Juliana Canto Duarte
“Produção de ácidos orgânicos C-3 e C-4 através da fermentação de diferentes substratos por Propionibacterium acidipropionici”
Campinas
vii Resumo
Foram realizadas fermentações em batelada do sorbitol, sacarose, glicerol e glicose por
Propionibacterium acidipropionici livre em biorreatores. As fermentações do sorbitol forneceram
a maior concentração final de ácido propiônico (39,5±5,2 g L-1) e as fermentações da glicose forneceram a menor concentração final de ácido propiônico (23,9±2,1 g L-1). Apenas as fermentações do glicerol produziram n-propanol e sua concentração final foi de 1,7±0,1 g L-1, além disso, o ácido acético não foi produzido nas fermentações do glicerol. As fermentações da sacarose forneceram a maior concentração final de ácido acético (10,9±0,0 g L-1). O maior valor de produtividade do ácido propiônico foi obtido nas fermentações do sorbitol (0,60 g L-1 h-1). Fermentações do sorbitol e da sacarose em batelada utilizando células de P. acidipropionici livres e imobilizadas em montmorilonita K10 foram realizadas em três ciclos sequenciais com reciclo celular. As concentrações finais de ácido propiônico para as fermentações do sorbitol com células livres foram 39,5±5,2; 35,8±1,4 e 34,4±1,9 g L-1 e para células imobilizadas foram 33,1±0,7; 37,2±0,6 e 36,6±0,4 g L-1, para o primeiro, segundo e terceiro ciclos sequenciais, respectivamente. O maior valor de produtividade e de rendimento do ácido propiônico nas fermentações do sorbitol foi obtido para o primeiro ciclo com células livres: 0,60 g L-1 h-1 e 0,613 g g-1, respectivamente. As concentrações finais de ácido propiônico para as fermentações da sacarose com células livres foram 33,4±0,3; 31,3±0,9 e 31,1±0,1 g L-1 e para células imobilizadas foram 26,9±0,6; 29,1±0,3 e 29,5±0,8 g L-1 para o primeiro, segundo e terceiro ciclos sequenciais, respectivamente. A produtividade e o rendimento do ácido propiônico foram maiores no primeiro ciclo para células livres: 0,48 g L-1 h-1 e 0,409 g g-1, respectivamente. Foram realizadas co-fermentações de glicose:glicerol em duas razões mássicas (1:1 e 2:1) em batelada utilizando P.
acidipropionici livre e imobilizada em montmorilonita K10. Apenas nas co-fermentações foi
observada a produção do ácido lático e trealose além dos ácidos acético, succínico e propiônico. A maior concentração final de ácido propiônico foi obtida para as co-fermentações glicose:glicerol de razão mássica 2:1 com células de P. acidipropionici livres (31,4±0,3 g L-1) e a menor concentração final foi obtida nas co-fermentações de razão mássica 1:1 para células imobilizadas (23,9±0,8 g L-1). O ácido acético foi produzido apenas nas co-fermentações de razão mássica 2:1 para células livres (0,3±0,4 g L-1) e imobilizadas (1,1±0,2 g L-1). A maior concentração final de ácido lático foi obtida nas co-fermentações de razão mássica 1:1 para células livres (10,5±0,3 g L-1) e a menor concentração final foi obtida nas co-fermentações de razão mássica 2:1 para células livres (0,9±0,6 g L-1). A maior concentração final de trealose foi obtida nas co-fermentações de razão mássica 2:1 para células imobilizadas (12,1±0,1 g L-1) e a menor concentração final foi obtidas nas co-fermentações de razão mássica 2:1 para células livres (6,7±1,0 g L-1). O maior valor de produtividade e de rendimento do ácido propiônico foram obtidos nas co-fermentações de razão mássica 2:1 para células livres: 0,45 g L-1 h-1 e 0,412 g g-1, respectivamente.
Palavras chave: ácido propiônico, ácido succínico, fermentação, Propionibacterium
ix Abstract
Batch fermentations of sorbitol, sucrose, glycerol and glucose by free cells of
Propionibacterium acidipropionici were conducted in bioreactors. Sorbitol fermentations yield
the major final propionic acid concentration (39.5±5.2 g L-1) while glucose fermentations yield the minor result (23.9±2.1 g L-1). Only glycerol fermentations yield n-propanol (1.7±0.1 g L-1), furthermore, acetic acid was not generated in glycerol fermentations. In the other hand, sucrose fermentations yield great acetic acid final concentration (10.9±0.0 g L-1). The major propionic acid productivity was got in sorbitol fermentations (0.60 g L-1 h-1). Sorbitol and sucrose batch fermentations by free and immobilized cells of P. acidipropionici in montmorillonite K10 were carried out in three sequential cycles with cell reuse. The final propionic acid concentrations to sorbitol with free cells were 39.5±5.2; 35.8±1.4 e 34.4±1.9 g L-1 and with immobilized cells were 33.1±0.7; 37.2±0.6 e 36.6±0.4 g L-1, to the first, second and third sequential cycles, respectively. The major propionic acid productivity was got in the first cycle with free cells to sorbitol fermentations (0.60 g L-1 h-1). The major propionic acid yield was 0.613 g g-1 in the first cycle to free cells. The final propionic acid concentrations to sucrose fermentations with free cells were 33.4±0.3; 31.3±0.9 e 31.1±0.1 g L-1 and to immobilized cells were 26.9±0.6; 29.1±0.3 e 29.5±0.8 g L-1 to the first, second and third sequential cycles, respectively. The propionic acid productivity was major in the first cycle to free cells (0.48 g L-1 h-1). The major propionic acid yield was 0.409 g g-1 in the first cycle to free cells. Batch co-fermentations of glucose and glycerol were also conducted in two different mass ratios (1:1 and 2:1 glucose:glycerol) by P. acidipropionici free and immobilized in montmorillonite K10. The major propionic acid final concentration was got in glucose:glycerol 2:1 mass ratio co-fermentations by free cells (31.4±0.3 g L-1) while the minor final concentration was got with co-fermentation 1:1 mass ratio to immobilized cells (23.9±0.8 g L-1). Acetic acid was got only in co-fermentations 2:1 mass ratio to free (0.3±0.4 g L-1) and immobilized (1.1±0.2 g L-1) cells. The major propionic acid productivity was got in co-fermentations 2:1 mass ratio to free cells (0.45 g L-1 h-1). The major propionic acid yield was got in co-fermentations 2:1 mass ratio to free cells (0.412 g g-1). Only co-fermentations yield lactic acid and trehalose. The major lactic acid final concentration was got in co-fermentations 1:1 mass ratio to free cells (10.5±0.3 g L-1) and the minor final concentration was got in co-fermentations 2:1 mass ratio to free cells (0.9±0.6 g L-1). The major trehalose final concentration was got in co-fermentations 2:1 mass ratio to immobilized cells (12.1±0.1 g L-1) and the minor final concentration was got in co-fermentations 2:1 mass ratio to free cells (6.7±1.0 g L-1).
Keywords: propionic acid, succinic acid, fermentation, Propionibacterium acidipropionici,
xi Sumário
Lista de figuras ... xix
Lista de tabelas ... xxvii
Lista de abreviaturas e siglas ... xxxi
Capítulo 1 ... 1 1.1 Introdução... 1 1.2 Objetivos ... 5 Capítulo 2 ... 7 2.1 Revisão da literatura ... 7 2.1.1 Ácido propiônico ... 7 2.1.2 Ácido succínico ... 10 2.1.3 Ácido acético ... 11 2.1.4 Ácido lático ... 12 2.1.5 n-propanol ... 15 2.1.6 Trealose ... 16 2.1.7 Propionibacterium acidipropionici ... 17
2.1.8 Rota metabólica e processo fermentativo ... 18
2.1.9 Co-fermentação ... 21
2.1.10 Suporte para imobilização celular ... 24
Capítulo 3 ... 27
3.1 Fermentação em batelada sequencial de células livres e imobilizadas utilizando sorbitol e sacarose como fontes de carbono ... 27
3.2 Introdução... 27 3.2.1 Sorbitol ... 27 3.2.2 Sacarose ... 28 3.3 Parte experimental ... 28 3.3.1 Materiais ... 28 3.3.2 Análise quantitativa ... 29
3.3.3 Meios para pré-inóculo e inóculo e para crescimento da biomassa e fermentação . 29 3.3.4 Microrganismo ... 30
xii
3.3.6 Cultura do microrganismo preservado por processo de liofilização ... 30
3.3.7 Biorreatores ... 31
3.3.8 Pré-inóculo e inóculo ... 33
3.3.9 Crescimento da biomassa ... 34
3.3.10 Fermentação em batelada sequencial ... 35
3.3.11 Fermentação em batelada sequencial com imobilização em montmorilonita K10 . 36 3.4 Fermentação do sorbitol com células livres e imobilizadas ... 38
3.4.1 Resumo... 38
3.4.2 Resultados ... 39
3.4.3 Discussão... 44
3.5 Fermentação da sacarose com células livres e imobilizadas ... 61
3.5.1 Resumo... 61
3.5.2 Resultados ... 62
3.5.3 Discussão... 67
3.6 Sugestões para trabalhos futuros ... 83
3.7 Conclusões ... 84
3.7 Estudo da adsorção de substrato e dos ácidos succínico, acético e propiônico pela montmorilonita K10 ... 88
3.7.1 Resumo... 88
3.7.2 Resultados e discussão ... 88
2.7.3 Conclusões ... 91
Capítulo 4 ... 93
4.1 Co-fermentação em batelada de células livres e imobilizadas utilizando glicose e glicerol como fontes de carbono ... 93
4.2 Introdução... 93
4.3 Parte experimental ... 94
4.3.1 Materiais ... 94
4.3.2 Análise quantitativa ... 95
4.3.3 Meios para pré-inóculo e inóculo e para crescimento da biomassa e fermentação . 95 4.3.4 Microrganismo ... 96
xiii
4.3.6 Crescimento da biomassa ... 96
4.3.7 Fermentação e co-fermentação em batelada ... 97
4.3.8 Co-fermentação em batelada com imobilização em montmorilonita K10 ... 97
4.3.9 Biorreatores ... 98
4.4 Fermentação do glicerol em batelada com células livres ... 98
4.4.1 Resumo... 98
4.4.2 Resultados ... 99
4.5 Fermentação da glicose em batelada com células livres ... 99
4.5.2 Resultados ...100
4.6 Co-fermentação glicose:glicerol em batelada com células livres e imobilizadas ...100
4.6.1 Co-fermentação glicose:glicerol – razão mássica 1:1 (razão molar 1:2) ...100
4.6.2 Co-fermentação glicose:glicerol – razão mássica 2:1 (razão molar 1:1) ...106
4.7 Co-fermentação glicose:glicerol – razão mássica 1:1 (razão molar 1:2) e fermentação da glicose a partir do crescimento celular em glicerol ...108
4.7.1 Resumo ...108
4.7.2 Resultados ...109
4.8 Discussão ...110
4.9 Sugestões para trabalhos futuros ...149
4.10 Conclusões ...150
Capítulo 5 ...155
5.1 Fermentação em batelada utilizando diferentes fontes de carbono ...155
5.2 Introdução ...155
5.3 Parte experimental ...157
5.3.1 Materiais ...157
5.3.2 Análise quantitativa ...157
5.3.3 Meios para pré-inóculo e inóculo e para crescimento da biomassa e fermentação ...158
5.3.4 Microrganismo ...158
5.3.5 Pré-inóculo e inóculo ...158
5.3.6 Crescimento da biomassa ...159
5.3.7 Fermentação em batelada ...159
xiv
5.4 Fermentação do sorbitol em batelada com células livres ...160
5.4.1 Resumo ...160
5.4.2 Resultados ...160
5.5 Fermentação da sacarose em batelada com células livres ...161
5.5.1 Resumo ...161
5.5.2 Resultados ...161
5.6 Fermentação do glicerol em batelada com células livres ...162
5.6.1 Resumo ...162
5.6.2 Resultados ...162
5.7 Fermentação da glicose em batelada com células livres ...163
5.7.1 Resumo ...163
5.7.2 Resultados ...163
5.8 Discussão ...163
5.9 Sugestões para trabalhos futuros ...185
5.10 Conclusões ...185
xv Dedicatória
xvii
Agradecimentos
Nunca teria chegado até aqui se não fosse todo apoio e amor que recebi dos meus pais desde o meu nascimento. Foi a partir daquela data que se iniciaram os bons exemplos de honestidade, respeito, amor, confiança, caráter e princípios. Foi por meus pais torcerem pelo meu sucesso, depositarem confiança em mim e por acreditarem em meu potencial que tive forças para continuar crescendo como pessoa e como profissional. Foi o amor constante, a dedicação e o trabalho deles que me possibilitaram a estudar e estar aqui hoje. Sem dúvidas, todos os passos que dei em minha vida e as dificultades que superei teriam sido mais difícies se não tivesse ao meu lado os pais que tenho. Meus pais são o exemplo para mim e busco me espelhar neles para trilhar meu caminho, sei o quanto eles se esforçaram para que eu pudesse estudar e realizar o sonho de concluir o doutorado, portanto, dizer obrigado parece não ser suficiente para demonstrar o que sinto, mas o que sinto por eles pode ser resumido em uma simples palavra: amor!
Não poderia deixar de agradecer ao meu irmão, Henrique Canto Duarte, que sempre esteve comigo, me ajudando em todas as questões, principalmente aquelas referentes à informática sendo sempre paciente. Tenho muito orgulho de ter um irmão tão inteligente, com quem eu sempre pude conversar sobre diferentes assuntos e que sempre me surpreendeu por seu conhecimento. Uma pessoa grandiosa em diversos aspectos!
Há uma pessoa a quem eu deixo um obrigado muito especial! A você Adilson Roberto Brandão, com quem aprendo e cresço diariamente, você me fortalece e me ajuda a superar as dificuldades encontradas. Obrigada por sempre me ouvir, por me ajudar e por estar ao meu lado em todos os momentos. Você tem uma forma única de me fazer sorrir e me motivar quando me sinto triste. Obrigada pelas conversas sempre enriquecedoras, pelos risos, pelo exemplo de determinação e confiança e por me apoiar neste trabalho.
Quero agradecer aos professores Dr. Paulo J. S. Moran e Dr. José Agusto R. Rodrigues do Instituto de Química da UNICAMP que me receberam de braços abertos e me acolheram em seu laboratório, que me orientaram e me auxiliaram o tempo todo no desenvolvimento deste trabalho. Sem a colaboração dos professores Moran e J. Augusto, este trabalho não teria sido possível. Obrigada pelas conversas, pelas sugestões, pelas correções, pelos ensinamentos, pelo respeito, pelo companheirismo, pelos bons momentos vividos no laboratório e pela oportunidade de trabalhar com pessoas ilustres como os senhores.
Agradeço ao professor Dr. Gustavo Paim Valença por me orientar neste trabalho, por apresentar suas sugestões, pelos questionamentos contrutivos que ajudaram no desenvolvimento deste trabalho. Agradeço pelas discussões acerca dos experimentos que me fizeram refletir e me ajudaram a crescer profissionalmente e pessoalmente. Obrigada professor, por compartilhar seu conhecimento e dividir sua sabedoria.
xviii
Fábio Domingues Nasário e Tarcila Cazetta, muito obrigada! Ter a oportunidade de conhecê-los e contar com a amizade de vocês foi essencial em minha vida! Vou levar para sempre em meu coração todos os momentos felizes que passamos juntos no laboratório! Obrigada por me ajudarem, por me ensinarem, pelos almoços divertidos, pelas conversas enriquecedoras, pela força, pela compreensão e pelo carinho.
Gostaria de agradecer aos amigos M. Lair Sabóia, Bruna Zucoloto e Michel R. Chaves pela amizade, pelas boas conversas, pelos momentos divertidos (que foram muitos) e por toda ajuda que tornou possível a conclusão deste trabalho. Vocês fizeram parte dele e seguirão sempre em minhas lembranças.
Agradeço também à professora Dra. Anita J. Marsaiolli e ao Thiago Inácio, ambos do Instituto de Química da UNICAMP, pelo apoio, pela disponibilidade em ajudar e pela orientação técnica nos experimentos de RMN. Obrigada pela amizade, pelos bons momentos de discussão e pelas orientações que permitiram chegar aos resultados obtidos.
À Braskem S/A pela colaboração neste trabalho, pelas sugestões, pela disponibilidade em ajudar no desenvolvimento dos estudos e pela bolsa oferecida durante o doutorado, muito obrigada!
Agradeço os funcionários do Instituto de Química da UNICAMP e do Laboratório de Recursos Analíticos e Calibração – LRAC da Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP pelo apoio técnico, pela troca de conhecimento, pelas discussões acerca dos resultados obtidos nos ensaios analíticos, pela busca constante de aprimorá-los, entendê-los e interpretá-los corretamente, pelo respeito, pela atenção e pelo profissionalismo, muito obrigada! Sem o empenho e dedicação no trabalho de cada um de vocês, a conclusão deste não teria ocorrido como tal.
Agradeço o auxílio financeiro concedido para este trabalho pela FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (PITE – Rotas verdes para o propeno – Processo 2007/58336-3 e Processo 2011/51861-9) e pela CAPES – Coodenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior.
xix Lista de figuras
Figura 1.1 Rota para a fermentação de ácido propiônico com P. acidipropionici a partir de
glicerol (Zhang e Yang, 2009). ... 2
Figura 2.1 Estrutura do ácido propiônico. ... 8
Figura 2.2 Rota metabólica para diversas fontes de carbono para fermentação pela propionibactéria (Parizzi et al., 2012). ... 9
Figura 2.3 Estrutura do ácido succínico. ... 10
Figura 2.4 Estrutura do ácido acético... 12
Figura 2.5 Estruturas do D-ácido lático e L-ácido lático. ... 12
Figura 2.6 Estrutura do n-propanol. ... 15
Figura 2.7 Estrutura da trealose. ... 16
Figura 2.8 Imagem obtida através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) da cepa de P. freudenreichii (Gautier, 1999). ... 17
Figura 2.9 Rota do ácido dicarboxílico para a formação do ácido acético, propiônico e succínico (Adaptado de Suwannakham, 2005). ... 21
Figura 2.10 Estrutura do glicerol. ... 22
Figura 2.11 Estrutura da glicose. ... 22
Figura 2.12 Co-metabolismo do glicerol e da glicose para a Propionibacterium sob condições anaeróbicas (modificado de Liu et al., 2011). ... 23
Figura 2.13 Estrutura da montmorilonita (Paiva et al., 2008). ... 26
Figura 3.1 Estrutura do sorbitol. ... 27
Figura 3.2 Estrutura da sacarose. ... 28
Figura 3.3 Liofilização das células de P. acidipropionici em liofilizador. ... 31
Figura 3.4 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici livre para o primeiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 40
Figura 3.5 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici livre para o segundo ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 40
Figura 3.6 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici livre para o terceiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 41 Figura 3.7 a) concentração de sorbitol, b) concentração de ácido acético, c) concentração de ácido succínico e d) concentração de ácido propiônico no final de cada ciclo sequencial por P.
xx
acidipropionici livre (cada ciclo foi realizado em quatro dornas independentes operando
simultaneamente). ... 41 Figura 3.8 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici imobilizada para o primeiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 43 Figura 3.9 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici imobilizada para o segundo ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 43 Figura 3.10 Perfil da fermentação do sorbitol pela P. acidipropionici imobilizada para o terceiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 44 Figura 3.11 a) concentração de sorbitol, b) concentração de ácido acético, c) concentração de ácido succínico e d) concentração de ácido propiônico no final de cada ciclo sequencial por P.
acidipropionici imobilizada (cada ciclo foi realizado em quatro dornas independentes operando
simultaneamente). ... 44 Figura 3.12 Comparação do perfil de fermentação do sorbitol para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o primeiro ciclo de fermentação em batelada
sequencial. ... 49 Figura 3.13 Comparação do perfil de fermentação do sorbitol para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o segundo ciclo de fermentação em batelada
sequencial. ... 50 Figura 3.14 Comparação do perfil de fermentação do sorbitol para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o terceiro ciclo de fermentação em batelada sequencial.
... 50 Figura 3.15 Fermentação do sorbitol com células de P. acidipropionici livres (à esquerda) e células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 (à direita) no início da fermentação. ... 59 Figura 3.16 Separação da montmorilonita K10 e células de P. acidipropionici do meio líquido na fermentação do sorbitol após 1 hora sem agitação ao final da fermentação. ... 60 Figura 3.17 Fermentação do sorbitol com células de P. acidipropionici livres após 1 hora sem agitação ao final da fermentação. ... 60 Figura 3.18 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici livre para o primeiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 63
xxi
Figura 3.19 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici livre para o segundo ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 63 Figura 3.20 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici livre para o terceiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 64 Figura 3.21 a) concentração de sacarose, b) concentração de ácido acético, c) concentração de ácido succínico e d) concentração de ácido propiônico no final de cada ciclo sequencial por P.
acidipropionici livre (cada ciclo foi realizado em quatro dornas independentes operando
simultaneamente). ... 64 Figura 3.22 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici imobilizada para o primeiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 66 Figura 3.23 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici imobilizada para o segundo ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 66 Figura 3.24 Perfil da fermentação da sacarose pela P. acidipropionici imobilizada para o terceiro ciclo operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 67 Figura 3.25 a) concentração de sacarose, b) concentração de ácido acético, c) concentração de ácido succínico e d) concentração de ácido propiônico no final de cada ciclo sequencial por P.
acidipropionici imobilizada (cada ciclo foi realizado em quatro dornas independentes operando
simultaneamente). ... 67 Figura 3.26 Comparação do perfil de fermentação da sacarose para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o primeiro ciclo de fermentação em batelada
sequencial. ... 72 Figura 3.27 Comparação do perfil de fermentação da sacarose para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o segundo ciclo de fermentação em batelada
sequencial. ... 73 Figura 3.28 Comparação do perfil de fermentação da sacarose para as células de P.
acidipropionici livres e imobilizadas para o terceiro ciclo de fermentação em batelada sequencial.
... 73 Figura 3.29 Fermentação da sacarose com células de P. acidipropionici livres (à direita) e células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 (à esquerda) após 48 horas do início da fermentação. ... 82
xxii
Figura 3.30 Separação da montmorilonita K10 e células de P. acidipropionici do meio líquido na fermentação da sacarose após 1 hora sem agitação ao final da fermentação. ... 83 Figura 3.31 Fermentação da sacarose com células de P. acidipropionici livres após 1 hora sem agitação ao final da fermentação. ... 83 Figura 3.32 Perfis do estudo de adsorção de substrato e ácidos orgânicos pela montmorilonita K10. a) Sem adição de montmorilonita K10, b) adição de 5,5 g de montmorilonita K10, c) adição de 7,5 g de montmorilonita K10 e d) adição de 9,5 g de montmorilonita K10. ... 89 Figura 3.33 Dornas do biorreator sem montmorilonita K10 (à esquerda) e com 5,5 g de montmorilonita K10 (à direita) após 2 horas sem agitação. ... 90 Figura 3.34 Dornas do biorreator com 7,5 g de montmorilonita K10 (à esquerda) e com 9,5 g de montmorilonita K10 (à direita) após 2 horas sem agitação. ... 91 Figura 4.1 Perfil da fermentação em batelada do glicerol pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ... 99 Figura 4.2 Perfil da fermentação em batelada da glicose pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ...100 Figura 4.3 Cromatogramas obtidos para a) amostra de co-fermentação glicose glicerol na proporção 2:1 com células livres após 70 h; b) amostra padrão de trealose; c) amostra de co-fermentação glicose glicerol na proporção 2:1 com células livres após 70 h enriquecida com trealose. ...102 Figura 4.4 Espectros de RMN 2D correlação heteronuclerar 1H – 13C de uma ligação (HSQC) para a) amostra de co-fermentação glicose glicerol na proporção 2:1 com células livres após 70 h; b) amostra padrão de trealose, c) amostra de co-fermentação glicose glicerol na proporção 2:1 com células livres após 70 h enriquecida com trealose. ...104 Figura 4.5 Perfil da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 em batelada pela P.
acidipropionici livre operando simultaneamente em duas dornas independentes. ...105
Figura 4.6 Perfil da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 em batelada pela P.
acidipropionici imobilizada operando simultaneamente em duas dornas independentes. ...106
Figura 4.7 Perfil da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 em batelada pela P.
acidipropionici livre operando simultaneamente em duas dornas independentes. ...107
Figura 4.8 Perfil da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 em batelada pela P.
xxiii
Figura 4.9 Perfil da fermentação da glicose em batelada pela P. acidipropionici livre obtida do crescimento celular prévio em glicerol, operando simultaneamente em duas dornas independentes. ...109 Figura 4.10 Perfil da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 em batelada pela P.
acidipropionici livre obtida do crescimento celular prévio em glicerol, operando simultaneamente
em duas dornas independentes. ...110 Figura 4.11 Co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 com células de P.
acidipropionici livres (à direita) e células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita
K10 (à esquerda) após 24 horas do início da fermentação. ...129 Figura 4.12 Co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 com células de P.
acidipropionici livres (à direita) e células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita
K10 (à esquerda) após 24 horas do início da fermentação. ...129 Figura 4.13 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 após 10 minutos sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...130 Figura 4.14 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 após 10 minutos sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...131 Figura 4.15 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 após 30 minutos sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...132 Figura 4.16 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 após 30 minutos sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...132 Figura 4.17 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 após 1 hora sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...133 Figura 4.18 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 após 1 hora sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...133
xxiv
Figura 4.19 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 1:1 após 2 horas sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...134 Figura 4.20 Dornas da co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 após 2 horas sem agitação ao final da co-fermentação. À esqueda, células de P. acidipropionici imobilizadas em montmorilonita K10 e à direita, células de P. acidipropionici livres. ...135 Figura 4.21 Falcons de 500 mL após centrifugação e descarte do sobrenadante. À esquerda falcon apenas com células de P. acidipropionici depositadas no fundo cônico. À direita falcon com montmorilonita K10 depositada na camada mais ao fundo e células de P. acidipropionici depositadas na camada superior do fundo cônico. ...136 Figura 4.22 Imagem do fundo da dorna do biorreator que conduziu a co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 com depósito da substância. ...136 Figura 4.23 Imagem da dorna do biorreator que conduziu a co-fermentação glicose:glicerol de razão mássica 2:1 com depósito da substância nas paredes e no fundo da dorna e também com material em suspensão...137 Figura 4.24 Espectro no infravermelho da P. acidipropionici e da substância branca. ...138 Figura 4.25 Perfil da concentração final dos ácidos orgânicos de acordo com a razão entre glicose e glicerol. ...139 Figura 4.26 Comparação dos perfis de consumo da glicose para o crescimento da P.
acidipropionici em glicose e fermentação em glicose e crescimento prévio da P. acidipropionici
em glicerol e fermentação em glicose. ...147 Figura 4.27 Comparação dos perfis de consumo da glicose para o crescimento da P.
acidipropionici em glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e fermentação em glicose:glicerol na
razão mássica 1:1 e crescimento prévio da P. acidipropionici em glicerol e fermentação em glicose:glicerol na razão mássica 1:1. ...148 Figura 4.28 Comparação dos perfis de consumo do glicerol para o crescimento da P.
acidipropionici em glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e fermentação em glicose:glicerol na
razão mássica 1:1 e crescimento prévio da P. acidipropionici em glicerol e fermentação em glicose:glicerol na razão mássica 1:1. ...149
xxv
Figura 5.1 Rota metabólica da fermentação do glicerol, da glicose e do ácido lático por
Propionibacterium acidipropionici. DHAP dihidroxiacetona fosfato, PEP fosfoenolpiruvato
(adaptada de Barbirato et al., 1997). ...156 Figura 5.2 Perfil da fermentação em batelada do sorbitol pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ...160 Figura 5.3 Perfil da fermentação em batelada da sacarose pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ...161 Figura 5.4 Perfil da fermentação em batelada do glicerol pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes ...162 Figura 5.5 Perfil da fermentação em batelada da glicose pela P. acidipropionici livre operando simultaneamente em quatro dornas independentes. ...163 Figura 5.6 Perfil do consumo do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose nas fermentações em batelada por P. acidipropionici livre. ...166 Figura 5.7 Início da fermentação da glicose com células livres em biorreator. ...184 Figura 5.8 Final da fermentação da glicose com células livres em biorreator. ...184
xxvii Lista de tabelas
Tabela 1.1 Grau de redução de diversos compostos ... 4 Tabela 3.1 Concentração final de sorbitol, ácidos orgânicos, células, massa celular úmida final e carbono recuperado para as fermentações por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 47 Tabela 3.2 Concentração final de sorbitol, ácidos orgânicos, massa celular úmida final e carbono recuperado para as fermentações por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais 48 Tabela 3.3 Produtividade de ácidos orgânicos e células para a fermentação do sorbitol por P.
acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 52
Tabela 3.4 Produtividade de ácidos orgânicos e células para a fermentação do sorbitol po P.
acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 52
Tabela 3.5 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 53 Tabela 3.6 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 53 Tabela 3.7 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 55 Tabela 3.8 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 56 Tabela 3.9 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 57 Tabela 3.10 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação do sorbitol por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 58 Tabela 3.11 Concentração final de sacarose, ácidos orgânicos, células, massa celular úmida final e carbono recuperado para as fermentações por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 70 Tabela 3.12 Concentração final de sacarose, ácidos orgânicos, massa celular úmida final e carbono recuperado para as fermentações por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 71
xxviii
Tabela 3.13 Produtividade de ácidos orgânicos e células para a fermentação da sacarose por P.
acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 75
Tabela 3.14 Produtividade de ácidos orgânicos e células para a fermentação da sacarose por P.
acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 75
Tabela 3.15 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 76 Tabela 3.16 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 76 Tabela 3.17 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 78 Tabela 3.18 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 79 Tabela 3.19 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici livre nos três ciclos sequenciais ... 80 Tabela 3.20 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação da sacarose por P. acidipropionici imobilizada nos três ciclos sequenciais ... 81 Tabela 4.1 Concentrações finais dos ácidos orgânicos, trealose, massa celular úmida final e carbono recuperado para as co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P.
acidipropionici livre e imobilizada ...112
Tabela 4.2 Concentrações finais dos ácidos orgânicos, n-propanol, células e carbono recuperado para as fermentações em batelada do glicerol, da glicose e das co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre ...114 Tabela 4.3 Produtividade de ácidos orgânicos para as co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre e imobilizada ...115 Tabela 4.4 Produtividade de ácidos orgânicos, n-propanol e células para as fermentações em batelada do glicerol, da glicose e das co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre ...116
xxix
Tabela 4.5 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para as co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P.
acidipropionici livre e imobilizada ...118
Tabela 4.6 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para as fermentações em batelada, do glicerol, da glicose e das co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre ...119 Tabela 4.7 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para as co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre e imobilizada ...122 Tabela 4.8 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para as fermentações do glicerol, da glicose e das co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P.
acidipropionici livre ...124
Tabela 4.9 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para as co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P. acidipropionici livre e imobilizada ...126 Tabela 4.10 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação do glicerol, da glicose e das co-fermentações glicose:glicerol nas razões mássicas 1:1 e 2:1 por P.
acidipropionici livre ...128
Tabela 4.11 Concentração final dos ácidos orgânicos de acordo com a razão entre glicose e glicerol...139 Tabela 4.12 Concentrações finais dos ácidos orgânicos, células, trealose e carbono recuperado para a co-fermentação glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e para a fermentação da glicose por
P. acidipropionici livre crescida previamente em glicerol ...141
Tabela 4.13 Produtividade de ácidos orgânicos para a co-fermentação glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e para a fermentação da glicose por P. acidipropionici livre crescida previamente em glicerol...142 Tabela 4.14 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para a co-fermentação glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e para a fermentação da glicose por P. acidipropionici livre crescida previamente em glicerol ...143 Tabela 4.15 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para a co-fermentação glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e para a fermentação da glicose por P. acidipropionici livre crescida previamente em glicerol ...144
xxx
Tabela 4.16 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a co-fermentação glicose:glicerol na razão mássica 1:1 e para a fermentação da glicose por P. acidipropionici livre crescida previamente em glicerol ...146 Tabela 5.1 Concentrações finais dos ácidos orgânicos, n-propanol, células e carbono recuperado para as fermentações em batelada do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose por P.
acidipropionici livre ...168
Tabela 5.2 Produtividade de ácidos orgânicos, n-propanol e células para as fermentações em batelada do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose por P. acidipropionici livre ...169 Tabela 5.3 Razões molares de ácido propiônico/ácido acético (P/A) e ácido propiônico/ácido succínico (P/S) para as fermentações em batelada do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose por P. acidipropionici livre ...170 Tabela 5.4 Coeficientes de rendimento e de manutenção celular para as fermentações do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose por P. acidipropionici livre ...172 Tabela 5.5 Taxas instantâneas e taxa específica de crescimento celular para a fermentação do sorbitol, da sacarose, do glicerol e da glicose por P. acidipropionici livre ...173 Tabela 5.6 Comparação dos resultados dos estudos das fermentações com sorbitol, sacarose, glicose e glicerol com resultados da literatura para a fermentação por P. acidipropionici utilizando diferentes fontes de carbono com células livres e imobilizadas em batelada e em batelada alimentada (Adaptado de Dishisha et al., (2012) e Liu et al., (2012))...176
xxxi Lista de abreviaturas e siglas
YX/S rendimento da biomassa com respeito ao substrato
YAS/S rendimento do ácido succínico com respeito ao substrato
YAA/S rendimento do ácido acético com respeito ao substrato
YAP/S rendimento do ácido propiônico com respeito ao substrato
YAL/S rendimento do ácido lático com respeito ao substrato
Yn-P/S rendimento do n-propanol com respeito ao substrato
YT/S rendimento da trealose com respeito ao substrato
YAS/X rendimento do ácido succínico com respeito à biomassa
YAA/X rendimento do ácido acético com respeito à biomassa
YAP/X rendimento do ácido propiônico com respeito à biomassa
YAL/X rendimento do ácido lático com respeito à biomassa
Yn-P/X rendimento do n-propanol com respeito à biomassa
YT/S rendimento da trealose com respeito à biomassa
m coeficiente de manutenção celular
rs taxa instantânea de consumo de substrato
rp(AS) taxa instantânea de produção de ácido succínico
rp(AA) taxa instantânea de produção de ácido acético
rp(AP) taxa instantânea de produção de ácido propiônico
rp(AL) taxa instantânea de produção de ácido lático
xxxii
rp(T) taxa instantânea de produção de trealose
rx taxa instantânea de crescimento celular
µx taxa específica de crescimento celular
PCS peso celular seco
OD600 densidade ótica a 600 nm
P/A razão de ácido propiônico/ácido acético
S/A razão de ácido succínico/ácido acético
1 Capítulo 1
1.1 Introdução
O ácido propiônico e seus sais compõem diversos produtos de interesse industrial com várias aplicações como inibidor de bolores (Liu et al., 2011), conservantes para alimentos (Zhang e Yang, 2009), aroma de frutas, base de essências, aditivos em plásticos celulósicos, herbicidas, medicamentos terapêuticos para animais (Boyaval e Corre, 1995), intermediário químico na síntese de fibras celulósicas, perfumes e produtos farmacêuticos. Ésteres de ácido propiônico têm muitas aplicações na indústria química como intermediários na produção de termoplásticos ou como solventes em tintas e resinas. Grande parte do ácido propiônico é utilizada como sais de cálcio, sódio e amônio como conservantes de alimentos e também como importantes ingredientes na alimentação animal (Ekman e Börjesson, 2011) com consumo mundial estimado em 293.400 toneladas em 2009, representando um mercado de aproximadamente 530 milhões de dólares com crescimento esperado de 3,9 % até 2014 (Bizzari e Gubler, 2004). Atualmente a produção do ácido propiônico é quase exclusivamente realizada através de processos petroquímicos. Porém, o aumento do preço do petróleo e a crescente demanda por produtos produzidos através de rotas verdes, têm gerado interesse comercial em produzir ácido propiônico e outros produtos químicos a partir de fontes renováveis (Feng et al., 2011; Ruhal 2011; Tsoskounogiou et al., 2008; Zhang e Yang, 2009). Além disso, o aumento do custo para eliminação de resíduos e restrições ao aterro para determinados tipos de resíduos, levou ao aumento do interesse em uma produção mais sustentável de produtos químicos e materiais de base biológica de matérias-primas renováveis (Tsoskounogiou et al., 2008). A conversão de resíduos de base biológica ou subprodutos em produtos químicos com alto valor agregado oferece várias vantagens como baixo custo de produção, menor impacto ambiental, menor exigência de energia e produtos menos tóxicos e biodegradáveis.
Com o aumento do preço do petróleo, a demanda por biodiesel tem crescido dramaticamente. O biodiesel é produzido principalmente a partir de óleos vegetais e alcoóis via transesterificação produzindo o glicerol como principal subproduto. Grandes quantidades de glicerol bruto produzido apresentam um problema para o meio ambiente se não tratado corretamente. Portanto, o uso do glicerol para produção de produtos químicos e
2
biocombustíveis como uma fonte renovável e de baixo custo é considerável (Ekman e Börjesson, 2011; Gungormusler et al., 2011). A Figura 1.1 apresenta a rota metabólica para obtenção do ácido propiônico a partir da fermentação glicerol por P. acidipropionici.
Figura 1.1 Rota para a fermentação de ácido propiônico com P. acidipropionici a partir de
glicerol (Zhang e Yang, 2009).
Bactérias do gênero Propionibacterium sp. têm sido extensivamente estudadas para a produção de ácido propiônico. Elas são capazes de utilizar diversos subprodutos e resíduos de origem industrial e agrícola que servem como fonte de carbono para a fermentação, como por exemplo, o glicerol (Ruhal et al., 2011), o melaço de cana-de-açúcar (Feng et al., 2011), o hidrolisado de peixe (Mahmoud e Levin, 1993), a lactose do soro do leite (Yang et al.,1995), o hidrolisado de milho (Huang et al., 2002), a glicose (Koussémon et al., 2003), a farinha de trigo (Kagliwal et al., 2013; Sabra et al., 2013) e vários outros subprodutos incluindo a co-fermentação usando misturas de glicerol e glicose (Wang e Yang, 2013). A fonte de carbono é um dos fatores mais importantes a serem considerados na determinação do custo de produção do ácido propiônico. As fontes de
3
carbono mais utilizadas na produção de ácido propiônico são glicose, lactose e glicerol (Boyaval e Corre, 1995). A fonte de carbono também influencia no crescimento celular, consumo de substrato, formação de subprodutos e afeta a cinética de fermentação do ácido propiônico pela Propionibacterium acidipropionici através de uma resposta celular que redistribui a composição dos produtos finais para alcançar o balanço de redução-oxidação (redox). Os perfis metabólicos resultantes das diferentes fontes de carbono durante a fermentação do ácido propiônico têm sido elucidados utilizando a análise da estequiometria metabólica e têm demonstrado a existência de diferentes mecanismos de controle (Suwannakham, 2005).
Comparado à glicose e a outros carboidratos, o glicerol apresenta alto grau de redução (γD = 4,667) (VanBriesen, 2002), o que favorece a produção de metabólitos mais reduzidos. O grau de redução de um composto é definido como o número de mols de elétrons disponíveis para serem transferidos para o oxigênio para completa combustão do composto. Para o cálculo do grau de redução, γD, é utilizada a Equação 1.1 apresentada abaixo para uma molécula genérica CaHbOcNdSePf (VanBriesen, 2002). Além disso, a Tabela 1.1 apresenta o grau de redução de diversos compostos.
4 Tabela 1.1 Grau de redução de diversos compostos
Grau de redução (γD) Referência
Biomassa 4,29 Papoutsakis e Meyer (1985a)
Sorbitol 4,33 VanBriesen (2002)
Sacarose 4,00 Cálculo neste trabalho
Glicerol 4,67 VanBriesen (2002)
Glicose 4,00 VanBriesen (2002)
Ácido succínico 3,50 VanBriesen (2002)
Ácido acético 4,00 VanBriesen (2002)
Ácido propiônico 4,67 VanBriesen (2002)
Ácido lático 4,00 VanBriesen (2002)
Piruvato 3,33 VanBriesen (2002) Citrato 3,00 VanBriesen (2002) Dihidroxiacetona 4,00 VanBriesen (2002) Fumarato 3,00 VanBriesen (2002) Malato 3,00 VanBriesen (2002) Propanol 6,00 VanBriesen (2002)
O processo de fermentação convencional de ácido propiônico é limitado pela baixa produtividade, baixo rendimento, lento crescimento celular e baixa concentração final, devido à forte inibição causada pelo ácido propiônico (Blanc e Goma, 1987; Goswami e Srivastava, 2001; Liu et al., 2011; Zhang e Yang, 2009). Devido à baixa concentração de ácido propiônico, a recuperação de subprodutos, separação e purificação apresentam altos custos no processo (Suwannakham, 2005). Consequentemente, a bioprodução de ácido propiônico atual não tem potencial comercial competitivo com as rotas petroquímicas utilizadas (Zhang e Yang, 2009; Boyaval e Corre, 1995). O aumento da tolerância bacteriana ao ácido propiônico é um ponto crítico para sua produção econômica, pois mesmo em baixa concentração exerce forte inibição (Gu et al., 1998). Avanços na engenharia genética têm fornecido ferramentas para a criação de microrganismos mutantes com melhores condições de tolerância (Zhang e Yang, 2009). Além disso, a imobilização celular tem produzido altas concentrações de ácido propiônico pela Propionibacterium
5
acidipropionici (Zhang e Yang, 2009; Boyaval e Corre, 1995). Por exemplo, os trabalhos
de Rickert et al., (1998) e Coronado et al., (2001), utilizaram alginato de cálcio e poligalactorunato de cálcio como suportes para imoblização da propionibactéria para a produção de ácido propiônico. No entanto o alto preço destes suportes limita a produção de ácido propiônico e, portanto, é necessário que novos suportes para a imobilização de
Propionibacterium acidipropionici sejam estudados para melhorar a eficiência da produção
do ácido propiônico (Boyaval e Corre, 1995).
Diferentes microrganismos têm sido empregados para transformar glicerol em produtos industrialmente relevantes como ácido propiônico, ácido succínico, ácido acético, entre outros. Entretanto, é a P. acidipropionici aquela que tem apresentado maior seletividade proporcionando majoritariamente o ácido propiônico (Himmi et al., 2000).
1.2 Objetivos
O objetivo geral deste estudo foi desenvolver uma tecnologia de fermentação para melhorar a produção de ácido propiônico pela Propionibacterium acidipropionici. Para atingir este objetivo, foram propostos três objetivos específicos:
Objetivo 1: Estudar o processo de fermentação para células livres e imobilizadas em montmorilonita K10 em batelada sequencial
O estudo da fermentação para células livres e imobilizadas em montmorilonita K10 em batelada sequencial com reutilização celular foi realizado para duas diferentes fontes de carbono com diferentes graus de redução: sorbitol e sacarose.
Objetivo 2: Estudar a co-fermentação para células livres e imobilizadas em montmorilonita K10
O estudo da co-fermentação em batelada para células livres e imobilizadas em montmorilonita K10 foi realizado para duas diferentes fontes de carbono com diferentes graus de redução: glicose e glicerol. Este estudo foi realizado para duas diferentes razões mássicas de glicose:glicerol (1:1 e 2:1).
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Objetivo 3: Estudar o processo de fermentação em batelada de células livres utilizando diferentes fontes de carbono
O estudo da fermentação em batelada de células livres foi realizado para quatro diferentes fontes de carbono com diferentes graus de redução: sorbitol, sacarose, glicerol e glicose.
7 Capítulo 2
2.1 Revisão da literatura
2.1.1 Ácido propiônico
O ácido propiônico (Figura 2.1) é um importante ácido orgânico de fórmula C3H6O2. Este ácido tem sido utilizado na indústria como intermediário químico para diversas aplicações. Devido sua atividade antimicrobiana, os sais de ácido propiônico têm sido utilizados como conservantes nas indústrias alimentícias. O ácido propiônico perturba o gradiente de pH da membrana celular, uma força motriz essencial para o transporte de nutrientes e metabólitos em anaeróbios facultativos como a propionibactéria. O ácido propiônico não dissociado pode difundir-se através da membrana celular para o citoplasma, e em seguida, dissociar-se em próton e ânion propionato em pH alcalino, no interior da célula. Assim, uma fonte de prótons no interior da célula é criada. Para manter o gradiente de pH da membrana, uma quantidade extra de trifosfato de adenosina (ATP) é consumida pela H+-ATPase para expulsar o próton da célula, desta forma, diminui a quantidade de ATP disponível para o metabolismo celular (Gu et al., 1998; Zhang e Yang, 2009).
O ácido propiônico é utilizado na fabricação de plásticos, herbicidas, perfumes (Dishisha et al., 2013) e também como precursor em outros processos industriais como para a produção de produtos farmacêuticos, plastificantes, intermediário de tintas, solventes, bem como aroma e cosméticos (Barbirato et al., 1997; Ramsay et al., 1998; Sabra et al., 2013). Os sais de cálcio, sódio e potássio do ácido propiônico são utilizados como conservantes de alimentos (Coral et al., 2008, Goswami et al., 2000; Himmi et al., 2000; Kagliwal et al., 2013; Liu et al., 2012; Zhang e Yang, 2009). Naturalmente, o ácido propiônico ocorre em maçãs, morangos, grãos, queijos e no suor humano (Sabra et al., 2013). Sua produção global foi estimada em 349000 toneladas em 2006 (Dishisha et al., 2013).
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Figura 2.1 Estrutura do ácido propiônico.
Atualmente, o ácido propiônico é produzido através de rotas petroquímicas (Zhu et
al., 2010). No entanto, o aumento crescente no preço do petróleo e a demanda por produtos
de base biológica têm gerado grandes interesses industriais na produção de ácido propiônico e outros produtos químicos a partir de matérias-primas renováveis incluindo resíduos industriais e agrícolas (Liu et al., 2012; Sabra et al., 2013; Zhang e Yang, 2009). O ácido propiônico têm sido produzido através da fermentação de diversas fontes de carbono pela Propionibacterium sp. (Figura 2.2) incluindo a hemicelulose (Ramsay et al., 1998), glicerol (Liu et al., 2011; Ruhal et al., 2011), xilose (Carrondo et al., 1987) melaço de cana (Coral et al., 2008; Feng et al., 2011), glicose (Koussémon et al., 2003), hidrolisado de peixe (Mahmoud e Levin, 1993), lactose do soro do leite (Yang et al., 1995), hidrolisado de milho (Huang et al., 2002), glicose (Himmi et al., 2000; Koussémon et al., 2003), farinha de trigo (Kagliwal et al., 2013; Sabra et al., 2013), e vários outros subprodutos incluindo a co-fermentação usando misturas de glicerol e glicose (Wang e Yang, 2013). Porém, o baixo rendimento e produtividade devido à inibição do ácido propiônico no crescimento celular e na síntese do ácido propiônico e o custo elevado para separação dos produtos são as principais desvantagens destes processos (Blanc e Goma 1987; Feng et al., 2011; Goswami e Srivastava, 2001; Gu et al., 1998; Zhu et al., 2010). Para diminuir a inibição do ácido propiônico no crescimento celular e na síntese do ácido propiônico, diversas tecnologias são utilizadas como a fermentação extrativa de ácido propiônico (Goswami e Srivastava, 2001; Lewis e Yang, 1992) e a produção de ácido propiônico utilizando células de bactérias tolerantes ao ácido propiônico obtidas via evolução adaptativa (Woskow e Glatz, 1991; Zhu et al., 2010). Além disso, avanços na engenharia genética têm fornecido novas ferramentas para a criação de mutantes com maior capacidade de fermentação (Zhang e Yang, 2009) e processos fermentativos com imobilização celular têm apresentado diversas vantagens como aumento na produtividade volumétrica e nas taxas reacionais proporcionadas pela alta densidade celular de células
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adaptadas, também é possível alcançar altas taxas de diluição sem a lixiviação da cultura celular (Coronorado et al., 2001; Dishisha et al., 2012; Feng et al., 2011; Huang et al., 2002). Outra vantagem é que com a imobilização, os custos para separação dos produtos são reduzidos além de haver a possibilidade de utilização contínua das células, estabilidade de operação, intensificação do processo e resistência a inibidores e toxinas (Czaczyk et al., 1997). Diversos materiais têm sido empregados como suporte para imobilização como carragena (Czaczyk et al., 1997), alginato de cálcio (Rickert et al., 1998), esferas de poligalactorunorato de cálcio (Coronorado et al., 2001), fibras celulósicas (Jain et al., 1991), PEI-Poraver e PEI-Luffa (Dishisha et al., 2012) e também o uso de reatores de leito fluidizado (Feng et al., 2011; Huang et al., 2002; Yang e Huang 1995; Zhu et al., 2012).
Figura 2.2 Rota metabólica para diversas fontes de carbono para fermentação pela
10 2.1.2 Ácido succínico
O ácido succínico (C4H6O4) (Figura 2.3) tem grande aplicação industrial como intermediário químico para a produção de lacas, perfumes, aromatizantes e agentes bacteriostáticos ou neutralizantes na indústria alimentícia. Além disso, o ácido succínico possui mercado de produtos químicos especiais para a produção de revestimentos, corantes surfactantes, detergentes, solventes verdes, plásticos biodegradáveis e estimulantes para o crescimento de plantas e animais. Baseado na estrutura linear saturada de um ácido dicarboxilíco, o ácido succínico pode ser prontamente convertido em outros produtos químicos como 1,4-butanodiol (Minh et al., 2010), γ-butirolactona, tetrahidrofurano, ácido adípico, N-metilpirrolidona e ésteres lineares alifáticos. Um novo polímero biodegradável, poli(succinato de 1,3-propileno), pode ser obtido por policondensação de ácido succínico com 1,3-propanodiol e poli(butileno succinato) (Ranucci et al., 2000). Além disso, é esperado o aumento na demanda do ácido succínico devido seu uso no processo de produção de polímeros biodegradáveis como polibutirato succinato (PBS) e poliamidas (Nylon®) e vários solventes verdes (Song e Lee 2006). Enquanto a atual produção global de ácido succínico está em torno de 30000 a 50000 toneladas ao ano com o preço de mercado de US$ 2400-3000 por tonelada, é esperado que a produção atinja 100000 toneladas por ano até 2015 (Adsul et al., 2011). Segundo Koutinas et al., (2014) se a produção de glicerol a partir do biodiesel esperada para 2021 (3x106 toneladas) for utilizada para a produção e ácido succínico, com um rendimento de 0,8 g g-1 e admitindo uma perda de 8,4 % durante o processo de separação e purificação, então 2,2x106 toneladas de ácido succínico poderiam ser produzidos, o que seria uma produção mais do que 40 vezes maior do que a produção global atual.
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Atualmente, a maior parte do ácido succínico disponível comercialmente é produzida através de processos petroquímicos como a oxidação da parafina, a hidrogenação catalítica, ou eletro redução de ácido maleico ou anidrido maleico (Zhang e Zhang, 2004). Desenvolvimentos recentes concentram-se em alternativas biotecnológicas, em particular, a transformação microbiana baseada na utilização da biomassa como matéria-prima renovável (Cheng et al., 2012; Hatti-Kaul et al., 2007).
2.1.3 Ácido acético
A produção de ácido propiônico geralmente é acompanhada pela produção de ácido acético (C2H4O2) (Figura 2.4), um subproduto da fermentação pela propionibactéria, além da produção de ácido succínico e dióxido de carbono. A produção de ácido acético prejudica o rendimento e dificulta a purificação do ácido propiônico (Liu et al., 2011). A separação dos ácidos acético e propiônico é difícil de ser alcançada e é uma etapa cara do processo fermentativo (Boyaval et al., 1994). A formação do ácido acético ocorre por razões estequiométricas e para manter o balanço de hidrogênio e redox (Seshadri e Mukhopadhyay, 1993). No metabolismo da glicose pela propionibactéria, por exemplo, teoricamente são gerados 2 mols de propionato, 1 mol de acetato e 1 mol de dióxido de carbono a partir de 1,5 mol de glicose (Woskow e Glatz, 1991). Alguns estudos utilizando do glicerol como fonte de carbono (Dishisha et al., 2012; Himmi et al., 2000; Liu et al., 2011; Zhang e Yang, 2009) mostraram-se interessantes e vantajosos uma vez que a produção de ácido acético foi menor para o consumo do glicerol que para outras fontes de carbono. Liu et al., (2011) notaram que a formação de ácido acético era aproximadamente 80 % menor com o glicerol que com a glicose. É conhecido que o glicerol e o ácido propiônico têm o mesmo grau de redução (γD = 4,67) (VanBriesen, 2002) e assim podem manter o balanço redox sem a produção de outro metabólito (Liu et al., 2011). Em contraste, a produção de ácido propiônico a partir da glicose leva necessariamente à formação de um metabólito mais oxidado como o ácido acético (γD = 4,00) para alcançar o balanço redox, assim, uma porção do fluxo de carbono é direcionada para a formação do ácido acético a partir da glicose, o que resulta em menor rendimento do ácido propiônico (Himmi et al., 2000).
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Figura 2.4 Estrutura do ácido acético. 2.1.4 Ácido lático
O ácido lático (ácido 2-hidroxipropiônico) (C3H6O3) é o ácido carboxílico com maior ocorrência na natureza. O químico sueco Scheele foi o primeiro a descobri-lo em 1780, mas foi produzido comercialmente pela primeira vez por Charles E. Avery em Littleton, Massachussets, EUA em 1881 (Naraynan et al., 2004).
O ácido lático pode ser produzido via síntese química ou fermentação microbiana. No entanto, o processo químico produz a mistura racêmica (50:50) de D-ácido lático e L -ácido lático (Figura 2.5), o que é indesejável para as indústrias alimentícia, farmacêutica e de bebidas devido aos problemas metabólicos que o D-ácido lático pode causar. A indústria do poli(ácido lático), normalmente requer L-ácido lático com alta pureza ótica (98-99 %), desta forma, a síntese química não é o processo apropriado para esta aplicação e o processo fermentativo é preferido devido sua facilidade química e econômica que possibilita a produção de ácido lático óticamente puro (Datta e Henry, 2006; Inkinen et al., 2011).
Figura 2.5 Estruturas do D-ácido lático e L-ácido lático.
A síntese química do ácido lático é baseada na lactonitrila. Ácido cianídrico é adicionado ao acetaldeído na presença de uma base para produzir a lactonitrila. Esta reação ocorre em fase líquida a altas pressões atmosféricas. A lactonitrila é purificada por destilação e é posteriormente hidrolisada para ácido lático com HCl concentrado ou com H2SO4, produzindo o sal de amônio correspondente e o ácido lático. O ácido lático é então
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esterificado com metanol para produzir lactato de metila, o qual é removido e purificado por destilação e hidrolisado sob catálise ácida para produzir ácido lático e metanol, o qual é reciclado. Este processo está representado abaixo pelas reações (Narayanan et al., 2004):
a) Adição de HCN 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂 + 𝐻𝐶𝑁 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑁 b) Hidrólise com H2SO4 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑁 + 𝐻2𝑂 + 1 2⁄ 𝐻2𝑆𝑂4 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 + 1 2⁄ (𝑁𝐻4)2𝑆𝑂4 c) Esterificação 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶𝐻3𝑂𝐻 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐶𝐻3 + 𝐻2𝑂 d) Hidrólise com H2O 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐶𝐻3 + 𝐻2𝑂 → 𝐶𝐻3𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝐶𝐻3𝑂𝐻
Como dito anteriormente, a síntese química do ácido lático produz uma mistura racêmica de D-ácido lático e L-ácido lático. Há outras rotas químicas para a produção do ácido lático: catálise básica da degradação de açúcares, oxidação do propilenoglicol, reação do acetaldeído, monóxido de carbono e água a altas temperaturas e pressão, hidrólise do ácido cloropropiônico, fermentação de carboidratos e oxidação do propileno por ácido nítrico (Narayanan et al., 2004).
A pureza ótica do ácido lático é crucial durante a produção do poli(ácido lático), (PLA), pois pequenas quantidades de impurezas enantioméricas mudam drasticamente algumas propriedades do polímero como a cristalinidade e a taxa de biodegradação (Inkinen et al., 2011). Muitas bactérias contêm uma enzima chamada lactado desidrogenase (LDH) que converte o ácido pirúvico em ácido lático. Dependendo da espécie bacteriana e da especificidade de sua enzima LDH, o processo de fermentação do ácido lático pode gerar L-ácido lático ou D-ácido lático com alta pureza ou uma mistura destes. Ferramentas de biologia molecular têm sido empregadas para deletar o gene D-LDH em cepas produtivas para aumentar a pureza ótica do L-ácido lático. Quando o ácido lático acumula-se no meio de fermentação, o pH é reduzido, levando a inibição da produção de ácido lático. O pH ótimo durante o processo de fermentação do ácido lático pode ser mantido através da
