UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA - UFSC
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB DEP. DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E
GENÉTICA - BEG
LAB. DE CÉLULAS TRONCO E REGENERAÇÃO TECIDUAL – LACERT
Adriane Cristina Fagundes
Efeito da radiação ultravioleta B em células tronco mesenquimais derivadas da pele
Trabalho apresentado como requisito para a conclusão dadisciplina de Trabalho de Conclusão de Curso II (BIO7016) do currículo do Curso de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: Dra. Talita da Silva Jeremias. Co-orientadora: Profa. Dra. Andréa Trentin
Florianópolis 2016
Adriane Cristina Fagundes
Efeito da radiação ultravioleta B em células tronco mesenquimais derivadas da pele
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Licenciado em Ciências Biológicas”, e aprovado em sua forma final pelo Curso de
Ciências Biológicas.
Florianópolis, 02 de Dezembro de 2016.
Professora Dra. Maria Risoleta F. Marques Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas
Banca examinadora:
Dra. Talita da Silva Jeremias Orientadora
Dra. Cláudia Beatriz Nedel Examinadora
Universidade Federal de Santa Catarina
Msc. Priscilla Delben Barros Examinadora
Universidade Federal de Santa Catarina
Msc. Diana Heck Suplente
Aos meus pais por todo o amor e todo o esforço que tiveram para que eu chegasse até aqui e aos meus irmãos pela amizade e inspiração.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina pela oportunidade de realizar esse trabalho e concluir meu curso e ao CNPq pelo apoio financeiro durante minha graduação.
À minha orientadora, Talita Jeremias. Todas as pessoas no mundo deveriam ter uma Talita na sua vida. Uma pessoa incrível de todas as formas!
À minha co-orientadora, Profa. Andréa Trentin, por ter me aceitado e me recebido de braços abertos.
A todos os meus amigos e colegas do LACERT; Prof. Ricardo Garcez, por todos os ensinamentos. Diana Heck, Helena Zomer e Priscilla Delben, sempre tão dispostas a ajudar. À Camila Acordi, Maiara Marques (cafézinhoooo!), Aruana Hansel, Gabriel Pescador, Alessandra Barauna, Jaqueline Isoppo, Gisele Varela, Rafaela Grecco, Gabriel Petry, Patrícia Dillenburg, Juliano Tibbola, Fernanda Lamin, Ana Júlia Gonçalves e Jéssica Andrade por toda parceria, vocês são demais!
Aos meus ex-colegas de laboratório e hoje grandes amigos, Marcelo Falchetti, Gabriel Matos, Amanda Silveira (amada mãe!), Jaqueline da Rosa, Graziela Vieira, Emily Justino, Cairé Barreto, Bruno Dominski e Mariana Pilotto. Sinto saudade de vê-los todos os dias!
Às minhas colegas e amigas de graduação, Amanda Tuyama, Mahoany Machado, Tamires Gregorio, Nágilla Alberton, Natani Coser, Joana Weck e Maysa Almeida. Foi um prazer imenso estar ao lado de vocês por todos esse anos. A todos os meus amigos queridos, os de infância: Bianca Brasil, João Fransisco, Gustavo Lemos e Larissa Lorenzi. E àqueles que adquiri um pouco depois, Camila Reis (a melhor das melhores amigas), Jefferson Corrêa (meu irmão de coração!), Camila Leal, Henrique Lobo, Diego Feijó, Jhon
(André) Trevisol, Kacilha Macedo, Douglas de Menezes, Joel Mello e Leonardo Cabral. Obrigada por tantas alegrias compartilhadas, pessoal!
Ao meu namorado, Luan Gomes, que conheci na biologia e com quem posso contar desde então. Obrigada por todo o apoio que você me dá em todos os momentos. Eu não teria permanecido tão calma (tanto quanto posso ser) se não fosse por você. E nem tão feliz! Te amo!
Aos meus pais por tudo o que fizeram por mim. Eu sei o quanto vocês batalham ainda hoje para que eu seja o melhor que posso. Eu sou imensamene grata por tudo. E amo vocês. Também agradeço aos meus irmãos e melhores amigos. Minha irmã, Lisiane, por alegrar todos os dias da minha vida com sua risada cheia de vida e o seu senso de humor. Meu irmão, Rodrigo, por ter sido meu ídolo nos estudos. Tentei até gostar de matemática por sua causa. Espero sempre ser motivo de orgulho a todos vocês.
“Don't adventures ever have an end? I suppose not. Someone else always has to carry on on the story.”
RESUMO
FAGUNDES, A. C. Efeito da radiação ultravioleta B em células tronco mesenquimais derivadas da pele. Trabalho de Conclusão de Curso – Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, 2016.
As células tronco mesenquimais (CTMs) são multipotentes, capazes de se diferenciar em diversas linhagens celulares e, sugere-se, que estejam presentes em todos os tecidos e órgãos do corpo. Trabalhos tem mostrado que em condições adversas como hipóxia, as CTMs sobrevivem. Por ser um órgão extenso e externo, a pele recebe a maior parte da carga de radiação UV proveniente do sol. A radiação ultravioleta do tipo B (UVB: 280-320 nm) é o tipo de radiação mais energética, a qual atua como mediador de espécies reativas de oxigênio e a exposição a essa radiação é altamente mutagênica. Entretanto, também pode estimular a proliferação, a diferenciação celular e aumentar a secreção de fatores relacionados ao reparo tecidual. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi verificar o efeito da radiação UVB em células tronco mesenquimais derivadas da pele (CTMp). As CTMp foram isoladas in vitro e expostas à diferentes doses de radiação UVB (2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) para análise de viabilidade, morfologia, dano de DNA, ciclo celular, morte celular e apoptose. Os resultados obtidos mostram que altas doses de radiação UVB diminuem a viabilidade das CTMs ao causar dano no DNA, o que por sua vez causa parada no ciclo celular e culmina na ativação de cascatas de sinalização para morte celular. Já em baixas doses (2,5 mJ/cm²) as CTMp não mostram diferenças signifitavas em relação ao controle. Sendo as CTMp ativas em processos de reparo de regiões lesionadas, analisar seu meio condicionado. (secretoma) por radiação UVB é o próximo passo para o estudo de uso dessas células como terapia. Palavras-chave: células tronco, CTM, UVB
ABSTRACT
FAGUNDES, A. C. Effects of Ultraviolet B radiation on mesenquymal stem cells derived from the skin. Trabalho de Conclusão de Curso – Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina, 2016.
Mesenquymal stem cells (MSC) are multipotent cells capable of differentiating in various cell lineages and it is suggested that they are present in all the bodys tissues and organs. Research has shown that MSC survive in adverse conditions such as hypoxia. Because the skin is an extense and exposed organ, it recieves most of the radiation coming from the sun. Ultraviolet B radiation (UVB: 280-320 nm) is the most energetic type of radiation and exposure to it is highly mutagenic. However, it can also estimulate cell proliferation and differentiation and increase secretion of tissue repair related factors. Therefore, our objective was to evaluate the effect of UVB radiation on mesenquymal stem cells derived from the skin (MSCd). MSCd were isolated in vitro and exposed to different UVB radiation doses (2,5, 5, 10, 20, 30, 40 and 50 mJ/cm²) to investigate cell viability, morphology, DNA damage, cell cicle, cell death and apoptosis. Our results show that high doses of UVB radiation decrease MSCd viability by causing DNA damage and cell cicle arrest, which ends in activation of cell death signaling pathways. However, MSCd did not show significative differences compared to the control group, when exposed to low dose radiation (2,5 mJ/cm²). Since MSCd participate in repairing wounded regions, studying the MSCd conditionated medium (secretome) by UVB radiation is the next step towards the use of these cells as therapy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática da pele ... 22 Figura 2 – Localização de nichos de CTs na pele ... 23 Figura 3 – Representação da penetração da luz ultravioleta na pele ... 27 Figura 4 – Esquema da cascata de sinalização de apoptose ... 30 Figura 5 – Viabilidade das CTMp após exposição a radiação UVB ... 44 Figura 6 – Morfologia das CTMp após a irradiação por luz UVB ... 45 Figura 7 – Expressão de γH2AX nas CTMp irradiadas UVB ... 47 Figura 8 – Dados referentes à porcentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular ... 49 Figura 9 – Efeito da irradiação UVB na quantidade de CTMps viáveis e inviáveis dos diferentes grupos ... 51 Figura 10 – Análise da apoptose após irradiação UVB das CTMps ... 53 Figura 11 – Representação esquemática dos resultados obtidos ... 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CT – Célula tronco
CTM – Célula tronco mesenquimal
CTMp – Células tronco mesenquimais derivadas da pele DAPI – 4',6-diamidino-2-phenylindole
DMEM – F12 – Dulbecco's Modified Eagle Medium Ham’s F12
DMSO – Dimetilsulfóxido
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra- acético ERO – Espécies reativas de oxigênio
MTT – (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólico)
IP – Iodeto de proídeo PBS – Tampão Fosfato Salina PS – Penicilina e Estreptomicina RUV – Radiação ultravioleta SBF – Soro Bovino Fetal UV – Ultravioleta
UVA – Ultravioleta do tipo A UVB – Ultravioleta do tipo B UVC – Ultravioleta do tipo C
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 21
1.1 Pele ... 21
1.1.1Nicho de células tronco na pele ... 22
1.2 Radiação ultravioleta ... 26 1.2.1 Danos no DNA... 28 1.2.2 Morte celular ... 29 2 JUSTIFICATIVA ... 33 3 OBJETIVOS ... 35 2.1 Geral ... 35 2.2 Específicos ... 35 4 METODOLOGIA ... 37
4.1 Obtenção das amostras de tecido humano ... 37
4.2 Cultura de células tronco mesenquimais (CTM) derivadas da pele humana (CTMp) ... 37
4.3 Irradição das CTMp com ultravioleta B (UVB) ... 38
4.4 Ensaio de MTT ... 39
4.4 Análise da morfologia ... 40
4.6 Análise de ciclo celular ... 40
4.7 Imunocitoquímica ... 41
4.8 Ensaio de viabilidade celular (vida/morte) ... 42
5.1 Análise de viabilidade celular das CTMp ... 43
5.2 Análise da morfologia celular ... 44
5.3 Análise de dano de DNA ... 46
5.4 Análise de ciclo celular por citometria de fluxo ... 48
5.3 Análise de morte celular ... 50
6 DISCUSSÃO ... 55
7 CONCLUSÃO ... 59
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1. INTRODUÇÃO
1.1 Pele
A pele é um órgão multifuncional que recobre toda a superfície do corpo, protegendo-o contra a perda de água, microorganismos, ações mecânicas e químicas e radiações solares (ALONSO & FUCHS, 2003). A estrutura da pele é composta de duas porções: a epiderme e a derme, sendo a primeira a camada mais externa. A epiderme, originada da ectoderme, é constituída por uma fina camada epitelial estratificada pavimentosa, que por sua vez é composta principalmente por queratinócitos. Ela também possui melanócitos, células de Langerhans e de Merkel (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004). Nesta camada, estão presentes também os anexos epidérmicos: folículos pilosos, glândulas sudoríparas e glândulas sebáceas.
Já a derme, de origem mesodérmica, está localizada adjacente à epiderme e apresenta uma camada de espessura variável, muito resistente e rica em colágeno, glicosaminoglicanos e elastina. Essa região da pele é subdividida em derme papilar e derme fibrilar. A primeira está localizada abaixo da epiderme e possui sistema circulatório associado, enquanto a segunda é localizada mais abaixo, próxima do tecido subcutâneo, e sua matriz extracelular é mais densa. A derme é composta majoritariamente por fibroblastos, porém também são encontradas células imunes e do endotélio vascular. Abaixo da derme encontra-se um tecido distinto composto por camadas de células adiposas. Esse tecido é responsável por propocionar isolamento térmico e pelo deslizamento da pele sobre suas estruturas de apoio (Figura 1) (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
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Figura 1. Representação esquemática da pele
Adaptado de:
http://www.ccsb.org/Cancer/Summary/CDR0000258037/. 1.1.1 Nicho de células tronco na pele
As células tronco (CT) são caracterizadas por sua alta taxa de proliferação in vitro, sua capacidade de autorrenovação e diferenciação em tipos celulares especializados. Essa capacidade de diferenciação é estabelecida dependendo da origem e potencialidade das CT. Em tecidos embrionários e fetais, as CT são totipotentes e pluripotentes. CT totipotentes são capazes de se diferenciar em todos os tipos celulares de um organismo, incluindo os anexos embrionários, enquanto as CT pluripotentes são localizadas na massa interna do embrião, sendo capazes de originar células dos três folhetos embrionários. Já em tecidos adultos, estão presente CT multipotentes, que apresentam um potencial menos abrangente, sendo capazes de se diferenciar em apenas algumas linhagens celulares (ALISON et al., 2009).
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Atualmente, têm-se levantado a hipótese de que todos os tecidos adultos possuem um “compartimento tronco” ou nicho onde estão localizadas as CTs. Esses nichos são responsáveis pela reposição celular e pelo reparo de lesões. Sendo assim, cada tecido tem uma taxa diferenciada de capacidade de renovação. A pele, por exemplo, possui uma alta taxa de proliferação celular, sendo que a epiderme apresenta capacidade de se regenerar a cada duas semanas como resultado da atividade de CTs adultas (ADOLPHE & WAINWRIGHT, 2005). Já foram identificadas populações de CTs em diversos nichos da pele, incluindo epiderme, folículo piloso, glândula sebácea, derme e hipoderme (tecido adiposo) (Figura 2) (WONG et al., 2012).
Figura 2. Localização de nichos de CTs na pele
Esquema ilustrando os diferentes nichos de CTs (em verde) na pele: na camada basal da epiderme, no bulge e papila dermal do folículo piloso, na derme e hipoderme. Quando há uma lesão no tecido, essas
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células são recrutadas e auxiliam no processo de reparo. Adaptado de: (WONG et al., 2012).
A existência de CTs dermais na pele de mamíferos ainda é pouco compreendida, entretanto, sabe-se que as CTs obtidas da derme e epiderme possuem diferentes características fenotípicas e potencialidades. Mas, em geral permanecem capazes de se diferenciar in vitro em algumas linhagens celulares e possuem marcadores de superfície semelhantes às CTs mesenquimais da medula óssea (VISHNUBALAJI et al., 2012; WONG et al., 2012).
As células tronco mesenquimais (CTM) se caracterizam por serem aderentes ao plástico e positivas para os marcadores de células tronco mesenquimais CD29, CD44, CD71, CD73, CD105, CD90 e CD166 e negativas para CD45, CD14, CD34, CD133 e HLA-DR, de acordo com o Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy. As CTMs são multipotentes e, portanto, capazes de se diferenciar em diversas linhagens celulares derivadas do mesoderma, como osteoblastos, adipócitos e condrócitos (BIANCO et al., 2001). Inicialmente, essas células foram isoladas da medula óssea e caracterizadas por Friedestein e colaboradores em 1968, e, atualmente sugere-se que as CTMs estejam presentes em todos os tecidos adultos, já que vem sendo isoladas de outros órgãos e tecidos, como gordura, sangue do cordão umbilical, líquido amniótico, placenta, polpa dentária, tendões e músculo esquelético (MEIRELLES et al., 2008). No nosso grupo de pesquisa, foi isolada e caracterizada uma população de células mesenquimais derivadas da derme humana, com características imunofenotipicas semelhantes as células da medula óssea, e com capacidade de diferenciação para fenótipos mesodermais e ectodermais (JEREMIAS et al., 2013).
De fato, estudos sugerem que as CTMs podem possuir uma plasticidade celular mais abrangente, sendo
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capazes de se diferenciar em células de origem endodérmica (SATO et al, 2005) e ectodérmica (KOPEN et al, 1999). Uma pesquisa realizada por Kopen e colaboradores (1999) demonstrou que ao injetar CTMs de camundongos em ventrículos laterais de camundongos neonatos, é observada a diferenciação dessas células tronco em células neurais. Também já foi descrito que o uso de CTMs é eficaz em diversas estratégias de terapia celular como tratamento de crianças com osteogênse imperfeita (HORWITZ et al., 2002), recuperação hematopoiética (KOC et al., 2000) e estratégias de regeneração tecidual (PETITE et al., 2000). Para a medicina regenerativa, essa versatilidade celular é mais uma característica em potencial a ser explorada, já que as CTMs já vem sendo estudadas como possibilidade para tratamentos de tecidos lesionados (ALDAHMASH et al., 2012).
Atualmente tem-se associado a presença destas células em diferentes tecidos com a manutenção da homeostase tecidual e recrutamento após lesões, e que o seu efeito reparatório ocorre não só a partir da habilidade de diferenciação das CTMs, mas também pelo seu efeito parácrino, ou seja, os fatores secretados por essas células (Figura 2). Análises do meio condicionado de CTMs mostram a produção de diversos mediadores do processo de reparo, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, e moléculas de matriz extracelular (CHEN et al., 2008; PHINNEY, 2007). Além disso, trabalhos tem mostrado que em condições adversas, como hipóxia e radiação ultravioleta, as CTMs são capazes de sobreviver e secretar uma quantidade maior desses mediadores do processo de reparo (RAJENDRANNAIR et al., 2016; JEONG et al., 2013).
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1.2 Radiação ultravioleta
A nossa superfície terrestre recebe diversos tipos de energia radioativa da nossa estrela local, o sol. Essas energias são classificadas como radiação eletromagnética não ionizada, o que inclui: infravermelho (780 – 3000 nm), luz visível (400 – 780 nm) e ultravioleta (100 – 400 nm). A luz infravermelha representa 54% da radiação solar, enquanto que a ultravioleta representa apenas 7% (KOCHEVAR et al., 2008).
A exposição à radiação ultravioleta (RUV) desencadeia diversas mudanças na pele, como hiperemia, hiperalgesia e inflamação. Todas essas mudanças podem ser observadas após a exposição à luz ultravioleta de diferentes comprimentos de onda. Essa radiação pode ser classificada em UVA (320 – 400 nm), UVB (280 - 320 nm) e UVC (100 – 290 nm) (EUBANKS et al., 2006). A radiação UVC é eficientemente absorvida pela camada de ozônio e não chega a superfície terrestre, já a UVB não é totalmente absorvida, sendo que cerca de 0,1% atinge a superfície da Terra no verão (região do Equador – 12:00hrs). Quanto à radiação UVA, cerca de 5% atinge a superfície terrestre (HOLICK, 2016).
Por ser um órgão extenso e externo, a pele recebe a maior parte da carga de RUV, porém, das três formas apenas duas conseguem penetrar na pele, em diferentes níveis. A radiação UVB é majoritariamente absorvida pela epiderme, mas penetra também na camada superior da derme, enquanto a UVA penetra mais profundamente, chegando até a camada reticular da derme (Figura 3). De maneira geral, quando em contato com a pele, a radiação UV pode prejudicar as funções celulares direta e indiretamente ao gerar danos do DNA e induzir assim, à parada no ciclo celular e apoptose (CHA et al., 2014).
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Figura 3. Representação esquemática da penetração da radiação ultravioleta na pele
Adaptado de: (HUSSEIN, 2005)
A radiação ultravioleta do tipo B (UVB: 280-320 nm) é o tipo de radiação mais energética, a qual atua como mediador de espécies reativas de oxigênio (EROs) e a exposição a essa radiação é altamente mutagênica, o que possibilita o aparecimento de doenças, além de ocasionar queimaduras e câncer de pele (JEONG et al., 2013). Entretanto, a radiação do tipo UVB é essencial na indução da produção de vitamina D e tem sido utilizada no tratamento de doenças, como vitiligo e psoríase (NJOO et al., 2000; GREEN et al., 1988).
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1.2.1 Danos no DNA
Os danos ao DNA podem ser causados de forma indireta e direta por diversos agentes exógenos, como a radiação ultravioleta. Os danos indiretos são aqueles causados a longo prazo, consequência da produção de EROs. Ao produzir EROs, a radiação UVB causa, indiretamente, dano oxidativo no DNA, RNA, proteínas e lipídios (SWALWELL et al, 2012; GODAR et al, 1993). Já danos diretos são aqueles que ocorrem no momento da exposição. No caso da luz UVB, os danos ocorrem devido ao fato de as bases nitrogenadas que compõe o DNA absorverem diretamente os fótons da luz UVB (RAVANANT et al., 2001). Como consequência dessa absorção, ocorre um rearranjo de nucleotídeos nessas macromoléculas que induzem a formação de dímeros de piramidina ciclobutano (CPDs) e pirimidina (6-4) pirimidona. Tais danos podem afetar as células a curto e longo prazo. Como consequência de lesões não reparadas, danos podem se estabelecer e alterações permanentes podem ocorrer ocasionando mutações, além de interferências nos processos de transcrição e replicação. Essas alterações no DNA acarretam bloqueios da replicação e indução da fosforilação da histona H2AX na serina 139 (γH2AX) (ROGAKOU et al., 1998; ROGAKOU et al.,1999), também responsável pela sinalização de moléculas de reparo de DNA.
Durante o sistema de checagem do ciclo celular, as lesões de DNA são reconhecidas por proteínas, o que induz uma parada no ciclo celular para que haja o reconhecimento de lesão (PIETENPOL & STEWART, 2002). Esse reconhecimento se dá no período de intérfase do ciclo, o qual é subdividido em três etapas: G0/G1, fase de crescimento celular e que possui duração variável, além de poder permanecer em estado quiescente (G0) por tempo indeterminado como resposta à estímulos; S, fase em que há duplicação do material genético; G2, fase que possui alguns pontos de checagem e é o período que a célula permanece até
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que todo o material genética tenha sido duplicado para só então passar à fase mitótica (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
Caso o reparo não seja eficiente, pode haver sinalização para que se inicie o processo de apoptose (PEI & STRAUSS, 2013).
1.2.2 Morte celular
A morte celular é o principal mecanismo de eliminação celular nos metazoários e suas formas mais conhecidas são a necrose e apoptose. A necrose é caracterizada pela formação de vacúolos citoplasmáticos, desestabilização da membrana plasmática e inflamação ao redor das células necróticas (EDINGER & THOMPSON, 2004). Já a morte por apoptose tem como característica a degradação de componentes celulares, a fragmentação do DNA e a formação de corpos apoptóticos (HAIL et al, 2006). Entretanto, não há rompimento da membrana plasmática e não há presença de processo inflamatório (EDINGER & THOMPSON, 2004). Essas características morfológicas da apoptose são consequência da ativação de caspases, as quais são ativadas devido a secreção de mediadores da mitocôndria ou por receptores de morte (Figura 4) (EDINGER & THOMPSON, 2004). Há muitos eventos que podem desencadear a apoptose, sendo um deles, o dano de DNA, que por sua vez, pode ser induzido por fatores exógenos como a radiação ultravioleta. (GRIVICICH et al., 2007; SUZANNE & STELLER, 2013).
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Figura 4. Esquema da cascata de sinalização de apoptose
Representação da cascata de sinalização da caspase, que resulta em apoptose. Caspases são altamente expressas na maioria das células na forma de proenzimas inativas. Quando há dano de DNA, proteínas, como a p53, são acumuladas no núcleo celular e, quando não há sucesso no reparo, ativa as vias de caspase, inicializando assim a cascata de sinalização apoptótica (PEI & STRAUSS, 2013; ELMORE, 2007).
Diferentes tipos celulares podem ter reações distintas à exposição a luz ultravioleta. Em queratinócitos e linfócitos há a indução de apoptose, mas é interessante observar que os linfócitos são mais sensíveis à radiação, sendo necessárias menores doses de luz ultravioleta para que essas células sinalizem para a apoptose (SCHINDL et al., 1998; AUFIERO et al., 2006). Já em melanócitos, por exemplo, há o aumento da densidade celular quando a pele é exposta a radiação solar (TAYLOR, 2005).
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Trabalhos recentes têm mostrado a influência da radiação UVB em CTs de diferentes tecidos. Estudos com CTs do folículo piloso mostram que a exposição à RUV, além de desestabilizar o microambiente dessas células reduz seu potencial de formação de colônias, bem como sua viabilidade (AOKI et al, 2013). Em relação a CT derivadas do tecido adiposo, foi descrito que em baixas doses, a radiação UVB aumenta a sobrevivência e a migração celular. Além disso, as CT derivadas do tecido adiposo secretam mais fatores de crescimento envolvidos com o reparo tecidual, como bFGF, KGF, HGF e VEGF (JEONG et al., 2013). Neste contexto, as CTMs encontradas na derme também podem ser afetadas pela radiação UVB. Entretanto, ainda não existem estudos acerca do pefil celular que essas células apresentam quando expostas a essa radiação.
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2 JUSTIFICATIVA
As CTMs estão presentes em diversos tecidos, sendo sugerido que estejam presentes em todos os tecidos adultos (MEIRELLES, 2008). Essas células possuem a capacidade de manter a manutenção tecidual e de auxiliar no processo de reparo após lesão. Atualmente, discute-se que o efeito reparatório ocorre não só a partir da habilidade de diferenciação das CTMs, mas também pelo seu efeito parácrino (VISHNUBALAJI et al., 2012). Entretanto, diversos aspectos do microambiente, como diferentes substratos, contato célula-célula e a exposição à ambientes estressores, como hipóxia e radiação UV, podem afetar a sobrevivência e a secreção de fatores parácrinos.
A luz UVB, quando em contato com a pele, pode afetar as células e desestabiliziar o microambiente, ocasionado morte celular. Entretanto, por estarem tão sujeitas a exposição a agentes danosos, as células tronco da pele são altamente resistentes ao processo de envelhecimento e ao dano de DNA, possuindo mecanismos de reparo altamente eficientes (RACILA & BICKENBACH, 2009; STERN & BICKENBACH, 2007; GIANGRECO et al., 2008)
Assim, o efeito da irradiação UVB pode nem sempre ser negativo e resultar em morte celular. Ao contrário, pode estimular a proliferação, a diferenciação celular e aumentar a secreção de fatores relacionados ao reparo tecidual (JEONG et al., 2013). Recentemente, estudos vem sendo realizados a fim de elucidar os efeitos da radiação UVB em diferentes tipos celulares derivados da pele, incluindo as CTs epidermais do folículo piloso e da papila dérmica. Entretanto, não há dados na literatura em relação as CTMs da pele (CTMp).
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Dessa forma, faz-se necessário adquirir conhecimentos acerca dos efeitos da radiação UVB em células tronco mesenquimais derivadas da pele, visto que essas células são importantes para a renovação do tecido e são ativadas no reparo tecidual. Além disso, a possível modificação dessas células após a irradiação pode aumentar as possibilidades de uso das CTMp para terapias celulares através do estímulo de secreção de biomoléculas que atuam no processo de reparo.
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3 OBJETIVOS
2.1 Geral
Analisar o efeito da radiação ultravioleta B em células tronco mesenquimais derivadas da pele humana, in vitro.
2.2 Específicos
- Avaliar a viabilidade das CTMp após a irradiação com diferentes doses de UVB.
- Analisar a morfologia das CTMp após serem expostas à radiação UVB.
- Verificar o dano no DNA causado nas CTMp após irradiação UVB
- Analisar o ciclo celular das CTMp após a irradiação UVB. - Estudar o processo de apoptose das células CTMp após a irradiação UVB.
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4 METODOLOGIA
4.1 Obtenção das amostras de tecido humano
As amostras de pele humana foram obtidas através de uma colaboração com o Hospital Universitário – HU (Florianópolis) onde pacientes submetidos a cirurgias plásticas de “lifting facial” (ritidoplastias) doaram os fragmentos de pele, retirados durante o procedimento cirúrgico, após a apresentação e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. O fragmento de pele foi coletado e armazenado a 4ºC em recipiente estéril, contendo DMEM-F12 acrescido de antibióticos (penicilina e estreptomicina - PS) (1U/μg) e encaminhado para o Laboratório de Células Tronco e Regeneração Tecidual, onde foram realizados os procedimentos de cultura celular.
4.2 Cultura de células tronco mesenquimais (CTM) derivadas da pele humana (CTMp)
Os fragmentos de pele foram cortados em pedaços de aproximadamente 1,0 cm² e incubados com 12,5 U/mL de dispase durante 15 horas, a 4°C. Após este período, a epiderme e a hipoderme foram removidas do tecido e a derme incubada com 0,25% de tripsina a e 0,02% EDTA (Gibco) durante 45 minutos, a 37°C. Após o bloqueio da reação enzimática com DMEM acrescido de 10% de soro bovino fetal (SBF), a suspensão de células foi filtrada com cell strainer de 70 μm (BD) e centrifugada durante 7 minutos a 392 g. As células foram então ressuspensas em DMEM suplementado com 10% de SBF e antibióticos (PS) e mantidas em garrafas de cultura de 25cm² a 37ºC, em 5% de CO2 e 95% de umidade. Após 4 dias, o meio de cultivo foi trocado e as células não aderentes descartadas. As células que
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permaneceram aderidas passaram a ser chamadas de células tronco mesenquimais derivadas da pele (CTMp). As CTMp foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de SBF e antibióticos (PS), em garrafas de cultura de 25 cm2 a 37ºC,
em 5% de CO2 e 95% de umidade. Quando atingiram
confluência de 80% foram repicadas e consideradas em passagem 1. As células foram utilizadas entre 1 e 5 passagens.
4.3 Irradição das CTMp com ultravioleta B (UVB)
Para a irradiação das CTMp com a luz UVB foi utilizado um aparato totalmente fechado, a fim de eliminar a incisão de outras radiações. A lâmpada ultravioleta (marca) foi posicionada a uma altura definida neste aparato, na qual a intensidade da radiação UVB (312 nm) incidente é de 34 μW/cm2. Para a definição das doses, as CTMp foram expostas
a essa intensidade, em períodos de tempos diferentes, conforme tabela 1. Foi utilizado um mesmo grupo controle para todas as doses, que foi mantido por 4 minutos em PBS 1X.
Para realizar o procedimento de irradiação, o meio de cultivo foi retirado e as células foram mantidas em 3 mL de PBS 1X durante a exposição às diferentes doses de radiação UVB. Em seguida, foram incubadas com DMEM suplementado com 10% de SBF a 37ºC, 5% CO2 e 95% de
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Tabela 1. Tempo de exposição das CTMs à radiação UVB na intensidade de 34 uW/cm2 e suas respectivas doses.
Dose Tempo 2,5 mJ/cm² 1 min. 15s 5 mJ/cm² 2 min. 30s 10 mJ/cm² 4 min. 54s 20 mJ/cm² 9 min. 48s 30 mJ/cm² 14 min. 42s 40 mJ/cm² 19 min. 36s 50 mJ/cm² 24 min. 30s 4.4 Ensaio de MTT
Para a análise da viabilidade celular foi realizada uma curva dose-resposta da sobrevida das CTMp irradiadas com UVB, através do ensaio colorimétrico de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromo tetrazólico). Esse ensaio consiste na medição de atividade da redutase mitocondrial em células vivas, baseando-se na clivagem do sal amarelo tetrazólio para cristais de formazan azuis por células metabolicamente ativas.
Para a realização do ensaio, 1x104 células foram
cultivadas em placas de 96 poços, e após atingirem confluência de aproximadamente 70%-80% foram irradiadas com 0, 2.5, 5, 10, 20, 30, 50 mJ/cm² de UVB, conforme o item
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4.3. Após 24, 48 e 72 horas, as CTMp foram incubadas com MTT (2,5 mg/mL) dissolvido em DMEM acrescido de 10% de SBF, por 3 horas a 37ºC, em 5% de CO2 e 95% de umidade.
Após este período, o meio foi removido e 100μL de DMSO (dimetilsulfóxido) foi acrescentado à amostra. A coloração obtida a partir dessa solubilização com DMSO foi quantificada por leitura de absorbância (470 nm) em leitor de microplacas Tecan Infinite M200.
4.4 Análise da morfologia
Para avaliar a morfologia celular das CTMp após a irradiação UVB nas doses de 2,5 e 5 mJ/cm², as células foram irradiadas em suas respectivas doses conforme a tabela 1 e então mantidas com meio DMEM suplementado com 10% de SBF. As CTMp foram fotografadas imediatamente após serem expostas à radiação UVB e 48h após o tratamento.
4.6 Análise de ciclo celular
As CTMp foram cultivadas 1x105 em placas de
100mm e, ao atingir a confluência de 70 a 80% foram irradiadas com UVB (0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²), e após 48 horas foram incubadas com 0,05% de tripsina/EDTA 0,02% durante 5 minutos, a 37ºC. Após, foram ressuspensas em PBS 1X acrescido de 10% de SBF, para bloqueio da reação enzimática, e a concentração ajustada para 100.000 células/mL. A suspensão celular foi centrifugada por 5 minutos, a 392 g e, posteriormente, fixadas com 100 μl de etanol 70% gelado, a -20ºC, durante 30 minutos. Em seguida, as células foram lavadas com PBS 1X, novamente centrifugadas, e incubadas com 100 μL de PBS Triton 0,1%, 100 μg/mL de RNAase e 14 μg/mL de iodeto de propídio, por
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uma hora em temperatura ambiente. A leitura foi feita através de um Citômetro de fluxo FACS Calibur da BD®, e os resultados foram analisados pelo programa Flowing onde foi possível verificar em qual período do ciclo celular as células se encontravam, G0/G1, S ou G2. Os dados foram apresentados em porcentagem.
4.7 Imunocitoquímica
As análises de dano de DNA e apoptose, foram realizadas através do ensaio de imunocitoquímica. Para avaliar o dano de DNA foi verificada a expressão da fosfohistona H2aX fosforilada (-H2aX), e a apoptose pela expressão de caspase-3.
Para isso, as CTMp foram fixadas com paraformaldeído 4% durante 30 minutos, a temperatura ambiente, e permeabilizadas com PBS-Triton X-100 (0,25%) durante 30 minutos. Os sítios inespecíficos foram bloqueados com 5% de SBF durante 40 minutos e em seguida, incubadas com os anticorpos primários -H2aX (Millipore) e anti-caspase-3 (Abcam AB13847). A incubação com o anticorpo primário foi realizada por um período de 14 horas, a 4°C e, após este período, foram realizadas 3 lavagens com PBS-Tween 20 (0,05%). Em seguida foi realizada incubação com o anticorpo secundário do tipo IgG2a e IgG conjugado ao fluorocromo Alexa 488 ou 594 respectivamente, durante 1 hora, a temperatura ambiente, e posteriormente lavadas com PBS Tween 20 (0,05%). Para a observação dos núcleos totais, as células foram coradas com 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Sigma) durante 30 segundos, a temperatura ambiente.
As marcações fluorescentes para os diferentes marcadores analisados foram visualizadas em microscópio
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epifluorescente Olympus IX71 e as imagens capturadas com a câmera Olympus DP71. Para a quantificação das células foi utilizado o programa Flowing Software.
4.8 Ensaio de viabilidade celular (vida/morte)
Para a distinção de células vivas de células mortas, foi utilizado o Kit de viabilidade/citotoxidade “LIVE/DEAD” (invitrogem). Esse kit utiliza dois
marcadores fluorescentes: a calceína (verde) para indicar a atividade da esterase intracelular, e o etídio (vermelho) para indicar perda da integridade da membrana. Assim, as células marcadas em verde são consideradas vivas, e as vermelhas células mortas.
As CTMp foram cultivadas em placas de 100mm e, ao atingir a confluência de 70 a 80% foram irradiadas com UVB (0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) e após 48 horas foram submetidas ao ensaio de vida/morte. Para isso, foram incubadas com 0,05% de tripsina/EDTA 0,02% durante 5 minutos, a 37ºC. Após, foram ressuspensas em PBS 1X acrescido de 10% de SBF, para bloqueio da reação enzimática, e a concentração ajustada para 1x105 células/mL.
As células foram então centrifugadas por 5 minutos, a 392 g, e posteriormente, incubadas com 2 μL de calceína e 4 μL de iodeto de propídeo, de 15 a 20 minutos, a temperatura ambiente, e protegido da luz.
A leitura foi feita através de um Citômetro de fluxo FACS Calibur da BD®, e os resultados foram analisados pelo programa Flowing. Os dados foram apresentados em porcentagem.
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5 RESULTADOS
5.1 Análise de viabilidade celular das CTMp
Para avaliar o efeito da radiação UVB sobre a viabilidade das CTMp, estas foram expostas à diferentes doses de UVB e, após 24, 48 e 72 horas foi realizado o ensaio de MTT. Como resultado, foi observado que, quando submetidas à dose de 2,5 mJ/cm² a viabilidade das CTMps foi de aproximadamente 80%, mostrando uma redução em todos os tempos analisados (Figura 5). Já na dose de 5 mJ/cm², a viabilidade foi de cerca de 56% em 24 horas e 48 horas, apresentando um aumento após 72 horas (67%). Em doses mais altas (10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm²) foram observadas porcentagens de cerca de 50% após 24 horas e de cerca de 30% após 48 e 72 horas de cultivo.
Em resumo estes resultados mostram que a exposição a baixas doses de UVB já é capaz de reduzir a viabilidade das CTMp.
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Figura 5. Viabilidade das CTMp após exposição a radiação UVB.
Representação gráfica da viabilidade celular realizada através dos ensaios de MTT . Os dados mostram a viabilidade das células irradiadas com diferentes doses (2,5, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm2)
de luz ultravioleta B em relação ao grupo controle (100%). Os valores representam as médias ± desvio padrão de triplicata de 3 experimentos independentes. ***P<0,001 por ANOVA uma via seguido de teste de Bonferroni em relação ao controle.
5.2 Análise da morfologia celular
As CTMp são caracterizadas por possuírem adesão ao plástico e morfologia semelhante a fibroblastos (Figura 6). Assim, após a irradiação das CTMp com diferentes doses de UVB, foi avaliada a morfologia das CTMp através de microscopia de contraste de fase. Após 48 horas de cultivo não foram observadas alterações morfológicas nas células irradiadas com as doses de 2,5 e 5,0 mJ/cm2. Já nas doses de
10, 20, 30, 40 e 50 mJ/cm2 foram observadas várias células
em suspensão, além de debris celulares (dados não mostrados).
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Figura 6. Morfologia das CTMp após a irradiação por luz UVB.
Imagens representativas do grupo controle e dos grupos de doses 2,5 mJ/cm2 e 5 mJ/cm2 em 0 horas e 48 horas após a irradiação. As
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5.3 Análise de dano de DNA
Para avaliar os danos no DNA das CTMp submetidas a irradiação UVB, foi analisada a expressão da histona γH2Ax fosforilada. Sabe-se que após radiação ionizante ocorre quebras duplas de DNA, levando a um bloqueio da replicação e indução da fosforilação da histona H2AX na serina 139 (γH2AX). Assim, a γH2AX é um marcador característico em resposta a quebras duplas de DNA, indicando dano. Foram consideradas células positivas para γH2AX as que apresentaram focis de marcação maior que 5 e as com marcação pan-nuclear (núcleo completamente marcado) (Figura 7A).
Foi observado que no grupo controle a maioria das células apresentaram apenas um foci de γH2AX sendo consideradas como nível basal de acordo com os critérios estabelecidos (Figura 7B e C). Os dados obtidos mostram que a porcentagem de dano de DNA é de 100% a partir da dose de 30mJ/cm² e que em doses baixas (2,5 e 5 mJ/cm²) o dano é significativamente menor do que em doses superiores (Figura 7B e C). Nas CTMps expostas, as doses de 2,5 e 5 mJ/cm², 4% e 6% das células expressam mais que 5 focis de γH2AX, respectivamente. Já a exposição a doses superiores (10 – 50 mJ/cm²) induziu um aumento significativo na expressão de γH2AX em relação ao grupo controle e as doses de 2,5 e 5 mJ/cm². As células irradiadas com doses de 30, 40 e 50 mJ/cm² apresentavam uma maior quantidade de núcleos com marcação pan-nuclear.
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Figura 7. Expressão de γH2AX nas CTMp irradiadas UVB.
(A) Imagens representativas da marcação de γH2aX. A primeira coluna mostra a marcação da fosfohistona γH2aX, em que núcleos celulares que apresentam focis abaixo de 3 são consideradas marcações a nível basal para dano. Acima de 3 focis são consideradas positivas, bem como as que apresentam marcação pan-nuclear. A segunda coluna mostra a marcação nuclear por DAPI e na terceira coluna está representada a sobreposição das imagens anteriores. (B) O gráfico mostra a proporção de células positivas para fosforilação da fosfohistona H2aX. Os valores representam as médias ± desvio padrão de triplicata de 3 experimentos independentes. ***P<0,001 por ANOVA uma via seguido de teste de Bonferroni em relação ao controle. (C) O grupo controle e as doses de 2,5, 5, 10 e 50 mJ/cm2 estão representadas por imagens
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5.4 Análise de ciclo celular por citometria de fluxo
Células com danos de DNA são reconhecidas por proteínas presentes no sistema de checagem do ciclo celular. Durante esse reconhecimento, ocorre uma parada no ciclo celular, o que proporciona mais tempo para que ocorra o reparo do DNA para que o dano não se perpetue após a síntese de DNA e a segregação cromossômica. Em caso de persistência do dano, é ativada a cascata de sinalização para a morte celular. Assim, foi avaliada a progressão no ciclo celular das CTMp irradiadas com UVB por citometria de fluxo (Figura 8).
A partir dos resultados anteriores, foram selecionadas as três doses mais baixas para análise do ciclo celular (2,5, 5 e 10 mJ/cm²). Nos resultados obtidos, os picos observados no histograma (Figura 8A) representam uma população de células em diferentes fases do ciclo celular. As células que não estão dentro das regiões prédeterminadas são células não viáveis.
O grupo controle (não irradiado) apresentou cerca de 92% de células em G0/G1, 1% em fase S e 7% em G2. Quando irradiadas há uma diminuição de células em fase G0/G1 de aproximadamente 9%, 12% e 7% nas doses de 2,5, 5 e 10 mJ/cm², respectivamente. Nas fases S e G2 há um aumento de cerca de 5% no número de células de todos os grupos irradiados em relação ao grupo controle. (Figura 8B). Estas diferenças não tiveram significância estatística.
Com essa análise foi observado que a radiação por luz ultravioleta B parece afetar o ciclo celular das CTMp, indicando uma parada no ciclo celular na fase S e G2.
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Figura 8. Dados referentes à porcentagem de células nas diferentes fases do ciclo celular.
Histograma representativo da população de células dos grupos controle e irradiados nas fases G1, S e G2 do ciclo celular (A). Gráfico que mostra a porcentagem de células nas fases do ciclo celular entre os diferentes grupos irradiados e o grupo controle (B). Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o número de células dos grupos controle e irradiados.
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5.3 Análise de morte celular
Os resultados obtidos até o momento indicam que a radiação UVB, na doses mais baixas, causam danos no DNA e que isto provoca parada no ciclo celular das CTMps. Assim, para avaliar se o processo de morte celular é ativado, primeiramente foi avaliada a quantidade de células viáveis e inviáveis no grupo controle e nos grupos irradiados com luz UVB, através do ensaio de morte/vida (Figura 9). As células não-viáveis correspondem a células necróticas e apoptóticas.
Os dados obtidos através de citometria de fluxo mostra que o número de células viáveis foi reduzido de maneira dose dependente após a exposição à radiação UVB. No grupo controle observa-se 95% de células viávies. Em células irradiadas há uma redução no número de CTMp viáveis de aproximadamente 10%, 20% e 45% nas doses de 2,5, 5 e 10 mJ/cm2, respectivamente. Não houve diferença
significativa na dose de 2,5 mJ/cm2 em relação ao grupo
controle.
Da mesma forma, o número de células não viáveis aumenta também de forma dose depentente após a irradiação por UVB. O aumento de quantidade é de cerca de 15% e 45% nas doses de 5 e 10 mJ/cm², respectivamente. A dose de 2,5 mJ/cm² não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle.
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Figura 9. Efeito da irradiação UVB na quantidade de CTMps viáveis e inviáveis dos diferentes grupos (controle e
irradiados).
Gráfico que demonstra a quantidade, em porcentagem, de células viáveis e inviáveis nos grupos controle e irradiados. ***P<0,001 por ANOVA uma via seguido de teste de Bonferroni em relação ao controle.
Os resultados obtidos até então indicam que dentre as células não viáveis, existe uma população de células apoptóticas. Então, para analisar se a cascata de sinalização de apoptose foi desencadeada após a irradiação UVB, foi avaliada a expressão de caspase-3 por imunocitoquímica. Os dados mostram um aumento de células positivas para caspase-3 após a irradiação UVB. As células irradiadas com 2,5, 5 e
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10 mJ/cm2 apresentaram um aumento de cerca de 1, 6 e 16
vezes na expressão de caspase-3, respectivamente. Entretanto, as células irradiadas com 2,5 e 5 mJ/cm2 não apresentaram
diferenças significativas em relação ao controle (Figura 10A). Foi observado também que as células positivas para caspase-3 possuem morfologia alterada, apresentando vesículas citoplasmáticas e menos pontos de adesão ao substrato (Figura 10B).
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Figura 10. Análise da apoptose após irradiação UVB das CTMps.
O gráfico mostra a porcentagem de células com marcação positiva para anti-caspase 3+. **P<0,001 por ANOVA uma via seguido de
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teste de Bonferroni em relação ao controle (A). Imagens representativas obtidas por microscopia de florescência de todos os grupos foram dispostas para mostrar as marcações de DAPI e caspase 3 (B).
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6 DISCUSSÃO
A pele é o maior órgão humano, sendo continuamente renovado para que sua viabilidade e integridade sejam mantidas e, assim, possa prover proteção para o corpo. A homeostase do tecido é mantida por CTs epidermais presentes na camada externa da epiderme e pelas CTM nas camada interna da derme. Essas células são frequentemente afetadas pelo ambiente, principalmente em áreas do corpo que estão continuamente expostas à diferentes agentes estressores que podem danificar direta e indiretamente o DNA celular, como a RUV. A radiação UV é um dos maiores responsáveis por danos de DNA em CT e a diminuição dessas células na pele pode prejudicar a homeostase tecidual (PANICH et al., 2016). Sendo assim, nosso objetivo foi avaliar o efeito da radiação UVB em CTMp a fim de verificar o perfil que as CTMp apresentam após a irradiação por UVB. Assim, foi analisado neste trabalho a viabilidade, dano de DNA, morfologia, ciclo celular e morte das CTMp, após a irradiação com diferentes doses de UVB.
Os resultados obtidos mostram que a viabilidade das CTMp irradiadas com UVB foi reduzida de forma dose dependente. Mesmo em doses consideradas baixas na literatura (2,5 e 5,0 mJ/cm2), foi observada uma diminuição
significativa de 20% em relação ao grupo controle. Com base nos resultados obtidos no trabalho de Jeong e colaboradores, o qual avaliou a habilidade de baixas doses de luz UVB em estimular a sobrevivência, migração e atividade de formação de tubos de CTM do tecido adiposo, os resultados do nosso estudo foram discrepantes. Enquanto no trabalho de Jeong o tratamento com radiação UVB aumentou a sobrevivência de células tronco mesenquimais do tecido adiposo, no presente trabalho não foi observado aumento de viabilidade celular. Essas diferenças podem ter ocorrido pelo fato de as CTM de diferentes tecidos responderem de maneira distinta frente a exposição a UVB.
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Outro fator que pode ter influência são as doses de UVB utilizadas, pois, apesar de iguais, podem não corresponder a mesma intensidade. Durante o estudo da literatura foi visto que os trabalhos não descrevem claramente a intensidade e o tempo utilizados em seus experimentos de irradiação. Assim, mesmo que a dosagem de radiação UVB seja a mesma, a diferença em intensidade e o tempo de exposição fazem com que os efeitos sejam diferentes. Em trabalho recente foi demonstrado que efeitos biológicos opostos ocorrem in vivo quando a dosagem permanece constante, mas é exposto a diferentes tempos e intensidades de radiação UVB. Os autores sugerem que os trabalhos devem informar a intensidade (mW/cm2) e o tempo de exposição
(segundos) utilizados nos experimentos, além da dosagem (mJ/cm2) para que os dados sejam mostrados corretamente
(LIDA et al., 2016).
Pelo fato da pele estar mais exposta a condições que danificam o DNA celular, trabalhos sugerem que as CT sejam altamente resistentes ao envelhecimento e dano de DNA e possuam diversos processos ativos de mecanismos de reparo (RACILA & BICKENBACH, 2009; STERN & BICKENBACH, 2007; GIANGRECO et al., 2008). Nossos resultados mostram que conforme o aumento da dose de irradiação UVB, há um aumento na quantidade de células positivas para γ-H2AX e na quantidade de focis nucleares. Sabe-se que a expressão deste marcador está associada a uma resposta à lesão no DNA, sendo então, amplamente utilizado na literatura como um indicador de dano. Foi observado que nas doses mais baixas, o número de células positivas para este marcador foi estatisticamente semelhante ao das CTMp não irradiadas, indicando que estas doses de radiação não são suficientes para afetar o DNA das CTMp. Entretanto, não foram encontrados dados na literatura sobre a expressão de danos ao DNA em CTMp.
Em resposta à lesão no DNA, são ativados mecanismos de reparo que afetam a progressão no ciclo
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celular. Sabe-se que células expostas a UV, ao sofrer dano direto no seu DNA, acumulam proteínas responsáveis por iniciar o processo de checagem e reparo e assim, é ativada a transcrição de genes de reparo de DNA (PEI & STRAUSS, 2013). Dependendo das proteínas que forem ativadas nessa etapa, e se o erro persistir ao longo do ciclo celular, a radiação UV pode induzir a parada em G1, S e G2 (LIMA, 2014). Os resultados do nosso estudo mostram um aumento de células nas fases S e G2, indicando parada no ciclo nestas fases, apesar de não ter sido encontrada diferença estatística entre os grupos. Entretanto, isso se deve ao fato de o número amostral para este experimento ser pequeno (n=2). Acredita-se que aumentando o número de análises, haverá significância estatística. Além disso, sugere-se análises mais especificas de proteínas envolvidas com a checagem do ciclo celular, como p53, Chk1 e Chk2 para melhor avaliar as alterações na progressão do ciclo celular das CTMps irradiadas com UVB.
Com a parada no ciclo celular, proporciona-se mais tempo para que o reparo ocorra. Havendo reparo, a célula sobrevive e continua seu ciclo e, caso o reparo não seja efetivo, pode levar à morte celular. Assim, com base nos resultados anteriores foi avaliada a morte celular das CTMps expostas a radiação UVB, e foi observado um aumento no número de células não viáveis e, mais especificamente, em células apoptóticas. Na dose mais baixa de radiação UVB (2,5 mJ/cm2) o número de células viáveis é semelhante a do
controle (diminuição de 10%). As doses de 5 e 10 mJ/cm2
apresentam diminuição no número de células viáveis e aumento das inviáveis. Considerando que a radiação UVB é um agente estressor, espera-se que hajam mais células em processo de apoptose em grupos irradiados. Entretanto, alguns trabalhos vem mostrando que pode haver aumento de proliferação celular em células expostas à radiação UVB (JEONG et al., 2013).
O presente estudo é o primeiro a mostrar o efeito da radiação UVB em CTM derivadas da pele. Os nossos
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resultados mostram que as CTMps mostram-se sensíveis à exposição UVB, mesmo nas baixas doses utilizadas neste estudo. Assim, acreditamos que no organismo, essas células possam ser afetadas negativamente pela radiação UVB e acometer a homeostase tecidual, provocando envelhecimento precoce e reparo menos eficiente do tecido. Entretanto, para confirmar esta hipótese, análises in vivo devem ser realizadas.
Sugerimos ainda, que apenas as doses de 2,5 e 5 mJ/cm2 podem ser utilizadas para o pré-condicionamento das
CTMp. Outras formas de pré-condicionamento já foram utilizadas com o objetivo de aumentar o potencial regenerativo de diversas células tronco (REHMAN et al., 2004; SAMPAT et al., 2011; PETERSON et al., 2011). Sendo assim, analisar o potencial regenerativo das CTMp pré-condicionadas com radiação UVB, além do seu meio condicionado (secretoma) é uma das perspectivas desse estudo.
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7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados desse trabalho, sugere-se que altas doses de radiação UVB diminuem a viabilidade das CTMp ao causar dano no DNA dessas células de forma dose dependente. Ao reconhecer a lesão, as células ativam vias de resposta que promovem parada no ciclo celular, culminando então, na ativação da cascata de sinalização para morte celular. Porém, quando expostas à baixas doses de radiação UVB, as CTMp não apresentam diferenças na quantidade de células positivas para dano de DNA e morte celular em relação ao controle, apesar de haver diminuição da viabilidade celular. Também não foram observadas diferenças morfológicas entre os grupos irradiados e controle em baixas doses.
Figura 11. Representação esquemática dos possíveis efeitos da radiação UVB nas CTMp
1. Quando expostas à baixas doses de radiação UVB (2,5 e 5 mJ/cm2) não há diferenças na morfologia entre os grupos irradiados
e o grupo controle. Também não são observados aumento de lesão no DNA e células em processo de apoptose. Entretanto, há diminuição da viabilidade celular. 2. A radiação UVB, nas doses consideradas altas, causam lesão no DNA nas CTMp, as quais ativam vias de resposta para que haja parada no ciclo celular e então,
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não obtendo sucesso no reparo de DNA, sinaliza para que ocorra o processo de morte celular, assim, diminuindo a viabilidade das CTMp. Esse processo ocorre de maneira dose-dependente, havendo uma maior quantidade de células mortas quanto mais elevada a dose de radiação UVB. Fonte: Elaborado pela autora.
61
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