NATÁLIA DE ALMEIDA RODRIGUES
IMPACTO DE DIFERENTES RELAÇÕES DE INTENSIDADE E VOLUME DE
TREINAMENTO MONÓTONO E PERIODIZADO LINEAR SOBRE
MARCADORES DE BIOGÊNESE MITOCONDRIAL EM RATOS
NADADORES
IMPACT OF DIFFERENT RELATIONS OF INTENSITY AND VOLUME OF MONOTONE TRAINING AND LINEAR PERIODIZATION ON MITOCHONDRIAL BIOGENESE
MARKERS IN SWIMMING RATS
LIMEIRA 2018
NATÁLIA DE ALMEIDA RODRIGUES
IMPACTO DE DIFERENTES RELAÇÕES DE INTENSIDADE E VOLUME DE TREINAMENTO MONÓTONO E PERIODIZADO LINEAR SOBRE MARCADORES DE
BIOGÊNESE MITOCONDRIAL EM RATOS NADADORES
IMPACT OF DIFFERENT RELATIONS OF INTENSITY AND VOLUME OF MONOTONE TRAINING AND LINEAR PERIODIZATION ON MITOCHONDRIAL BIOGENESE MARKERS IN
SWIMMING RATS
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Aplicadas do Campus de Limeira da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, na área de Biodinâmica do Movimento Humano e Esporte.
Thesis presented to the School of Applied Science of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Nutrition Science and Sport and Metabolism, in the area of Biodynamics of Human Movement and Sport.
Orientadora: PROFA. DRA. FÚLVIA DE BARROS MANCHADO-GOBATTO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONTE À VERSÃO FINAL TESE DEFENDIDA PELA ALUNA NATÁLIA DE ALMEIDA RODRIGUES E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. FÚLVIA DE BARROS MANCHADO-GOBATTO
LIMEIRA 2018
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Fúlvia de Barros Manchado-Gobatto PRESIDENTE DA BANCA
Prof. Dr. Wladimir Rafael Beck
Profa. Dra. Fernanda Klein Marcondes
Profa. Dra. Marciane Milanski Ferreira
Profa. Dra. Adriana Pertille
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo
de vida acadêmico do aluno
Gostaria de agradecer primeiramente a Deus por todas as oportunidades e desafios vivenciados durante o período de doutorado.
A Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESP) pelo suporte financeiro que possibilitou a realização desse trabalho.
A coordenadora do Laboratório de Fisiologia Aplicada ao Esporte (LAFAE), Profa. Dra. Fúlvia de Barros Manchado-Gobatto, pela generosidade em compartilhar o conhecimento, me orientando e sendo exemplo de profissional durante todo o processo. Agradeço também pela amizade e por confiar a mim esse projeto de pesquisa tão importante na minha formação.
Ao coordenador do LAFAE, Prof. Dr. Claudio Alexandre Gobatto, pela amizade e pelas oportunidades de crescimento profissional.
Agradeço aos amigos do LAFAE por todas as experiências vividas, que contribuíram direta ou indiretamente para a conclusão dessa etapa. Em especial, ao meu amigo e parceiro de trabalho Lucas Dantas Maia Forte por compartilhar comigo todos os momentos de construção desse projeto. A minha família, que estiveram ao meu lado me apoiando e sonhando comigo esse momento.
E, por último, ao meu querido Filipe Antônio de Barros Sousa por me incentivar e me ensinar a valorizar essa caminhada.
RESUMO
O exercício físico é um potente promotor de adaptações mitocondriais. Essas adaptações estão relacionadas aos parâmetros de quantidade, dinâmica e tamanho dessas organelas, tanto em modelos animais quanto em humanos, e tem sido amplamente relacionada com benefícios para a saúde e performance. Entretanto, ainda são restritos os conhecimentos sobre qual seria uma ótima prescrição de treinamento, considerando-se o método e as variáveis como intensidade e volume, capaz de potencializar os efeitos da biogênese mitocondrial. Dessa maneira, o objetivo dessa tese investigar as respostas de conteúdo proteico de marcadores de biogênese mitocondrial em tecido muscular esquelético, cardíaco e hepático após esforço agudo isocarga, bem como as adaptações aeróbias após treinamento em modelo monótono isocarga e periodizado linear de ratos nadadores. Para isso dois experimentos foram propostos, sendo um agudo e um crônico, nos quais foram determinados individualmente, pelo teste de lactato mínimo, as intensidades de capacidade aeróbia. No experimento agudo os grupos foram divididos em controle (GC), dois grupos que se exercitaram abaixo do limiar anaeróbio - LAn (GE80, GE90), um grupo que se exercitou na intensidade de LAn (GE100) e dois, acima do LAn (GE 110 e G120). Todos os animais que se exercitaram foram submetidos a volume (min) que lhes conferiu a mesma relação de carga (i.e., esforços isocarga). No experimento crônico os ratos foram divididos em Baseline, controle (GC), um grupo que treinou monotonamente abaixo do limiar anaeróbio (GT80), um grupo que treinou monotonamente na intensidade de LAn (GT100), um grupo treinado acima do LAn (GT120) e um submetido ao modelo periodizado linear (GPE). Todos os animais que treinaram monotonamente possuíram um volume que lhes conferiu a mesma relação de carga. Análise de quantidade proteica de COXIV (citocromo c oxidase) e TFAM foram feitas pelo método de Western bloting e atividade de citrato sintase pelo método enzimático. Os principais resultados mostraram que os estímulos agudos propostos não foram capazes de alterar o conteúdo das proteínas COXIV e TFAM para os tecidos musculares, cardíaco e hepático, enquanto que atividade de citrato sintase foi sensível apenas para o gastrocnêmio e fígado em decorrência das alterações de intensidade, destacando a redução da atividade de citrato sintase no GE120 para ambos os tecidos. No experimento crônico foi possível também observar uma tecido-dependência com relação as adaptações, sendo que o conteúdo de proteína TFAM apenas aumentou para o grupo GT100 no gastrocnêmio, enquanto COXIV aumentou em GT80, GT100 e GT120 no sóleo. No entanto, a atividade de citrato sintase aparece aumentada apenas para o grupo GT120 no tecido gastrocnêmio, o que coincide com a menor redução da capacidade aeróbia ao longo do período. Em suma, alterações no conteúdo de proteínas responsáveis pelo funcionamento da fosforilação oxidativa parecem ser favoráveis para minimizar os declínios da capacidade aeróbia dos animais submetidos a 12 semanas de treinamento de natação. Os treinamentos monótonos se mostraram mais eficazes se comparados ao periodizado, com destaque para o grupo GT120 com melhora da capacidade aeróbia e GT80 com melhora anaeróbia e sendo mais eficiente na manutenção do exercício.
to the parameters of quantity, dynamics and size of these organelles, both in animal models and in humans, and have been widely related to health and performance benefits. However, the knowledge about what would be a great training prescription, considering the method and the variables as intensity and volume, is still limited, capable of potentiating the effects of mitochondrial biogenesis. Thus, the objective of this thesis was to investigate the protein content responses of markers of mitochondrial biogenesis in skeletal, cardiac and hepatic muscle tissue after acute isoload effort, as well as the aerobic adaptations after training in a monotonous isoload and linear periodized model of swimming rats. For this, two experiments were proposed, one being acute and one chronic, in which the aerobic capacity intensities were determined individually by the minimum lactate test. In the acute experiment the groups were divided in control (GC), two groups that exercised below the anaerobic threshold - LAn (GE80, GE90), one group that exercised in the intensity of LAn (GE100) and two, above the LAn (GE 110 and GT120). All animals that were exercised were subjected to volume (min) which gave them the same loading ratio (i.e., isotonic efforts). In the chronic experiment the rats were divided into baseline, control (GC), a group that trained monotonously below the anaerobic threshold (GT80), a group that monotonously trained in the intensity of LAn (GT100), a group trained above the LAn (GT120) and one submitted to the periodized linear model (GPE). All animals that trained monotonously had a volume that gave them the same load ratio. Protein amount analysis of COXIV (cytochrome c oxidase) and TFAM were done by Western blotting method and citrate synthase activity by the enzymatic method. The main results showed that the proposed acute stimuli were not capable of altering the content of the COXIV and TFAM proteins to the muscular, cardiac and hepatic tissues, whereas citrate synthase activity was sensitive only to the gastrocnemius and liver due to changes in intensity, highlighting the reduction of citrate synthase activity in GE120 for both tissues. In the chronic experiment it was also possible to observe a tissue-dependence regarding the adaptations, and the TFAM protein content only increased for the GT100 group in the gastrocnemius, while COXIV increased in GT80, GT100 and GT120 in the soleus. However, citrate synthase activity appears to be increased only for the GT120 group in gastrocnemius tissue, which coincides with the lower reduction of aerobic capacity over the period. In summary, changes in the content of proteins responsible for the functioning of oxidative phosphorylation seem to be favorable to minimize declines in aerobic capacity of animals submitted to 12 weeks of swimming training. The monotonous training proved to be more effective compared to the periodized one, with emphasis on the GT120 group with improved aerobic capacity and GT80 with anaerobic improvement and being more efficient in maintaining the exercise.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação da determinação da intensidade de lactato mínimo (iLM) pelo método intensidade
vs. tempo. a) Curva da concentração de lactato sanguíneo ao longo da fase 3 do teste de lactato mínimo (teste incremental) para determinação do ponto mínimo, b) Reta de regressão intensidade vs. tempo.
Figura 2. A) Rato nadando durante procedimento experimental. Filtro de luz vermelha no ambiente de
coleta. B) Cargas construidas com peças de chumbo e latex.
Figura 3. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento agudo. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados nos grupos exercícios e 4h após a sessão aguda foram eutanasiados. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Figura 4. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento crônico. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o primeiro teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados nos grupos e foram submetidos a um período de 12 semanas de treinamento com frequência de 6 dias/semana. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Figura 5. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo. Comparação
entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) no gastrocnêmio e sóleo. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
Figura 6. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo. Comparação
entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos hepático e cardíaco. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
e cardíaco. diferente de GE80; diferente de GE90; diferente de GE100; diferente de GE110; diferente de GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM).
Figura 8. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para o gastrocnêmio, glúteo e fígado para o experimento
agudo. b diferente de GE80; c diferente de GE90; d diferente de GE100; e diferente de GE110; f diferente de
GE120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM).
Figura 9. (a) Média ± ep da iLM (%mc) para os grupos GC, GT80, GT100, GT120 e GPE; (b) Média ± ep
da iLM normalizada pelas iLM do momento pré para os grupos; (c) Média ± ep da Tlim 13%mc (s) para os grupos; (d) Média ± ep da Tlim 13%mc normalizada pelas Tlim 13%mc do momento pré para os grupos a
diferente de GC; c diferente de GT100; d diferente de GT120, e diferente de GPE, * diferença entre pré e pós.
P < 0.05. (GC= grupo controle; GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear.)
Figura 10. Média ± ep da relação entre Tlim normalizado e iLM normalizado para os grupos GT80, GT100,
GT120 e GPE pós período de treinamento. a diferente de GT80. P < 0.05. (GT80=grupo treinamento a 80%
da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 11. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o gastrocnêmio e sóleo no
experimento crônico. a diferente de GC; b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de GPE.
Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 12. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para os tecidos hepático e cardíaco do
experimento crônico. b diferente de baseline; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as análises foi
usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 13. Média ± ep da atividade de citrato sintase dos tecidos musculares (gastrocnêmio e sóleo),
hepático e cardíaco para o experimento crônico. a diferente de GC; b diferente de baseline; c diferente de
GT80; d diferente de GT100; e diferente de GT120; f diferente de GPE. Para as análises foi usado um
P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Figura 14. Média ± ep do conteúdo de glicogênio para os tecidos gastrocnêmio, glúteo e fígado para o
experimento crônico. b diferente de baseline; c diferente de GT80; d diferente de GT100; e diferente de
GT120. Para as análises foi usado um P<0,05. (GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear).
Tabela 1. Descrição das intensidades (%mc), volume (min) e carga dos grupos exercício referentes ao experimento agudo.
Tabela 2. Descrição das intensidades (%mc), volume (min), carga de treinamento, frequência e o momento em que os animais foram eutanasiados referentes ao experimento crônico.
Tabela 3. Organização do treinamento do grupo periodizado linear (GPE) utilizando as intensidades (END1, END2, END3 e ANA) ao longo das 12 semanas como proposto por de Araújo et al., 2012.
Tabela 4. Média ± ep dos valores de tempo limite - Tlim (s) e intensidade de lactato mínimo - iLM (%mc) obtidos no teste de lactato mínimo (TLM).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPK - Proteína quinase ativada por AMP ATP – Adenosina trifosfato
CAMKII – Calmodulina dependente de cálcio COXIV – Citocromo c oxidase
DNA – Ácido desoxirribonucleico HIIT – High Intensity Interval Training mRNA –Ácido ribonucleico mensageiro mtDNA – DNA mitocondrial
nDNA – DNA nuclear
NRF1/2 – Fator respiratório nuclear 1/2
PGC-1α - Coativador de transcrição proliferador de peroxissomo ativado receptor-γ coativador-1α PPARβ - Receptor de ativado por proliferador de peroxisoma β
p38 MPK – Proteína quinase ativada por mitógeno p38 rRNAs - Ácido ribonucleico ribossômico
Sirt1 – Sirtuin 1
SIT – Sprint Interval Training
TFAM – Fator A de transcrição mitocondrial tRNAs - Ácido ribonucleico transportador TFB1M – Fator de transcrição mitocondrial B1 TFB2M - Fator de transcrição mitocondrial B2 VO2max –Consumo máximo de oxigênio
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 17
2.1. Domínios de intensidade de exercício ... 17
2.2. Aspectos gerais da biogênese mitocondrial ... 18
2.3. Vias de regulação da biogênese mitocondrial induzida pelo exercício ... 19
2.4. Influência da intensidade e volume sobre a biogênese mitocondrial ... 21
3. OBJETIVO ... 25
4. HIPÓTESES ... 26
5. MATERIAIS E MÉTODOS ... 26
5.1. Animais ... 26
5.2. Procedimentos experimentais gerais ... 27
5.2.1. Adaptação ao meio líquido – ... 27
5.2.2. Teste do Lactato Mínimo: ... 27
5.3. Desenho experimental ... 28
5.3.1. Experimento agudo ... 30
5.3.2. Experimento Crônico ... 31
5.3.3. Amostras sanguíneas: ... 34
5.4. Obtenção do material biológico ... 35
5.4.1. Quantificação de proteína por Western blotting ... 35
5.4.2. Atividade enzimática de citrato sintase (CS) ... 35
5.4.3. Estoque de glicogênio ... 36
6. RESULTADOS ... 36 6.1. Experimento Agudo ... 36 6.2. Experimento Crônico ... 41 7. DISCUSSÃO ... 47 8. CONCLUSÃO ... 51 9. REFERÊNCIA ... 51
1. INTRODUÇÃO
O exercício físico é capaz de promover adaptações que favorecem o desempenho esportivo, a qualidade de vida e a longevidade. Recentemente ganharam notoriedade as adaptações relacionadas aos parâmetros de quantidade, dinâmica e tamanho de organelas mitocondriais tanto em modelos animais quanto em humanos, devido a gama de benefícios associados a saúde, pertinentes à redução de sintomas de doenças crônicas como obesidade (Heo et al., 2017) e diabetes (Besseiche et al. 2015; Herst et al. 2017), aumento da produção de compostos antioxidantes (Ji et al. 2016), redução dos efeitos deletérios da idade (Cartee et al. 2016) e melhora de performance por meio de uma maior eficiência de ressíntese de ATP por via oxidativa (Drake et al. 2016).
No entanto, ainda há pouco conhecimento sobre qual seria a ótima relação entre intensidade e volume (carga) para a prescrição de exercício, considerando-se o método e as variáveis de treinamento, capaz de potencializar os efeitos adaptativos mitocondriais. Em recente revisão de literatura, Bishop et al. (2014) questionam como a função e o conteúdo mitocondrial se modelam frente às variáveis de volume e intensidade de exercício. Os autores apresentaram dados que relacionam a função mitocondrial (via consumo isolado de oxigênio ou consumo de oxigênio de fibras permeabilizadas) com o aumento da intensidade do exercício e o conteúdo mitocondrial, (atividade de citrato sintase) com o aumento do volume. Embora os autores apresentem uma tendência dessas relações, há ainda a necessidade de investigar o efeito dessas variáveis de treinamento sobre as adaptações mitocondriais e como isso pode refletir no desempenho aeróbio.
Em 1967, Holloszy propôs um dos primeiros estudos em que se atribuiu ao treinamento de endurance (alto volume e moderada intensidade) o aumento de marcadores de biogênese mitocondrial em tecido músculo esquelético em roedores. Mais recentemente, Mille-Hamard et
al. (2015) prescreveram individualmente três intensidades de exercício tendo como parâmetros
a velocidade crítica (relativo a capacidade aeróbia), a velocidade de VO2max e 150% da velocidade crítica determinada em corrida para camundongos. Nesse caso, os três exercícios caracterizados como esforços intenso e severos respectivamente, refletiram em diferentes expressões de genes relacionados a biogênese mitocondrial (PGC-1α, PPARβ, Sirt1, TFAM), mostrando que o aumento da intensidade pode promover uma moderada expressão desses marcadores. Não obstante, Terada et al. (2005) ao proporem um treinamento intervalado de alta
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intensidade e um contínuo em baixa intensidade para roedores encontraram que o primeiro aumenta o conteúdo proteico de PGC-1α , uma vez que, segundo os autores, o aumento da atividade de enzimas oxidativas mitocondriais é provocado pela alta intensidade de exercício.
Os estudos que envolvem modelos humanos e treinamento tendem a mostrar a efetividade dessas adaptações mitocondriais associadas à elevação de parâmetros aeróbios (Bishop et al., 2014), porém devem ser considerados o nível inicial de condicionamento físico dos participantes e a aderência ao programa de treinamento, bem como a pequena representação da porção músculo esquelética executada por meio de biópsia, o que também impossibilita a avaliação de outros tecidos. Por outro lado, embora os estudos com modelos animais, mais propriamente os roedores, fiquem aquém dos gestos motores e especificidades esportivas, esses conseguem representar respostas fisiológicas e metabólicas semelhantes ao modelo humano com a vantagem de um maior controle ambiental, de treinamento e de linhagem (Booth et al., 2010).
A proposta de investigar as adaptações de proteínas mitocondriais relacionadas a biogênese e diferentes modelos e variações de volume e intensidade de treinamento foi impulsionada por estudos anteriores que identificaram modificações na capacidade aeróbia de roedores frente ao treinamento (de Araujo et al., 2013; de Araujo et al., 2012). Em 2012, de Araujo et al. (2012) propuseram um modelo periodizado para ratos com cargas de treinamento lineares em natação. Esse modelo foi composto por cargas que se modulavam ao longo do período, iniciando com a predominância do volume na fase de base e finalizando com a predominância da intensidade na fase de polimento. Ao longo das doze semanas de treinamento, foi observado que a capacidade aeróbia dos animais treinados reduziu em 18% enquanto para os animais controle, a redução foi de 35% em comparação aos animais baseline.
Os autores observaram uma similar resposta adaptativa da capacidade aeróbia em outro estudo (de Araujo et al., 2013) em que também treinaram roedores, durante doze semanas, em um modelo monótono de treinamento de natação. Nesse caso, a relação da carga de treinamento não se alterava ao longo do tempo, sendo testadas duas intensidades de esforço sub limiar anaeróbio (LAn) (80% e 90% do LAn), desempenhadas sob mesmo volume (aproximadamente 50min diários). Ambos os grupos submetidos ao treinamento apresentaram uma redução atenuada da capacidade aeróbia em aproximadamente 15%, enquanto essa mesma capacidade para o grupo controle sofreu redução de 19% se comparada ao grupo baseline.
Tais resultados despertaram o interesse e o questionamento sobre os motivos que levaram a atenuação da redução da capacidade aeróbia nos animais treinados e quais modelos ou relações das variáveis de treinamento são mais efetivos para desenvolver (ou ao menos
atenuar o declínio) dessa capacidade. Em resposta a esses questionamentos, um modelo de treinamento monótono isocarga (cargas de treinamento equivalentes) foi proposto para que a comparação entre os modelos permita inferir qual variável (intensidade ou volume) é mais influente nas respostas adaptativas para a capacidade aeróbia.
Dessa maneira essa tese foi dividida em dois experimentos, que foram desenvolvidos sequencialmente, com modelo animal de roedores e natação. A proposta do experimento 1 foi uma análise das respostas ao esforço agudo considerando cinco exercícios em isocarga, sendo dois com intensidades sub limiar anaeróbio (80% e 90%), uma na intensidade de limiar anaeróbio (100%) e dois com intensidades supra limiar anaeróbio (110% e 120%). Para o
experimento 2 foi analisado as adaptações ao treinamento seguindo o modelo monótono com
intensidades selecionadas do experimento 1 (80%, 100% e 120% relativos ao limiar anaeróbio) e o modelo de treinamento periodizado linear.
Ambos seguem a proposta de analisar a quantificação de proteínas em diferentes tecidos (muscular, hepático e cardíaco) que estão ligadas a adaptações relativas de biogênese mitocondrial. Dentre as proteínas, foram selecionadas duas que acionam funções específicas no DNA mitocondrial (TFAM e COXIV) e uma enzima do ciclo de ácido tricarboxílico (citrato sintase), sendo que todas possuem relação com o exercício físico (Hood et al., 2016; Leek et
al., 2001; Theilen et al., 2017).
Desta maneira, investigar o efeito do exercício agudo e do treinamento sobre marcadores de biogênese mitocondrial em modelos isocarga possibilita aprofundar o estudo sobre como potencializar os ganhos aeróbios. Adicionado a isso, averiguar o conteúdo proteico desses marcadores em diferentes tecidos pode indicar um caminho, tanto na área da performance quanto na da saúde.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Domínios de intensidade de exercício
Os domínios de intensidade de exercício são delimitações fisiológicas correspondentes às demandas energéticas. Uma adequada prescrição de exercícios agudos e crônicos depende do conhecimento dessas intensidades individuais, pois cada domínio possui características particulares. De acordo com Gaesser e Poole (1996), os domínios de intensidade são caracterizados como moderado, intenso e severo, sendo eles distintos quando consideradas as respostas fisiológicas geradas bem como suas adaptações advindas do treinamento.
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No domínio moderado são encontradas respostas fisiológicas estáveis (frequência cardíaca, consumo de oxigênio e lactato sanguíneo), proporcionado pelo pequeno aumento da contribuição cardiorrespiratória e metabólica. No domínio intenso encontra-se a zona de transição aeróbia-anaeróbia (Faude et al., 2009) compreendido entre o primeiro limiar, também conhecido como limiar aeróbio e o segundo limiar conhecido como limiar anaeróbio (Kiderman
et al., 1979), que na presente tese será tratado também como capacidade aeróbia. Nesse domínio
de intensidade as respostas fisiológicas são mais elevadas se comparadas ao exercício moderado, mas ainda, de modo tardio, conseguem encontrar a estabilização em esforços contínuos. A mais alta intensidade em que ocorre esse equilíbrio, sendo também o ponto onde a produção de lactato se iguala a remoção, é nomeado de máxima fase estável de lactato (Faude
et al., 2009).
No domínio severo, intensidades acima do limiar anaeróbio, as respostas fisiológicas tendem aos seus valores máximos, uma vez que esforços nesse domínio, diferentemente do anterior, não geram condições estáveis ao organismo. Em complemento, Hill et al. (2005) sugerem ainda um quarto domínio de intensidade, intitulado como extremo, ocorrendo em intensidades de exercício supra máximas, onde ocorre a fadiga sem o consumo de oxigênio atingir valores pico.
A identificação individualizada dos limites entre os domínios, principalmente do ponto de transição metabólica, permite potencializar os efeitos do exercício e uma correta prescrição dos métodos de treinamento. Diferentes adaptações são encontradas quando explorado intensidades dentro de cada domínio, sendo observado uma intensidade dependência nas respostas celulares (Egan et al., 2010). Assim, diferentes intensidades, contidas em distintos domínios, serão explorados visando as principais adaptações com relação a biogênese mitocondrial.
2.2. Aspectos gerais da biogênese mitocondrial
A mitocôndria apresenta características importantes para a sobrevivência da célula eucariótica, sendo responsável por 90% da energia produzida (Mootha et al., 2003). Em sua estrutura é possível encontrar uma membrana externa, uma interna na qual ocorre a cadeia de transporte de elétrons e onde está localizada o complexo ATP sintetase, as cristas da membrana interna e a matriz mitocondrial, onde há uma alta concentração de enzimas responsáveis pela oxidação de piruvato e ácidos graxos no ciclo de ácido tricarboxílico. Apresenta também um DNA circular, no qual são codificados uma pequena quantidade de genes específicos, sendo 13
proteínas estruturais da cadeia de transporte de elétrons, 22 tRNAs e 2 rRNAs. O restante de seus genes é codificado no núcleo da célula (Dominy & Puigserver, 2013).
As mitocôndrias estão envolvidas em diversos processos celulares tais como as vias de biossíntese, produção de corpos cetônicos, síntese hormonal, manutenção da homeostase e na morte celular (Dominy and Puigserver, 2013; Ploumi et al., 2017). Devido à importância dessas funções dentro da célula, as mitocôndrias estabelecem uma complexa rede com o núcleo, se adaptando em relação ao seu número e função, em situações de alteração metabólica e modificações do seu estado homeostático (Ploumi et al., 2017).
A biogênese mitocondrial ocorre por meio de atividades coordenadas entre o DNA nuclear (nDNA) e DNA mitocondrial (mtDNA), com o propósito de formar novas proteínas que são adicionadas ao retículo da mitocôndria para posterior incorporação e remodelação dentro dos processos de fusão e fissão (Kim et al., 2017). Esse processo é dinâmico e permite, além do compartilhamento de componentes do mtDNA, a remoção e degradação de componentes danificados (Russell et al., 2014). Por conseguinte, o conteúdo mitocondrial dentro de uma célula estabelece uma relação de equilíbrio entre a sua biogênese e os processos de degradação (Hood et al., 2015; Russell et al., 2014).
As adaptações de conteúdo mitocondrial podem ser encontradas tanto em modelo animal quanto em humano por meio da análise das atividades enzimáticas (citrato sintase, succinato desidrogenase e COX) e quantificação de genes e proteínas específicas (COX, NRF1/2, TFAM, PGC-1α, SIRT1) (Herst et al., 2017). Embora as mitocôndrias estejam presentes em quase todas as células eucarióticas, seu proteoma é complexo e exibe heterogeneidade de tecido para satisfazer as necessidades metabólicas e energéticas específicas de cada tipo de célula (Valero, 2014). Ainda, as diferenças entre espécies e a quantidade ofertada de estímulo pode gerar resultados conflitantes (Islam et al., 2017; Safdar et al., 2011).
Nesse contexto, sendo o exercício físico um potente indutor de biogênese mitocondrial (Bishop et al., 2014; MacInnis et al., 2017), nessa revisão serão discutidas as principais vias da biogênese mitocondrial induzida pelo exercício e a relação com as variáveis de treinamento (volume e intensidade).
2.3. Vias de regulação da biogênese mitocondrial induzida pelo exercício
Tem-se o conhecimento que o exercício físico atua como um agente estressor celular, promovendo alterações na homeostase tais como a diminuição dos níveis de ATP mitocondrial que causam a privação de energia (aumento da taxa de AMP/ATP) induzindo o aumento da
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sinalização de proteínas quinase (AMPK), elevação de Ca+2 citosólico proporcionado pelo aumento da contração muscular, elevação da taxa NADH/NAD+ que afeta a membrana e o potencial redox, fosforilação da proteína p38 AMPK e aumento das espécies reativas de oxigênio (ROS) (Herst et al., 2017; Hood et al., 2016; Hood et al., 2015). Todas essas alterações são capazes de estimular fatores transcrionais que aumentam a regulação de genes mitocondriais.
Segundo Hood et al. (2016) a síntese de novas organelas é resultado de um acúmulo de estímulos agudos resultante do processo de treinamento. Ainda, cada sessão de exercício aumentaria a expressão de mRNAs específicos promovendo uma nova cascata de sinalizações podendo resultar na tradução de novas proteínas. De acordo com Erlich et al. (2016) o conteúdo mitocondrial do músculo esquelético pode aumentar entre 50 e 100%, dependendo do programa de exercício, fornecendo a esse tecido uma capacidade aprimorada de fornecimento de energia oxidativa. Em contrapartida, a inatividade física pode provocar a redução de 50 a 75%, o que pode comprometer o funcionamento celular.
Um dos pioneiros na associação entre exercício físico e biogênese mitocondrial no tecido esquelético foi Hollosky (1967) que propôs um treinamento de doze semanas com exercício de longa duração (120min) para modelo de roedores em esteira rolante. Posteriormente, Puigserver et al. (1998) mostrou que o coativador 1-alfa do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α) age coordenando a interação entre nDNA e mtDNA promovendo a síntese de proteínas relacionadas a biogênese mitocondrial e termogênese em tecido de gordura marrom. Dessa maneira a PGC-1α tem sido reconhecida como um dos principais coativadores transcricionais da via da biogênese, sendo um marcador sensível das alterações homeostáticas causadas pelo exercício.
Em recente revisão, Islam et al. (2017) discute a possibilidade de duas vias nas quais a PGC-1α poderia mediar o processo de biogênese mitocondrial induzida pelo exercício no tecido músculo esquelético. A primeira está pautada no paradigma apresentado, no qual a PGC-1α, quando fosforilada, seria capaz de coativar fatores transcricionais nucleares que induzem o aumento de genes mitocondriais. Assim, a PGC-1α se translocaria do citosol para o núcleo da célula promovendo o aumento de fatores respiratórios nucleares (NRF1/2) que se ligariam aos promotores dos genes alvo induzindo a expressão do fator transcricional A mitocondrial (TFAM) e fatores transcricionais B1 e B2 mitocondrial (TFB1M e TFB2M). Destaca-se que a TFAM apresenta a função de iniciar a transcrição, replicação e manutenção do mtDNA (Theilen
A segunda via discutida por Islam et al. (2017) estaria relacionada a interação direta da PGC-1α com a TFAM dentro da mitocôndria, não necessitando da ação coordenada com o núcleo celular. Outros autores como Safdar et al. (2011) e Smith et al. (2013) mostraram que o exercício agudo em ratos, camundongos e humanos seria capaz de translocar a PGC-1α para dentro do subsarcolema mitocondrial, no qual aumentaria a função regulatória da TFAM na região D-loop (displacement loop) do mtDNA.
Embora essas vias sejam as mais comuns para explicar a biogênese de mitocôndrias induzida pelo exercício, outros mecanismos necessitam de elucidação, uma vez que esse processo é dinâmico e complexo. Nesse sentido, estudos que utilizam modelos de roedores com seleção de linhagem para baixa e alta capacidade de treinamento (Marton et al., 2015) e modelos knockout para genes como PGC-1α (Erlich et al., 2016) tem demonstrado a importância do exercício para a manutenção do conteúdo dessa organela, mesmo nos animais que não expressam geneticamente essa característica.
Pode-se citar alguns marcadores de biogênese mitocondrial como a PGC-1α, TFAM, COX e citrato sintase, sendo esses modulados pelo exercício físico (Russell et al., 2014). Além do exemplificado para PGC-1α e TFAM, o citocromo-c oxidase (COX) representa a subunidade 4 da cadeia de transporte de elétrons, responsável pela doação de elétrons ao oxigênio, estando relacionada a fosforilação oxidativa e produção de ATP. Essa subunidade é codificada no núcleo celular dependendo também da ação coordenada entre nDNA e mtDNA (Bengtsson et
al., 2001). Ainda a citrato sintase, é uma enzima transferase que controla a etapa inicial do ciclo
do ácido tricarboxílico. Embora seja codificada no núcleo mitocondrial, se localiza na matriz dessa organela (Bengtsson et al., 2001).
Assim, diversas proteínas e vias estão relacionadas ao processo de biogênese mitocondrial, devido a sua importância dentro do funcionamento celular. Dessa maneira, no próximo item utilizaremos dessas proteínas e fatores transcricionais para caracterizar como as variáveis de treinamento podem influenciar na biogênese mitocondrial.
2.4. Influência da intensidade e volume sobre a biogênese mitocondrial
As variáveis de intensidade e volume de treinamento são capazes de promover diferentes adaptações mitocondriais, sendo que alguns estudos sinalizam uma relação da intensidade com a melhora da função e o volume, com o aumento da biogênese mitocondrial (Bishop et al., 2014). O treinamento de endurance, no qual ocorre a prevalência do volume e uma moderada intensidade, é reconhecido por beneficiar o condicionamento aeróbio e aumentar
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o conteúdo de mitocôndrias (Greggio et al., 2017). Por outro lado, estudos têm indicado que exercícios em alta intensidade possam ser mais eficientes nesse processo (MacInnis e Gibala, 2017; Scalzo et al., 2014).
Com a proposta de investigar uma possível “intensidade-dependência” na regulação da expressão de PGC-1α no músculo esquelético humano, Egan et al. (2010) propuseram um experimento agudo em cicloergômtro, em que duas intensidades foram avaliadas, sendo uma equivalente 40% (baixa intensidade) e, a segunda, em 80% (alta intensidade) do VO2pico. A maior contração do músculo esquelético em intensidade alta de exercício promoveu uma maior ativação da sinalização das proteínas quinases AMPK e CAMKII como resultado do aumento do influxo de cálcio, aumento da necessidade de energia e estresse celular. Essas proteínas quinases são algumas das principais reguladoras upstream da PGC-1α, apresentando, nesse caso, uma maior expressão em intensidades altas. Em animais, essa relação de “intensidade-dependência” da PGC-1α também foi testada por Brandt et al. (2017) mostrando que em exercício agudo e treinamento a intensidade estabelece uma relação crescente com as respostas de expressão. Nesse caso, conteúdo de COXIV não se alterou, bem como, atividade de citrato sintase reduziu com a intensidade.
Embora PGC-1α regule as atividades transcricionais nucleares e mitocondriais, a análise isolada da sua expressão pode levar a conclusões errôneas sobre como a intensidade de exercício geram adaptações no conteúdo mitocondrial. Nesse contexto, Cochran et al. (2014) propuseram dois experimentos em ciclo ergômetro, sendo que o primeiro examinava se a cascata de sinalização ligada a biogênese mitocondrial era sensível ao método de exercício. Assim, um exercício intervalado de alta intensidade com 4 séries de Wingate (30s) com pausas de 4 min e um exercício em all-out (~4min) foram executados. Ambos apresentaram aumento na expressão de AMPK, p38 MPK e PGC-1α mRNA em tecido muscular esquelético. O segundo experimento consistia de verificar se haveria o aumento de atividade de citrato sintase e conteúdo de COX, após 6 semanas (3 vezes por semana) dos mesmos protocolos de exercício. Neste caso, apenas o treinamento em alta intensidade apresentou o aumento de COX, especificamente de subunidade 4, acompanhado de uma melhora de VO2max. A atividade de citrato sintase não apresentou diferença entre as intervenções.
Em complemento, Granata et al. (2016) propuseram um treinamento de 4 semanas contemplando três protocolos, um contínuo (25 - 30min) com intensidades abaixo do limiar anaeróbio; um HIIT ‘high intensity interval training’ com 4min de exercício em intensidades supra limiares e pausa ativa de 2min e um SIT ‘sprint interval training’ com 30s de exercício em intensidades acima da potência pico e pausa passiva de 4min. Os autores observaram que o
conteúdo de proteína PGC-1α após o treinamento em SIT, entretanto atividade de citrato sintase e TFAM não se alteraram.
A maior intensidade de exercício parece promover modificações na PGC-1α, entretanto os outros marcadores de biogênese mitocondrial parecem não acompanhar tais modificações. Ainda, resultados discrepantes são também encontrados, como o estudo de Mille-Hamard et al. (2015) no qual propuseram três diferentes intensidades de exercício relativas a velocidade crítica e velocidade pico para camundongos. A análise de correlação apresentou uma relação negativa entre a expressão de PGC–1α e a intensidade, o que sugere neste estudo que intensidades altas promovem um menor aumento da expressão desse coativador, enquanto que a proteína TFAM apresentou uma redução para todos os grupos. Todos os três exercícios foram realizados até exaustão representando uma significativa diferença entre os volumes e consequentemente entre as cargas.
Bishop et al. (2014) apresentaram uma relação entre a atividade de citrato sintase e o aumento do volume de treinamento, entretanto discrepantes respostas na literatura podem ser motivadas por questões metodológicas como nível de condicionamento dos participantes, duração ou método de treinamento (Leek et al., 2001; Vigelso et al., 2014). Discordantes também são as alterações para TFAM e COX levantadas por Islam et al. (2017), em relação as com respostas coordenadas com a PGC–1α principalmente para o modelo humano, indicando uma diferença nas respostas frente aos estímulos em decorrência da espécie e do tecido.
Os tecidos esquelético, cardíaco e hepático demandam diferentes necessidades energéticas gerando adaptações específicas a cada nível celular. A diferença na resposta da PGC-1α entre os tecidos esquelético e cardíaco pode ser atribuída as diferenças na disponibilidade de fatores transcricionais e sinalização celular (Russel et al., 2004). Diferente dos outros tecidos, a demanda energética do coração é elevada, dependendo assim de uma alta produção de energia, que é sustentada por uma especializada capacidade do sistema mitocondrial (Leone, et al., 2011). Evidencia-se também que o tipo e a intensidade do exercício determinam a natureza e o grau das adaptações nesse tecido com mudanças hemodinâmicas que fornece estímulo para crescimento e adaptações atriais e ventriculares (Fulghum e Hill, 2018). A PGC-1α parece ser um ponto comum aos processos de biogênese mitocondrial nesses tecidos, sendo que no coração é sensível ao aumento de catecolaminas, promovido pelo exercício, via sinalização de receptores β-adrenérgicos (Fulghum e Hill, 2018). Entretanto, o papel desse coativador, não se restringe apenas à resposta dos mecanismos contráteis e de estresse como anteriormente elucidados. Destaca-se também, seu importante papel na maturação metabólica cardíaca, sendo que durante o período fetal, o coração sofre uma
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mudança dramática na preferência de substratos energéticos, que inicialmente é dependente de glicose e lactato, e após o nascimento, apresenta uma elevada preferência pela oxidação de ácidos graxos na mitocôndria (Lehman et al., 2008).
A mudança do substrato energético cardíaco é resultado de uma superexpressão de PGC-1α elevando o processo de biogênese mitocondrial na fase neonatal (Lehman et al. 2008; Lai et al. 2008). Entretanto, Russel et al. 2004 conferiu que, ao induzir essa superexpressão de PGC-1α em camundongos adultos, ocorre um aumento moderado do número de mitocôndrias, desarranjos na estrutura mitocondrial e cardiopatias, sugerindo que alguns componentes do processo de biogênese mitocondrial fiquem inativos em células adultas do miocárdio, possivelmente sendo mais resistente à essas adaptações.
Em relação ao fígado, o exercício pode modificar os componentes mitocondriais por meio de mecanismos fosfosrilativos, capacidade oxidativa de substratos, biogênese mitocondial, danos oxidativos e formação de antioxidantes (Santos-Alves at al., 2015). Esse tecido possui como importante função a gliconeogênese, que é a formação de glicose por compostos como lactato, aminoácidos e glicerol, podendo esse processo aumentar frente ao exercício. Diferentes intensidades relativas ao limiar anaeróbio podem contribuir para tal processo, sendo que o lactato acumulado em intensidade de domínio severo poderia provocar modificações na infraestrutura bioenergética hepática para facilitar o processo de gliconeogênese em detrimento da fosforilação oxidativa e das adaptações mitocondriais (Lu et
al., 2013).
Como amplamente elucidado anteriormente, a relação de adaptações mitondriais mediante as variáveis do exercício e ao tecido muscular são mais visados na literatura (Bishop
et al., 2014), entretanto há a necessidade de estudar a relação com outros tecidos buscando-se
entender o complexo mecanismo adaptativo. Ainda em relação à esse tecido, o músculo esquelético possui uma ampla plasticidade em resposta as demandas energéticas apresentando fenotipagens diferentes como tipo I, IIa, IId/x e IIb (Yan et al., 2011). Fibras tipo I são fibras de contração lenta, oxidativas dependentes dofluxode energia mitocondrial e menor produção de força. As fibras tipo IIa são fibras rápidas, apresentando também um perfil oxidativo, porém apresentam uma produção de força rápida. Fibras tipo IId/x são fibras de contração rápida com perfil glicolítico. Dentro desse perfil a utilização de glicogênio, que é pouco utilizado em exercício de baixa intensidade, se torna um predominante substrato para manter o esforço (Jensen e Richter, 2012). Por último, as fibras tipo IIb são fibras de contração mais velozes e com um fenótipo glicolítico mais acentuado que o tipo anterior (Yan et al., 2011). Cada
mecanismo de contração e utilização energética desencadeia específicas cascatas de sinalização podendo gerar adaptações mitocondriais.
Assim, as relações entre as variáveis de treinamento (intensidade e volume) e as adaptações de biogênese mitocondrial precisam ser melhores investigadas, considerando tanto os efeitos agudos e crônicos acrescentando a essas modulações uma relação de isocarga viabilizando a comparação entre as prescrições de exercício.
3. OBJETIVO
3.1. Geral
Investigar as respostas de conteúdo proteico de marcadores de biogênese mitocondrial em tecido muscular esquelético, cardíaco e hepático após esforço agudo isocarga, bem como as adaptações aeróbias após treinamento em modelo monótono isocarga e periodizado linear de ratos nadadores.
3.2. Objetivos específicos:
I) Investigar os efeitos de uma sessão de exercício realizado em cinco diferentes relações de intensidade e volume sobre o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase em tecidos muscular esquelético, cardíaco e hepático. II) Comparar o conteúdo de glicogênio muscular (gastrocnêmio e glúteo) e hepático
nos animais que realizaram a sessão de exercício nas diferentes relações de intensidade e volume.
III) Investigar as adaptações promovidas por 12 semanas de diferentes treinamentos monótono (sub, no e supra limiar anaeróbio) sobre o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase nos tecidos musculares esqueléticos, cardíaco e hepático.
IV) Comparar o conteúdo de glicogênio muscular (gastrocnêmio e glúteo) e hepático nos animais que realizaram os treinamentos monótonos em diferentes relações de intensidade e volume e periodizado linear.
V) Comparar a capacidade aeróbia e índice anaeróbio entre os períodos pré e pós intervenções de treinamento.
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4. HIPÓTESES
De acordo com os objetivos apresentados, as seguintes hipóteses foram levantadas:
I) A proteína COXIV, por estar relacionada a fosforilação oxidativa apresentará seu conteúdo aumentado nos tecidos musculares e cardíaco de animais submetidos à sessão de exercício em intensidades acima do limiar anaeróbio, enquanto a proteína TFAM, responsável pela manutenção e replicação do mtDNA, bem como a atividade de citrato sintase estarão aumentadas para os animais que realizarem exercício em intensidades abaixo a na intensidade de limiar. No tecido hepático, o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase estarão reduzidos nos animais que submetidos a sessão de exercício com intensidades acima do limiar anaeróbio.
II) Após 4h da sessão do exercício, ainda será observada a depleção do glicogênio muscular nos grupos exercitados em relação ao controle.
III) Em termos de adaptações advindas do treinamento, a proteína COXIV apresentará seu conteúdo aumentado nos tecidos musculares e cardíaco dos animais que treinarão de modo monótono com intensidades acima do limiar anaeróbio, enquanto a proteína TFAM e a atividade de citrato sintase estarão aumentadas nas relações de treinamento monótono abaixo e na intensidade de limiar e periodizado linear. No tecido hepático, o conteúdo de proteína COXIV, TFAM e atividade de citrato sintase estarão reduzidas nos animais que treinarão de modo monótono com intensidades acima do limiar anaeróbio.
IV) Após 12 semanas de treinamento, os animais apresentarão supercompensação de glicogênio nos tecidos musculares e hepáticos.
V) Os animais que treinarão no modelo monótono abaixo e na intensidade de limiar anaeróbio e periodizado linear, apresentarão maiores níveis de capacidade aeróbia, já ratos que treinarão no modelo monótono acima do limiar anaeróbio apresentarão maiores índices anaeróbios.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Animais
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética de Uso de Modelos Animais – CEUA da Universidade Estadual de Campinas (protocolo 3156-1). Para cada
experimento foram usados 60 ratos Wistar, com idade inicial de 46 dias e massa corporal de 242,5 ± 23,7g. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas de polipropileno, com um número máximo de 5 ratos por caixa e mantidos em ambiente controlado de temperatura (22 ± 1 Cº) e umidade (50 ± 5 %). O ciclo dos animais não foi invertido sendo que todos os procedimentos iniciaram às 18h (período noturno). Os animais receberam água e ração balanceada (CR1, NUVILAB, BR) ad libitum.
5.2. Procedimentos experimentais gerais
5.2.1. Adaptação ao meio líquido –
Para ambos os experimentos, a carga atada ao dorso foi expressa como a porcentagem equivalente de massa corporal (% mc) para cada animal. Essa carga foi construída com chumbo e elástico de látex como demonstrado na Figura 2. Essas cargas foram feitas individualmente para cada animal. A adaptação ao meio líquido foi realizada durante 14 dias consecutivos anteriores ao período de treinamento. O consistiu inicialmente de 3 dias de exposição a água rasa (5 cm de profundidade) com duração de 15 min, seguido de 5 dias de exercício em água profunda (100 cm de profundidade) com aumento progressivo da duração ao longo dos dias (2 a 10 min). Entre 9º e 14º dia, o exercício foi realizado em água profunda (100 cm de profundidade), com um aumento progressivo da intensidade e redução do volume de exercício que variou entre 3 a 15%mc e 5min a 30s de duração (Lima et al. 2017). Em todos os procedimentos a água apresentava uma temperatura de 31 ± 1 Cº.
5.2.2. Teste do Lactato Mínimo:
O teste de lactato mínimo foi realizado em ambos os experimentos para a determinação da capacidade aeróbia dos animais e foi desenvolvido em concordância com o estudo de de Araujo et al. (2012). O teste de lactato mínimo é composto de três fases, sendo a primeira de indução a hiperlactacidemia correspondendo a um esforço de 30s com 13% mc, seguidos de 30s de pausa passiva e um exercício em mesma intensidade (13%mc) até a exaustão; a segunda, um repouso passivo com duração de 9 min; e a terceira, um teste incremental com estágios de 5 min e com intensidades relativas correspondentes a 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6% e 7% mc. Amostras sanguíneas (25ul) foram extraídas da porção distal da cauda do animal nos momentos pré-teste, pós 8min e ao final de cada estágio da fase incremental. Para a determinação da intensidade de lactato mínimo (iLM) foi realizado um ajuste da concentração de lactato sanguíneo (mmol/l) versus o tempo (min), incluindo também o valor da concentração de lactato
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pico obtida pela fase de hiperlactacidêmia. Desse modo foi determinado o tempo em que ocorreu o valor mínimo de lactato, sendo esse identificado na reta de regressão da intensidade (%mc) versus o tempo (min) (Figura 1). A iLM foi determinada individualmente, sendo um parâmetro de capacidade aeróbia dos animais onde ocorre o equilíbrio entre produção e remoção de lactato.
Figura 1. Representação da determinação da intensidade de lactato mínimo (iLM) pelo método
intensidade vs. tempo. a) Curva da concentração de lactato sanguíneo ao longo da fase 3 do teste de lactato mínimo (teste incremental) para determinação do ponto mínimo, b) Reta de regressão intensidade vs. tempo.
5.3. Desenho experimental
A sessão de desenho experimental foi dividida em dois tópicos equivalente ao experimento agudo e crônico, seguindo a sequência cronológica dos eventos realizados. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em tanques com água profunda (100cm x 30 cm) e temperatura controlada de 31±1 Cº durante o período noturno, respeitando o horário de maior atividade espontânea dos animais (Beck et al. 2014). Devido à alta sensibilidade dos roedores a luminosidade, um filtro com luz vermelha (ROSCO®, SUPERGEL, > 600nm, <15lux) foi utilizada nos ambientes de exercício e treinamento (Figura 2). Os animais foram aleatorizados entre os grupos durante a execução dos exercícios e, após secos em maravalha limpa e devolvidos para suas respectivas gaiolas.
m
m
o
l/
Figura 2. A) Rato nadando durante procedimento experimental. Filtro de luz vermelha no ambiente de
coleta. B) Cargas construidas com peças de chumbo e latex.
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5.3.1. Experimento agudo
A representação esquemática do desenho experimental do experimento agudo está apresentada na Figura 3.
Figura 3. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento agudo. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados nos grupos exercícios e 4h após a sessão aguda foram eutanasiados. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Os animais (n=60, idade 60 dias, mc=293,2 ± 24,8g) foram submetidos ao teste de lactato mínimo para a determinação da iLM 24h após o término dos 14 dias referentes a adaptação ao meio líquido. Após a realização desse teste, os animais passaram por um período de 72h de repouso passivo e foram aleatoriamente divididos em 5 grupos exercício e 1 controle como descrito na Tabela 1. O produto entre a intensidade e volume se manteve a mesma entre os grupos, sendo de 3000 u.a.. Após 4h da finalização do exercício os tecidos musculares, hepático e cardíaco foram extraídos e armazenados para a posterior análise.
Tabela 1. Descrição das intensidades (%mc), volume (min) e carga dos grupos exercício referentes ao experimento agudo.
Grupos
Exercício Intensidade(%mc) Volume (min)
Carga (Intensidade*Volume) GC - - GE80 80% 37,5 3000 GE90 90% 33,3 3000 GE100 100% 30,0 3000 GE110 110% 27,25 3000 GE120 120% 25,0 3000
GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM
5.3.2. Experimento Crônico
Em concordância com o experimento agudo os procedimentos iniciais foram semelhantes e a mesma relação de carga foi utilizada para os grupos de treinamento monótono. Para esse experimento foram mantidas as intensidades de 80, 100 e 120% da iLM na tentativa de acentuar as adaptações advindas do treinamento. A representação esquemática do desenho experimental do experimento crônico está apresentada na Figura 4.
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Figura 4. Sequência cronológica do desenho experimental do experimento crônico. Após 14 dias de
adaptação ao meio líquido, o primeiro teste de lactato mínimo (TLM) foi desenvolvido para a determinação do tempo limite (Tlim) e intensidade de lactato mínimo (iLM). Os animais foram randomicamente separados nos grupos e foram submetidos a um período de 12 semanas de treinamento com frequência de 6 dias/semana. Todos os procedimentos foram realizados no período noturno.
Os animais (n=60, idade 60 dias, mc = 277,8 ± 26,2g) foram submetidos ao teste de lactato mínimo para a determinação da iLM e Tlim. Após a realização desse teste, os animais passaram por um período de 24h de repouso passivo e foram aleatoriamente divididos em 5 grupos treinamento, sendo 4 monótonos (Tabela 2) e 1 periodizado linear (Tabela 3), e 1 grupo controle. O modelo monótono propõe a manutenção da relação entre intensidade vs. volume ao longo do período, enquanto o modelo periodizado propõe que o volume se reduza e a intensidade se eleve gradativamente.
Tabela 2. Descrição das intensidades (%mc), volume (min), carga de treinamento, frequência e o momento em que os animais foram eutanasiados referentes ao experimento crônico.
Grupos Treinamento Eutanásia Intensidade (%mc) Volume (min) Carga (Intensidade*Volume) Frequência Semanal Baseline Semana 0 - - - - GC Semana 12 - - - - GT80 Semana 12 80% 37,5 3000 6 dias/semana GT100 Semana 12 100% 30,0 3000 6 dias/semana GT120 Semana 12 120% 25,0 3000 6 dias/semana
GC= grupo controle; GT80=grupo treinamento a 80% da iLM; GT100=grupo treinamento a 100% da iLM, GT120=grupo treinamento a 120% da iLM, GPE=grupo treinamento periodizado linear.
Os animais treinaram com uma frequência de 6 dias na semana durante um período de 12 semanas. Durante esse período os animais foram semanalmente pesados para o ajuste de suas intensidades e o TLM realizado ao final dos ciclos respeitando a periodização linear. Ao final do período de treinamento foram submetidos à um TLM e 24hs após eutanasiados, considerando-se o tempo para observar mudanças no conteúdo de glicogênio. Os tecidos musculares, hepático e cardíaco foram extraídos e armazenados para a análise.
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Tabela 3. Organização do treinamento do grupo periodizado linear (GPE) utilizando as intensidades (END1, END2, END3 e ANA) ao longo das 12 semanas como proposto por de Araújo et al., 2012.
OFF: Dia sem sessão de treinamento; END1: Intensidade de 60% da iLM com volume de 60min; END2: Intensidade de 100% da iLM com volume de 30min; END3: Exercício intermitente com 3 séries de 5min na intensidade de 120% da iLM e separadas por 1min de pausa passiva; ANA: Exercício intermitente com 5 séries até a exaustão na intensidade de 260% da iLM e separadas por 1min de pausa passiva.
5.3.3. Amostras sanguíneas:
O volume de 25 μL de sangue foi extraído da porção distal da cauda do animal por meio de tubos capilares heparinizados e calibrados. As amostras foram imediatamente transferidas para tubos eppendorf de 1,5mL contendo 400 μL de TCA (Ácido tricloroacético - 4%) para desproteinização do sangue e estocadas em geladeira entre 2º a 8ºC. Posteriormente, foi extraído 100μL de sobrenadante e transferidos para tubos de ensaio contendo 500μL de reativo (estoque glicina/EDTA e hidrazina-hidrato 1,2ml, 100mg de NAD (Beta-nicotinamide dinicleotide SIGMA) e 150μL de LDH (L-lactic dehydrogenase bovine heart)) devidamente ajustadas a um pH de 8,85 e incubado durante 60min. As amostras foram analisadas por espectrofotometria, com absorbância de 340nm, contra a curva de calibração (Engel e Jones, 1978).
5.4. Obtenção do material biológico
Após 4h da intervenção aguda e 24h do período de treinamento, os animais foram anestesiados com 1mL de Tiopental sódico (25mg.ml-1) e eutanasiados via toracotomia. Foram extraídas amostras de tecido muscular esquelético do sóleo, gastrocnêmio e glúteo, tecido hepático e cardíaco (ventrículo esquerdo). Esses tecidos foram imediatamente armazenados em ultrafreezer -80º C para posteriores análises.
5.4.1. Quantificação de proteína por Western blotting
Para as amostras foram utilizados 25mg de fígado 50mg de coração e tecido esquelético. Os tecidos foram homogeneizados em tampão de extração para imunoprecipitação contendo 1% de Triton X 100, 100mM de Tris (pH 7,4), 100mM de pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 10mM de EDTA, 10mM de vanadato de sódio, 2mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4ºC. O homogeneizado foi centrifugado a 11000rpm durante 30min e a partir do sobrenadante, foi determinada a concentração de proteínas utilizando o método de Bradford (Bradford, 1976). As amostras foram suspensas na solução conservante de Laemmli, contendo 100mmol/L de DTT (dithiothreitol). Após rápida fervura, as amostras foram pipetas em gel de poliacrilamida para separação por eletroforese (PAGE). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada overnight com anticorpo primário especifico em solução de albumina 5%. A ligação de anticorpo com proteínas não-específicas foi minimizada pela pré incubação da membrana de nitrocelulose com tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado; 10mmol/L de Tris; 150mmol/L de NaCl; 0,02% de Tween 20) por 1,5h. Os anticorpos para TFAM e COXIV foram ambos da Proteintech™ e suas proporções de diluição foram de 1:200 e 1:500 respectivamente. As bandas das proteínas foram quantificadas utilizando-se do software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). A massa molecular da proteína TFAM foi de 25kDa e COXIV de 17kDa. O controle endógeno para ambas as proteínas foi a alfa tubulina de massa molecular 55kDa.
5.4.2. Atividade enzimática de citrato sintase (CS)
As amostras foram homogeneizadas em tampão contendo PBS (pH 7.3), centrifugados por 2 minutos, a 4° C (5000 rpm), sendo o sobrenadante coletado para a análise. Uma mistura de 1M Tris-HCl (pH 8.1), 25 mM de oxalacetato, 10 mM de DTNB [5.5-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico)] e 5mM de acetila CoA foi adicionada às amostras com aproximadamente 3µg de proteína total. A redução de DTNB por citrato sintase foi medida por espectrofotômetro
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durante 5 minutos (37ºC), com absorbância de 412 nm (coeficiente de extinção = 13,6 mM-1 cm-1). A atividade enzimática de citrato sintase foi expressa como µmol de citrato .min-1. mg de proteína-1.
5.4.3. Estoque de glicogênio
A concentração de glicogênio no tecido muscular esquelético (gastrocnêmio e glúteo) e hepático foram analisados de acordo com Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers, and Smith (1951). Amostras do músculo (250mg) e fígado (500mg) foram preparadas em KOH (30%), depois misturadas a uma solução de sulfato de sódio e etanol para a precipitação de glicogênio. As amostras foram homogeneizadas com 20 μlL fenol (80%) e 2,0 ml de ácido sulfúrico. A absorbância (490 nm) foi obtida após 15min de ebulição e a concentração de glicogênio foi calculada a partir de uma curva de calibração.
5.5. Análise Estatística
Os dados estão apresentados em média ± ep (erro padrão). A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk e, assim que atestado, uma estatística paramétrica foi utiliza. Para identificar as diferenças dentro dos grupos exercício e treinamento dos conteúdos de proteína COXIV, TFAM, atividade de citrato sintase e concentração de glicogênio (variáveis dependentes), o teste de Anova one-way foi realizado seguido do post-hoc de Fisher. Para identificar as diferenças da iLM e Tlim (variáveis dependentes) entre os períodos pré e pós treinamento foi usado o teste de Anova para medidas repetidas seguido do post-hoc de Fisher. Para todas as análises foi adotado o p < 0,05.
6. RESULTADOS
6.1. Experimento Agudo
Os valores de média ± ep do Tlim (13% mc) e iLM (%mc) referentes ao teste de lactato mínimo dos animais que realizaram os esforços agudos podem ser observados na Tabela 4.
Tabela 4. Média ± ep dos valores de tempo limite - Tlim (s) e intensidade de lactato mínimo - iLM (%mc) obtidos no teste de lactato mínimo (TLM).
TLM
Grupos Tlim (13%mc) (s) iLM (%mc)
GC 98,0 ± 9,37 4,6 ± 0,40 GE80 79,0 ± 6,56 5,3 ± 0,24 GE90 96,6 ± 14,02 4,6 ± 0,20 GE100 83,8 ± 10,22 4,8 ± 0,20 GE110 105,0 ± 11,90 5,4 ± 0,30 GE120 91,6 ± 3,40 4,7 ± 0,25
GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM.
Os resultados apresentados nas Figura 5 e Figura 6 são referentes respectivamente a média ± ep da quantificação das proteínas COXIV e TFAM nos músculos gastrocnêmio, sóleo, cardíaco e hepático. Após 4h da sessão aguda de exercício, não foi encontrada alteração do conteúdo proteico das proteínas COXIV e TFAM para os tecidos musculares, cardíaco e hepático.
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Figura 5. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo (n=4).
Comparação entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) no gastrocnêmio e sóleo. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
Figura 6. Média ± ep do conteúdo de proteína COXIV e TFAM para o experimento agudo (n=4).
Comparação entre os grupos (GC, GE80, GE90, GE100, GE110 e GE120) para os tecidos hepático e cardíaco. (GC= grupo controle; GE80=grupo exercitado a 80% da iLM; GE90=grupo exercitado a 90% da iLM, GE100=grupo exercitado a 100% da iLM, GE110=grupo exercitado a 110% da iLM e GE120=grupo exercitado a 120% da iLM)
Para a atividade enzimática da citrato sintase (Figura 7), diferenças foram observadas gastrocnêmio para o GE90, que apresentou uma menor atividade enzimática em comparação aos grupos GE80, GE100 e GE110 (GE90 vs. e GE80, p = 0,02, GE90 vs. GE100, p = 0,007, GE90 vs. GE110, p = 0,008). Já os grupos GE100 e GE110 apresentaram uma maior atividade em relação aos grupos GE90 e GE120 (GE100 vs. GE120, p=0,03, GE110 vs. GE120, p=0,03). Para o tecido hepático tanto o grupo GE110 quanto o grupo GE120 apresentaram menor atividade enzimática em relação ao GE80 (GE110 vs. GE80, p = 0,02, GE120 vs. GE80, p = 0,006) e GE90 (GE110 vs. GE90, p = 0,03, GE120 vs. GE90, p = 0,01).
