1860 (Tratado). (***P<0,0001) (teste One Way ANOVA). (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-2 em homogeneizados de células MDCK, revelada por Western Blot, não indicou alterações significativas deste parâmetro após exposição à glicose em relação ao grupo controle (h). A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- β-actina (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica das bandas, correspondentes à claudina-2, que foram normalizados considerando-se os valores da β-actina obtidos. Os resultados são representativos de 6 membranas de 5 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA).

Figura 10: Distribuição e conteúdo celular de claudina-3 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose. Foi realizada marcação com FITC (claudina-3 - verde) (a,c, e), e DAPI (azul - núcleo) (em b,d, f). Observa-se a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a) e naquelas expostas às duas concentrações de glicose (c) e (e). Em g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-3 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores da densidade de pixels (fluorescência) para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa no conteúdo juncional de claudina-3 nas monocamadas expostas as duas concentrações elevadas de glicose, em relação ao controle (Figura g) (n= 3/grupo de 3 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para a análise de densidade de pixels, n= 1020 (Ct) e n=1020 (Tratado). (*P<0,05 e *** P<0,0001) (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni). (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-3, por imunoblotting em (h), não demonstrou alterações significativas para redução desta proteína (i) em relação ao grupo controle. A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- β- actina (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína claudina- 3, que foram normalizados considerando-se os valores da β-actina obtidos. Os resultados são representativos de pelo menos 5 membranas de 5 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 11: Distribuição e conteúdo celular de ocludina em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose. Foi realizada marcação com FITC (ocludina - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). É possível observar à localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a) e naquelas expostas às duas concentrações de glicose (c) e (e). Em g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para ocludina nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores da densidade de pixels (fluorescência) para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa no conteúdo juncional da proteína nas monocamadas expostas a 360 mg/dL glicose, em relação ao controle (n= 4/grupo de 4 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para a análise de densidade de pixels, n=1740 (Ct) e n=1740 (Tratado). (***P<0,0001) (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni). (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de ocludina, por

imunoblotting em (h) não demonstrou alterações significativas para redução desta proteína (i)

em relação ao grupo controle. A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- β-actina (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína ocludina, que foram normalizados considerando-se os valores da β- actina obtidos. Os resultados são representativos de pelo menos 6 membranas de 5 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 12: Distribuição e conteúdo celular de ZO-1 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 180 e 360 mg/dL de glicose. Foi realizada dupla marcação com FITC (ZO-1 - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). Pode-se observar a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a), e nas expostas às duas concentrações de glicose (c) e (e). Na Figura g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para ZO-1 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores de densidade de pixels para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa nas monocamadas expostas às duas concentrações de glicose em relação ao Controle (Fig g) (n=4/grupo de 3 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para análise de densidade de pixels, n=1620 (Ct) e n=1620 (Tratado).(***P<0,0001) (Teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni) (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de ZO-1 em (h), revelada por Western Blot, não demonstrou alterações significativas para esta proteína (i) em relação ao grupo controle. A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- β- actina (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína ZO-1, que foram normalizados considerando-se os valores da β-actina obtidos. Os resultados são representativos de 5 membranas de 3 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

4.3 Ácido Palmítico

As células MDCK foram expostas ao ácido palmítico, nas concentrações de 200 μM e 400 μM, para verificar a ocorrência de possíveis alterações na função de barreira epitelial mediada pelas JO, induzidas por este ácido graxo saturado nas células desta linhagem. As concentrações de 200 μM e 400 μM de ácido palmítico não induziram alterações significativas na Rt em relação às células controle. Sendo apenas observado um pequeno aumento de 24% na Rt em células expostas a 200 μM e de 12,5% em células tratadas com 400 μM de ácido palmítico (Figura 13a).

A análise de fluxo transepitelial com Phenol red (basalapical) foi realizada para verificar alterações na função de barreira paracelular em células tratadas com ácido palmítico (200 e 400 μM). Células expostas ao ácido palmítico (200 μM) durante 72h não apresentaram alteração significativa no Ft (5,8%), e o mesmo também ocorreu nas células expostas a concentração de 400 μM, embora tenha-se observado uma tendência de aumento no Ft (18%) com essa concentração de ácido palmítico em relação ao controle (P=0,06, teste t Student) (Figura 13b).

Assim como foi realizado com as células expostas a glicose, analisamos também as alterações no conteúdo juncional e expressão proteica das proteínas juncionais, claudina-1, claudina-2, claudina-3, ocludina e ZO-1 após tratamento com ácido palmítico.

A imunofluorescência indireta para as proteínas juncionais, igualmente ao detectado em células expostas a glicose, indicou marcação em forma de linha contínua na região intercelular das células MDCK controle (expostas somente ao veículo, DMSO) (Figura 14a). Observou-se que células expostas a 200 e 400 μM (Figura 14c, d, e, f) de ácido palmítico apresentaram redução significativa no conteúdo juncional de claudina-1 (P<0,05) (Figura 14g), em relação ao grupo controle (Figura 14a, b). Esta redução mais evidente em células expostas a 400 μM de ácido palmítico, como pode ser observado no gráfico da Figura 14g. Não foram detectadas alterações estatisticamente significativas na expressão proteica de claudina-1 em monocamadas expostas ao ácido palmítico (Figura 14h, i).

Já em relação ao conteúdo juncional de claudina-2, em comparação ao controle (Figura 15a, b), foi detectada redução significativa em células expostas a 200 μM de ácido palmítico (P< 0,05) (Figura 15c, d, g), enquanto não foram detectadas alterações nas células expostas a concentração de 400 μM (Figura 15e, f, g). Quanto ao nível de

conteúdo proteico de claudina-2, este não mostrou-se alterado em células expostas ao ácido palmítico, de acordo com a Figura 15 (h e i).

A reação de imunodetecção de claudina-3 indicou alterações similares às observadas para a claudina-1, em relação ao controle (Figura 16a, b). Foi observada diminuição no conteúdo juncional da claudina-3 em células expostas às duas concentrações de ácido palmítico (Figura 16c, d, e, f), de forma significativa (P<0,05) (Figura 16g). Por meio de Western Blotting, não foram detectadas alterações de conteúdo proteico de claudina-3 em células expostas ao ácido palmítico (Figura 16h, i).

Quanto à imunofluorescência indireta para ocludina, a análise semi-quantitativa indicou redução no conteúdo juncional da proteína em células expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (Figura 17a, b), em relação ao controle (Figura 17c, d, e, f), sendo tal redução estatisticamente significativa (P<0,05) (Figura 17g). Entretanto não foram detectadas alterações significativas no conteúdo proteico total de ocludina em células expostas ao ácido palmítico (Figura 17h, i).

Similarmente, foi observada redução significativa no conteúdo juncional de ZO-1, em células expostas a ambas as concentrações de ácido palmítico utilizadas (Figura 18c, d, e, f), em relação ao grupo controle (Figura 18a, b), como mostrado graficamente na Figura 18g (P<0,05). Não foram observadas alterações de conteúdo proteico de ZO-1, por meio de Western Blotting em células expostas ao ácido palmítico em relação ao grupo controle (Figura 18h, i).

À semelhança do tratamento com glicose, exposição nas concentrações e condições testadas de ácido palmítico não induziu morte celular em células MDCK, como comprovada pela ausência de alterações morfológicas dos núcleos marcados com DAPI e visualizados por microscopia de fluorescência.

Figura 13: Exposição de monocamadas de MDCK a concentrações elevadas de ácido palmítico (200 e 400 μM) durante 3 dias sobre a resistência elétrica transepitelial (Rt) (a) e fluxo transepitelial, do marcador Phenol red (b). Ambas as concentrações de ácido palmítico induziram pequeno aumento da Rt, de forma não significativa (n=16/grupo de 6 experimentos independentes) (P= (teste Two Way ANOVA; pós teste de Bonferroni) (a). Valores de Rt foram expressos como média ± SEM da porcentagem em relação ao valor inicial (tempo 0). Nenhuma diferença do Ft de fenol red foi detectada entre os grupos experimentais (b). Para o fluxo, os valores foram expressos como média ± SEM considerando-se como 100% a absorbância da solução inicialmente colocada na região basal das monocamadas, contendo

Phenol red (n=13/grupo de 5 experimentos independentes). (teste One Way ANOVA; pós teste

Figura 14: Distribuição e conteúdo celular de claudina-1 em monocamadas de células MDCK controle e expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. Foi realizada dupla marcação com FITC (claudina-1 - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). Pode-se observar a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a), e nas expostas às duas concentrações de ácido palmítico (c) e (e). Na Figura g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-1 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores de densidade de pixels para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa nas monocamadas expostas ao ácido palmítico em relação ao Controle (Figura g) (n=7/grupo de 5 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para análise de densidade de pixels, n=2220 (Ct) e n=2220 (Tratado).(**P<0,05 e *** P<0,0001) (Teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni) (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-1, revelada por Western Blot, não demonstrou alterações significativas neste parâmetro após exposição ao A.P. em relação ao grupo controle (h). A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti-GAPDH (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína claudina-1, que foram normalizados considerando-se os valores de anti-GAPDH obtidos. Os resultados são representativos de pelo menos 5 membranas de 4 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 15: Distribuição e conteúdo celular de claudina-2 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. Foi realizada dupla marcação com FITC (claudina-2 - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). Pode-se observar a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a), e nas expostas às duas concentrações de ácido palmítico testadas (c) e (e). Na Figura g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-2 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores de densidade de pixels para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa apenas nas monocamadas expostas a concentrações de 200 μM de ácido palmítico em relação ao Controle (Figura g) (n=4/grupo de 4 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para análise de densidade de pixels, n=1080 (Ct) e n=1080 (Tratado).(**P<0,05) (Teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni) (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-2 em (h), revelada por Western Blot, não demonstrou alterações significativas para esta proteína, em células expostas ao A.P. (i) em relação ao grupo controle. A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti- GAPDH (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína claudina-2, que foram normalizados considerando-se os valores de anti-GAPDH obtidos. Os resultados são representativos de 4 membranas de 4 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 16: Distribuição e conteúdo celular de claudina-3 em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. Foi realizada dupla marcação com FITC (claudina-3 - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). Pode-se observar a localização intercelular da proteína nas células controle (Ct) (a), e nas expostas às duas concentrações de ácido palmítico testadas (c) e (e). Na Figura g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para claudina-3 nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores de densidade de pixels para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa nas monocamadas expostas ao ácido palmítico em relação ao Controle (Figura g) (n=4/grupo de 4 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para análise de densidade de pixels, n=1560 (Ct) e n=1560 (Tratado). (*** P<0,0001) (Teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni) (Barra=50μm). A análise do conteúdo celular de claudina-3 em (h), revelada por Western Blot, não demonstrou alterações significativas para esta proteína em células expostas as duas concentrações de A.P. em relação ao grupo controle (i). A reação de controle interno da membrana foi realizada por meio de reincubação com anticorpo anti-GAPDH (h). O gráfico (i) representa os valores de densidade óptica da banda da proteína claudina-3, que foram normalizados considerando-se os valores de anti-GAPDH obtidos. Os resultados são representativos de 4 membranas de 4 experimentos independentes. (teste One Way ANOVA; pós teste de Bonferroni).

Figura 17: Distribuição e conteúdo celular de ocludina em monocamadas de células MDCK controle e nas expostas às concentrações de 200 e 400 μM de ácido palmítico (A.P.) durante 3 dias. Foi realizada dupla marcação com FITC (ocludina - verde) (a, c, e), e DAPI (azul - núcleo) (b, d, f). Pode-se observar a localização intercelular da proteína em células controle (Ct) (a), e nas expostas às duas concentrações testadas de ácido palmítico (c) e (e). Na Figura g, observa-se a quantificação da fluorescência juncional para ocludina nas imagens digitalizadas das monocamadas. Os valores de densidade de pixels para cada grupo experimental foram plotados em gráfico para melhor comparação entre os grupos. Foi detectada redução significativa nas monocamadas expostas ao ácido palmítico em relação ao Controle (Figura g) (n=3/grupo de 3 experimentos independentes; n° pontos amostrados/grupo para